CN110241263A - 鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组，包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物ChPV‑F和ChPV‑R组成，引物对Ⅱ由引物ANV‑F和ANV‑R组成；引物ChPV‑F、ChPV‑R、ANV‑F和ANV‑R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。据此，发明人还建立了相应检测鉴定方法并研制了对应试剂盒。本发明建立的二重PCR可用于快速检测鸡细小病毒和禽肾炎病毒的混合感染，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。

Description

鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组及其应用
技术领域
本发明属于鸡细小病毒和禽肾炎病毒检测技术领域，尤其涉及鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组及其应用。
背景技术
鸡细小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是一种单链DNA病毒，是引起鸡肠道疾病的主要病原体之一，可以引起以腹泻、精神抑郁、体温调节障碍、生长迟缓、增加饲料消耗等为特征的急性或慢性肠道性疾病、矮小综合症、营养不良综合症。ChPV在鸡群中普遍存在，主要侵害雏鸡，但以商品肉鸡感染率较高、蛋鸡或种鸡次之，给养鸡业造成巨大的经济损失。禽肾炎病毒(Avian Nephritis Virus，ANV)属肠道病毒，主要侵害幼龄雏鸡，但各龄期的鸡都有易感性。ANV能在鸡群中迅速传播，引起易感鸡的一种以典型的亚临诊症状，临床表现为肠炎、肾炎及肾功能衰竭等。ANV虽致病力不强，但感染性很强，广泛见于世界各地，并与鸡矮小综合征有关。ANV与其它病原菌或病毒的混合感染情形非常复杂，常可引起二重或多重感染。由于ChPV与ANV均为危害养鸡业的传染病，均能引起雏鸡肠道性疾病、矮小综合症以及营养吸收障碍综合征等疾病，特别是有混合感染时，缺乏快速鉴别诊断两种病毒的方法。
目前，实验室诊断检测上述两种病原的方法以传统的病毒分离、琼脂扩散试验、间接荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等为主，但这些检测方法存在耗时长、敏感性低、标准化难等缺点，在实际应用中具有一定的局限性，因此越来越多的学者致力于PCR检测方法。
在临床检测中，常出现多种病原体混合感染，为了用于多种病原的鉴别诊断，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的检测方法进行批量快速检测。二重(或多重)PCR采用多对引物同时扩增多个模板，克服了常规PCR的不足。但是，二重(或多重)PCR是在同一体系中存在多种模板和引物，复合扩增中引物之间、模板之间、引物与模板之间可能存在竞争抑制。因此有必要对各种条件进行优化，需要防止引物与模板间的非特异性结合，避免出现非特性条带，同时要尽量避免产生引物二聚体。此外，目的片段要有合适的梯度，各引物退火条件尽可能一致，以确保两种(或多种)扩增产物量的相对平衡。
与常规PCR相比，多重PCR具有可同时检测、鉴别多种病原体的特点，在多种病原混合感染的鉴别诊断中具有独特的优势和很高的临床实用价值，但目前尚无可快速鉴别诊断ChPV与ANV的多重PCR检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供高通量、低成本、高效率、低污染的鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组，包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物ChPV-F和ChPV-R组成，引物对Ⅱ由引物ANV-F和ANV-R组成；引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R的摩尔比为3:3:2:2。
上述引物组在PCR扩增中的应用，退火温度为53.8℃。
PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：
反应程序：95℃预变性5min；95℃1min，53.8℃1min，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min；
反应体系(25μL)：2×PCR Mix 12.5μL，其中ChPV-F、ChPV-R各1.2μL，ANV-F、ANV-R各0.8μL，模板2.0μL，ddH2O补足至25.0μL。
引物的浓度分别为：0.6pmol/μL ChPV-F、0.6pmol/μL ChPV-R、0.40pmol/μL ANV-F、0.4pmol/μL ANV-R。
模板来自待测样本中的病毒DNA、病毒cDNA。
待测样本为鸡病料，例如鸡口腔拭子、鸡泄殖腔拭子、生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品。
上述引物组在制备鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的试剂盒中的应用。
鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的试剂盒，含有用于检测的引物组；引物组包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物ChPV-F和ChPV-R组成，引物对Ⅱ由引物ANV-F和ANV-R组成；引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R的摩尔比为3:3:2:2。
针对目前鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒存在的问题，发明人设计了鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组，包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物ChPV-F和ChPV-R组成，引物对Ⅱ由引物ANV-F和ANV-R组成；引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。据此，发明人还建立了相应检测鉴定方法并研制了对应试剂盒。本发明建立的二重PCR可用于快速检测鸡细小病毒和禽肾炎病毒的混合感染，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。
附图说明
图1是实施例2中引物浓度的优化对应结果的电泳图，图中：泳道1-9依次对应采用反应体系Ⅰ-Ⅸ时得到的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。
图2是实施例2中退火温度的优化对应结果的电泳图，图中：泳道1-8依次对应退火温度Ⅰ-Ⅷ时得到的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物
