CN106498054A - 一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP分析方法，其中检测所用的引物包括1对霍乱弧菌特异性引物、1对副溶血性弧菌特异性引物和1对通用引物。本发明通过对待检样品增菌培养后，提取核酸，应用异性引物对及荧光标记引物进行PCR扩增，将扩增产物用遗传分析系统检测，并与标准分子量相对照，根据检测图谱来判断检测样品中是否存在霍乱弧菌和副溶血性弧菌污染。经验证，本发明的检测体系具有特异性高、稳定性好和检验周期短等特点。

Description

一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP分析 方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于GenomeLabTM GeXP(GenomeLabeXpress Profiling)多重基因表达分析技术检测霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）的方法。

背景技术

食品安全问题以及相关的食源性疾病已成为公共健康领域中倍受关注的热点。加强食品中致病菌的检测技术研究具有重要的现实意义，据世界卫生组织(WHO)统计，2005年世界范围内有150万人死于腹泻等疾病，其中有70%为食源性因素造成。在发展中国家情况更为严重，估计每年有2.7亿腹泻及其相关病例，导致240万5岁以下儿童死亡。近几年弧菌引起的食源性疾病已成为当今许多国家面临的公共卫生问题，其中霍乱弧菌(Vibriocholerae，Vc)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus，vp)引起的疾病占有很大比例。霍乱弧菌所致的霍乱为烈性肠道传染病，具有发病急、传播快、流行范围广等特征，曾在世界上发生过几次大流行。副溶性血弧菌对人类危害仅次于霍乱弧菌，副溶血弧菌能够引起多种无脊椎动物致病，包括石斑鱼、九孔鲍和虾，致病菌株可引起人类腹泻、恶心、呕吐、腹部痉挛，严重的可以引起昏迷、脱水甚至死亡。霍乱弧菌和副溶血性弧菌主要通过饮水、食品感染人类，导致食源性疾病。这些致病菌的常规检测需分离培养、生化和血清学鉴定等多个步骤，操作复杂，检测周期长(4~7d)，因此迫切需要发展快速、灵敏和特异的检测方法，对于预防和控制这些疾病的发生和流行至关重要。而基于多重聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)的检测方法具有特异、高效、成本低、速度快等优点，是食源性致病菌快速检测技术的重要发展方向。但普通的多重PCR的多对引物之间存在竞争效应，导致有些目标菌检测灵敏度降低甚至不能被检测。

GeXP多重基因分析技术是一种全新的基因表达谱定量分析平台，是多重PCR领域的突破性技术，它巧妙的将多重PCR技术和毛细管电泳技术相结合，采用通用引物与特异引物相结合的方法，能够有效地避免竞争效应的出现从而实现一次进行多达20个基因的检测，并且可以同时进行较多样品量的检测，通过其毛细管电泳系统对多重PCR反应产物进行高通量的快速分析，从而实现真正的高通量、自动化的检测。GeXP技术的优势在于可在同一样本中对多个基因进行检测，大大提高了反应效率，节约资源和成本，毛细管电泳分析自动化操作也降低了人为操作的误差。迄今为止，尚未有成功利用GeXP技术同步检测霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的同步检测霍乱弧菌和副溶血性弧菌食源性致病菌检测方法的不足，一是提供两对检测用特异性引物和一对通用引物，二是提供一种利用GeXP遗传分析技术的快速、高通量且易于观察结果的快速检测方法。

本发明将GeXP多重基因分析技术与多重PCR技术结合，在同一PCR反应体系中加入2对特异性引物和1对荧光标记的通用性引物，PCR扩增的前15个循环采用较高的退火温度进行特异性引物的扩增，后15个循环中，通用引物可对特异性引物扩增产物片段进行通用性的扩增，同时扩增出2个长度不同的荧光标记的核酸片段，最后采用毛细管电泳读取技术对多个目的基因进行有效分析，从而有效地避免了普通多重PCR扩增的引物间的竞争效应，提高了检测的灵敏性。

鉴于此，为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP检测用引物，包括1对霍乱弧菌特异性引物、1对副溶血性弧菌特异性引物和1对通用引物，它们的核苷酸序列如下：

霍乱弧菌上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，霍乱弧菌下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

副溶血性弧菌上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，副溶血性弧菌下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

通用上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，通用下游引物的核苷酸序列为SEQID NO.6。

