CN106282416A - 一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法 - Google Patents

一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病毒。本发明方法能够同时对鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性法氏囊病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。

Description

一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、 试剂盒及方法
技术领域
本发明属于养殖业的病毒检测领域，具体涉及一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法。
背景技术
免疫抑制是指由于免疫系统受到损害而导致家禽暂时性或永久性免疫应答功能不全以及对疾病的高度易感。近年来，免疫抑制性病毒越来越受到人们的关注。禽类病毒性免疫缺陷疾病是困扰当前养禽业的重要传染病，鸡群中存在免疫抑制性病毒的感染，会使鸡群对其它病毒或细菌不仅变得更为易感，而且使其感染的症状、病变不典型。除此之外，还会造成鸡群对某些疫苗的免疫反应下降甚至不反应，导致免疫失败。可引起免疫抑制的病毒很多，主要有鸡马立克氏病病毒（MDV，Marek's disease virus）、鸡传染性贫血病病毒（CAV，Chicken infectious anemia virus）、禽网状内皮组织增殖症病毒（REV，Reticuloendotheliosis virus）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV，Infections BursalDisease virus）和禽呼肠孤病毒（REO，Avian reovirus），等。这类免疫缺陷的大多数病毒主要通过垂直传播，还可通过水平传播，在鸡群中长期存在，难以净化，给养禽业造成了严重的经济损失。这些病毒往往共同作用，以二重感染或多重感染的方式造成鸡的免疫抑制，使疾病的诊断更加复杂。这些病毒往往共同作用，以二重感染或多重感染的方式造成鸡的免疫抑制，使疾病的诊断更加复杂。
这些免疫抑制性病毒常呈持续性亚临床感染，由于其临床症状不典型，很难做出正确的诊断，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，传统的检测方法主要包括病原分离鉴定、血清学试验和酶联免疫吸附试验等，但这些方法常受临床病材料新鲜度、污染程度或病程等因素的限制，操作也十分繁琐、费时，而且敏感性低，特异性差，不易检测出混合感染，不利于疾病的及时诊断治疗，从而造成重大的经济损失。近年来，随着分子生物学的发展，PCR 技术已被广泛应用于这些鸡传染病的检测，并建立了多重 PCR 检测技术，同时检测几种病原，多重RT-PCR因其灵敏性、特异性和操作的简单性被广泛应用于禽病的混合感，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性，而多重PCR是靠片段的大小来区别的，一般到了三重以上，片段大小差别大，其每种病毒的扩增效率不一样，造成结果存在偏差。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但实时荧光PCR技术受到荧光种类及仪器自身的限制，最多只能对5个靶标进行检测，且实验成功的难度极大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物。
本发明的目的在于提供一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析试剂盒。
本发明的目的在于提供一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，所述引物核苷酸序列如下所示：
引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），
引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；
引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），
引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；
引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），
引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；
引物O1：5’-CGTGTAACGGTGCGACTG-3’ （SEQ ID NO：7），
引物O2：5’-CCGCTAGATAAGGCCAAT-3’ （SEQ ID NO：8）；
引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：9），
引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：10）。
进一步的，所述引物C1和C2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物M1和M2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物R1和R2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物O1和O2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物B1和B2其中一条引物的5’端被生物素化。
进一步的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
进一步的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2这5组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:11~15所示的tag序列，且该5组引物对中连接的tag序列互不相同。
一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析试剂盒，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，该试剂盒中含有上述任一所述引物。
进一步的，上述试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、5种编码不同荧光色的荧光编码微球。
进一步的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析方法，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以提取的病毒核酸为模板，用上述任一所述的引物进行RT-PCR扩增；
3）将上步扩增产物、5种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；
4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病原的类型；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
进一步的，步骤2）中RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer 4µL
dNTP 0.8µL
引物混合液 2µL
酶 0.8µL
模板 1µL
ddH2O 11.4µL
Total 20µL；
步骤2）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循环35次；72℃ 10min，4℃ 保存。
进一步的，步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：
5种荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
总体积 100µL；37℃孵育30min。
本发明的有益效果是：
1）本发明方法同时对鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性法氏囊病毒进行检测时，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值时，分辩不同类型的病原。
