CN106566892A

CN106566892A - 一种利用ic‑lamp检测香蕉束顶病毒的方法

Info

Publication number: CN106566892A
Application number: CN201610826175.7A
Authority: CN
Inventors: 饶雪琴; 李华平; 罗宝花; 刘娟
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-09-18
Filing date: 2016-09-18
Publication date: 2017-04-19

Abstract

本发明公开了一种利用IC‑LAMP检测香蕉束顶病毒的方法，还包括一组LAMP引物组，所述引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为BBTV‑F3/BBTV‑B3，序列如SEQ ID NO.1～2所示，内引物对为BBTV‑FIP/BBTV‑BIP，序列如SEQ ID NO.3～4所示。本发明将血清学和LAMP相结合，首先用特异性的BBTV抗血清捕捉病毒粒子，并以该病毒粒子为模板，利用上述引物组进行LAMP 扩增检测BBTV。该方法是一种简便、灵敏、特异的针对香蕉植株、吸芽及组培苗中BBTV的快速检测技术，操作简单，特异性好，灵敏度高，可应用于BBTV的检测与鉴定，监控其发生、扩散和流行。

Description

一种利用IC-LAMP检测香蕉束顶病毒的方法

技术领域

本发明属于植物病原物检测技术领域，具体地，涉及一种利用免疫捕捉—环介导等温扩增反应（IC-LAMP）检测香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus, BBTV）的方法。该方法适用于香蕉组培苗和田间香蕉植株上香蕉束顶病毒的快速检测及病害诊断。

背景技术

香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus, BBTV）属于矮缩病毒科香蕉束顶病毒属，是香蕉束顶病的病原。BBTV在苗圃和田间仅能由香蕉交脉蚜（Pentalonia nigronervosa）以持久性方式传播，其短距离传播主要依赖于蚜虫，而长距离的传播主要来源于带病的繁殖材料；其寄主范围较窄，均属于芭蕉科。香蕉束顶病病株矮缩，新叶变短变窄，呈束状丛生，叶脉上出现深绿色点线状的“青筋”并出现停止生长的现象，少数晚期受害的则果形变细、果味变淡，导致失去商品价值。BBTV的不同株系在不同香蕉品种上症状存在差异。BBTV在香蕉植株中的潜育期一般在25～85d，但也因香蕉品种、气候、非生物因素和BBTV毒株之间的遗传差异而有所不同。香蕉束顶病是世界性限制香蕉生产和分布最严重最普遍的香蕉病害之一，已成为香蕉上重要的毁灭性病害之一，威胁着世界各地的香蕉生产，包括太平洋、印度洋和东南亚。在我国南方的香蕉产区，香蕉束顶病分布较广，特别是在广东，海南、云南和广西等香蕉产区的危害非常严重，发病率严重者达到70%～80%，甚至导致蕉园的毁灭。

有效的防治香蕉病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的基本前提则是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此，香蕉束顶病毒的检测对于香蕉束顶病对的防治具有重要的意义。

目前，常用的BBTV检测技术是血清学技术和PCR技术。ELISA检测BBTV灵敏度不如PCR，但是PCR需要特殊的仪器设备。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification, LAMP）是一项核酸扩增新技术。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。引物设计是否合理是决定LAM方法是否高效、特异的关键。该方法通过4条特异引物，即上游内部引物（FIP）、下游内部引物（BIP）、上游外部引物（F3）、下游外部引物（B3），来识别靶基因的6个特异序列，即位于靶标基因5' 端的F1、F2和F3以及3'端的B1c、B2c和B3c区的序列。引物的位置均有严格的顺序性，6个不同位点完全匹配才能进行扩增，具有很高的特异性。通过具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，使得链置换DNA合成可以不停地自我循环，整个反应分为两大阶段，即初反应物哑铃状模板的合成，基因循环扩增、延伸和再循环阶段。目前，该技术在水产养殖病原物检测、植物病原物检测、医学病原物检测和食品安全检测等领域均有应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中香蕉束顶病毒检测方法的缺陷与不足，提供一种利用IC-LAMP检测香蕉束顶病毒的方法。该方法可用于快速、准确地检测香蕉植株、吸芽、香蕉试管苗或组培苗中的BBTV，通过该方法可以检测显症、疑似症状或无症状的香蕉植株或组织中是否含有BBTV，且操作简单，不需要特殊的仪器设备。

