CN110564896A - 鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组及其应用 - Google Patents

鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组，包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物FadV‑4F和FadV‑4R组成，引物对Ⅱ由引物CIAV‑F和CIAV‑R组成；引物FadV‑4F、FadV‑4R、CIAV‑F和CIAV‑R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。据此，发明人还建立了相应检测鉴定方法并研制了对应试剂盒。本发明建立的二重PCR可用于快速检测禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的混合感染，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。

Description

鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组及其应用
技术领域
本发明属于禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒检测技术领域，尤其涉及鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组及其应用。
背景技术
腺病毒4型(Fowl adenovirus，FadV-4)是一种无囊膜的双链DNA病毒，自2015年下半年以来，山东、江苏、河南、河北、辽宁、吉林、安徽、浙江、湖北和山西等地的鸡群相继发生一种以心包积液、肝脾肿大为特征的急性传染病，该病能引起高度传染性和高死亡率，感染3-5周龄鸡可导致突然死亡，死亡率高达80％。该病没有明显的临床症状，个别鸡在死亡前出现精神沉郁、羽毛卷曲等临床表现。病死鸡的剖检病变，主要为心包腔中蓄积有大量的淡黄色水样或胶状液体，心脏松弛，肝脏充血、肿大。该病呈急性经过，死亡率高，给禽业生产带来了巨大的经济损失。
鸡传染性贫血病由鸡传染性贫血病病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)引起的一种传染病，可引起雏鸡全身淋巴组织萎缩，尤其是骨髓造血组织和胸腺等淋巴组织，进而导致雏鸡发生免疫抑制。日本学者Yuasa等1979年首次发现并报道了该病，崔现兰等1992年在我国发病鸡群中首次分离到该病毒，从而确证了该病在我国的存在，目前CIAV已在各种不同鸡群中广泛传播，甚至在某些SPF鸡群中也检测到CIAV的存在。除垂直传播和水平传播外，CIAV还可以通过污染禽弱毒疫苗来感染鸡群。因此，加强对禽弱毒疫苗中CIAV污染的监测对于种禽场防控CIAV也极其重要。
目前，实验室诊断检测上述两种病原的方法以传统的病毒分离、琼脂扩散试验、间接荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等为主，但这些检测方法存在耗时长、敏感性低、标准化难等缺点，在实际应用中具有一定的局限性，因此，越来越多的学者致力于PCR检测方法。
在临床检测中，常出现多种病原体混合感染，为了用于多种病原的鉴别诊断，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的检测方法进行批量快速检测。二重(或多重)PCR采用多对引物同时扩增多个模板，克服了常规PCR的不足。但是，二重(或多重)PCR是在同一体系中存在多种模板和引物，复合扩增中引物之间、模板之间、引物与模板之间可能存在竞争抑制。因此有必要对各种条件进行优化，需要防止引物与模板间的非特异性结合，避免出现非特性条带，同时要尽量避免产生引物二聚体。此外，目的片段要有合适的梯度，各引物退火条件尽可能一致，以确保两种(或多种)扩增产物量的相对平衡。
与常规PCR相比，多重PCR具有可同时检测、鉴别多种病原体的特点，在多种病原混合感染的鉴别诊断中具有独特的优势和很高的临床实用价值，但目前尚无可快速鉴别诊断FadV-4与CIAV的多重PCR检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供快速、高效、准确的鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组，包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物FadV-4F和FadV-4R组成，引物对Ⅱ由引物CIAV-F和CIAV-R组成；引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R的摩尔比为2:2:3:3。
上述引物组在PCR扩增中的应用，退火温度为60.0℃。
PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：
反应程序：95℃预变性5min；95℃1min，60.0℃1min，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min；
反应体系：2×PCR Mix 12.5μL，其中FadV-4F、FadV-4R各1μL，CIAV-F、CIAV-R各1μL，模板2.0μL，ddH2O补足至25.0μL；引物的浓度分别为：0.4pmol/μL FadV-4F、0.4pmol/μLFadV-4R、0.6pmol/μL CIAV-F、0.6pmol/μL CIAV-R。
模板来自待测样本中的病毒DNA、病毒cDNA，病毒具体可为禽腺病毒4型、鸡传染性贫血病毒、禽腺病毒(1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12型)、鸡细小病毒、禽肾炎病毒、马立克病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或传染性支气管炎病毒。
待测样本为鸡病料，例如鸡口腔拭子、鸡泄殖腔拭子、生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品等。
上述引物组在制备鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的试剂盒中的应用。
鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的试剂盒，含有用于检测的引物组；引物组包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物FadV-4F和FadV-4R组成，引物对Ⅱ由引物CIAV-F和CIAV-R组成；引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R分别单独包装。
