CN104946796A - 用于rt-lamp法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明“用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法”，涉及植物病毒检测领域。所述试剂盒包括独立包装或混装在一起的特异引物FIP、BIP、F3、B3、LOOP-F及LOOP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～NO.6所示。本发明提供的检测方法无需特殊仪器，只要有水浴锅或是金属浴即可实现操作；检测时间短，40分钟即可获得实验结果；灵敏度高，能够检测低至7.148×10^-5μg/μl RNA模板浓度的样本；容易读取结果，扩增完成后，只需目测反应溶液的浑浊度或加入EB或SYBR Green等染料即可判断待测样品中是否含有番茄斑萎病毒。

Description

用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法。

背景技术

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒属(Tospovirus)代表性成员之一，病毒粒子近似球形，寄主植物十分广泛，现可侵染84个科，1090多种植物，主要包括番茄、烟草、花生、辣椒、莴苣、大豆等蔬菜作物和数以千计的观赏植物。番茄斑萎病毒感染的寄主植物在早期会出现严重矮化、叶脉坏死、叶面皱缩、整株变黄或产生褪绿斑点等典型症状，从而导致产量下降，除叶片上出现同心环纹斑或镶嵌的坏死斑点外，坏死条纹延伸到芽茎末端，花器上也会出现死斑，产生畸形花，受感染的果实出现坏死斑点和轮纹，成熟的果实出现黄色斑点同心环或坏死条纹同时存在。不仅叶片上症状明显，茎秆和根部也会出现坏死现象。严重时会导致整株死亡，造成严重的经济损失。

番茄斑萎病毒是一种RNA病毒，直径约为80-110nm，其中外膜为20～25nm，核壳体为60nm，具有膜包被的三分体单链RNA(L RNA，M RNA，S RNA)基因组，包含4种结构蛋白。其中，L RNA(～8.9kb)为负义RNA，包含一个开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码病毒RNA的依赖性聚合酶蛋白(RdRp)；而M RNA(～4.8kb)和S RNA(～2.9kb)为双义RNA，其中M RNA包含有2个开放阅读框，互补编码非结构蛋白NSm(病毒的运输蛋白：MP)，病毒链编码G1，G2两个前体糖蛋白；S RNA病毒包含有2个开放式阅读框，病毒链编码结构蛋白NSs，互补链编码外壳蛋白，又称核壳体蛋白(Nucleocapsid protein,N)。TSWV三个RNA片段末端8个核苷酸(3’序列为UCUCGUUA…，5’端为AGAGCAAU…)高度保守，每个RNA片段末端约65个核苷酸系列互补，区域互补从而形成假环状结构(Pseudo circularstructure)。

1906年番茄斑萎病毒引起的病症第一次被观察到，Brittlebank等人(1915年)在澳大利亚首次描述该病症，从发现到现在已有近百年的历史，目前在世界多个国家和地区广泛分布，在夏威夷的生菜、番茄和胡椒上损失达60％～70％；在法国和西班牙等欧洲国家和地区，曾因该病毒大量扩散而引起番茄、辣椒等作物的严重病害，造成毁灭性损失，重病地块损失达100％；20世纪90年代末期，TSWV在日本的菊花上发生严重。TSWV以其广泛的寄主范围和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。我国首次于1984年在广州发现TSWV，并得到其分离物。张仲凯等人2000在云南晒烟区发现番茄斑萎病毒已广泛分布，局部地区损失已达60％以上。2006年，我国首次将TSWV列为全国农业植物检疫性有害病毒；2008年，在云南蝴蝶兰上检测到TSWV；2009-2010年，董家红等在云南昆明的多个地区检测到TSWV；2012年广州检验检疫中心首次在美国进境生菜种子中截获TSWV；李飞等2012年在北京检测到TSWV。