本发明的目的是提供一组用于IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的引物组。

本发明的另一目的是提供一种利用IC-LAMP检测香蕉束顶病毒的方法。

本发明的再一目的是提供上述方法在香蕉组培苗和/或田间香蕉植株上对香蕉束顶病毒的快速检测方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种用于IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的LAMP引物组，所述引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为BBTV-F3/BBTV-B3，序列如SEQ ID NO.1～2所示；所述内引物对为BBTV-FIP/BBTV-BIP，序列如SEQ ID NO.3～4所示。

引物设计是否合理是决定LAMP方法是否高效、特异的关键。本发明设计的LAMP引物组，通过4条特异引物，即上游内部引物（FIP）、下游内部引物（BIP）、上游外部引物（F3）、下游外部引物（B3），来识别靶基因的6个特异序列，即位于靶标基因5' 端的F1、F2和F3以及3' 端的B1c、B2c和B3C区的序列。引物的位置均有严格的顺序性，6个不同位点完全匹配才能进行扩增，具有很高的特异性。

本发明所设计得到的上述引物组能够很好的应用于香蕉束顶病毒的LAMP检测。

一种利用上述引物以IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的方法，所述方法具体包括如下步骤：

S1. 用特异性的BBTV抗血清捕捉待测样品中的病毒粒子；

S2. 以步骤S1捕捉的病毒粒子为模板，利用上述引物组进行LAMP 扩增；

S3. 根据扩增结果判断病毒粒子待测样品中是否含有香蕉束顶病毒；即判断是否捕获到病毒粒子和/或病毒粒子是否为香蕉束顶病毒。

其中，优选地，步骤S1所述病毒粒子的捕捉的方法为：将稀释后的BBTV抗血清包被容器（如PCR管）；用碳酸盐包被缓冲液研磨香蕉待检测组织，取适量研磨组织的汁液加入上述容器（如PCR管）中进行孵育，以获得免疫捕捉的病毒粒子。

优选地，步骤S1所述BBTV抗血清可以为多克隆抗体或单克隆抗体，可以自制或从商业途径获得。

优选地，步骤S2所述LAMP扩增的扩增体系，以扩增体系25 μl为例，扩增体系中各组分的含量为：dNTPs（10 mmol/L each）4 μL；betaine（5 mol/L）5 μL；MgSO₄（20 mmol/L）5μL；10×Thermopol reaction buffer 5 μL；引物BBTV-F3/ BBTV-B3（25 μmol/L）各0.2 μL；引物BBTV-FIP/ BBTV-BIP（50 μmol/L）各0.8 μL；Bst 酶（8 U/μL）1 μL；ddH₂O 补至25 μL。

优选地，步骤S2所述LAMP扩增的反应条件为：50～65℃恒温水浴中扩增反应60～70 min；80～85℃，6～10min。

更优选地，步骤S2所述LAMP扩增的反应条件为：60℃恒温水浴中扩增反应65 min；85℃，8 min。

优选地，步骤S3所述根据扩增结果判断病毒粒子是否为香蕉束顶病毒的的具体方法为荧光染料技术或电泳检测技术。

优选地，所述荧光染料技术为：取SYBR Green I荧光染料反应液加入步骤S2所述LAMP扩增的反应产物中，在紫外灯下，若扩增产物为绿荧光色即为阳性反应，表示样品中含有BBTV；若扩增产物颜色不变则为阴性反应，表示样品中不含有BBTV。

优选地，SYBR Green I荧光染料反应液的加入量与反应液的体积比为1：25。

优选地，所述电泳检测技术为：将步骤S2所述LAMP扩增的产物进行电泳观察，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，即为阳性反应，表示样品中含有BBTV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含有BBTV。

