CN110878368A

CN110878368A - 一种可检测snp的新型lamp方法、引物组和试剂盒

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Publication number: CN110878368A
Application number: CN201911236437.4A
Authority: CN
Inventors: 张建民; 温俊平; 廖明; 张红霞
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-03-13

Abstract

本发明公开了一种可检测SNP的新型LAMP方法，包括以下步骤：(1)提取DNA为待检测模板；(2)设计荧光基团修饰的环引物探针、内引物和外引物，环引物探针具有与DNA突变位点相结合的RNA碱基；(3)建立反应体系，将待检测模板加入到反应体系中，检测反应物是否产生荧光信号，若产生荧光信号则表示待检测模板中具有目标DNA，若未产生荧光信号则表示待检测模板中无目标DNA。相应的，本发明还公开了基于上述方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组和试剂盒。本发明的检测方法具有特异性强和灵敏度高的优点。

Description

一种可检测SNP的新型LAMP方法、引物组和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种可检测SNP的新型LAMP方法、引物组和试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即DNA序列中单个碱基的差别。在自然界中，SNP具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，与许多疾病直接相关。对于SNP的检测分析在新药研究、用药探讨、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。

目前已有报道的SNP检测技术包括高通量测序技术、毛细管电泳技术，流式荧光杂交、变性高效液相色谱检测、等位基因特异寡核苷酸片段分析，焦磷酸测序技术、ARMS-技术和HRM技术等，这些方法在SNP检测中要么检测周期长、要么灵敏度低、要么特异性不够强、要么成本高操作复杂，要么容易造成污染，因此亟需发明一种能更好地客服主流方法缺陷的SNP检测方法。

环介导等温扩增(LAMP)技术针对靶基因的多个区域设计多种特异引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst酶)，在恒温条件下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。与传统分离鉴定相比，具有周期短、敏感性强，特异性高的优点。LAMP引物组一般由内引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2)，外引物F3和B3以及环引物LoopF/LoopB组成。环引物是设计在F1c和F2之间或者B1c和B2之间的引物，其主要是在LAMP正常延伸反应启动的前提下，起到大大提高等温扩增效率的作用。然而，最初的LAMP技术仅能扩增一定的基因片段而无法实现对SNP的检测。

鸡白痢沙门菌(Salmonella Pullorum)属于肠道杆菌科沙门氏菌属的成员，其与鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌都属于沙门菌D血清组。鸡白痢沙门菌造成的鸡白痢病是一种严重的系统性疾病，能垂直传播，临床症状是体重减轻，产卵减少和生殖能力受损，严重影响蛋鸡生产，感染2～3周龄的小鸡时造成很高的死亡率；鸡伤寒沙门菌造成的禽伤寒病对任何年龄的禽类都有影响，主要在成年鸡中观察到，可垂直传播，主要临床症状是进食量突然减少，嗜睡，发烧，黄绿色腹泻，很快死亡。肠炎沙门氏菌是引起急性胃肠炎的主要病原菌，感染后的典型症状包括发热、腹泻和呕吐；在临床生产中三者有时往往难以区分。

国务院提出2020年全国所有种鸡场的鸡白痢沙门菌病达到净化标准，但目前部分场净化效果还不太理想。鸡白痢沙门菌的早期快速检测鉴别是该病防控和净化的基础。传统的分离鉴定方法周期长，经历预增菌、选择性增菌、生化鉴定、运动型检查、血清学鉴定等流程。而玻片凝集试验容易产生非特异性反应并且缺乏敏感性。因为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和鸡肠炎沙门菌都属于D血清群，具有非常相似的抗原表达式，在玻片凝集试验中纯粹依靠抗原表达式往往发生误判。因此，在目前国内养殖场提倡净化鸡白痢的大环境下，发明一种效率高、特异性强、敏感性高的鸡白痢沙门菌检测方法具有重要的公共卫生学意义。

发明内容

本发明的目的在于提出一种可检测SNP的新型LAMP方法，具有特异性强、敏感性高的特点。

本发明的目的在于提出基于一种可检测SNP的新型LAMP方法用于检测鸡白痢沙门菌的引物组和试剂盒，具有准确快速检测出鸡白痢沙门菌的特点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种可检测SNP的新型LAMP方法，包括以下步骤：

(1)提取DNA为待检测模板；

(2)设计荧光基团修饰的环引物探针、内引物和外引物，环引物探针具有与DNA突变位点相结合的RNA碱基；

(3)建立反应体系，将待检测模板加入到反应体系中，检测反应物是否产生荧光信号，若产生荧光信号则表示待检测模板中具有目标DNA，若未产生荧光信号则表示待检测模板中无目标DNA。

进一步的，环引物探针由荧光基团和淬灭基团修饰；

反应体系中包含RnaseHⅡ酶，当环引物探针与DNA突变位点结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使荧光基团和淬灭基团分离。