常规的检测技术对仪器、检测环境要求较高，且耗时较长。Notomi等于2000年开发了一种新型的核酸扩增方法——环介导恒温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，该方法不需要昂贵的仪器设备，在等温条件下即可高效、快速、特异、灵敏地扩增靶序列，且操作简单、适合多种检测环境。因此，自开发以来，该方法已经在国内外医学病原物检测、食品安全检测及基因芯片等方面有广泛的应用且效果良好，近些年也逐渐渗透到植物病原检测领域。该方法针对靶基因6个特异区域(3’端的F3c，F2c，Flc区以及5’端的B1，B2，B3区)设计4条特异引物，即上游内部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游内部引物(BIP)、下游外部引物(B3)。为提高引物的特异性，可以再在引物组合内添加2条环状引物，上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)，引物的位置均有一定的顺序性。该技术是利用Bst DNA聚合酶的链置换活性提供反应的动力，在恒温条件下短时间(30～60min)内完成靶DNA的高效扩增，整个反应分为两大阶段，即初反应物哑铃状模板的合成，基因循环扩增、延伸和再循环阶段。反应第一阶段：在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，内引物FIP与模板DNA结合形成互补链；随后，新合成链在外引物F3的作用下被置换，而被置换的单链在5’末端形成环状结构。然后，内引物BIP与该单链结合，在延伸过程中同时打开环状结构，形成双链DNA。最后，外引物B3与该双链DNA的B3c结合，随着引物B3的不断延伸，两侧分别为FIB和BIP的完整单链被置换。由于该单链两端存在互补序列，于是形成“哑铃状”循环扩增的起始结构。在第二阶段，在哑铃状结构中，以3’端F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，F2与F2c结合，启动新一轮链置换反应，使F1区段新合成的链解离，解离出的单链再形成环状结构。该环状结构一方面以B1为引物进行延伸，使F2合成链解离，解离链进而形成哑铃状结构，重复上述过程；另一方面，BIP引物上的B2与环上的B2c结合，启动新一轮扩增，再经过链解离、环状结构形成、环状结构自身扩增、单链置换等过程，最后形成大小不一的茎环结构、多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，使得琼脂糖凝胶电泳条带呈现梯形。

在检测番茄斑萎病毒方面，方法主要包括生物学检测、电子显微镜检测、血清学检测以及分子生物学检测。生物学检测依靠寄主植物上的典型症状来判断，该方法直观便捷，但对其他具有类似症状的病毒较难分辨。电镜检测可以直接观察病毒的形态结构变化，但该方法对于病毒分分类和归属较难判定。血清学检测是将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法，目前该方法广泛被用于植物病毒检测，1977年，Clark和Adams采用TAS-ELISA的方法检测出TSWV，INSV和WSMOV。分子生物学检测主要包括常规PCR、免疫捕捉RT-PCR和qRT-PCR。分子生物学检测灵敏度较高。Roberts等应用qRT-PCR技术从植物叶片总RNA中检测到TSWV，灵敏度可达500fg，不同方法在使用成本、操作难易和灵敏度方面均存在差异。赵巍巍等比较了番茄斑萎病毒qRT-PCR、常规PCR、DAS-ELISA、快速检测试纸条等检测方法，快速检测试纸条是一种简便快捷的胶体金免疫层析技术，适合基层推广使用，该方法由于检测灵敏度和定量水平低的缺点，只适合在病毒浓度较高的情况下才能检测出来；DAS-ELISA技术目前是我国进出口检验检疫检测病毒的主要方法，也是病毒诊断与检测的一种常规手段，该方法具有方法简便，成本低，能批量检测等优点，但是检测时间较长且存在非特异性颜色反应干扰，容易出现假阳性高特异性和高灵敏度等需要；常规PCR和qRT-PCR比快速检测试纸条和DAS-ELISA特异性和灵敏度更高，但常规PCR不能准确定量，也易出现交叉污染，产生假阳性；qRT-PCR检测灵敏度远高于常规PCR，为常规PCR的近125倍，qRT-PCR灵敏度和准确度高，但是由于该技术对核酸要求高，仪器设备昂贵等影响其广泛应用。

发明人设想采用RT-LAMP方法检测番茄斑萎病毒，其灵敏度应该会远远高于常规PCR、DAS-ELISA、快速检测试纸条等检测方法，而且与qRT-PCR相比不需要特殊仪器且检测时间短。Aichi Prefecture等根据日本TSWV核酸序列(GenBank:AB010996)设计了一组LAMP引物用于菊科植物TSWV病毒的检测。但是，发明人验证了目前已知的检测TSWV的LAMP引物和方法，发现无法与国内毒源获得特异性检测结果。采用RT-LAMP方法检测番茄斑萎病毒，需要开发出特异引物和方法。

发明内容

根据上述领域的需求和空白，本发明提供用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法，能够高效、快速、特异、灵敏地检测待测样品中是否存在番茄斑萎病毒，操作简单，适用于多种检测环境。本发明请求保护的技术方案如下：