一种利用IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的试剂盒，包含有上述引物组和/或特异性的BBTV抗血清。

进一步优选地，所述试剂盒还包含有LAMP 扩增反应所需试剂。

优选地，所述试剂盒还包含有如下试剂：

溶液1：碳酸盐包被缓冲液（0.05 M pH9.6）：称取0.2 g NaN₃，2.93 g NaHCO₃，1.59 gNa₂CO₃，双蒸水溶解后定容至1 L；

溶液2：磷酸缓冲液（PBS）（0.02 M pH 7.4）：取8.0 g NaCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 gNa₂HPO₄·12H₂O，0.2 g KCl 置于烧杯中，加800 mL ddH₂O 溶解并调pH值，双蒸水定容至1000 mL，混匀；

溶液3：磷酸洗涤缓冲液（PBST，0.02 M pH 7.4）：取8.0 g NaCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 gNa₂HPO₄·12H₂O，0.2 g KCl 置于烧杯中，加800 mL ddH₂O 溶解并调pH值，再加0.5mLTween-20，双蒸水定容至1000 mL，混匀。

溶液4：荧光染料检测液SYBR Green I 。

更优选地，利用所述试剂盒检测BBTV的方法如下：

（1）用磷酸缓冲液（PBS）来稀释BBTV病毒的抗血清（BBTV 单抗为1:4000，或根据BBTV抗体推荐浓度进行稀释），分装至200 μL反应容器（如PCR管）中各100 μL，4℃过夜或37℃孵育2小时，磷酸洗涤缓冲液（PBST）洗涤3 次；取1 mL 碳酸盐包被缓冲液（0.05 M，pH9.6）来研磨0.1 g 香蕉待测组织，从中取出100 μL 研磨液置于上述反应容器（如PCR管）中，在恒温箱中37℃放置3 h；磷酸缓冲液洗涤液（PBST）洗涤3次，甩干；即获得免疫捕捉病毒粒子；

（2）配制IC-LAMP反应缓冲液（总体系25 μL），按总体系25μL 建立扩增体系为：dNTPs（10 mmol/L each）4 μL；betaine（5 mol/L）5 μL；MgSO₄（20 mmol/L）5 μL；10×Thermopolreaction buffer 5 μL；外引物BBTV-F3/ BBTV-B3（25 μmol/L）各0.2 μL；内引物BBTV-FIP/ BBTV-BIP（50 μmol/L）各0.8 μL；Bst 酶（8 U/μL）1 μL；ddH₂O补至25 μL；

（3）将配制好的IC-LAMP反应液加入上述完成了BBTV免疫捕捉的反应容器（如PCR管）中，置于冰上用移液器混匀，加入等体积的石蜡油，盖紧反应容器（如PCR管）；

（4）在50～65℃金属恒温浴中扩增反应60～70 min；80～85℃，6～10min（优选为60 ℃扩增65 min，85℃，8 min）。

（5）观察结果：取出反应后的反应容器（如PCR管），在反应容器（如PCR管）盖内侧加1 μL 10×SYBR Green I 荧光染料工作液，上下颠倒混匀即可；在紫外光下，呈阳性即绿色的表示样品中含有BBTV；呈阴性即保持染料不变色，则表示样品中不含有BBTV。或者结果的观察可以采用电泳检测技术。

另外，上述引物组、方法或试剂盒在检测和/或鉴定香蕉束顶病毒方面的应用也在本发明的保护范围之内。可应用于监控香蕉束顶病发生、扩散和流行。检测对象可以为香蕉植株、吸芽或香蕉组培苗中BBTV及其不同株系或分离物。