引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R的摩尔比为2:2:3:3。
针对目前鉴定禽腺病毒4型(FadV-4)和鸡传染性贫血病毒(CIAV)存在的问题，发明人设计了鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组，包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物FadV-4F和FadV-4R组成，引物对Ⅱ由引物CIAV-F和CIAV-R组成；引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。据此，发明人还建立了相应检测鉴定方法并研制了对应试剂盒。本发明建立的二重PCR可用于快速检测禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的混合感染，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。
附图说明
图1是实施例2中引物浓度的优化对应的电泳图，图中：泳道1-9依次对应采用反应体系Ⅰ-Ⅸ时得到的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。
图2是实施例2中退火温度的优化对应的电泳图，图中：泳道1-8依次对应退火温度Ⅰ-Ⅷ时得到的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。
图3是实施例3中特异性检测对应的电泳图，图中：N对应阴性对照，P为混合样本的二重PCR的扩增产物，1为CIAV的DNA的二重PCR的扩增产物，2为FadV-4的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，3-13为FadV-1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12型，14为NDV的cDNA的二重PCR的扩增产物，15为MDV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，16为ANV的基因组cDNA的二重PCR的扩增产物，17为CHPV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，18为AIV H9的cDNA的二重PCR的扩增产物，19为IBV的cDNA的二重PCR的扩增产物，20为ILTV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。
图4是实施例4中敏感性检测对应的电泳图，图中：泳道1-8依次对应采用反应体系1-8时二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。
图5是实施例5中临床样品检测对应的电泳图，图中：P对应阳性对照的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物，P对应阳性对照的二重PCR的扩增产物，泳道1-16依次对应50份鸡病料中16份的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。其中，禽腺病毒1-12型、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)、禽肾炎病毒(ANV)、鸡新城疫病毒(NDV)、马立克病毒(MDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)材料为申请人留存，公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物设计
进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定禽腺病毒4型的若干引物和用于鉴定鸡传染性贫血病毒的若干引物。对各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的的引物对Ⅰ和引物对Ⅱ。
用于鉴定禽腺病毒4型的特异性引物对(简称引物对Ⅰ)由如下两条引物组成(5’→3’)：
FadV-4F(SEQ.ID.NO.1)：TTCGCCAAGTCTCAGTACAAT；
FadV-4R(SEQ.ID.NO.2)：GGAGTCGTGATACAGCAGGTT；
用于鉴定鸡传染性贫血病毒的特异性引物对(简称引物对Ⅱ)由如下两条引物组成(5’→3’)：
CIAV-F(SEQ.ID.NO.3)：CGACATCGGAGGAGACAGA；
CIAV-R(SEQ.ID.NO.4)：AGGGTCATTTGCTTAGGGT。
引物组合由引物对Ⅰ和引物对Ⅱ组成。
实施例2、二重PCR反应条件优化
一、模板的制备
1、提取禽腺病毒4型的基因组DNA，得到样本A。
2、提取鸡传染性贫血病毒的DNA，得到样本B。
3、将样本A和样本B混合，得到混合样本。
二、引物浓度的优化
取步骤一得到的混合样本，作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。
二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，步骤一得到的混合样本2.0μL(2.0μL混合样本中，禽腺病毒4型的基因组DNA的含量为1.0ng，鸡传染性贫血病毒的DNA的含量为1.0ng)，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。
根据引物对Ⅰ和引物对Ⅱ在反应体系中的浓度，设置8种不同的反应体系，具体如下：
反应体系Ⅰ：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.1pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.9pmol/μL。
反应体系Ⅱ：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.2pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.8pmol/μL。
反应体系Ⅲ：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.3pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.7pmol/μL。
