CN106435034A - 鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用 - Google Patents

鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106435034A
CN106435034A CN201611071803.1A CN201611071803A CN106435034A CN 106435034 A CN106435034 A CN 106435034A CN 201611071803 A CN201611071803 A CN 201611071803A CN 106435034 A CN106435034 A CN 106435034A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chpv
primer
sequence
chicken
dna molecular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611071803.1A
Other languages
English (en)
Inventor
谢芝勋
奉彬
张艳芳
黄娇玲
王盛
范晴
黄莉
谢丽基
曾婷婷
罗思思
邓显文
谢志勤
刘加波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Veterinary Research Institute
Original Assignee
Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Veterinary Research Institute filed Critical Guangxi Veterinary Research Institute
Priority to CN201611071803.1A priority Critical patent/CN106435034A/zh
Publication of CN106435034A publication Critical patent/CN106435034A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用。本发明的引物组合由引物ChPV‑F1、ChPV‑F2和ChPV‑R组成，分别如序列表1、2和3所示。本发明还保护所述引物组合在鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒中的应用、鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒中的应用。本发明建立的方法可用于快速检测ChPV的感染、监控鸡群感染ChPV后的排毒情况及临床上ChPV流行病学的监测，具有简便快速、特异性好、敏感性高等特点，本发明为ChPV的快速检测提供了新方法，对有效防制该病毒引起的疫病具有重要意义。

Description

鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及一种鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用。
背景技术
鸡细小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是引起鸡肠道疾病重要的病原体之一，可以引起以腹泻、精神抑郁、体温调节障碍、生长迟缓、增加饲料消耗等为特征的急性或慢性肠道性疾病、矮小综合症、营养不良综合症。ChPV在鸡群中普遍存在，主要侵害雏鸡，其中以商品肉鸡感染率较高、蛋鸡或种鸡次之。自2010年以来，北美、波兰、匈牙利、克罗地亚、巴西、南韩等国家相继暴发了该病，给养鸡业造成较大的经济损失，但是，在中国尚未有鸡细小病毒流行病学调查的报道。因此，建立ChPV的快速检测方法，是有效防制我国ChPV的技术保障。
目前，鉴定病毒的方法主要依靠传统的病毒分离、琼脂扩散试验和ELISA等，这些方法通常具有耗时费力且敏感性不高等弊端。巢式PCR，又称套式PCR，使用2对PCR引物进行扩增，巢式PCR的第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的优点在于，如果第一次扩增产生了错误片段，通过第二次引物的配对扩增降低错误的扩增，因此，巢式PCR的扩增非常的特异。同时，由于第一次扩增是对模板进行放大，因此巢式PCR要比常规PCR检测的敏感性要高。目前尚未有关于建立ChPV半巢式PCR检测方法的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用。
本发明提供了一种引物组合，包括引物ChPV-F1和引物ChPV-R；所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R的靶序列含有特异DNA分子甲；所述特异DNA分子甲为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列4所示的DNA分子；
(a2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。
所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R的靶序列具体可为所述特异DNA分子甲。
所述引物ChPV-F1具体为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物ChPV-R具体为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合还包括引物ChPV-F2；所述引物ChPV-F2和所述引物ChPV-R的靶序列含有特异DNA分子乙；所述特异DNA分子乙为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列5所示的DNA分子；
(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。
所述引物ChPV-F2和引物ChPV-R的靶序列具体可为所述特异DNA分子乙。
所述引物ChPV-F2具体为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(d2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
以上任一所述引物组合的用途为如下(e1)至(e4)中的任意一种：
(e1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；
(e2)制备用于鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的试剂盒；
(e3)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒；
(e4)制备用于鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的试剂盒。
本发明还保护以上任一所述引物组合的应用，为如下(e1)至(e4)中的任意一种：
(e1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；
(e2)制备用于鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的试剂盒；
(e3)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒；
(e4)制备用于鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的试剂盒。
本发明还保护含有以上任一所述所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(f1)或(f2)：