本发明将免疫捕捉和环介导等温扩增反应结合起来的IC-LAMP技术是一种通过微量抗原的捕获并结合LAMP扩增来检测病原物的方法，其检测对象是完整的病原物，通过固相化的特异抗体捕捉特定的病原物抗原，再利用病原物基因组序列特异的引物进行扩增，通过对扩增产物的检测和分析达到对完整病原物的检测。IC-LAMP检测方法将血清学方法的检测特异性和分子生物学方法的灵敏性有机地结合起来，克服了血清学技术和PCR技术的不足之处，更有利于检测植物组织中含量低的香蕉束顶病毒。而且IC-LAMP检测方法特异性强，灵敏度高，不需要特殊的仪器设备，简化了操作过程，提高了检测效率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明将血清学和LAMP扩增技术有机相结合，充分发挥两种检测方法的优越性，并根据BBTV复制酶基因保守的序列设计LAMP扩增引物，采用LAMP技术建立一种简便、灵敏、特异的检测香蕉植株、吸芽及组培苗中BBTV检测技术，结果分析简便，可以通过颜色反应直接判断检测结果，实现对香蕉束顶病的早期监测和有效控制，建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的IC-LAMP检测方法，以便及时采取有效的防控手段防治该病害的扩散与传播。

（2）本发明是用特异性的BBTV血清捕捉待测样品中的BBTV粒子，提高了检测的特异性，减少了假阳性。

（3）本发明直接以捕捉的病毒粒子作为检测对象进行LAMP检测，避免了抽提植物总DNA，减少了分子检测的环节，避免了二次污染。

（4）本发明通过颜色反应可以直接判断结果，使检测结果更直观。

（5）本发明具有操作简单，不需要特殊的仪器设备，反应快速，成本低，特异性强，灵敏度高的优点，且用时短，其灵敏度比普通PCR高100倍，对病毒早期诊断灵敏高效。可利用本检测方法快速检测和鉴定BBTV，监控其发生、扩散和流行。可作为香蕉束顶病毒特异性检测的有效手段，以便及时采取措施，减少病毒病带来的经济损失。

附图说明

图1为IC-LAMP法检测香蕉病样；A、B和C分别为肉眼下、紫外灯下和琼脂凝胶中的检测结果图，1～9分别为1～9个香蕉病样；10为阳性对照；N：阴性对照；B：空白对照；M：DNAMarker 2000；检测结果：自左到右，第1～8个和第10个试管为绿色；9、N和B为染料颜色。

图2为IC-LAMP和PCR检测香蕉病株中BBTV的灵敏度比较；图A为紫外灯分析IC-LAMP检测香蕉病株中BBTV的灵敏度；图B为电泳分析IC-LAMP检测香蕉病株中BBTV的灵敏度；图A和B中，1～8：香蕉病株中BBTV的浓度分别为8.40×10⁶～8.40×10^-1 copies/μL，9：香蕉健株，10：ddH₂O，M：DNA Marker 2000 bp；图C为电泳分析PCR检测香蕉病株中BBTV的灵敏度；1～8：香蕉病株中BBTV的浓度分别为8.40×10⁶～8.40×10^-2 copies/μL，10：香蕉健株，11：ddH₂O，M：DNA Marker 2000 bp；检测结果：自左到右，第1～6个试管为绿色；7～10为为染料颜色。

图3为IC-LAMP和PCR检测香蕉病株中BBTV的特异性分析；图A为紫外灯分析IC-LAMP检测特香蕉病株中BBTV的异性；图B为电泳分析IC-LAMP检测香蕉病株中BBTV的特异性；图C为电泳分析PCR检测香蕉病株中BBTV的特异性；图中1～8分别为：CMV侵染的香蕉、BBTV侵染的香蕉、BSV侵染的香蕉、香蕉枯萎病病原菌Foc1、香蕉枯萎病病原菌Foc4、香蕉细菌软腐病菌株XJ8-3、香蕉细菌鞘腐病菌株XJ5-1分别侵染的香蕉、香蕉健株，9：ddH₂O，M：DNA Marker 2000 bp；检测结果：自左到右，第1个试管为绿色；2～9为染料颜色。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 IC-LAMP检测田间采集的疑似BBTV侵染的香蕉样品

