CN105154589A - 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法 - Google Patents

一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105154589A
CN105154589A CN201510598669.XA CN201510598669A CN105154589A CN 105154589 A CN105154589 A CN 105154589A CN 201510598669 A CN201510598669 A CN 201510598669A CN 105154589 A CN105154589 A CN 105154589A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
fluorescence
tag sequence
seqidno
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510598669.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105154589B (zh
Inventor
朱余军
郭鹏举
黄韧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Original Assignee
Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute filed Critical Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority to CN201510598669.XA priority Critical patent/CN105154589B/zh
Publication of CN105154589A publication Critical patent/CN105154589A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105154589B publication Critical patent/CN105154589B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病毒。本发明方法，能够同时对猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪A群轮状病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。

Description

一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法
技术领域
本发明属于养殖业的病毒检测领域，具体涉及一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的
多重荧光免疫分析方法。
背景技术
近几年猪腹泻病的流行呈上升趋势，流行规律也有很大变化，该病一般冬春季节为多发，但最近几年夏季也开始流行，而且各年龄和各生理状况的猪都有发生，其中以仔猪发病率和病死率最高。猪腹泻病是目前最严重的仔猪疾病之一，也是引起仔猪死亡的重要原因。据调查，仔猪因腹泻死亡占仔猪死亡总数的39.8%。近年来，我国仔猪腹泻十分普遍，据报道，30千克以下的仔猪，全年平均发病率46.5%，死亡率10.3%。在养猪业较发达的国家如美国，仔猪断奶前死亡率约15.5%，荷兰11.5%-14.2%。仔猪腹泻在养猪业危害中居首位，严重威胁养猪业健康发展，导致饲料报酬较低、仔猪成活率下降、生长缓慢、生长发育停滞（即所谓僵猪），甚至死亡，是危害猪场最严重的疾病之一。猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒是导致猪腹泻的三种主要病毒性病原，并且经常混合感染，给疾病的诊断和防治造成了困难，同时由这三种病毒引起的疾病已经给我国和世界上养猪国家造成了巨大的经济损失，是危害猪场最严重的疾病之一。
猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪A群轮状病毒(PoRV)的临床症状、病理变化和流行病学极为相似，在临床和组织病理学上很难区分，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，如病毒分离、免疫荧光试验技术、电镜、免疫酶联吸附实验、RT-PCR和核苷酸序列分析等，虽然以上方法均能鉴别出不同类型的病毒，但如病毒分离、免疫荧光试验、电镜等方法费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查；由于不同毒株间壳依蛋白抗原具有相当大的变异性，因此酶联免疫吸附试验的应用也受到限制，而PCR技术具有特异性强、敏感度高的优点，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但实时荧光PCR技术受到荧光种类及仪器自身的限制，最多只能对5个靶标进行检测，且实验成功的难度极大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速区分猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法及引物。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速区分猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
PEDV引物P1：CGCAAAGACTGAACCCACTAATTT（SEQIDNO：1）；
PEDV引物P2：TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT（SEQIDNO：2）；
TGEV引物T1：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAA（SEQIDNO：3）；
TGEV引物T2：GCTTCCAAACAGAATGCTA（SEQIDNO：4）；
PoRV引物R1：ATCAAGCACGATTTGGAAC（SEQIDNO：5）；
PoRV引物R2：GATTCAGTTCGCAATGTAAGTCC（SEQIDNO：6）。
优选的，引物P1、T1和R1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。
优选的，引物P1、T1和R1的5’端的tag序列分别为：
引物P1的tag序列为：CTTTCTTAATACATTACAACATAC（SEQIDNO：7）；
引物T1的tag序列为：ATCTCAATTACAATAACACACAAA（SEQIDNO：8）；
引物R1的tag序列为：ACTTATTTCTTCACTACTATATCA（SEQIDNO：9）。
优选的，引物P2、T2和R2的5’端还添加有生物素标记。
一种快速区分猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA，以RNA为模板，加入上述引物进行RT-PCR扩增；
2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定其病毒的类型；
其中，所使用的引物如上所述。
优选的，步骤2）中的荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与tag序列互补配对。
优选的，步骤1）中RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer4μL
dNTP0.8μL
上游引物P1、T1、R1混合液1μL
下游引物P2、T2、R2混合液1μL
酶1μL
模板1μL
ddH2O11.2μL
总体积20μL。
优选的，步骤1）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸10min。