(f1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；
(f2)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒。
本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的方法，包括如下步骤(g1)一(g3)：
(g1)提取待测病毒的基因组DNA；
(g2)以步骤(g1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R进行第一轮PCR扩增；
(g3)以步骤(g2)得到的第一轮PCR产物为模板，采用所述引物ChPV-F2和所述引物ChPV-R进行第二轮PCR扩增，如果第二轮PCR扩增产物中含有176-196bp的DNA片段、待测病毒为或候选为鸡细小病毒，如果第二轮PCR扩增产物中不含有176-196bp的DNA片段、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒。
本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病毒的基因组DNA中是否含有所述特异DNA分子甲，如果所述基因组DNA中含有所述特异DNA分子甲、待测病毒为或候选为鸡细小病毒，如果所述基因组DNA中不含有所述特异DNA分子甲、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒。
本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病毒的基因组DNA中是否含有所述特异DNA分子乙，如果所述基因组DNA中含有所述特异DNA分子乙、待测病毒为或候选为鸡细小病毒，如果所述基因组DNA中不含有所述特异DNA分子乙、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒。
本发明还保护一种鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的方法，包括如下步骤(h1)一(h3)：
(h1)提取待测样本的总DNA；
(h2)以步骤(h1)提取的总DNA为模板，采用所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R进行第一轮PCR扩增；
(h3)以步骤(h2)得到的第一轮PCR产物为模板，采用所述引物ChPV-F2和所述引物ChPV-R进行第二轮PCR扩增，如果第二轮PCR扩增产物中含有176-196bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有鸡细小病毒，如果第二轮PCR扩增产物中不含有176-196bp的DNA片段、待测样本不含有或疑似不含有鸡细小病毒。
本发明还保护一种鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否含有所述特异DNA分子甲，如果所述总DNA中含有所述特异DNA分子甲、待测样本含有或疑似含有鸡细小病毒，如果所述总DNA中不含有所述特异DNA分子甲、待测样本不含有或疑似不含有鸡细小病毒。
本发明还保护一种鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的方法，包括如下步骤:检测待测样本的总DNA中是否含有所述特异DNA分子乙，如果所述总DNA中含有所述特异DNA分子乙、待测样本含有或疑似含有鸡细小病毒，如果所述总DNA中不含有所述特异DNA分子乙、待测样本不含有或疑似不含有鸡细小病毒。
以上任一所述176-196bp的DNA片段具体为186bp的DNA片段。
所述DNA片段具体可为如下(i1)或(i2)：
(i1)序列表的序列5所示的DNA分子；
(i2)与序列表的序列5具有97％以上同源性的DNA分子。
以上任一所述待测病毒具体可为鸡细小病毒、鸡新城疫病毒、马立克病毒、H9亚型禽流感病毒、传染性支气管炎病毒或传染性喉气管炎病毒。
以上任一所述待测样本具体可为鸡病料，例如鸡喉头拭子、鸡泄殖腔拭子、生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品等。
以上任一所述方法中，所述第一轮PCR扩增的退火温度具体为56.6℃。
以上任一所述方法中，所述第二轮PCR扩增的退火温度具体为54.3℃。
以上任一所述第一轮PCR扩增的反应体系中，ChPV-F1和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。
以上任一所述第二轮PCR扩增的反应体系中，ChPV-F2和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。
以上任一所述第一轮PCR扩增的反应体系(25μL)具体可为：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(5.62fg-5.62ng)，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。
以上任一所述第二轮PCR扩增的反应体系(25μL)具体可为：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(5.62fg-5.62ng)，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。
以上任一所述第一轮PCR的反应程序具体可为：95℃预变性3min；94℃变性15s，56.6℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
以上任一所述第二轮PCR的反应程序具体可为：95℃预变性3min；94℃变性15s，54.3℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
本发明设计合成用于检测ChPV的3条特异性引物，能成功扩增出特异性目的片段，且优化后的ChPV半巢式PCR能够确保一定温度范围内扩增效率的相对平衡。特异性试验和敏感性试验表明，该ChPV半巢式PCR能够成功扩增出186bp的ChPV特异性片段，相反，对AIVH9、NDV、MDV、IBV、AILTV等5种病原体不敏感，具有良好的特异性；该ChPV半巢式PCR能检出5.62fg的ChPV核酸模板，敏感性较高，能够在临床上满足ChPV感染检测的要求。
本发明建立的方法可用于快速检测ChPV的感染、监控鸡群感染ChPV后的排毒情况及临床上ChPV流行病学的监测，具有简便快速、特异性好、敏感性高等特点，本发明为ChPV的快速检测提供了新方法，对有效防制该病毒引起的疫病具有重要意义。
附图说明
图1为实施例2中半巢式PCR反应优化对应的电泳图。
图2为实施例3中特异性检测对应的电泳图。
图3为实施例4中敏感性检测对应的电泳图。
图4为实施例5中临床样品检测对应的电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
鸡细小病毒(chicken parvovirus，缩写为ChPV)：参考文献：Day J M，ZsakL.Determination and analysis of the full-length chicken parvovirus genome.[J].Virology，2010，399(1)：59-64.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
鸡新城疫病毒(NDV)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫病毒半巢式荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008，19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