用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒，其特征在于：包括独立包装或混装在一起的特异引物，所述特异引物的核苷酸序列如下：

F3：5’-TCTGTTTTTTAACCCCGAAC-3’；

B3：5’-CAAAGAAGTATGACACCAGG-3’；

FIP：5’-AGCTCCAGCAATCCTAATGCTAAGTTAAGAGTTTCACTGTAATGTTCC-3’；

BIP：5’-GCATACTCTTTCCCTTTCTTCACCCCTTAGGAAAAGTTTGCACTG-3’；

LOOP-F：5’-CTTCATTCATTTCAATGC-3’；

LOOP-R：5’-AGTTCTATGAA-3’。

番茄斑萎病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA；

(2)采用权利要求1所述的试剂盒中的特异引物，以步骤(1)获得的样品RNA为模板进行RT-LAMP反应，得到扩增产物；

(3)采用以下至少一种方法检测步骤(2)得到的扩增产物：

琼脂糖凝胶电泳检测：出现预期带型的样品的为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病毒；所述预期带型指梯状条带，主条带大小为213bp；

目测浑浊度：出现浑浊的反应管为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病毒；

在反应管中添加染料：目测出现染色信号的样品为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病毒。

所述RT-LAMP反应的体系为：10mM dNTP Mix 3.5μl，100mM MgSO4 1.5μl，10×ThermoPol Buffer 2.5μl，8000U/ml Bst DNA聚合酶1μl，10U/μl AMV反转录酶1μl，20μmFIP 2μl，20μm BIP 2μl，5μm F3 1μl，5μm B3 1μl，10μm LOOP-F 1μl，10μm LOOP-R 1μl，样品RNA5μl，ddH2O 2.5μl，共25μl。

所述RT-LAMP反应的条件为：63℃反应40min，80℃灭活10min。

所述染料为溴化乙淀或SYBR Green。

所述待测样品为TSWV寄主植物或传播载体西花蓟马。

权利要求2～6任一所述的方法在番茄斑萎病毒检测中的应用。

本发明提供用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒，包含独立包装或混装在一起的一组特异引物FIP、BIP、F3、B3、LOOP-F及LOOP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～NO.6所示。所述引物结合番茄斑萎病毒S基因中的保守序列，特异性强，如图3所示，本发明提供的特异引物与其它病毒基因或植物基因组无交叉反应，能够准确检测待测样品中是否含有番茄斑萎病毒。

本发明还提供番茄斑萎病毒的RT-LAMP检测方法，该方法采用所述特异引物，以待测样品的RNA为模板进行RT-LAMP反应，能够快速准确地检测样品中是否含有番茄斑萎病毒。本发明提供的检测方法具有下述优点：(1)无需特殊仪器：只要有水浴锅或是金属浴即可实现操作，适用于多种检测环境，既可以将样品带回实验室检测，也可以在野外直接检测，十分方便；(2)检测时间短：只需40分钟即可判断待测样品中是否含有番茄斑萎病毒；(3)灵敏度高：能够检测低至7.148×10^-5μg/μl RNA模板浓度的样本；(4)容易读取结果：扩增完成后，只需加入EB或是SYBR Green等即可目测实验结果，判断待测样品中是否含有番茄斑萎病毒。如需进一步确认，只需对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若扩增产物大小为213bp，则待测样品中含有番茄斑萎病毒，反之亦然。

番茄斑萎病毒引起的感染症状与很多其它病毒引起的症状非常相似，如西瓜花叶病毒WMV，烟草花叶病毒TMV，番茄黄化曲叶病毒TYLCV，瓜类退绿黄化病毒病CCYV等，但其危害和传播速度远远超过其它病毒。在野外考察或大田管理时，很难分辨属于哪种病毒感染。采用本发明提供的检测方法，无需将大量样品带回实验室，即可快速判断待测样品是否感染番茄斑萎病毒，从而迅速采取防疫措施，控制该病毒的传播，将其危害降至最低。既减小了经济损失，又节约了时间及成本。

附图说明

图1.RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的扩增曲线图，

其中，1-7为5倍梯度稀释的RNA：处理1为1.1169μg/μl；处理2为0.2234μg/μl；处理3为0.0.0447μg/μl；处理4为0.0089μg/μl；处理5为0.0018μg/μl；处理6为0.00044μg/μl；处理7为7.148×10^-5μg/μl；CK为空白对照ddH₂O。