具体地，上述核苷酸序列SEQ ID NO.5的5’端用cy5荧光标记。

为了实现上述第二目的，本发明提供一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP分析方法，包括以下步骤：

1）DNA提取

选用细菌DNA提取试剂盒，提取待测样品DNA，获得待测DNA模板。

2）GeXP多重扩增体系的构建

扩增反应体系25μL：包含0.1 mM霍乱弧菌上游引物0.2μL，0.1 mM霍乱弧菌下游引物0.2μL，0.1 mM副溶血性弧菌上游引物0.2μL，0.1 mM副溶血性弧菌下游引物0.2μL，1.0 mM通用上游引物1.0μL，1.0 mM通用下游引物1.0μL，Pre MIX酶预混液12.5μL，DNA模板1.0μL，9.7μL灭菌去离子水。

反应程序为94℃ 45s，61℃ 45s，72℃ 30s，15个循环；94℃ 45s，54℃ 45s，72℃30s，15个循环。

3）PCR产物片段分析

首先将步骤2）扩增得到的PCR产物用10mM Tris-HCl稀释5倍备用，然后在每个样品管中加入甲酰胺（SLS）38.5μL和DNA分子量标准品-400 0.5μL，震荡混匀，离心除去气泡并滴加矿物油之后加入分离缓冲液（Separation Buffer）250μL，利用GeXP多重基因分析系统的片段分析程序进行分析。

4）结果判定

霍乱弧菌和副溶血性弧菌目标扩增产物核酸片段长度分别为288bp和261bp，分析结果若出现相应片段长度的产物峰则该对应的致病菌检测结果为阳性，否则为阴性。

分析结果若出现相应片段长度的产物峰则该对应的致病菌检测结果为阳性，否则为阴性。

本发明所述的快速检测方法，适用于食品样品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的同步快速定性检测。

结合以上技术方案，本发明具有以下优点：（1）高特异性：分别根据霍乱弧菌和副溶血性弧菌基因的保守区域分别设计2对特异性引物，引物特异性高，并且通用性引物的序列设计来自于一段非生物源性的核苷酸序列，避免了非特异性产物的通用性扩增；（2）灵敏度高：扩增模板仅需10ng或更少，多重PCR反应体系中加入2对特异性引物和1对荧光标记的通用性引物，通用引物可对特异性引物扩增产物片段进行通用性的扩增，从而有效地避免了普通多重PCR扩增的引物间的竞争效应，提高检测灵敏度；（3）采用毛细管电泳读取技术根据核酸片段长度的荧光信号进行自动化读取和分析，能够对长度相差仅数个bp的核酸片段进行区分，且可同时实现对较多样品量的检测；（4）快速、高效扩增：检测时间3个小时左右，可同时实现对较多样品量的检测；（5）用途广：可广泛用于食品中致病菌的安全快速检测。

附图说明

图1表示同时检出霍乱弧菌和副溶血性弧菌的试验结果，图中出现3个峰，横坐标是各峰对应核酸长度；A：峰值217代表阳性对照； B：峰值261代表副溶血性弧菌；C：峰值出现在288代表霍乱弧菌。

具体实施方式

结合实例对本发明做进一步说明，不当作对本发明的限制。

实施例1，引物设计

选择霍乱弧菌的ompW基因和副溶血性弧菌的toxR基因作为扩增的特异基因，采用eXpressDesigner设计特异性引物，引物序列及产物大小见表1。

表1

通用性引物是一对非生物来源的寡核苷酸序列，上游引物5’端用cy5荧光进行标记，序列见表2。

表2

引物名称	引物序列(5’-3’)
		SEQ ID NO.5	GACACTGTGATGTCTTAT
SEQ ID NO.6	GTTGCTGAGTGATATCCCT

上述引物送由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

实施例2，用GeXP法同步检测水产品（黄花鱼）中霍乱弧菌和副溶血性弧菌。

取黄花鱼不同部位的待检样品25g接种于225mL的 3％氯化钠碱性蛋白胨水中置生化培养箱中37℃±1℃培养18-24 小时。

核酸提取：取增菌培养液1.5 mL置于离心管中，12,000rpm离心3min后弃去上清液。选用通用型商品化的革兰氏阴性细菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书规定步骤进行操作提取培养物的核酸，-70℃保存备用。