马立克病毒(MDV)：参考文献：邓显文，谢芝勋，谢志勤，等.鸡传染性贫血病毒病LAMP快速可视化检测方法的建立[J].家畜生态学报，2011，32(6)：57-60.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H9亚型禽流感病毒(AIV H9)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫病毒半巢式荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008，19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
传染性支气管炎病毒(IBV)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫病毒半巢式荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008，19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
传染性喉气管炎病毒(ILTV)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫病毒半巢式荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008，19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
2×PCR Mix：宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1、引物设计
进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定鸡细小病毒的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定鸡细小病毒的一套引物组合。
用于鉴定鸡细小病毒的特异性引物对由如下三条引物组成(5’→3’)：
ChPV-F1(序列表的序列1)：ATAACGATATCACTCAAGTTTCCAA；
ChPV-F2(序列表的序列2)：GCTGCAATCAGAGCAAGATG；
ChPV-R(序列表的序列3)：GGGTTGGTTAAATGGCAAAG。
实施例2、半巢式PCR反应条件优化
1、提取鸡细小病毒的基因组DNA。
2、取步骤1得到的基因组DNA作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行半巢式PCR。
(1)以步骤1得到的基因组DNA作为模板，采用引物ChPV-F1和引物ChPV-R进行第一轮PCR扩增：
第一轮PCR的反应体系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(DNA含量为5.62ng)，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。第一轮PCR反应体系中，ChPV-F1和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。
第一轮PCR的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
分别设置如下退火温度：
退火温度I：52.0℃；
退火温度II：52.8℃；
退火温度III：54.3℃；
退火温度IV：56.6℃；
退火温度V：59.3℃；
退火温度VI：61.6℃；
退火温度VII：63.1℃；
退火温度VIII：64.0℃。
将第一轮PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
根据实验结果，确定第一轮PCR的最佳退火温度为56.6℃。
(2)将步骤(1)退火温度为56.6℃的第一轮PCR扩增产物用ddH2O稀释100倍。
(3)以步骤(2)的稀释液作为模板，采用引物ChPV-F2和引物ChPV-R进行第二轮PCR扩增：
第二轮PCR的反应体系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。第二轮PCR反应体系中，ChPV-F2和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。
第二轮PCR的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
分别设置如下退火温度：
退火温度I：52.0℃；
退火温度II：52.8℃；
退火温度III：54.3℃；
退火温度IV：56.6℃；
退火温度V：59.3℃；
退火温度VI：61.6℃；
退火温度VII：63.1℃；
退火温度VIII：64.0℃。
将半巢式PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
第二轮PCR扩增结果见图1。图1中，泳道1-8依次对应退火温度I-VIII时得到的PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker。根据实验结果，确定第二轮PCR最佳退火温度为54.3℃。
根据以上结果，确定半巢式PCR的最佳反应程序为：
第一轮：95℃预变性3min；94℃变性15s，56.6℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
第二轮：95℃预变性3min；94℃变性15s，54.3℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
实施例3、特异性
1、提取待测样本的基因组DNA。待测样本分别为：鸡细小病毒(ChPV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)。
2、提取待测样本的总RNA，并反转录成cDNA。待测样本分别为：鸡新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)。
3、分别将步骤1得到的各个基因组DNA样本、步骤2得到的各个eDNA样本作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行半巢式PCR。
(1)以步骤1得到的各个基因组DNA样本、步骤2得到的各个eDNA样本作为模板，采用引物ChPV-F1和引物ChPV-R进行第一轮PCR扩增：
第一轮PCR的反应体系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(DNA或cDNA的含量为5.62ng)，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。第一轮PCR反应体系中，ChPV-F1和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。设置用等体积水作为模板的阴性对照。
第一轮PCR的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，56.6℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
(2)将步骤(1)的第一轮PCR扩增产物用ddH2O稀释100倍。
(3)以步骤(2)的稀释液作为模板，采用引物ChPV-F2和引物ChPV-R进行第二轮PCR扩增：
第二轮PCR的反应体系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。第二轮PCR反应体系中，ChPV-F2和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。
第二轮PCR的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，54.3℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