图3是实施例3中特异性检测对应结果的电泳图，图中：1为混合样本的二重PCR的扩增产物，2为ANV的cDNA的二重PCR的扩增产物，3为ChPV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，4为NDV的cDNA的二重PCR的扩增产物，5为MDV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，6为AIV H9的cDNA的二重PCR的扩增产物，7为IBV的cDNA的二重PCR的扩增产物，8为ILTV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。
图4是实施例4中敏感性检测对应结果的电泳图，图中：泳道1-8依次对应采用反应体系1-8时二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。
图5是实施例5中临床样品检测对应的电泳图，图中：P对应阳性对照的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物，泳道1-15依次对应50份鸡病料中15份的检测结果(泳道1和3泳道显示ChPV+ANV均为阳性结果；泳道6显示ChPV为阳性结果；泳道4、7、8、9显示ANV为阳性结果)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。其中，鸡细小病毒(ChPV)、禽肾炎病毒(ANV)、鸡新城疫病毒(NDV)、马立克病毒(MDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)为申请留存，公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物设计
经大量序列分析比对获得了用于鉴定鸡细小病毒的若干引物和用于鉴定禽肾炎病毒的若干引物。将各引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能后，最终得到本发明鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组。
用于鉴定鸡细小病毒的特异性引物对(简称引物对Ⅰ)由如下两条引物组成(5’→3’)：
ChPV-F(SEQ.ID.NO.1)：aacgtggatagtctcctaaa；
ChPV-R(SEQ.ID.NO.2)：cctgggacctcattctta；
用于鉴定禽肾炎病毒的特异性引物对(简称引物对Ⅱ)由如下两条引物组成(5’→3’)：
ANV-F(SEQ.ID.NO.3)：ctgtggcaggacccaagtc；
ANV-R(SEQ.ID.NO.4)：acaaaaggaagaacctgtt。
实施例2、二重PCR反应条件优化
一、模板的制备
1、提取鸡细小病毒的基因组DNA，得到样本A。
2、提取禽肾炎病毒的总RNA，并反转录成cDNA，得到样本B。
3、将样本A和样本B混合，得到混合样本。
二、引物浓度的优化
取步骤一得到的混合样本，作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，步骤一得到的混合样本2.0μL(2.0μL混合样本中，鸡细小病毒的基因组DNA的含量为1.0ng，禽肾炎病毒的cDNA的含量为1.0ng)，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。
根据引物对Ⅰ和引物对Ⅱ在反应体系中的浓度，设置9种不同的反应体系，具体如下：
反应体系Ⅰ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.1pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.9pmol/μL。
反应体系Ⅱ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.2pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.8pmol/μL。
反应体系Ⅲ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.3pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.7pmol/μL。
反应体系Ⅳ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.4pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.6pmol/μL。
反应体系Ⅴ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.5pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.5pmol/μL。
反应体系Ⅵ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.6pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.4pmol/μL。
反应体系Ⅶ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.7pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.3pmol/μL。
反应体系Ⅷ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.8pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.2pmol/μL。
反应体系Ⅸ：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.9pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.1pmol/μL。
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、53.8℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
将二重PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
设置用等体积水代替混合样本的阴性对照；阴性对照相应的反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.6pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.4pmol/μL。
结果见图1。综合考虑引物对Ⅰ和引物对Ⅱ的扩增效果，最佳引物浓度组合为：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.6pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.4pmol/μL。