以田间采集的疑似感染BBTV的香蕉样品作为待测样品，利用本发明的方法进行IC-LAMP检测，以健康香蕉植株为阴性对照，以感染BBTV的香蕉植株为阳性对照。

1. 引物设计

根据NCBI获得的BBTV复制酶基因保守的序列设计引物，通过DNAstar软件分析后找出该病毒复制酶基因保守区域序列作为模板参考序列，设计LAMP外引物对BBTV-F3/BBTV-B3和内引物对BBTV-FIP/BBTV-BIP，序列如下：

BBTV-F3：5’-GGCGCGATATGTGGTATGC-3’；

BBTV-B3：5’-TCATACAGTACGCCCGTGC-3’；

BBTV-FIP：

5’-GTACCCTCCTGTCCCCTCTCCACCAACAATCCCGCTTCACTTCC-3’；

BBTV-BIP：

5’-TTCTCTGAAGCAGATGAGAGGCCTTGGCTCCCCTTTCGTTTC-3’。

2. 免疫捕捉BBTV

（1）用磷酸缓冲液（PBS）来稀释病毒的抗血清（BBTV单抗为1:4000，或根据BBTV抗体推荐浓度进行稀释），分装至200 μL PCR管中各100 μL，4℃过夜，洗涤3 次；

（2）取1 mL 碳酸盐包被缓冲液（0.05 M，pH9.6）来研磨0.1 g香蕉叶片，从中取出100 μL研磨液置于上述PCR管中，在恒温箱中37℃放置3 h；

（3）磷酸缓冲液洗涤液（PBST）洗涤3次，甩干；即获得免疫捕捉BBTV。

3. LAMP反应

（1）配制LAMP反应缓冲液（总体系25μL）：LAMP检测的反应体系为25μL，扩增体系中各组分的含量为：dNTPs（10 mmol/L）4 μL；betaine（5 mol/L）5 μL；MgSO₄（20 mmol/L） 5 μL；10×Thermopol reaction buffer 5 μL；引物BBTV-F3/ BBTV-B3（25 μmol/L）各0.2 μL；引物BBTV-FIP/ BBTV-BIP（50 μmol/L）各0.8 μL；Bst 酶（8 U/μL）1 μL；ddH₂O补至25 μL。将配制好的IC-LAMP反应液加入上述PCR管中，加入等体积的石蜡油。

（2）在金属恒温浴中60℃扩增65min，85℃，8 min。

（3）应结束后，在PCR管盖内侧加1 μL 10×SYBR Green I荧光染料工作液，盖紧PCR管，混匀。

4. 结果分析

肉眼观察（图1A），若扩增产物淡绿色，则为感染BBTV的香蕉样品；若扩增产物颜色不变，则为未感染BBTV的香蕉样品。在紫外灯下（图1B），扩增产物颜色有绿荧光色的为感染BBTV的香蕉样品；若颜色不变，则为未感染BBTV的香蕉样品。检测结果：自左到右，第1～8个和第10个试管为绿色；9、N和B为染料颜色。

电泳检测结果（图1C）显示明亮的弥散状核酸泳带，则为感染BBTV的香蕉样品；无弥散状核酸泳带为未感染BBTV的香蕉样品。

这种检测植株上BBTV方法的应用包括：在香蕉植株、香蕉组培苗、香蕉吸芽、以及其他芭蕉科作物上疑似病株的诊断和鉴定。

实施例2 PCR和IC-LAMP检测BBTV的灵敏度比较

1、为了对PCR和IC-LAMP方法检测BBTV的灵敏度进行比较，将BBTV侵染的香蕉取适量混匀，分为二份。一份用Omege公司植物组织DNA抽提试剂盒提取总DNA，总DNA浓度调节至100ng/μL，定量分析测定其初始核酸浓度为8.40×10⁶ copies/μL，进行10倍浓度梯度连续稀释（8.40×10⁶～8.40×10^-1 copies/μL），进行PCR扩增；另一份相同浓度的样品用作IC-LAMP扩增。实验均重复3次。