将半巢式PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
结果见图2。图2中，1为ChPV基因组DNA的半巢式PCR扩增产物，2为NDV cDNA的半巢式PCR扩增产物，3为MDV基因组DNA的半巢式PCR扩增产物，4为AIV H9eDNA的半巢式PCR扩增产物，5为IBV eDNA的半巢式PCR扩增产物，6为ILTV基因组DNA的半巢式PCR扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的半巢式PCR扩增产物。结果表明，ChPV扩增出186bp的特异性条带(经测序，如序列表的序列5所示)，而NDV、MDV、AIV H9、IBV、ILTV均无特异性条带出现。
实施例4、敏感性
1、提取鸡细小病毒的基因组DNA。
2、用ddH2O 10倍梯度稀释步骤1得到的基因组DNA溶液，得到各个稀释液。
3、取步骤2得到的各个稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行半巢式PCR。
(1)以步骤2得到的各个稀释液作为模板，采用引物ChPV-F1和引物ChPV-R进行第一轮PCR扩增：
第一轮PCR的反应体系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。第一轮PCR反应体系中，ChPV-F1和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。设置用等体积水作为模板的阴性对照。
由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.62ng；
反应体系2中，鸡细小病毒DNA的初始含量为562pg；
反应体系3中，鸡细小病毒DNA的初始含量为56.2pg；
反应体系4中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.62pg；
反应体系5中，鸡细小病毒DNA的初始含量为562fg；
反应体系6中，鸡细小病毒DNA的初始含量为56.2fg；
反应体系7中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.62fg；
反应体系8中，鸡细小病毒DNA的初始含量为0.56fg。
第一轮PCR的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，56.6℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
(2)将步骤(1)的第一轮PCR扩增产物用ddH2O稀释100倍。
(3)以步骤(2)的稀释液作为模板，采用引物ChPV-F2和引物ChPV-R进行第二轮PCR扩增：
第二轮PCR的反应体系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。第二轮PCR反应体系中，ChPV-F2和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。
第二轮PCR的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，54.3℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
将半巢式PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
结果见图3。图3中，泳道1-8依次对应采用反应体系1-8时半巢式PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的半巢式PCR的扩增产物。结果表明，最低能检测到5.62fg的ChPV。
实施例5、临床样品检测
待测样本为：2014年10月-2016年11月采集的48份鸡病料(鸡喉头、泄殖腔双棉拭子)。
1、提取待测样本的总DNA。
2、将步骤1得到的总DNA作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行半巢式PCR。
(1)以步骤1得到的总DNA作为模板，采用引物ChPV-F1和引物ChPV-R进行第一轮PCR扩增：
第一轮PCR的反应体系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(DNA的含量为5.62ng)，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。第一轮PCR反应体系中，ChPV-F1和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。
第一轮PCR的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，56.6℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
(2)将步骤(1)的第一轮PCR扩增产物用ddH2O稀释100倍。
(3)以步骤(2)的稀释液作为模板，采用引物ChPV-F2和引物ChPV-R进行第二轮PCR扩增：
第二轮PCR的反应体系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。第二轮PCR反应体系中，ChPV-F2和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。
第二轮PCR的反应程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，54.3℃退火30s，共进行30个循环，68℃延伸10min。
部分检测结果见图4。图4中，M对应100bp DNA Marker，泳道1-24依次对应48份鸡病料中24份的检测结果(泳道1、7、9、16、17和19显示ChPV阳性结果)。48份鸡病料中共检出8份ChPV阳性病料。五次重复检测，结果一致。将显示ChPV阳性结果的泳道中的特异条带回收并测序，其测序结果与序列5的同源性高达97％。
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用
<130> GNCYXMN162087
<160> 5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ataacgatat cactcaagtt tccaa 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gctgcaatca gagcaagatg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gggttggtta aatggcaaag 20
<210> 4
<211> 239
<212> DNA
<213> 鸡细小病毒
<400> 4
ataacgatat cactcaagtt tccaacagga atgccatctc aacagttcat gcagctgcaa 60
ttagagcaag atgcctaaaa ttcacgttta acaattggct aacttcaaat tggggattga 120
taacagttaa tcaaatgtac caatttttat gctggggaga actggacggc attccgacag 180
tggatagtct cctaagagat catcccgaat ttaacgggac tttgccctat aatcaaccc 239
<210> 5
<211> 186
<212> DNA
<213> 鸡细小病毒
<400> 5
gctgcaatta gagcaagatg cctaaaattc acgtttaaca attggctaac ttcaaattgg 60
ggattgataa cagttaatca aatgtaccaa tttttatgct ggggagaact ggacggcatt 120
ccgacagtgg atagtctcct aagagatcat cccgaattta acgggacttt gccctataat 180