三、退火温度的优化
取步骤一得到的混合样本，作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，步骤一得到的混合样本2.0μL(2.0μL混合样本中，鸡细小病毒的基因组DNA的含量为0.55ng，禽肾炎病毒的cDNA的含量为0.58ng)，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.6pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.4pmol/μL。
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、退火1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。分别设置如下退火温度：
退火温度Ⅰ：50.0℃；
退火温度Ⅱ：50.7℃；
退火温度Ⅲ：51.9℃；
退火温度Ⅳ：53.8℃；
退火温度Ⅴ：56.1℃；
退火温度Ⅵ：58.0℃；
退火温度Ⅶ：59.2℃；
退火温度Ⅷ：60.0℃。
将二重PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
设置用等体积水代替混合样本的阴性对照，其相应的退火温度为53.8℃。
结果见图2。综合考虑引物对Ⅰ和引物对Ⅱ的扩增效果，最佳退火温度为53.8℃。
综合步骤二和步骤三，得到如下结论：二重PCR反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的优选浓度均为0.6pmol/μL，ANV-F和ANV-R的优选浓度均为0.4pmol/μL；二重PCR的优选反应程序为：95℃预变性5min；95℃1min、53.8℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
实施例3、特异性
1、提取待测样本的基因组DNA。待测样本分别为：鸡细小病毒(ChPV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)。
2、提取待测样本的总RNA，并反转录成cDNA。待测样本分别为：禽肾炎病毒(ANV)、鸡新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)。
3、分别将步骤1得到的各个基因组DNA样本、步骤2得到的各个cDNA样本以及实施例2的步骤一得到的混合样本作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，模板2.0μL，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.6pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.4pmol/μL。设置用等体积水代替混合样本的阴性对照。
模板为步骤1得到的各个基因组DNA样本时，2.0μL模板中的DNA含量0.55ng；
模板为步骤2得到的各个cDNA样本时，2.0μL模板中的cDNA含量0.58ng；
模板为实施例2的步骤一得到的混合样本时，2.0μL模板中鸡细小病毒的基因组DNA的含量为0.55ng、禽肾炎病毒的cDNA的含量为0.58ng。
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、53.8℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
将二重PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
结果见图3。结果表明，ChPV扩增出242bp的特异性条带(经测序，如序列表的SEQ.ID.NO.5)，ANV扩增出511bp的特异性条带(经测序，如序列表的SEQ.ID.NO.6)，而NDV、MDV、AIV H9、IBV、ILTV均无特异性条带出现。
实施例4、敏感性
一、制备模板
1、提取鸡细小病毒的基因组DNA，得到DNA浓度为100.0ng/μL的DNA溶液。
2、提取禽肾炎病毒的总RNA，并反转录成cDNA，得到cDNA浓度为100.0ng/μL的cDNA溶液。
3、将步骤1得到的DNA溶液和步骤2得到的cDNA溶液混合。
4、用ddH2O 10倍梯度稀释步骤3得到的混合液，得到各个稀释液。
二、敏感性的检测
将步骤一得到的稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，步骤一得到的稀释液1μL，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.6pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.4pmol/μL。设置用等体积水代替混合样本的阴性对照。
由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，鸡细小病毒DNA的初始含量为55ng、禽肾炎病毒DNA的初始含量为58ng；
反应体系2中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.5ng、禽肾炎病毒DNA的初始含量为5.8ng；
反应体系3中，鸡细小病毒DNA的初始含量为0.55ng、禽肾炎病毒DNA的初始含量为0.58ng；
反应体系4中，鸡细小病毒DNA的初始含量为55pg、禽肾炎病毒DNA的初始含量为58pg；
反应体系5中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.5pg、禽肾炎病毒DNA的初始含量为5.8pg；
反应体系6中，鸡细小病毒DNA的初始含量为0.55pg、禽肾炎病毒DNA的初始含量为0.58pg；
反应体系7中，鸡细小病毒DNA的初始含量为55fg、禽肾炎病毒DNA的初始含量为58fg；
反应体系8中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.5fg、禽肾炎病毒DNA的初始含量为5.8fg；
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、53.8℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
将二重PCR的产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
结果见图4。结果表明，最低能同时检测到55fg的ChPV和58fg的ANV。
实施例5、临床样品检测
2017年10月-2018年12月采集50份鸡病料(口腔+泄殖腔双棉拭子)，按如下步骤进行鉴定：
1、取病料，提取总DNA。
2、取病料，提取总RNA并反转录得到cDNA。
3、将步骤1得到的基因组DNA(DNA含量为Xng)和步骤2得到的cDNA混合(DNA含量也为Xng)，得到混合样本。