进一步的，内引物为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP；外引物为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3。

进一步的，反应体系包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、环引物探针、内引物和外引物。

进一步的，反应体系的反应温度为58℃-62℃。

基于上述检测方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组，包括：

正向外侧引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；

反向外侧引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

正向内侧引物FIP的核苷酸序列：

5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；

反向内侧引物BIP的核苷酸序列：

5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGCGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；

环引物探针的核苷酸序列：5′-CAGAGTATT(FAM)AGAG(RNA碱基)TCTAT-Eclipse-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

基于上述检测方法的检测鸡白痢沙门菌的试剂盒，包括反应液，反应液包括环引物探针、正向内侧引物FIP、反向内侧引物BIP、正向外侧引物F3和反向外侧引物B3；

正向外侧引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；

反向外侧引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

正向内侧引物FIP的核苷酸序列：

5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；

反向内侧引物BIP的核苷酸序列：

5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGCGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

进一步的，反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dNTP：2μl、Bst酶1.0μl、RnaseHⅡ酶0.1μl、环引物探针0.5μl、FIP+BIP 4μl和F3+B3 0.5μl。

本发明的有益效果为：

1、本发明根据该新型LAMP扩增法则提出了基于环引物探针-单核苷酸互补激活酶切割的环介导等温扩增方法用于SNP检测。该检测方法的原理是靶向含有SNP的待检基因，设计一条荧光基团修饰的环引物探针。在该探针相应位点设计可与DNA突变位点相结合的RNA碱基，当两者特异互补结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，产生荧光信号；当不发生特异结合时不产生荧光信号。基于单核苷酸互补激活酶切割产生荧光信号的原理具有非常好的特异性，能完成对SNP的特异检出，同时具有很好的敏感性。

2、本发明的可检测SNP的新型LAMP方法，具有反应效率高的特点，40min内即可完成检出。

3、本发明的可检测SNP的新型LAMP方法特异性强，能很好地从22种沙门菌和9种其他致病菌中准确检出，敏感性极强，检测下限为21个拷贝数，优于PCR方法检测结果。

4、根据NCBI已公布的沙门菌全基因序列以及查阅相关资料发现，沙门菌rfbs基因是一段具有单核苷酸多态性(SNP)的特定DNA序列。在第237位点鸡白痢为鸟嘌呤，而鸡伤寒和鸡肠炎等为腺嘌呤，别的一些血清型和别的种类的菌株不含有该基因或者变化较大。本发明根据鸡白痢沙门菌在第237位点的单核苷酸多态性，设计了基于环引物探针-单核苷酸互补激活酶切割的环介导等温扩增引物组和实验方法检测鸡白痢沙门菌。靶向鸡白痢rfbs基因，设计一条荧光基团修饰的环引物探针。在环引物探针上设计可与rfbs基因第237位点DNA碱基互补的RNA碱基，当两者特异互补结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，产生荧光信号；当不发生特异结合时不产生荧光信号，从而达到准确快速检测鸡白痢沙门菌的目的。

附图说明

图1是本发明可检测SNP的新型LAMP方法的原理图；

图2是基础反应体系扩增结果图；

图3是反应温度优化结果图；

图4是特异性评价实验结果图；

图5是敏感性评价实验结果图；

图6是临床样本分离样本鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。

实施例1一种可检测SNP的新型LAMP方法

本实施例的可检测SNP的新型LAMP方法，包括以下步骤：

(1)提取DNA为待检测模板；

在步骤(2)中，环引物探针由荧光基团和淬灭基团修饰；在步骤(3)中，反应体系中包含RnaseHⅡ酶，当环引物探针与DNA突变位点结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使荧光基团和淬灭基团分离。

本发明根据该LAMP扩增法则提出了基于环引物探针-单核苷酸互补激活酶切割的环介导等温扩增方法用于SNP检测。该检测方法的原理是靶向含有SNP的待检基因，设计一条荧光基团修饰的环引物探针。在该探针相应位点设计可与DNA突变位点相结合的RNA碱基，如图1所示，当两者特异互补结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，产生荧光信号；当不发生特异结合时不产生荧光信号。基于单核苷酸互补激活酶切割产生荧光信号的原理具有非常好的特异性，能完成对SNP的特异检出，同时具有很好的敏感性。

具体的，内引物为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP；外引物为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3。FIP、BIP、F3和B3构成LAMP扩增中的内引物组和外引物组。

具体的，反应体系包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、环引物探针、内引物和外引物。

具体的，反应体系的反应温度为58℃-62℃。在此反应温度范围下，反应可平稳进行，最优选的，反应体系的反应温度为61℃。

实施例2用于检测鸡白痢沙门菌的引物组

本实施例的引物组是基于实施例1检测方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组，包括：

正向外侧引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；

反向外侧引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

正内侧引物FIP的核苷酸序列：

5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；

反向内侧引物BIP的核苷酸序列：

5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGCGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；