优选的，步骤2）中扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交的体系为：
荧光编码微球20μL
链霉亲和素-藻红蛋白75μL
扩增产物5μL
总体积100μL
37℃反应30min。
一种快速区分猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA，将样品RNA反转录获得cDNA后，以cDNA为模板，加入上述引物进行PCR扩增；
2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定病毒的类型；
其中，所使用的引物如上所述；荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与tag序列互补配对。
本发明的有益效果是：
本发明的上游引物5’端的特异性的tag序列，可以与包被有特异的anti-tag序列的3种荧光编码微球结合，而下游引物5’端的Biotin标记，可以与链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交。本发明方法同时对猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪A群轮状病毒进行检测时，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值时，分辩不同类型的病毒。
本发明的方法将多重荧光免疫分析（MFIA）和TAG技术结合起来，TAG技术使用Luminex专有的通用标签，通过标签序列与反标签序列的专一性互补配对，进行核酸实验优化，产品开发和分子诊断化验。TAG技术能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。
本发明方法，能够同时对猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪A群轮状病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。
附图说明
图1是猪腹泻病毒等三种病毒质粒PCR的电泳图；
图2是猪腹泻病毒等三种病毒质粒多重荧光免疫分析方法检测实验结果图；
图3是猪腹泻病毒等三种病毒质粒多重荧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图；
图4是猪腹泻病毒等三种病毒质粒多重荧光免疫分析方法检测特异性实验结果图；
图5是猪腹泻病毒等三种病毒样品两步法多重荧光免疫分析方法检测实验结果图；
图6是猪腹泻病毒等三种病毒样品一步法多重荧光免疫分析方法检测实验结果图。
具体实施方式
一种快速区分猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PoRV)的多重荧光免疫分析方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
PEDV引物P1：CGCAAAGACTGAACCCACTAATTT（SEQIDNO：1）；
PEDV引物P2：TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT（SEQIDNO：2）；
TGEV引物T1：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAA（SEQIDNO：3）；
TGEV引物T2：GCTTCCAAACAGAATGCTA（SEQIDNO：4）；
PoRV引物R1：ATCAAGCACGATTTGGAAC（SEQIDNO：5）；
PoRV引物R2：GATTCAGTTCGCAATGTAAGTCC（SEQIDNO：6）。
优选的，引物P1、T1和R1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。
更优选的，所述间隔臂为SpacerC18。
优选的，引物P1、T1和R1的5’端的tag序列分别为：
引物P1的tag序列为：CTTTCTTAATACATTACAACATAC（SEQIDNO：7）；
引物T1的tag序列为：ATCTCAATTACAATAACACACAAA（SEQIDNO：8）；
引物R1的tag序列为：ACTTATTTCTTCACTACTATATCA（SEQIDNO：9）。
优选的，引物P2、T2和R2的5’端还添加有生物素标记。
一种快速区分猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PoRV)的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA，以RNA为模板，加入上述引物进行RT-PCR扩增；
2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定其病毒的类型；
其中，所使用的引物如上所述。
优选的，步骤2）中的荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与tag序列互补配对。
优选的，步骤1）中RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer4μL
dNTP0.8μL
上游引物P1、T1、R1混合液1μL
下游引物P2、T2、R2混合液1μL
酶1μL
模板1μL
ddH2O11.2μL
总体积20μL。
优选的，步骤1）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸10min。
优选的，步骤2）中扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交的体系为：
荧光编码微球20μL
链霉亲和素-藻红蛋白75μL
扩增产物5μL
总体积100μL
37℃反应30min。
一种快速区分猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA，将样品RNA反转录获得cDNA后，以cDNA为模板，加入上述引物进行PCR扩增；
2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定病毒的类型；
其中，所使用的引物如上所述；荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与tag序列互补配对。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒质粒的构建
用试剂盒MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0分别提取PEDV、TGEV、PoRV病毒的RNA，反转录成cDNA，分别以上述对应的引物，进行PCR扩增，扩增体系如下：
扩增的反应程序为：
94℃预变性5min；
94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；
72℃终延伸10min。
将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。
用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的cDNA连接至pMD-19T载体中，载体连接反应体系如下（10μl）：
反应条件：16℃，4h以上。
将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。
实施例2：猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法的建立：
1、质粒PCR扩增
用特异性扩增猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪A群轮状病毒引物进行单重、两重、三重PCR扩增。
上游引物混合液的制备：将P1、T1和R1以1:1:1比例进行混合；下游引物混合液的制备：将P2、T2和R2以1:1:1比例进行混合。利用三种特异性模板，以及两重模板、三重模板对上述三种病毒的特应性区域进行扩增。其中两重模板的制备：将两两质粒以1:1的比例进行混合，三重模板的制备：将三种质粒以1:1:1的比例进行混合。