图2.番茄斑萎病毒RT-LAMP法检测结果，

其中，图2A为8个样品经RT-LAMP法扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；图2B为扩增后8个样品的目测浑浊度；图2C为添加EB染料后自然光下的显色图；图2D为添加EB染料后在紫外灯下的显色图；图2.E为添加SYBR Green染料后利用Molecular Imager ChemiDoc凝胶成像系统拍摄的照片；1-7为5倍梯度稀释的RNA：处理1为1.1169μg/μl；处理2为0.2234μg/μl；处理3为0.0.0447μg/μl；处理4为0.0089μg/μl；处理5为0.0018μg/μl；处理6为0.00044μg/μl；处理7为7.148×10^-5μg/μl；CK为空白对照ddH₂O。

图3.RT-LAMP引物的特异性验证，

其中，图3A的泳道1为TSWV感染的辣椒、2为TSWV感染的曼陀罗、3为TYLCV感染的番茄、4为TMV感染的辣椒、5为TMV感染的南瓜、6为CMV感染的辣椒、7为CMV感染的番茄、8为无模板阴性对照。

图3B的泳道1为本发明中的F3、B3引物与带毒曼陀罗cDNA模板的PCR反应产物；泳道2为Aichi Prefecture等报道的F3、B3引物与带毒曼陀罗cDNA模板的PCR反应产物。

图4.利用RT-LAMP法检测单头西花蓟马中的TSWV，

其中，图4A为扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，1～7为单头西花蓟马样品，CK为阴性对照；图4B为扩增产物添加SYBR Green染料后自然光下的显色图，1～7为单头西花蓟马样品，CK为阴性对照。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行详细解释，需要说明的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不能理解为对本发明的任何限制。

病毒株系：番茄斑萎病毒(TSWV-YN)，由浙江省农科院植物保护与微生物研究所张治军副研究员提供，采用人工摩擦的方法接种于曼陀罗(Datura stramonium)上活体保存病毒。

番茄黄化曲叶病毒TYLCV、烟草花叶病毒TMV以及黄瓜花叶病毒CMV，来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所植病组。

上述病毒株系本实验室亦有保存，申请人声明自申请日起二十年内，可向公众发放用于必要的验证试验。

植物材料：感染TSWV的辣椒及曼陀罗来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组，感染TMV的辣椒及南瓜、感染CMV的辣椒及番茄、感染TYLCV的番茄，来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所植病组。

主要仪器与试剂：

LAMP快速检测基因扩增系统，荣研生物科技(中国)有限公司；

Molecular Imager ChemiDoc凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；

Trizol总RNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；

植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；

TaKaRa PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒，琼脂糖，dNTP Mix(10mM)，MgSO4(100Mm)，宝生物工程(大连)有限公司；

2×ES Taq Master Mix，北京康为世纪生物科技有限公司；

Bst DNA聚合酶，纽英伦生物技术(北京)有限公司；

AMV反转录酶，美国Promega公司。

本发明未特别说明的实验试剂，均为本领域常规试剂，可以通过本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、TSWV RT-LAMP特异引物的获得

1、引物设计与合成

参考GenBank中登录的TSWV的S基因序列(GenBank：JF960237)，应用生物学软件进行比对，选取保守序列，利用软件PrimerExpoer V4设计RT-LAMP检测引物，获得了5000多组引物序列，从中筛选出50多组引物序列，由上海生工生物技术有限公司合成后进行PCR反应，进一步筛选特异引物，对PCR条件和体系进行反复调试，最终选到一组特异性良好的引物，其核苷酸序列如下：

F3：5’-TCTGTTTTTTAACCCCGAAC-3’,

B3：5’-CAAAGAAGTATGACACCAGG-3’,

FIP：5’-AGCTCCAGCAATCCTAATGCTAAGTTAAGAGTTTCACTGTAATGTTCC-3’，

BIP：5’-GCATACTCTTTCCCTTTCTTCACCCCTTAGGAAAAGTTTGCACTG-3’，

LOOP-F：5’-CTTCATTCATTTCAATGC-3’，

LOOP-R：5’-AGTTCTATGAA-3’。

2、引物的特异性验证

选择与TSWV病症相似的番茄黄化曲叶病毒TYLCV、烟草花叶病毒TMV以及黄瓜花叶病毒CMV为对照，检验TSWV引物特异性。

(1)参照植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书，提取感染TYLCV的番茄的基因组DNA，用于引物特异性检测。