环引物探针的核苷酸序列：5′-CAGAGTATT(FAM)AGAG(RNA碱基)TCTAT-Eclipse-3′；其中，Eclipse为荧光猝灭基团。

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

采用一种可检测SNP的新型LAMP方法以上述引物组对鸡白痢沙门菌rfbs基因进行检测，达到快速准确的检测效果。

实施例3检测鸡白痢沙门菌的试剂盒

基于实施例1检测方法的检测鸡白痢沙门菌的试剂盒，包括反应液，反应液包括环引物探针、正向内侧引物FIP、反向内侧引物BIP、正向外侧引物F3和反向外侧引物B3；

正向外侧引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；

反向外侧引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

正向内侧引物FIP的核苷酸序列：

5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；

反向内侧引物BIP的核苷酸序列：

5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGCGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dNTP：2μl、Bst酶1.0μl、RnaseHⅡ酶0.1μl、环引物探针0.5μl、FIP+BIP 4μl和F3+B3 0.5μl。

采用本实施例的试剂盒进行检测时，向反应液中加入菌模板2.5μl，加入超纯水不起25μl，即反应体系为25μl体系，反应温度为58℃-62℃。

以检测鸡白痢沙门菌为例，验证本发明的可检测SNP的新型LAMP方法的可靠性。

1、材料和方法

1.1菌株

鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、科瓦利斯沙门菌、德比沙门菌、罗森沙门菌、伦敦沙门菌、韦太夫雷登沙门菌、鼠伤寒沙门菌、阿尔巴尼沙门菌、巴拿马沙门菌、塞罗沙门菌、肯塔基沙门菌、哈瓦那沙门菌、姆班达卡沙门菌、婴儿沙门菌、黄金海岸沙门菌、火鸡沙门菌、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌、圣保罗沙门菌、猪霍乱沙门菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绵羊李斯特菌、志贺菌、鸭疫里莫氏杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌等，包括标准菌和由华南农业大学兽医学院人兽共患病防治重点实验室鉴定保存菌株。

1.2主要试剂

LB肉汤、LB琼脂、XLT4琼脂基础、缓冲蛋白胨水溶液(BPW)、四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(TTB)、脑心浸出液肉汤(BHI)等购自广东环凯微生物科技有限公司；Bst酶、硫酸镁、Buffer等(新英格兰生物实验室公司)；RnaseHⅡ酶(Integrated DNA Technologies)；dNTP(北京全式金生物技术有限公司)；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；超纯水由Elix100纯净水装置制备(美国Millipore公司)。

1.3实验

1.3.1提取细菌基因组DNA

采用热裂解法制备各细菌基因组DNA模板，用于下述的特异性评价实验和敏感度实验评价。

DNA模板包括鸡白痢沙门菌(2株)、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、科瓦利斯沙门菌、德比沙门菌、罗森沙门菌、伦敦沙门菌、韦太夫雷登沙门菌、鼠伤寒沙门菌、阿尔巴尼沙门菌、巴拿马沙门菌、塞罗沙门菌、肯塔基沙门菌、哈瓦那沙门菌、姆班达卡沙门菌、婴儿沙门菌、黄金海岸沙门菌、火鸡沙门菌、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌、圣保罗沙门菌、猪霍乱沙门菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绵羊李斯特菌、志贺菌、鸭疫里莫氏杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌共32株。

1.3.2构建标准质粒

根据鸡白痢沙门菌rfbs基因登录号：GenBank:LK931482.1，鸡伤寒沙门菌rfbs基因登录号：AF442573，在两种菌的rfbs基因两侧设计PCR引物。rfbs F:AATATCACCATGTACAAACTCAAAG，rfbs R:ATCGTGTAGTGGGTGAGT。用PCR方法扩增出鸡白痢沙门菌和及鸡伤寒沙门菌rfbS基因的全长。

扩增出的产物经电泳实验验证后采用商业化试剂盒(品牌Omega)进行胶回收，过夜连接T载体，将连接产物转化入DH5α感受态细胞，将该感受态细胞进行扩大培养，提取DNA进行电泳测试和进行测序验证，同时按商业化试剂盒说明提取质粒。用分光光度计测定质粒浓度并换算成拷贝数，然后-20℃保存待用。