2）本发明方法能够同时对鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性法氏囊病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。
附图说明
图1是禽免疫抑制5种病原及人工模拟的多重感染的PCR的电泳图；
图2是禽免疫抑制5种病原的多重荧光免疫分析方法检测实验结果图；
图3是禽免疫抑制5种病原的多重荧光免疫分析方法检测特异性实验结果图；
图4是禽免疫抑制5种病原的多重荧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图；
图5是禽免疫抑制5种病原的多重荧光免疫分析方法临床检测实验结果图。
具体实施方式
一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，所述引物核苷酸序列如下所示：
引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），
引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；
引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），
引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；
引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），
引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；
引物O1：5’-CGTGTAACGGTGCGACTG-3’ （SEQ ID NO：7），
引物O2：5’-CCGCTAGATAAGGCCAAT-3’ （SEQ ID NO：8）；
引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：9），
引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：10）。
优选的，所述引物C1和C2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物M1和M2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物R1和R2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物O1和O2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物B1和B2其中一条引物的5’端被生物素化。
优选的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
优选的，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2这5组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:11~15所示的tag序列，且该5组引物对中连接的tag序列互不相同。
一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析试剂盒，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，该试剂盒中含有上述任一所述引物。
优选的，上述试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、5种编码不同荧光色的荧光编码微球。
优选的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析方法，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以提取的病毒核酸为模板，用上述任一所述的引物进行RT-PCR扩增；
3）将上步扩增产物、5种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；
4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病原的类型；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
优选的，步骤2）中RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer 4µL
dNTP 0.8µL
引物混合液 2µL
酶 0.8µL
模板 1µL
ddH2O 11.4µL
Total 20µL；
步骤2）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循环35次；72℃ 10min，4℃ 保存。
优选的，步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：
5种荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
总体积 100µL；37℃孵育30min。
优选的，步骤3）中5种编码不同荧光色的荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，5种荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 引物设计
经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2对多重荧光同时检测鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒这5种禽免疫抑制病原的效果最好，其碱基序列如下所示。
引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），
引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；
引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），
引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；
引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），
引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；
引物O1：5’-CGTGTAACGGTGCGACTG-3’ （SEQ ID NO：7），
引物O2：5’-CCGCTAGATAAGGCCAAT-3’ （SEQ ID NO：8）；
引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：9），
引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：10）。
本发明采用多重荧光分析的方法对上述5种禽免疫抑制病原进行区分，故将上述引物作进一步的修饰，以满足相应的操作要求。其中引物C1、M1、R1、O1和B1的5’端连接有tag序列，所连接的tag序列分别为：
引物C1的tag序列为：5’-ATACTTTACAAACAAATAACACAC-3’ （SEQ ID NO：11）；
引物M1的tag序列为：5’-TACTTAAACATACAAACTTACTCA-3’ （SEQ ID NO：12）；
引物R1的tag序列为：5’-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3’ （SEQ ID NO：13）；
引物O1的tag序列为：5’-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3’ （SEQ ID NO：14）；
引物B1的tag序列为：5’-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3’ （SEQ ID NO：15）；
另外，引物C2、M2、R2、O2和B2的5’端还添加有生物素标记。
实施例2 用于快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析试剂盒
试剂盒包括以下组分：
（1）实施例1所设计的的多重荧光免疫分析引物组；