反应体系Ⅳ：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.4pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.6pmol/μL。
反应体系Ⅴ：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.5pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.5pmol/μL。
反应体系Ⅵ：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.6pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.4pmol/μL。
反应体系Ⅶ：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.7pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.3pmol/μL。
反应体系Ⅷ：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.8pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.2pmol/μL。
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、60.0℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
将二重PCR的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
设置用等体积水代替混合样本的阴性对照；阴性对照相应的反应体系中，FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.4pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.6pmol/μL。
结果如图1所示，泳道1-9依次对应采用反应体系Ⅰ-Ⅸ时得到的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。综合考虑引物对Ⅰ和引物对Ⅱ的扩增效果，最佳引物浓度组合为：FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.4pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.6pmol/μL。
三、退火温度的优化
取步骤一得到的混合样本，作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。
二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，步骤一得到的混合样本2.0μL(2.0μL混合样本中，禽腺病毒4型的基因组DNA的含量为0.75ng，鸡传染性贫血病毒的DNA的含量为0.83ng)，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.4pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.6pmol/μL。
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、退火60.0℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。分别设置如下退火温度：
退火温度Ⅰ：50.0℃；
退火温度Ⅱ：50.7℃；
退火温度Ⅲ：51.9℃；
退火温度Ⅳ：53.8℃；
退火温度Ⅴ：56.1℃；
退火温度Ⅵ：58.0℃；
退火温度Ⅶ：59.2℃；
退火温度Ⅷ：60.0℃。
将二重PCR的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
设置用等体积水代替混合样本的阴性对照，其相应的退火温度为60.0℃。
结果如图2所示，泳道1-8依次对应退火温度Ⅰ-Ⅷ时得到的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。综合考虑引物对Ⅰ和引物对Ⅱ的扩增效果，最佳退火温度为60.0℃。
综合步骤二和步骤三，得到如下结论：二重PCR反应体系中FadV-4F和FadV-4R的优选浓度均为0.4pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的优选浓度均为0.6pmol/μL；二重PCR的优选反应程序为：95℃预变性5min；95℃1min、60.0℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
实施例3、特异性
1、提取待测样本的基因组DNA。待测样本分别为：禽腺病毒1-12型(FadV1-12)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)。
2、提取待测样本的总RNA，并反转录成cDNA。待测样本分别为：禽肾炎病毒(ANV)、鸡新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)。
3、分别将步骤1得到的各个基因组DNA样本、步骤2得到的各个cDNA样本以及实施例2的步骤一得到的混合样本作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。
二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，模板2.0μL，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.4pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.6pmol/μL。设置用等体积水代替混合样本的阴性对照。
模板为步骤1得到的各个基因组DNA样本时，2.0μL模板中的DNA含量0.75ng；
模板为步骤2得到的各个cDNA样本时，2.0μL模板中的cDNA含量0.83ng；
模板为实施例2的步骤一得到的混合样本时，2.0μL模板中禽腺病毒4型的基因组DNA的含量为0.75ng、鸡传染性贫血病毒的cDNA的含量为0.83ng。