PCR扩增反应体系如下：
扩增的反应程序为：
94℃预变性5min；
94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；
72℃终延伸10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。图中，M：DL1000DNAmarker，1：PEDV，2：PoRV，3：TGEV，4：PEDV+PoRV，5：PEDV+TGEV，6：PoRV+TGEV，7：PEDV+PoRV+TGEV，8：PCRblank。
从图1中可以看出，PEDV的扩增产物大小约为198bp，PoRV的扩增产物大小约为166bp，TGEV的扩增产物大小约为153bp，由于这三种病毒的扩增产物大小相近，所以两重和三重PCR扩增产物的电泳条带无法分辨。
、PCR产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE）工作液杂交，包括以下步骤：
分别包被有特异的anti-tag序列的3种微球，其中anti-tag序列能相应地与PEDV、TGEV和PoRV三种病毒引物上的tag序列互补配对。三种微球均购自luminex公司，具体的PEDV、TGEV和PoRV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A025、MTAG-A067和MTAG-034。
荧光编码微球工作液的制备：将2500个/ul荧光编码微球用1.1×TmHybrdizationBuffer稀释到1ul约含有125个/种荧光编码微球。
SA-PE工作液制备：将1mg/mlSA-PE用1×TmHybrdizationBuffer稀释到10ug/ul。
充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20ul，样品孔中加入5ulPCR产物，背景孔中加入5ulPCRblank产物，再加入75ul的SA-PE工作液，充分混匀，于金属加热器中37℃孵育30min。
依照检测仪Luminex200仪器的说明将杂交后的50ul上述反应液进行检测，结果如图2所示，虽然两重、三重模板的扩增产物无法用电泳分辨，但用检测仪Luminex200仪器读取MFI值时，明显分辩不同类型的病毒。
结果判断标准（注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整）如下：
最低检测阈值（cutoff值）的确定：选取10头健康猪粪便或肠内容物样品（每个样品平行重复3次），分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff值。本发明所获得cutoff值为996.5，因此将本发明的cutoff值定为1000。只有检测样品的MFI值高于1000时，该实验数据才能进行有效分析。
待测样本的分析判断：1）当待测样本的MFI值＞1000时，判断为阳性样本；2）待测样本的MFI值≤1000时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
实施例3：PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验
将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至0.01fg/ul，用上述建立的多重荧光免疫分析方法进行检测。PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验结果如图3所示，实验结果表明，PEDV、TGEV、PoRV的灵敏度较高，检出限均为1fg/PCR。
实施例4：PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析检测特异性实验
分别用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环2型病毒、猪伪狂犬病毒作为模板进行多重荧光免疫分析检测。实验结果如图4所示，只有猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。
实施例5：PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析检测重复性实验
三种病毒分别做了批内和批间实验，实验结果如表1所示。
表1PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析检测重复性结果
从表1结果可知，批内实验的变异系数在2%以下，批间实验的变异系数在4%以下，表明该方法的检测性能稳定，结果可靠，具有可重复性。
实施例6：样品的检测
1、两步法多重荧光免疫分析
从猪场采集的猪粪便或肠内容物样品，用试剂盒MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0提取RNA，然后根据Takara反转录获得cDNA。以cDNA作为模板，采用上述PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析检测方法进行检测，结果如图5所示。
2、一步法多重荧光免疫分析
本发明还可以将提取的RNA直接通过多重RT-PCR扩增体系及程序进行扩增，扩增产物与荧光编码微球和SA-PE杂交，在Luminex200检测仪上读数。具体步骤如下：
PEDV、TGEV、PoRV多重RT-PCR扩增反应体系（QIAGEN的RT-PCR试剂盒）：
扩增的反应程序为：
50℃反转录30min；94℃预变性15min；
94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；
72℃终延伸10min。
反应体系中的上、下游引物混合液与上述的引物混合液相同。
扩增产物与荧光编码微球和SA-PE杂交的步骤与上述的杂交步骤一样，依照检测仪Luminex200的说明将杂交后的50ul上述反应液进行检测，实验结果判断标准同上。检测结果如图6所示。
经普通PCR检测实验结果表明，样品5、6、9为阴性样本；1、2、8、10为猪流行性腹泻病毒样品；3、12为猪A群轮状病毒样品；7为猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒混合样品；4、11为猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒混合样品。通过分析，结果和图6中一步法多重荧光免疫分析结果一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>广东省实验动物监测所
<120>一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法
<130>
<160>9
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工引物
<400>1
cgcaaagactgaacccactaattt24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工引物
<400>2
ttgcctctgttgttacttggagat24
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工引物
<400>3
gcaggtaaaggtgatgtgacaa22
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工引物
<400>4
gcttccaaacagaatgcta19
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工引物
<400>5
atcaagcacgatttggaac19
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工引物
<400>6
gattcagttcgcaatgtaagtcc23
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工引物