PCR扩增体系的配置和扩增参数：采用25μL反应体系，内含特异性引物SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2（0.1 mM）各0.2 μL，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4（0.1 mM）各0.2 μL，通用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6（1.0 mM）各1.0 μL，Pre MIX酶预混液12.5 μL，DNA模板1.0μL，9.7μL灭菌去离子水。反应程序为94℃ 45s，61℃ 45s，72℃ 30s，15个循环；94℃45s，54℃ 45s，72℃ 30s，15个循环。

扩增产物毛细管电泳分析：

①、准备10mM Tris-HCl (Tris-HCl（1M，pH8.0)：去核酸水=1：99（V/V）)

②、稀释PCR产物，所需试剂及使用量见表3。

表3

试剂	使用量
		10mM Tris-HCl pH8.0	8μL
PCR反应产物	2μL
		Total	10μL

注：可再加入Tris-HCl（10mM，pH8.0）以优化预稀释样品的浓度

③、配制上样体系（40μL），所需试剂及使用量见表4。

表4

试剂		使用量
			甲酰胺（SLS）		38.5μL
DNA分子量标准品-400		0.5μL
			稀释的PCR产物		1μL
Total		40μL

④、震荡混匀，离心以去除气泡。

⑤、每孔加一滴矿物油。

⑥、配制缓冲体系。

对应上样板加样的孔在缓冲液板上每孔加入3/4体积的分离缓冲液（SeparationBuffer）。

⑦、GeXP多重基因分析系统运用片段分析程序进行分析

PCR产物要避光放置。短期保存放置4℃冰箱。

结果判定：

对照检测结果图谱，当所检测的霍乱弧菌和副溶血性弧菌均为阳性结果时图中出现2个主峰，霍乱弧菌和副溶血性弧菌对应峰值位置分别为288bp和261bp。若只在288bp位置出现峰值则说明被检样品中检出霍乱弧菌；若只在261bp位置出现峰值则说明被检样品中检出副溶血性弧菌。若在288bp和261bp均未出现峰值则说明被检样品中未检出霍乱弧菌和副溶血性弧菌。

废弃物处理：

依照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。

<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP分析方法

<160> 6

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.1

gacactgtga tgtcttatcg ctcgtacgcc attttcac 38

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.2

gttgctgagt gatatccctc aagtccccat gagtcgtcc 39

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.3

gacactgtga tgtcttatat gacgcctctg ctaatg 36

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.4

gttgctgagt gatatcccta ccaatctgac ggaactg 37

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.5

gacactgtga tgtcttat 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.6

gttgctgagt gatatccct 19

Claims (3)

1.一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP检测用引物，其特征在于：包括1对霍乱弧菌特异性引物、1对副溶血性弧菌特异性引物和1对通用引物，它们的核苷酸序列如下：

霍乱弧菌上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，霍乱弧菌下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；

副溶血性弧菌上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，副溶血性弧菌下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

通用上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，通用下游引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.6。

2.根据权利要求1所述一种同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP检测用引物，其特征在于：所述核苷酸序列SEQ ID NO.5的5’端用cy5荧光标记。

3.利用权利要求1或2所述引物进行同步检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的GeXP分析方法，包括以下步骤：

1）DNA提取

选用细菌DNA提取试剂盒，提取待测样品DNA，获得待测DNA模板；

2）GeXP多重扩增体系的构建

扩增反应体系25μL：包含0.1 mM霍乱弧菌上游引物0.2μL，0.1 mM霍乱弧菌下游引物0.2μL，0.1 mM副溶血性弧菌上游引物0.2μL，0.1 mM副溶血性弧菌下游引物0.2μL，1.0 mM通用上游引物1.0μL，1.0 mM通用下游引物1.0μL，Pre MIX酶预混液12.5μL，DNA模板1.0μL，9.7μL灭菌去离子水；

反应程序为94℃ 45s，61℃ 45s，72℃ 30s，15个循环；94℃ 45s，54℃ 45s，72℃ 30s，15个循环；

3）PCR产物片段分析

首先将步骤2）扩增得到的PCR产物用10mM Tris-HCl稀释5倍备用，然后在每个样品管中加入甲酰胺38.5μL和DNA分子量标准品-400 0.5μL，震荡混匀，离心除去气泡并滴加矿物油之后加入分离缓冲液250μL，利用GeXP多重基因分析系统的片段分析程序进行分析；

4）结果判定

霍乱弧菌和副溶血性弧菌目标扩增产物核酸片段长度分别为288bp和261bp，分析结果若出现相应片段长度的产物峰则该对应的致病菌检测结果为阳性，否则为阴性。