（2）5种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物中的tag序列互补配对；五种微球均购自luminex公司，具体的CAV、MDV、REV、REO和IBDV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A019、MTAG-A065、MTAG-A056、MTAG-A034和MTAG-015。
（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物。
实施例3 5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析方法检测方法的建立
（1）五种禽呼吸道病原质粒的构建
用天根的核酸自动抽取仪分别提取CAV、MDV、REV、REO、IBDV病原的核酸（RNA/DNA），分别实施例1所设计的引物对C1和C2、M1和M2、R1和R2、B1和B2进行RT-PCR扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的cDNA连接至pMD-19T载体中，将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。
（2）质粒PCR扩增
用实施例1所设计引物对C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2分别对CAV、MDV、REV、REO、IBDV引物进行单重、两重、四重、五重PCR扩增。
上游引物混合液的制备：将C1、M1、R1、O1和B1以摩尔比1:1:1:1:1比例进行混合；下游引物混合液的制备：将C2、M2、R2、O2和B2以摩尔比1:1:1:1:1比例进行混合。利用禽免疫抑制五种病原的特异性模板，以及CAV、MDV两重模板；CAV、MDV、REV、REO四重模板、CAV、MDV、REV、REO、IBDV五重模板，对上述五种病毒的特应性区域进行扩增。其中两重模板的制备：将两两质粒体积比以1:1的比例进行混合，四重模板的制备：将四种质粒以体积比1:1:1:1的比例进行混合，五重模板的制备：将五种质粒以体积比1:1:1:1:1的比例进行混合。
PCR扩增反应体系如下：
Premix Ex Taq 10µL
上游引物混合液 1µL
下游引物混合液 1µL
模板 1µL（＜500ng）
ddH2O 7µL
Total 20µL；
其中上下游引物的终浓度为3μM。
扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。图1中，M：DL2000 DNAmarker，1：CAV，2：MDV，3：REV，4：REO， 5：IBDV，6：PCR blank（PCR空白对照），8：对CAV+MDV进行的二重PCR，9：对CAV+MDV+REV+REO进行的四重PCR，10：对CAV+MDV+REV+REO+IBDV进行的五重PCR。
从图1中可以看出，CAV的扩增产物大小约为121bp，MDV的扩增产物大小约为114bp，REV的扩增产物大小约为153bp，REO的扩增产物大小约为117bp，IBDV的扩增产物大小约为128bp。由于这五种病毒的扩增产物大小相近，所以两重、四重和五重PCR扩增产物的电泳条带无法分辨。
（3）将所得PCR产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE）工作液杂交，包括以下步骤：
分别包被有特异的anti-tag序列的5种微球，其中anti-tag序列能相应地与CAV、MDV、REV、REO和IBDV五种病毒引物上的tag序列互补配对。五种微球均购自luminex公司，具体的CAV、MDV、REV、REO和IBDV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A019、MTAG-A065、MTAG-A056、MTAG-A034和MTAG-015。
荧光编码微球工作液的制备：将2500个/μl荧光编码微球用1.1×TmHybrdization Buffer稀释到1μl约含有125个/种荧光编码微球。
SA-PE工作液制备：将1mg/ml SA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀释到10μg/μl。
充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20μl，样品孔中加入5μl PCR产物，背景孔中加入5μl PCR blank产物，再加入75μl的SA-PE工作液，充分混匀，于金属加热器中37℃孵育30min。
依照检测仪Luminex 200仪器的说明将杂交后的50μl上述反应液进行检测，结果如图2所示，虽然两重、四重和五重模板的扩增产物无法用电泳分辨，但用检测仪Luminex200仪器读取MFI值时，明显分辩不同类型的病毒。
结果判断标准（注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整）如下：
最低检测阈值（cutoff值）的确定：选取10头健康鸡组织样品（每个样品平行重复3次），分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff值。本发明所获得cutoff值为633.2，因此将本发明的cutoff值定为700。只有检测样品的MFI值高于700时，该实验数据才能进行有效分析。
待测样本的分析判断：1）当待测样本的MFI值＞700时，判断为阳性样本；2）待测样本的MFI值≤700时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
实施例4 CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重荧光免疫分析检测特异性实验
分别用鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性法氏囊病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒作为模板进行多重荧光免疫分析检测。
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以提取的病毒核酸为模板，用实施例1设计的引物对引物对C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2引物进行RT-PCR扩增；
RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer 4µL
dNTP 0.8µL
上游引物混合液 2µL
酶 0.8µL
模板 1µL
ddH2O 11.4µL
Total 20µL；
步骤2）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循环35次；72℃ 10min，4℃ 保存。
3）将上步扩增产物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；
杂交的反应体系和程序为：
4种荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
总体积 100µL；37℃孵育30min。
4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定其病毒的类型。
实验结果如图3所示，只有鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性法氏囊病毒为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。
实施例5：CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验
将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至101copies/μl，用上述建立的多重荧光免疫分析方法进行检测。CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验结果如图4所示，实验结果表明，除了IBDV的灵敏度检出限为104copies/μl，其他的灵敏度检出限为103copies/μl。
实施例6：样品的检测
从鸡场采集的脾、肾、肝等样品，用天根核酸自动抽取仪提取RNA/DNA，使用Qiagen的RT-PCR kit进行扩增，以RNA/DNA作为模板，采用上述CAV、MDV、REV、REO和IBDV的多重荧光免疫分析检测方法进行检测，扩增产物与荧光编码微球和SA-PE杂交，在Luminex 200检测仪上读数。具体步骤参照实施例3或实施例4，实验结果如图5所示。