caaccc 186

Claims (10)

1.引物组合，包括引物ChPV-F1和引物ChPV-R；所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R的靶序列含有特异DNA分子甲；所述特异DNA分子甲为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列4所示的DNA分子；
(a2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R的靶序列为所述特异DNA分子甲。
3.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于：
所述引物ChPV-F1为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物ChPV-R为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
4.如权利要求1-3任一所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合还包括引物ChPV-F2；所述引物ChPV-F2和所述引物ChPV-R的靶序列含有特异DNA分子乙；所述特异DNA分子乙为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列5所示的DNA分子；
(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。
5.如权利要求4所述的引物组合，其特征在于：所述引物ChPV-F2和引物ChPV-R的靶序列为所述特异DNA分子乙。
6.如权利要求4或5所述的引物组合，其特征在于：
所述引物ChPV-F2为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(d2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
7.权利要求1-6任一所述引物组合的应用，为如下(e1)至(e4)中的任意一种：
(e1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；
(e2)制备用于鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的试剂盒；
(e3)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒；
(e4)制备用于鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的试剂盒。
8.含有权利要求1-6任一所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(f1)或(f2)：
(f1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；
(f2)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒。
9.一种鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的方法，为方法A或方法B或方法C；
所述方法A包括如下步骤(g1)-(g3)：
(g1)提取待测病毒的基因组DNA；
(g2)以步骤(g1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求3中所述的引物ChPV-F1和引物ChPV-R进行第一轮PCR扩增；
(g3)以步骤(g2)得到的第一轮PCR产物为模板，采用权利要求6中所述的引物ChPV-F2和权利要求3中所述的引物ChPV-R进行第二轮PCR扩增，如果第二轮PCR扩增产物中含有176-196bp的DNA片段、待测病毒为或候选为鸡细小病毒，如果第二轮PCR扩增产物中不含有176-196bp的DNA片段、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒；
所述方法B包括如下步骤：检测待测病毒的基因组DNA中是否含有权利要求1中所述的特异DNA分子甲，如果所述基因组DNA中含有所述特异DNA分子甲、待测病毒为或候选为鸡细小病毒，如果所述基因组DNA中不含有所述特异DNA分子甲、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒；
所述方法C包括如下步骤：检测待测病毒的基因组DNA中是否含有权利要求4中所述的特异DNA分子乙，如果所述基因组DNA中含有所述特异DNA分子乙、待测病毒为或候选为鸡细小病毒，如果所述基因组DNA中不含有所述特异DNA分子乙、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒。
10.一种鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的方法，为方法D或方法E或方法F；
所述方法D包括如下步骤(h1)-(h3)：
(h1)提取待测样本的总DNA；
(h2)以步骤(h1)提取的总DNA为模板，采用权利要求3中所述的引物ChPV-F1和引物ChPV-R进行第一轮PCR扩增；
(h3)以步骤(h2)得到的第一轮PCR产物为模板，采用权利要求6中所述的引物ChPV-F2和权利要求3中所述的引物ChPV-R进行第二轮PCR扩增，如果第二轮PCR扩增产物中含有176-196bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有鸡细小病毒，如果第二轮PCR扩增产物中不含有176-196bp的DNA片段、待测样本不含有或疑似不含有鸡细小病毒；
所述方法E包括如下步骤：检测待测待测样本的总DNA中是否含有权利要求1中所述的特异DNA分子甲，如果所述总DNA中含有所述特异DNA分子甲、待测样本含有或疑似含有鸡细小病毒，如果所述总DNA中不含有所述特异DNA分子甲、待测样本不含有或疑似不含有鸡细小病毒；
所述方法F包括如下步骤：检测待测待测样本的总DNA中是否含有权利要求4中所述的特异DNA分子乙，如果所述总DNA中含有所述特异DNA分子乙、待测样本含有或疑似含有鸡细小病毒，如果所述总DNA中不含有所述特异DNA分子乙、待测样本不含有或疑似不含有鸡细小病毒。
CN201611071803.1A 2016-11-28 2016-11-28 鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用 Pending CN106435034A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611071803.1A CN106435034A (zh) 2016-11-28 2016-11-28 鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611071803.1A CN106435034A (zh) 2016-11-28 2016-11-28 鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106435034A true CN106435034A (zh) 2017-02-22

Family

ID=58219080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611071803.1A Pending CN106435034A (zh) 2016-11-28 2016-11-28 鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106435034A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241263A (zh) * 2019-07-02 2019-09-17 广西壮族自治区兽医研究所 鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组及其应用