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、60.0℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
将二重PCR的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
结果如图3所示，N对应阴性对照，P为混合样本的二重PCR的扩增产物，1为CIAV的DNA的二重PCR的扩增产物，2为FadV-4的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，3-13为FadV-1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12型，14为NDV的cDNA的二重PCR的扩增产物，15为MDV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，16为ANV的基因组cDNA的二重PCR的扩增产物，17为CHPV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，18为AIV H9的cDNA的二重PCR的扩增产物，19为IBV的cDNA的二重PCR的扩增产物，20为ILTV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。结果表明，FadV-4扩增出291bp的特异性条带(经测序，如序列表的SEQ.ID.NO.5所示)，CIAV扩增出473bp的特异性条带(经测序，如序列表的SEQ.ID.NO.6所示)，而FadV-1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12型，NDV、MDV、ChPV、ANV、AIV H9、IBV、ILTV均无特异性条带出现。
实施例4、敏感性
一、制备模板
1、提取禽腺病毒4型的基因组DNA，得到DNA浓度为100.0ng/μL的DNA溶液。
2、提取鸡传染性贫血病毒的基因组DNA，得到DNA浓度为100.0ng/μL的DNA溶液。
3、将步骤1得到的DNA溶液和步骤2得到的DNA溶液混合。
4、用ddH2O 10倍梯度稀释步骤3得到的混合液，得到各个稀释液。
二、敏感性的检测
将步骤一得到的稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。
二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，步骤一得到的稀释液1μL，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.4pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.6pmol/μL。设置用等体积水代替混合样本的阴性对照。
由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，禽腺病毒4型DNA的初始含量为75ng、鸡传染性贫血病毒DNA的初始含量为83ng；
反应体系2中，禽腺病毒4型DNA的初始含量为7.5ng、鸡传染性贫血病毒DNA的初始含量为8.3ng；
反应体系3中，禽腺病毒4型DNA的初始含量为0.75ng、鸡传染性贫血病毒DNA的初始含量为0.83ng；
反应体系4中，禽腺病毒4型DNA的初始含量为75pg、鸡传染性贫血病毒DNA的初始含量为83pg；
反应体系5中，禽腺病毒4型DNA的初始含量为7.5pg、鸡传染性贫血病毒DNA的初始含量为8.3pg；
反应体系6中，禽腺病毒4型DNA的初始含量为0.75pg、鸡传染性贫血病毒DNA的初始含量为0.83pg；
反应体系7中，禽腺病毒4型DNA的初始含量为75fg、鸡传染性贫血病毒DNA的初始含量为83fg；
反应体系8中，禽腺病毒4型DNA的初始含量为7.5fg、鸡传染性贫血病毒DNA的初始含量为8.3fg；
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、60.0℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
将二重PCR的产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
结果如图4所示，泳道1-8依次对应采用反应体系1-8时二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNA Marker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。结果表明，最低能同时检测到75fg的FadV-4和0.83pg的CIAV。
实施例5、临床样品检测
2018年10月-2019年6月采集50份鸡病料(口腔+泄殖腔双棉拭子)，按如下步骤进行鉴定：
1、取病料，提取总DNA。
2、将步骤1得到的基因组DNA(DNA含量为Xng)混合(DNA含量也为Xng)，得到混合样本。
3、将步骤2得到的混合样本作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。
二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCR Mix 12.5μL，模板2.0μL(DNA含量为0.5-2ng)，引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，最后用ddH2O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，FadV-4F和FadV-4R的浓度均为0.4pmol/μL，CIAV-F和CIAV-R的浓度均为0.6pmol/μL。设置用等体积水代替混合样本的阴性对照。设置用等体积的实施例二步骤1得到的混合样本代替步骤2得到的混合样本的阳性对照。
二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、60.0℃1min、72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。
将二重PCR的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳并拍照。
部分检测结果如图5所示，P对应阳性对照的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNAMarker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物，P对应阳性对照的二重PCR的扩增产物，泳道1-16依次对应50份鸡病料中16份的检测结果(泳道2显示FadV-4V+CIAV均为阳性结果；泳道4、7、11和14显示FadV-4V为阳性结果；泳道3、6、8、9、12、13和16显示CIAV为阳性结果)。统计结果，50份鸡病料中共检出1份FadV-4V和CIAV均为阳性病料，检出5份FadV-4V阳性病料，检出10份CIAV阳性病料。