1.3.3引物组

针对鸡白痢沙门菌rfbs基因，设计反应引物如下：

1.3.4建立基础反应体系

使用构建好的鸡白痢沙门菌标准质粒，鸡伤寒沙门菌标准质粒，设置荧光采集为1循环/min，共60个循环，调整试剂各组分比例，建立基础反应体系和优化反应温度。

基础反应体系为25μl体系，反应体系中具有：缓冲液(Buffer)2.5μl，硫酸镁2.0μl，dNTP 2μl，Bst酶(DNA聚合酶)1.0μl，RnaseHⅡ酶(核酸内切酶)0.1μl，环引物探针(Loop)0.5μl，FIP+BIP 4μl，F3+B3 0.5μl，菌模板2.5μl，超纯水补齐。

基础反应体系扩增结果如图2所示，其中，Ⅰ线是含鸡白痢沙门菌标准质粒反应体系扩增结果，Ⅱ线是含鸡伤寒沙门菌标准质粒反应体系扩增结果，Ⅲ线是不含菌模板反应体系扩增的阴性对照。由图2可知，只有鸡白痢沙门菌标准质粒发生扩增，鸡伤寒沙门菌标准质粒不发生扩增，实验结果验证原理可行，基础反应体系成功建立。

以含鸡白痢沙门菌标准质粒反应体系设置不同的反应温度扩增，进行反应温度优化，结果如图3所示，其中，a线是反应温度62℃，b线是反应温度61℃，c线是反应温度60℃、d线是反应温度59℃、e线是反应温度58℃，f线是反应温度63℃-65℃、阴性对照。取ct值最小的反应温度，最优反应温度优化为61℃。

1.3.5特异性评价实验

使用1.3.1提取的32株细菌基因组DNA模板，采用1.3.4建立的反应体系和反应温度，进行特异性评价实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和优化反应温度。结果如图4所示，其中，a线和b线是鸡白痢沙门菌的荧光检出结果，c是其他血清型沙门菌和其他种细菌、阴性对照的荧光检出结果。由图4可知，本发明的可检测SNP的新型LAMP方法能特异性的检出鸡白痢沙门菌。

1.3.6敏感性评价实验

经计算，1.3.2构建的鸡白痢沙门菌质粒质粒原液拷贝数为2.1×10¹⁰拷贝，采用10^-4—10^-10稀释度质粒用于扩增实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和优化反应温度。敏感性评价的结果如图5所示。图5中，a线为2.1×10⁶拷贝数扩增曲线，b线为2.1×10⁵拷贝数扩增曲线，c线为2.10×10⁴拷贝数扩增曲线，d线为2100拷贝数扩增曲线，e线为210拷贝数扩增曲线，f线为21拷贝数扩增曲线，g线为2.1拷贝数和阴性对照扩增线。

1.3.7临床分离样本鉴定

临床分离出27株鸡白痢沙门菌，分别提取DNA模板，用于扩增实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和优化反应温度，结果如图6所示，显示27株鸡白痢沙门菌在40min内全部被快速检出。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种可检测SNP的新型LAMP方法、引物组和试剂盒

<160> 5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggaacaatg aagctaccat a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcagtgatg ttccacaat 20

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcttccata gcaagcaata gtgtt cacga cagaaaataa ttggatcg 48

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acctgcaaca gctttaatag aaagcgaata ctgcatcaag tgatgag 48

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>

cagagtatta gagtctat 18

Claims

1.一种可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取DNA为待检测模板；

(2)设计荧光基团修饰的环引物探针、内引物和外引物，所述环引物探针具有与DNA突变位点相结合的RNA碱基；

2.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述环引物探针由荧光基团和淬灭基团修饰；

所述反应体系中包含RnaseHⅡ酶，当环引物探针与DNA突变位点结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使荧光基团和淬灭基团分离。

3.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述内引物为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP；所述外引物为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3。

4.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述反应体系包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、环引物探针、内引物和外引物。

5.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述反应体系的反应温度为58℃-62℃。

6.基于权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法用于检测鸡白痢沙门菌的引物组，其特征在于，包括：

正向外侧引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；

反向外侧引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

正向内侧引物FIP的核苷酸序列：

5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；

反向内侧引物BIP的核苷酸序列：

5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；

所述引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

7.基于权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法检测鸡白痢沙门菌的试剂盒，其特征在于，包括反应液，所述反应液包括环引物探针、正向内侧引物FIP、反向内侧引物BIP、正向外侧引物F3和反向外侧引物B3；

所述正向外侧引物F3的核苷酸序列：

5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；

所述反向外侧引物B3的核苷酸序列：

5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

所述正向内侧引物FIP的核苷酸序列：

5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；

所述反向内侧引物BIP的核苷酸序列：

5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGCGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；

所述环引物探针的核苷酸序列：5′-CAGAGTATT(FAM)AGAG(RNA碱基)TCTAT-Eclipse-3′；

所述引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dNTP：2μl、Bst酶1.0μl、RnaseHⅡ酶0.1μl、环引物探针0.5μl、FIP+BIP 4μl和F3+B30.5μl。