2、IC-LAMP检测感染BBTV香蕉样品的灵敏度结果

分别用BBTV抗血清捕捉，用实施例1中的IC-LAMP检测体系进行反应。

结果显示，在紫外灯下，稀释度为8.40×10⁶～8.40×10¹ copies/μL的香蕉样品有绿荧光色，而其他稀释度样品无绿荧光色（图2A）。

电泳结果显示，稀释度为8.40×10⁶～8.40×10¹ copies/μL的香蕉样品能够扩增出目的条带，其余样品均没有扩增出目的条带（图2B）。

这表明本发明IC-LAMP检测感染香蕉中BBTV的灵敏度为8.40×10¹ copies/μL（图2 A/B）。

3、PCR检测BBTV的灵敏度结果

根据NCBI报道的BBTV复制酶基因保守的序列设计PCR引物BBTV-RepF/ BBTV-RepR，序列如下：

BBTV-RepF: 5’-ATGGCGCGATATGTGGTATGCTGG-3’;

BBTV-RepR: 5’- TCAGCAAGAAACCAACTTTATTCGATC-3’。

对BBTV侵染的香蕉总DNA进行10倍梯度稀释，用引物BBTV-RepF/ BBTV-RepR对稀释的样品进行PCR扩增。PCR 反应体系为20μL，扩增体系中各组分的含量为：10×PCRBuffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6 μL，BBTV-RepF（10 μmol/L）0.5 μL，BBTV- RepR（10μmol/L）0.5 μL，DNA 模板（100 ng/μL）1 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH₂O 14.3 μL。

PCR反应程序为：预变性94℃ 5min，变性94℃ 30 s，延伸56℃ 30 s，退火72℃ 1min（变性、延伸和退火共35个循环），终止72℃ 5 min。

反应结束后，分别取PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。结果显示，稀释度为8.40×10⁶～8.40×10³ copies/μL的香蕉样品能够扩增出目的条带，其余样品均没有扩增出目的条带（图2B），表明PCR检测香蕉中BBTV的灵敏度为8.40×10³ copies/μL（图2C）。

4、PCR和IC-LAMP检测BBTV的灵敏度比较结果

IC-LAMP检测感染香蕉中的灵敏度为8.40×10¹ copies/μL（图2A/B），PCR检测香蕉中BBTV的灵敏度为8.40×10³ copies/μL（图2C），表明IC-LAMP检测BBTV的灵敏度比RT-PCR检测方法高100倍。

实施例3 IC-LAMP检测BBTV的特异性

1、为了对PCR和IC-LAMP方法检测BBTV的特异性进行分析，分别以感染CMV、BBTV或BSV病毒的香蕉，以及香蕉枯萎病的病原菌生理小种1号（Fusarium oxysporum f. sp.Cubenserace 1, Foc1）、香蕉枯萎病菌生理小种4号（Fusarium oxysporum f. sp.Cubenserace 4, Foc4）、香蕉细菌性软腐病病原菌（Dickeya zeae）菌株XJ8-3和香蕉叶鞘腐败病病原菌（Dickeya dadantii）菌株XJ5-1的香蕉为样品，分别进行IC-LAMP扩增和PCR验证。实验均重复3次。

2、IC-LAMP检测BBTV的特异性试验结果

为了分析IC-LAMP检测BBTV的特异性，以分别感染CMV、BBTV或BSV病毒的香蕉，以及分别感染香蕉枯萎病生理小种1（Foc1）、香蕉枯萎病生理小种4（Foc4）、香蕉细菌性软腐病病原菌XJ8-3和香蕉叶鞘腐败病病原菌XJ5-1的香蕉植株为样品，分别用BBTV抗血清捕捉，用实施例1中的IC-LAMP检测体系进行反应。

结果显示，用IC-LAMP扩增感染BBTV的香蕉样品扩增产物有绿荧光色；而扩增其他样品时均无绿荧光色（图3A）。电泳结果显示，除了感染BBTV的香蕉能够扩增出目的条带外，其余样品均没有扩增出目的条带（图3B）。