(2)按照下述植物总RNA提取方法，提取TSWV感染的辣椒及曼陀罗、TMV感染的辣椒及南瓜、CMV感染的辣椒及番茄的植物总RNA：

将约0.1克植物样品在液氮中研磨成粉末，转移至1.5ml RNase-free离心管中，加入1mlTrizol试剂，涡旋震动混匀，室温静置5min，12000rpm，4℃离心5min，吸取350μl上清液至新的RNase-free离心管中，加入350μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min，将上层水相(400μl)移至新离心管，加入400μl异丙醇，轻柔混匀，冰上静置5-10min，12000rpm，4℃离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底，加入1ml 75％乙醇，轻轻振荡离心管，8000rpm，4℃离心5min，尽量除去上清，室温放置10-15min，晾干，用30-40μl RNase-free ddH₂O溶解RNA，存放于-80℃冰箱备用。

然后参照TaKaRa PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书，将获得的植物总RNA反转录成cDNA，用于引物特异性检验。

(3)普通PCR检验RT-LAMP引物的特异性：

PCR反应体系为20μL：模板2μL、F3 0.5μL、B3 0.5μL、2×ES Taq MasterMix 10μL、ddH₂O7μL。

PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃终延伸5min。

扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

实验结果表明，除TSWV感染的辣椒及曼陀罗(图3A，泳道1、2)有目的条带(213bp)外，其他泳道(图3A，泳道3为感染TYLCV番茄，泳道4、5为感染TMV的辣椒及南瓜，泳道6、7为感染CMV的辣椒及番茄，泳道8为无模板阴性对照)都没有扩增条带出现，说明该TSWVRT-LAMP引物特异性强，与其它病毒基因组无交叉反应。图3B中，泳道1为本发明中的F3、B3引物与带毒曼陀罗cDNA模板的扩增产物；泳道2为Aichi Prefecture等设计的F3、B3引物与带毒曼陀罗cDNA模板的扩增产物，由图可知，文献报道的LAMP引物不能与本实验中的TSWV病毒模板产生特异性条带，而本发明中的引物可以。

实施例2、RT-LAMP法检测TSWV的灵敏度验证

为检测该方法的灵敏性，将实施例1提取的TSWV感染的辣椒的总RNA模板5倍稀释，共7个梯度(RNA浓度：处理1为1.1169μg/μl；处理2为0.2234μg/μl；处理3为0.0.0447μg/μl；处理4为0.0089μg/μl；处理5为0.0018μg/μl；处理6为0.00044μg/μl；处理7为7.148×10^-5μg/μl)，作为模板，采用实施例1合成的特异引物，按照下列反应体系和反应条件进行RT-LAMP反应，设置无RNA模板体系(以ddH₂O代替模板RNA)作为空白对照。

RT-LAMP反应体系：dNTP Mix(10mM)3.5μl，MgSO₄(100mM)1.5μl，10×ThermoPolBuffer 2.5μl，Bst DNA聚合酶(8000U/ml)1μl，AMV反转录酶(10U/μl)1μl，FIP(20μm)2μl，BIP(20μm)2μl，F3(5μm)1μl，B3(5μm)1μl，LOOP-F(10μm)1μl，LOOP-R(10μm)1μl，样品RNA 5μl，ddH₂O 2.5μl，共25μl。

RT-LAMP反应条件：63℃反应40min，80℃灭活10min。

所得产物首先目测其浑浊程度，然后取5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物加入SYBR Green染料观察颜色反应。

结果表明，RT-LAMP法对RNA模板浓度敏感，可检测到低至7.148×10^-5μg/μl RNA模板浓度的样本。如图1所示，除空白对照外，其它7个处理均有扩增曲线出现，且随着模板浓度的降低，扩增起始时间后延。图2A为8个样品经RT-LAMP法扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，除阴性对照外，其它7个样品均出现扩增呈梯状产物，且与预期产物大小一致；图2B为扩增后8个样品的目测浑浊度，可以明显看到，添加RNA的样本比阴性对照明显浑浊；图2C为添加EB染料后自然光下的显色图，可以看到1-7号样本微微呈现荧光绿色；图2D为添加SYBR Green染料后在紫外灯下的显色图，可明显看到1-7号样本的荧光绿色，而阴性对照为橙黄色；图2E为添加SYBR Green染料后利用Molecular Imager ChemiDoc凝胶成像系统拍摄的照片，可明显看到除阴性对照外，其它7个样本的扩增产物荧光影像。