本发明方法的检测结果表明，样品4F、4S、4XW和4W为阴性样本；12为传染性法氏囊病毒单独感染样品；46为禽呼肠孤病毒单独感染样品；26为鸡传染性贫血病病毒与禽网状内皮增生症病毒两重混合感染样品；11为鸡传染性贫血病病毒、马立克病毒与禽网状内皮增生症病毒三重混合感染样品；14、34、22、43、32、24、23为鸡传染性贫血病病毒与马立克病毒两重混合感染样品；其他的均为鸡传染性贫血病病毒单独感染样品。通过测序分析，结果一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省实验动物监测所
<120> 一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法
<130>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgacatcgga ggagacag 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagcggat agtcatagta ga 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccattccct cttctgcc 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgagcgta aaccgtc 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gactgccttg tgactgct 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
actcccactg ttgtctaaat c 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgtgtaacgg tgcgactg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccgctagata aggccaat 18
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgcggagcc ttctga 16
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
attagccctg accctgtg 18
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atactttaca aacaaataac acac 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tacttaaaca tacaaactta ctca 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cttaaactct acttacttct aatt 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acttatttct tcactactat atca 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tacttcttta ctacaattta caac 24

Claims (10)

1.一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，其特征在于，所述引物核苷酸序列如下所示：
引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO：1），
引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO：2）；
引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO：3），
引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO：4）；
引物R1：5’-GACTGCCTTGTGACTGCT-3’ （SEQ ID NO：5），
引物R2：5’-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC-3’ （SEQ ID NO：6）；
引物O1：5’-CGTGTAACGGTGCGACTG-3’ （SEQ ID NO：7），
引物O2：5’-CCGCTAGATAAGGCCAAT-3’ （SEQ ID NO：8）；
引物B1：5’-ATGCGGAGCCTTCTGA-3’ （SEQ ID NO：9），
引物B2：5’-ATTAGCCCTGACCCTGTG-3’ （SEQ ID NO：10）。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述引物C1和C2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物M1和M2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物R1和R2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物O1和O2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物B1和B2其中一条引物的5’端被生物素化。
3.根据利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
4.根据权利要求1或3所述的引物，其特征在于，所述引物C1和C2、M1和M2、R1和R2、O1和O2、B1和B2这5组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:11~15所示的tag序列，且该5组引物对中连接的tag序列互不相同。
5.一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析试剂盒，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1~4任一所述引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、5种编码不同荧光色的荧光编码微球。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
8.一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析方法，所述5种禽免疫抑制病原为鸡传染性贫血病病毒、鸡马立克氏病病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒和鸡传染性法氏囊病毒，其特征在于，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以提取的病毒核酸为模板，用权利要求1~4任一所述的引物进行RT-PCR扩增；
3）将上步扩增产物、5种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；
4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病原的类型；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤2）中RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer 4µL
dNTP 0.8µL
引物混合液 2µL
酶 0.8µL
模板 1µL
ddH2O 11.4µL
Total 20µL；
步骤2）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 25s，72℃ 20s；循环35次；72℃ 10min，4℃ 保存。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：
5种荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
总体积 100µL；37℃孵育30min。
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