这表明本发明建立的IC- LAMP方法具有很好的特异性。

3、PCR验证IC-LAMP检测的特异性结果

BBTV-RepF: 5’-ATGGCGCGATATGTGGTATGCTGG-3’;

BBTV-RepR: 5’- TCAGCAAGAAACCAACTTTATTCGATC-3’。

分别用Omege公司植物组织DNA抽提试剂盒抽提感染CMV、BBTV或BSV病毒的香蕉，以及分别感染香蕉枯萎病生理小种1（Foc1）、香蕉枯萎病生理小种4（Foc4）、香蕉细菌性软腐病病原菌XJ8-3和香蕉叶鞘腐败病病原菌XJ5-1的香蕉植株总DNA，并以此为PCR模板进行PCR扩增。

PCR反应体系为20μL，扩增体系中各组分的含量为：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6 μL，BBTV-RepF（10 μmol/L）0.5 μL，BBTV- RepR（10 μmol/L）0.5 μL，DNA模板（100 ng/μL）1 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH₂O 14.3 μL。

电泳结果显示，除了感染BBTV的香蕉能够扩增出目的条带外，其余样品均没有扩增出目的条带（图3C）。

同时，PCR检测的结果也再次验证了本发明IC-LAMP检测香蕉病株中BBTV的方法的特异性。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种利用IC-LAMP检测香蕉束顶病毒的方法

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcgcgatat gtggtatgc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcatacagta cgcccgtgc 19

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtaccctcct gtcccctctc caccaacaat cccgcttcac ttcc 44

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttctctgaag cagatgagag gccttggctc ccctttcgtt tc 42

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcgcgat atgtggtatg ctgg 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagcaagaa accaacttta ttcgatc 27

Claims

1.一组用于IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为BBTV-F3/BBTV-B3，序列如SEQ ID NO.1～2所示；所述内引物对为BBTV-FIP/BBTV-BIP，序列如SEQ ID NO.3～4所示。

2.权利要求1所述引物组在香蕉束顶病毒检测中的应用。

3.一种利用IC-LAMP检测香蕉束顶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 用特异性的BBTV抗血清捕捉待测样品中的病毒粒子；

S2. 以步骤S1捕捉的病毒粒子为模板，利用权利要求1所述的引物组进行LAMP 扩增；

S3. 根据扩增结果判断病毒粒子待测样品中是否含有香蕉束顶病毒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述BBTV抗血清为多克隆抗体或单克隆抗体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述LAMP扩增的体系如下：10mmol/L dNTPs 各4μL；5mol/L 甜菜碱5μL；20mmol/L MgSO₄ 5μL；10×反应缓冲液5μL；25μmol/L引物BBTV-F3/ BBTV-B3各0.2μL；50μmol/L引物BBTV-FIP/ BBTV-BIP各0.8μL；8 U/μL Bst酶1μL；ddH₂O 补至25μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述LAMP扩增的反应条件为：50～65℃恒温水浴中扩增反应60～70min；80～85℃，6～10min。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述捕捉待测样品中的病毒粒子的方法为：将BBTV抗血清稀释后包被容器；用碳酸盐包被缓冲液研磨待检测组织并加入上述容器中，免疫捕捉得到病毒粒子。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3所述根据扩增结果判断病毒粒子待测样品中是否含有香蕉束顶病毒的具体方法为荧光染料技术或电泳检测技术；所述荧光染料技术为：取SYBR Green I荧光染料反应液加入步骤S2所述LAMP扩增的反应产物中，在紫外灯下，若扩增产物变化为绿荧光色即为阳性反应，表示样品中含有BBTV；若扩增产物颜色不变则为阴性反应，表示样品中不含有BBTV；

所述电泳检测技术为：将步骤S2所述LAMP扩增的产物进行电泳观察，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，即为阳性反应，表示样品中含有BBTV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含有BBTV。

9.一种利用IC-LAMP法检测香蕉束顶病毒的试剂盒，其特征在于，包含有权利要求1所述引物组和/或特异性的BBTV抗血清。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包含有LAMP 扩增反应所需试剂。