<400>7
ctttcttaatacattacaacatac24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工引物
<400>8
atctcaattacaataacacacaaa24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工引物
<400>9
acttatttcttcactactatatca24

Claims (10)

1.一种快速区分猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
PEDV引物P1：CGCAAAGACTGAACCCACTAATTT（SEQIDNO：1）；
PEDV引物P2：TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT（SEQIDNO：2）；
TGEV引物T1：GCAGGTAAAGGTGATGTGACAA（SEQIDNO：3）；
TGEV引物T2：GCTTCCAAACAGAATGCTA（SEQIDNO：4）；
PoRV引物R1：ATCAAGCACGATTTGGAAC（SEQIDNO：5）；
PoRV引物R2：GATTCAGTTCGCAATGTAAGTCC（SEQIDNO：6）。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：引物P1、T1和R1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：引物P1、T1和R1的5’端的tag序列分别为：
引物P1的tag序列为：CTTTCTTAATACATTACAACATAC（SEQIDNO：7）；
引物T1的tag序列为：ATCTCAATTACAATAACACACAAA（SEQIDNO：8）；
引物R1的tag序列为：ACTTATTTCTTCACTACTATATCA（SEQIDNO：9）。
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：引物P2、T2和R2的5’端还添加有生物素标记。
5.一种快速区分猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA，以RNA为模板，加入权利要求1~4任一所述的引物进行RT-PCR扩增；
2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定其病毒的类型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2）中的荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与权利要求3中的tag序列互补配对。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1）中RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer4μL
dNTP0.8μL
上游引物P1、T1、R1混合液1μL
下游引物P2、T2、R2混合液1μL
酶1μL
模板1μL
ddH2O11.2μL
总体积20μL。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1）中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸10min。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2）中扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交的体系为：
荧光编码微球20μL
链霉亲和素-藻红蛋白75μL
扩增产物5μL
总体积100μL
37℃反应30min。
10.一种快速区分猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA，将样品RNA反转录获得cDNA后，以cDNA为模板，加入权利要求1~4任一所述的引物进行PCR扩增；
2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定病毒的类型；
其中，荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与权利要求3中的tag序列互补配对。
CN201510598669.XA 2015-09-18 2015-09-18 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法 Active CN105154589B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510598669.XA CN105154589B (zh) 2015-09-18 2015-09-18 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510598669.XA CN105154589B (zh) 2015-09-18 2015-09-18 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105154589A true CN105154589A (zh) 2015-12-16
CN105154589B CN105154589B (zh) 2018-07-06

Family

ID=54795630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510598669.XA Active CN105154589B (zh) 2015-09-18 2015-09-18 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105154589B (zh)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105671207A (zh) * 2016-03-28 2016-06-15 上海市农业科学院 猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法
CN106011313A (zh) * 2016-07-19 2016-10-12 广东省实验动物监测所 一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN106086241A (zh) * 2016-07-19 2016-11-09 广东省实验动物监测所 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法
CN106167836A (zh) * 2016-08-30 2016-11-30 广东省实验动物监测所 一种同时检测4株大鼠细小病毒的多重荧光分析方法及试剂盒
CN106191312A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 广东省实验动物监测所 一种快速区分aiv、ndv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN106191311A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 广东省实验动物监测所 一种快速检测豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo‑3病毒的多重液相基因芯片方法及试剂
CN106191319A (zh) * 2016-07-27 2016-12-07 广东省实验动物监测所 一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法
CN106282416A (zh) * 2016-10-08 2017-01-04 广东省实验动物监测所 一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法