实施例3、利用RT-LAMP法检测单头西花蓟马中的TSWV

1、单头西花蓟马总RNA提取

将获毒后单头西花蓟马及未获毒单头西花蓟马置于RNase-free 1.5ml的离心管中，每管中加入合适大小的DEPC水处理过的钢珠，然后再加入250μl Trizol试剂，12,000rpm短离心1min，将1.5ml离心管置于全自动样品快速研磨仪(Tissuelyser-48)中，65Hz振荡1min，样品室温放置5min；加入50μl氯仿混合物(氯仿:异戊醇＝24:1)，涡旋震荡混匀3min后，4℃条件下，12000rpm离心10min，将上清液移至另一离心管中(125μl)，随后加入125μl预冷的异丙醇，上下轻微颠倒混匀，室温温育10min后，4℃条件下，12,000rpm离心10min；弃上清，加入70％预冷的酒精(250μl)洗涤，在4℃条件下，12,000rpm离心5min；弃酒精，在超净工作台通风干燥，最后加入8μl DEPC水溶解RNA。

2、RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒

RT-LAMP反应体系：dNTP Mix(10mM)3.5μl，MgSO₄(100mM)1.5μl，10×ThermoPolBuffer 2.5μl，Bst DNA聚合酶(8000U/ml)1μl，AMV反转录酶(10U/μl)1μl，FIP(20μm)2μl，BIP(20μm)2μl，F3(5μm)1μl，B3(5μm)1μl，LOOP-F(10μm)1μl，LOOP-R(10μm)1μl，样品RNA 5μl，ddH₂O 2.5μl，共25μl。

RT-LAMP反应条件：63℃反应40min，80℃灭活10min。

所得产物取5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物加入SYBR Green染料，观察颜色反应。

实验结果表明，RT-LAMP可检测单头西花蓟马中TSWV，如图4A所示，除阴性对照外，其它7个样品均出现呈梯状的扩增产物，且与预期产物大小一致；图4B为添加SYBR Green染料后自然光下的显色图，可以看到1-7号样本微微呈现荧光绿色。

Claims (7)

1.用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒，其特征在于：包括独立包装或混装在一起的特异引物，所述特异引物的核苷酸序列如下：

F3：5’-TCTGTTTTTTAACCCCGAAC-3’；

B3：5’-CAAAGAAGTATGACACCAGG-3’；

FIP：5’-AGCTCCAGCAATCCTAATGCTAAGTTAAGAGTTTCACTGTAATGTTCC-3’；

BIP：5’-GCATACTCTTTCCCTTTCTTCACCCCTTAGGAAAAGTTTGCACTG-3’；

LOOP-F：5’-CTTCATTCATTTCAATGC-3’；

LOOP-R：5’-AGTTCTATGAA-3’。

2.番茄斑萎病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA；

(2)采用权利要求1所述的试剂盒中的特异引物，以步骤(1)获得的样品RNA为模板进行RT-LAMP反应，得到扩增产物；

(3)采用以下至少一种方法检测步骤(2)得到的扩增产物：

琼脂糖凝胶电泳检测：出现预期带型的样品的为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病毒；所述预期带型指梯状条带，主条带大小为213bp；

目测浑浊度：出现浑浊的反应管为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病毒；

在反应管中添加染料：目测出现染色信号的样品为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病毒。

3.根据权利要求2所述的检测方法，所述RT-LAMP反应的体系为：10mM dNTP Mix 3.5μl，100mM MgSO41.5μl，10×ThermoPol Buffer 2.5μl，8000U/ml Bst DNA聚合酶1μl，10U/μlAMV反转录酶1μl，20μm FIP 2μl，20μm BIP 2μl，5μm F31μl，5μm B31μl，10μm LOOP-F1μl，10μm LOOP-R 1μl，样品RNA5μl，ddH2O 2.5μl，共25μl。

4.根据权利要求3所述的检测方法，所述RT-LAMP反应的条件为：63℃反应40min，80℃灭活10min。

5.根据权利要求2所述的检测方法，所述染料为溴化乙淀或SYBR Green。

6.根据权利要求2～5任一所述的检测方法，所述待测样品为TSWV寄主植物或传播载体西花蓟马。

7.权利要求2～6任一所述的方法在番茄斑萎病毒检测中的应用。