三次重复检测，结果一致。
将显示FadV-4和CIAV阳性结果的泳道中的特异条带回收并测序，其测序结果与序列5和序列6的同源性高达98％-100％。
采用传统的病毒分离培养法鉴定上述50份样本，结果与本发明建立的方法的结果完全一致。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcgccaagt ctcagtacaa t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagtcgtga tacagcaggt t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgacatcgga ggagacaga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agggtcattt gcttagggt 19
<210> 5
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcgccaagt ctcagtacaa ttacgcttac ggtgcctacg tcaagcccgt cgccgccgac 60
ggttcccagt ccctcacgca gaccccctac tggatcatgg ataacacggg caccaattac 120
ctgggggcgg tagccgtcga ggactacacc aacagcctct cgtacccaga taccatagtc 180
gtgccgcctc ccgaggacta cgacgattat aacataggca ccacgcgtgc gctcaggccc 240
aactacatcg ggttcaggga taacttcatt aacctgctgt atcacgactc c 291
<210> 6
<211> 473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgacatcgga ggagacagcg gtatcgtaga cgagctttta ggaaggcctt tcacaacccc 60
cgccccggta cgtatagtgt gaggctgccg aacccccaat ctactatgac tatccgcttc 120
caaggagtca tctttctcac ggaaggactc attctgccta aaaacagcac agcggggggc 180
tatgcagacc acatgtacgg ggcgagagtc gccaagatct ctgtgaacct gaaggagttc 240
ctgctagcgt caatgaacct aacatacgtg agcaaactcg gaggccccat cgccggtgag 300
ttgattgcgg acgggtctaa atcacaagcc gcggagaact ggcctaattg ctggctgccg 360
ctagataata acatgccctc cgcgacacca tcggcatggt ggagatgggc cttaatgatg 420
atgcagccca cggactcttg ccggttcttt aatcacccta agcaaatgac cct 473

Claims (10)

1.鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组，其特征在于包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物FadV-4F和FadV-4R组成，引物对Ⅱ由引物CIAV-F和CIAV-R组成；所述引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的引物组，其特征在于：所述引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R的摩尔比为2:2:3:3。
3.权利要求1所述引物组在PCR扩增中的应用，其特征在于退火温度为60.0℃。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：反应程序：95℃预变性5min；95℃1min，60.0℃1min，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min；
反应体系：2×PCR Mix 12.5μL，其中FadV-4F、FadV-4R各1μL，CIAV-F、CIAV-R各1μL，模板2.0μL，ddH2O补足至25.0μL；所述引物的浓度分别为：0.4pmol/μL FadV-4F、0.4pmol/μLFadV-4R、0.6pmol/μL CIAV-F、0.6pmol/μL CIAV-R。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述模板来自待测样本中的病毒DNA、病毒cDNA。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述待测样本为鸡病料。
7.权利要求1所述引物组在制备鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的试剂盒中的应用。
8.鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的试剂盒，其特征在于含有用于检测的引物组；所述引物组包括引物对Ⅰ和引物对Ⅱ，引物对Ⅰ由引物FadV-4F和FadV-4R组成，引物对Ⅱ由引物CIAV-F和CIAV-R组成；所述引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
9.根据权利要求8所述的鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的试剂盒，其特征在于：所述引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R分别单独包装。
10.根据权利要求4所述的鉴定禽腺病毒4型和鸡传染性贫血病毒的试剂盒，其特征在于：所述引物FadV-4F、FadV-4R、CIAV-F和CIAV-R的摩尔比为2:2:3:3。
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