CN106282417A (zh) * 2016-10-08 2017-01-04 广东省实验动物监测所 一种快速区分cav、mdv、rev、ibdv的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法
CN106319091A (zh) * 2016-08-30 2017-01-11 广东省实验动物监测所 一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒
CN106544447A (zh) * 2016-10-08 2017-03-29 广东省实验动物监测所 一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、试剂盒及方法
CN106566897A (zh) * 2016-11-10 2017-04-19 广东省实验动物监测所 一种快速区分ect、mad、mcmv、poly的多重荧光基因检测方法
CN107326098A (zh) * 2017-06-20 2017-11-07 广东省实验动物监测所 一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN108913812A (zh) * 2018-07-18 2018-11-30 上海市农业科学院 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建
CN108950083A (zh) * 2018-08-24 2018-12-07 河南农业大学 同时检测GETV、PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR方法
CN109234465A (zh) * 2018-11-23 2019-01-18 山东新希望六和集团有限公司 用于检测a型猪轮状病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN109439796A (zh) * 2018-08-07 2019-03-08 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒
CN109652596A (zh) * 2019-01-30 2019-04-19 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 PEDV、TGEV和PoRV的三重实时RT-PCR引物组、试剂盒及方法
CN111321203A (zh) * 2020-03-18 2020-06-23 杭州广科安德生物科技有限公司 核酸检测试剂盒及其应用
CN111485033A (zh) * 2019-01-25 2020-08-04 山东省农业科学院家禽研究所 一种检测兔出血症病毒的引物及核酸检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232801A (zh) * 2014-09-29 2014-12-24 四川农业大学 检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂盒
CN104611466A (zh) * 2015-02-04 2015-05-13 四川农业大学 一种快速鉴别三种仔猪病毒性腹泻的分子试剂盒与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232801A (zh) * 2014-09-29 2014-12-24 四川农业大学 检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的试剂盒
CN104611466A (zh) * 2015-02-04 2015-05-13 四川农业大学 一种快速鉴别三种仔猪病毒性腹泻的分子试剂盒与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROHITO OGAWA ET AL: "Multiplex PCR and multiplex RT-PCR for inclusive detection of major swine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
吴洋等: "猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 *
陈小金: "PEDV、TGEV、PoRV SYBR Green I实时荧光PCR诊断方法的探索", 《中国农业科学院硕士毕业论文》 *

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105671207A (zh) * 2016-03-28 2016-06-15 上海市农业科学院 猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法
CN105671207B (zh) * 2016-03-28 2020-01-07 上海市农业科学院 猪病毒性腹泻四种病原的液相芯片检测方法
CN106011313A (zh) * 2016-07-19 2016-10-12 广东省实验动物监测所 一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN106086241A (zh) * 2016-07-19 2016-11-09 广东省实验动物监测所 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法
CN106011313B (zh) * 2016-07-19 2018-05-25 广东省实验动物监测所 一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN106191312A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 广东省实验动物监测所 一种快速区分aiv、ndv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN106191311A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 广东省实验动物监测所 一种快速检测豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo‑3病毒的多重液相基因芯片方法及试剂
CN106086241B (zh) * 2016-07-19 2018-05-25 广东省实验动物监测所 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法
CN106191319B (zh) * 2016-07-27 2018-07-06 广东省实验动物监测所 一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法
CN106191319A (zh) * 2016-07-27 2016-12-07 广东省实验动物监测所 一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法
CN106167836A (zh) * 2016-08-30 2016-11-30 广东省实验动物监测所 一种同时检测4株大鼠细小病毒的多重荧光分析方法及试剂盒
CN106167836B (zh) * 2016-08-30 2018-07-06 广东省实验动物监测所 一种同时检测4株大鼠细小病毒的多重荧光分析方法及试剂盒
CN106319091A (zh) * 2016-08-30 2017-01-11 广东省实验动物监测所 一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒
CN106282416A (zh) * 2016-10-08 2017-01-04 广东省实验动物监测所 一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法