4、将步骤3得到的混合样本作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，模板2.0μL(DNA含量为0.5-2ng)，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.6pmol/μL，ANV-F和ANV-R的浓度均为0.4pmol/μL。设置用等体积水代替混合样本的阴性对照。设置用等体积的实施例二步骤一得到的混合样本代替步骤3得到的混合样本的阳性对照。
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、53.8℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
将二重PCR的产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
部分检测结果见图5。统计结果显示，50份鸡病料中共检出2份ChPV和ANV均为阳性病料，检出1份ChPV阳性病料，检出5份ANV阳性病料。
三次重复检测，结果一致。
将显示ChPV和ANV阳性结果的泳道中的特异条带回收并测序，其测序结果与序列5和序列6的同源性高达98％-100％。
采用传统的病毒分离培养法鉴定上述50份样本，结果与本发明建立的方法的结果完全一致。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacgtggata gtctcctaaa 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctgggacct cattctta 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtggcagg acccaagtc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaaaaggaa gaacctgtt 19
<210> 5
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacgtggata gtctcctaaa agatcatccc gaatttaacg ggactttgcc atttaaccaa 60
cccaaaggta aattttgtgc cgattgtgtt aaccagttca gcactgcaac taacctgacc 120
gtgtgcccag cctgctccgg gtggacaaga aagcccttct ccgaagagga ggaacccccc 180
tatactggtt ctgaatccgg gctctttgaa aaagccaacg aaggtaagaa tgaggtccca 240
gg 242
<210> 6
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtggcagg acccaagtct tagaacttga ttggacacgg ttctatggca ccattccagt 60
tcagctcttc caaagaatgc gtactatgcg caaattcttc cttactaggc gttcaagaaa 120
gaggtatgga aagttacttg attggtataa tgcccagtta actgatagga ttactctctt 180
accaacaggg gaggtcactc atgtcaagaa gggtaatcca tctggacaat tttcaacaac 240
tgttgataat aaccttgtta atgagtggtt aactgccttt gagtttgcct ttcaacacct 300
ggaaaaccat ggcacgattc caacagtcaa agactacagg gcaaatgttg actttctttg 360
ttatggagat gataggcttt tagcctacaa tccatccttt gtcaactatg accctcaaaa 420
aaccattgat atgtataaaa acatctttgg tatgtgggtc aaacctgaaa atatcaagct 480
ctttggctcg ccaacaggtt cttccttttg t 511

Claims (10)

1.鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组，其特征在于包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物ChPV-F和ChPV-R组成，引物对Ⅱ由引物ANV-F和ANV-R组成；所述引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的引物组，其特征在于：所述引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R的摩尔比为3:3:2:2。
3.权利要求1所述引物组在PCR扩增中的应用，其特征在于退火温度为53.8℃。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：反应程序：95℃预变性5min；95℃1min，53.8℃1min，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min；
反应体系：2×PCR Mix 12.5μL，其中ChPV-F、ChPV-R各1.2μL，ANV-F、ANV-R各0.8μL，模板2.0μL，ddH2O补足至25.0μL。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述引物的浓度分别为：0.6pmol/μL ChPV-F、0.6pmol/μL ChPV-R、0.4pmol/μL ANV-F、0.4pmol/μL ANV-R。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述模板来自待测样本中的病毒DNA、病毒cDNA。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述待测样本为鸡病料。
8.权利要求1所述引物组在制备鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的试剂盒中的应用。
9.鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的试剂盒，其特征在于含有用于检测的引物组；所述引物组包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物ChPV-F和ChPV-R组成，引物对Ⅱ由引物ANV-F和ANV-R组成；所述引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
10.根据权利要求4所述的鉴定鸡细小病毒和禽肾炎病毒的试剂盒，其特征在于：所述引物ChPV-F、ChPV-R、ANV-F和ANV-R的摩尔比为3:3:2:2。
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