CN110592281A (zh) * 2019-09-26 2019-12-20 广西壮族自治区兽医研究所 鉴定鸡细小病毒和鸡传染性贫血病毒的引物组及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102002537A (zh) * 2010-11-26 2011-04-06 烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种辅助鉴定藜草花叶病毒的试剂及其应用
CN105567877A (zh) * 2016-03-09 2016-05-11 广西壮族自治区兽医研究所 一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组合及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102002537A (zh) * 2010-11-26 2011-04-06 烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种辅助鉴定藜草花叶病毒的试剂及其应用
CN105567877A (zh) * 2016-03-09 2016-05-11 广西壮族自治区兽医研究所 一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组合及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOMANSKA BLICHARZ.K等: "JQ178302.1", 《NCBI GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241263A (zh) * 2019-07-02 2019-09-17 广西壮族自治区兽医研究所 鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组及其应用
CN110592281A (zh) * 2019-09-26 2019-12-20 广西壮族自治区兽医研究所 鉴定鸡细小病毒和鸡传染性贫血病毒的引物组及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105567877B (zh) 一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组合及其应用
Fuller et al. Development of an L gene real-time reverse-transcription PCR assay for the detection of avian paramyxovirus type 1 RNA in clinical samples
Tang et al. Whole genome alignment based one-step real-time RT-PCR for universal detection of avian orthoreoviruses of chicken, pheasant and turkey origins
Niczyporuk et al. Application of cross-priming amplification (CPA) for detection of fowl adenovirus (FAdV) strains
CN110241263A (zh) 鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组及其应用
CN106282417B (zh) 一种快速区分cav、mdv、rev、ibdv的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法
CN108251558A (zh) 用于鸡星状病毒检测的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用
CN106435034A (zh) 鉴定鸡细小病毒的特异引物组合及其应用
Wang et al. Establishment and application of a quadruple real-time RT-PCR for detecting avian metapneumovirus
CN108411041B (zh) 一种检测新型鸡呼肠孤病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒及应用
CN110373496A (zh) 用于i亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法
Steyer et al. A diagnostic method based on MGB probes for rapid detection and simultaneous differentiation between virulent and vaccine strains of avian paramyxovirus type 1
Woźniakowski et al. The development and evaluation of cross‐priming amplification for the detection of avian reovirus
CN108707695A (zh) 一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN108998575B (zh) 鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立
CN106191318A (zh) 一种鉴定鸡细小病毒的引物对及其应用
Majo et al. Molecular characterization of Spanish infectious bursal disease virus field isolates
CN107904326B (zh) 用于rt-pcr快速分型检测禽偏肺病毒亚型的核酸及应用
CN103667538B (zh) 检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片及试剂盒与方法
CN106868198B (zh) 一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重pcr引物组及监测方法
CN110305986A (zh) Sva、o型fmdv和a型fmdv的一步法三重实时荧光定量pcr检测引物和探针
CN104946796A (zh) 用于rt-lamp法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法
Homayounimehr et al. Detection and identification of infectious bronchitis virus by RT-PCR in Iran
CN108866245B (zh) 鸡细小病毒、禽流感病毒和鸡新城疫病毒三重pcr检测方法的建立
Chousalkar et al. Detection of infectious bronchitis virus strain N1/88 from the oviduct and feces of experimentally infected vaccinated and unvaccinated hens

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170222

RJ01 Rejection of invention patent application after publication