CN106282417A (zh) * 2016-10-08 2017-01-04 广东省实验动物监测所 一种快速区分cav、mdv、rev、ibdv的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法
CN106282416B (zh) * 2016-10-08 2018-05-25 广东省实验动物监测所 一种快速区分5种禽免疫抑制病原的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法
CN106282417B (zh) * 2016-10-08 2018-05-04 广东省实验动物监测所 一种快速区分cav、mdv、rev、ibdv的多重荧光免疫分析引物、试剂盒及方法
CN106544447A (zh) * 2016-10-08 2017-03-29 广东省实验动物监测所 一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、试剂盒及方法
CN106566897B (zh) * 2016-11-10 2018-07-24 广东省实验动物监测所 一种快速区分ect、mad、mcmv、poly的多重荧光基因检测方法
CN106566897A (zh) * 2016-11-10 2017-04-19 广东省实验动物监测所 一种快速区分ect、mad、mcmv、poly的多重荧光基因检测方法
CN107326098A (zh) * 2017-06-20 2017-11-07 广东省实验动物监测所 一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂
WO2018233448A1 (zh) * 2017-06-20 2018-12-27 广东省实验动物监测所 一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN107326098B (zh) * 2017-06-20 2020-06-16 广东省实验动物监测所 一种快速区分兔瘟病毒、仙台病毒和兔轮状病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN108913812A (zh) * 2018-07-18 2018-11-30 上海市农业科学院 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建
CN108913812B (zh) * 2018-07-18 2021-11-30 上海市农业科学院 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建
CN109439796A (zh) * 2018-08-07 2019-03-08 广西壮族自治区兽医研究所 一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒
CN108950083A (zh) * 2018-08-24 2018-12-07 河南农业大学 同时检测GETV、PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR方法
CN109234465A (zh) * 2018-11-23 2019-01-18 山东新希望六和集团有限公司 用于检测a型猪轮状病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN111485033A (zh) * 2019-01-25 2020-08-04 山东省农业科学院家禽研究所 一种检测兔出血症病毒的引物及核酸检测方法
CN109652596A (zh) * 2019-01-30 2019-04-19 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 PEDV、TGEV和PoRV的三重实时RT-PCR引物组、试剂盒及方法
CN111321203A (zh) * 2020-03-18 2020-06-23 杭州广科安德生物科技有限公司 核酸检测试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105154589B (zh) 2018-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105154589A (zh) 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法
CN103602751B (zh) 一种稀有地中海贫血基因检测的基因芯片及试剂盒
CN101358246A (zh) 用于检测猪瘟病毒的lamp试剂盒及其制备方法
CN105018485A (zh) 一种应用rpa技术检测小反刍兽疫病毒的引物和探针
CN104611466A (zh) 一种快速鉴别三种仔猪病毒性腹泻的分子试剂盒与应用
CN102943115A (zh) α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒
CN105385780A (zh) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测的试剂盒及其应用
CN107475456A (zh) 基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的pedv快速检测方法及其试剂盒
CN103993101A (zh) 一种同时检测人的冠状病毒229e、oc43、nl63的方法及试剂盒
CN103725794B (zh) 检测prrsv的荧光定量rt‑pcr引物、探针及其方法
CN102925548B (zh) 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌lamp试剂盒及使用方法
CN103074447B (zh) 一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒pcr-hrm分析方法的建立
CN104630387B (zh) 猪流行性腹泻病毒的lamp检测试剂盒
CN106222256A (zh) 一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重免疫荧光分析方法
CN103276103A (zh) 检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用
CN106498054A (zh) 一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP分析方法
CN102943116B (zh) 泰国型α-地中海贫血的基因检测试剂盒
CN106191319B (zh) 一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法
CN105154584A (zh) 一种快速区分prrsv经典毒株和变异毒株的hrm非标记探针方法及其引物和探针
CN101935655B (zh) 一种牛肉嫩度选择的分子检测试剂盒
CN106011313A (zh) 一种快速区分iltv、ibv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN111471802A (zh) 一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用
CN102676653A (zh) 一种双重TaqMan探针荧光RT-PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的非诊断性方法
CN103184283A (zh) Pcr酶切分型检测军团菌试剂盒及其应用
CN100386442C (zh) 一种用于检测o1群霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant