CN106544447B - 一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、试剂盒及方法。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病原。本发明方法，能够同时检测鉴别鸡传染性贫血病毒和鸡马立克氏病病毒，而且具有特异性强，灵敏度高，重复性好等优点，可实现同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测。本发明灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。

Description

一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免 疫荧光分析引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于养殖业的病毒检测领域，具体涉及一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、试剂盒及方法。
背景技术
近年来，免疫抑制性病毒严重影响着养禽业的经济效益，给我国养禽业带来的危害越来越受到人们的重视。最近，关于鸡马立克氏病病毒（MDV）和鸡传染性贫血病病毒（CAV）的报道不断增多，这两种病毒是世界范围内养禽业的重大威胁。马立克氏病一直以来是威胁我国养禽业的重大疫病之一。它在临床上不但引起恶性淋巴瘤和死亡，更重要的是损害感染鸡的免疫器官，造成免疫抑制状态，导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不反应，引发其他多种病原的并发和继发感染，导致多种疾病的发生，鸡的生产性能下降、甚至死亡，经济损失严重。鸡传染性贫血是由鸡传染性贫血病毒引起的以鸡再生障碍性贫血和淋巴组织萎缩为主要特征的免疫抑制病，主要在家禽生产国家流行较为严重，而我国是养禽大国，CAV 在我国的流行在所难免。CAV 所造成的免疫抑制也是非常严重的，并且 CAV 往往与MDV 混合感染，造成鸡群大批死亡，并且 CAV 能增强 MDV致病性。
目前对 CAV 和MDV的常规诊断方法主要采取病原分离鉴定、血清学试验和酶联免疫吸附试验等，但这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程等因素的限制，操作也十分繁琐、费时，而且敏感性低，特异性差，不易检测出混合感染，不利于疾病的及时诊断治疗，已不适应现代集约化养禽业发展的需要。
针对此情况分子生物学方法被广泛应用，最近国内外建立了PCR/多重PCR、荧光定量PCR等检测方法。虽然PCR技术具有特异性强、敏感度高的优点，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，而建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道，使实验难度加大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物。
本发明的另一目的在于提供一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物，所述引物核苷酸序列如下所示：
引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO:1），
引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO:2）；
引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO:3），
引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO:4）。
进一步的，所述引物C1和C2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物M1和M2其中一条引物的5’端被生物素化。
进一步的，所述引物C1和C2、M1和M2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
进一步的，所述引物C1和C2、M1和M2这2组引物对中连接的tag序列选自SEQ IDNO:5~6所示的tag序列，且该2组引物对中连接的tag序列互不相同。
一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析试剂盒，该试剂盒中含有上述任一所述引物。
进一步的，上述试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、2种编码不同荧光色的荧光编码微球。
进一步的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取DNA；
2）以提取的DNA为模板，用上述任一所述的引物进行PCR扩增；
3）将扩增产物、2种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；
4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病毒的类型；
上述方法用于非疾病的诊断的治疗。
进一步的，步骤2）中PCR扩增的反应体系为：
2×Multiplex PCR Master Mix 10µL
引物混合液 2µL
DNA模板 1µL
ddH2O 7µL
Total 20µL；
步骤2）中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。
进一步的，步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：
3种荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
总体积 100µL；37℃孵育30min。
本发明的有益效果是：
1）本发明实现了同时对鸡传染性贫血病病毒和鸡马立克氏病病毒进行检测，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值时，分辩不同类型的病原。
2）本发明方，能够同时对鸡传染性贫血病病毒和鸡马立克氏病病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。
附图说明
图1是鸡传染性贫血病病毒和鸡马立克氏病病毒2种病原PCR的电泳图；
图2是鸡传染性贫血病病毒和鸡马立克氏病病毒2种病原的多重荧光免疫分析方法检测实验结果图；
图3是鸡传染性贫血病病毒和鸡马立克氏病病毒2种病原的多重荧光免疫分析方法检测特异性实验结果图；
图4是鸡传染性贫血病病毒和鸡马立克氏病病毒2种病原的多重荧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图；
图5是鸡传染性贫血病病毒和鸡马立克氏病病毒2种病原的多重荧光免疫分析方法临床检测实验结果图。
具体实施方式
一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物，所述引物核苷酸序列如下所示：
引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO:1），
引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO:2）；
引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO:3），
引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO:4）。
优选的，所述引物C1和C2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物M1和M2其中一条引物的5’端被生物素化。
优选的，所述引物C1和C2、M1和M2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
优选的，所述引物C1和C2、M1和M2这2组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:5~6所示的tag序列，且该2组引物对中连接的tag序列互不相同。
一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析试剂盒，该试剂盒中含有上述任一所述引物。
优选的，上述试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、2种编码不同荧光色的荧光编码微球。
优选的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取DNA；
2）以提取的DNA为模板，用上述任一所述的引物进行PCR扩增；
3）将扩增产物、2种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；
4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病毒的类型；
上述方法用于非疾病的诊断的治疗。
优选的，步骤2）中PCR扩增的反应体系为：
2×Multiplex PCR Master Mix 10µL
引物混合液 2µL
DNA模板 1µL
ddH2O 7µL
Total 20µL；
步骤2）中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。
优选的，步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：
3种荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
总体积 100µL；37℃孵育30min。
优选的，步骤3）中2种编码不同荧光色的荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，2种荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 引物设计
经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对C1和C2、M1和M2对多重免疫荧光分析同时检测鸡传染性贫血病病毒（CAV）和鸡马立克氏病病毒（MDV）的效果最好，其碱基序列如下所示。
引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO:1），
引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO:2）；
引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO:3），
引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO:4）。
本发明采用多重免疫荧光分析的方法对鸡传染性贫血病病毒和鸡马立克氏病病毒进行区分，故将上述引物作进一步的修饰，以满足相应的操作要求。其中引物C1、M1的5’端连接有tag序列，所连接的tag序列分别为：
引物C1的tag序列为：5’-ATACTTTACAAACAAATAACACAC-3’ （SEQ ID NO:5）；
引物M1的tag序列为：5’-TACTTAAACATACAAACTTACTCA-3’ （SEQ ID NO:6）。
另外，引物C2、M2的5’端还添加有生物素标记。
实施例 2：检测CAV、MDV的多重荧光免疫分析试剂盒的建立
试剂盒包括以下组分：
（1）实施例1所设计的多重荧光免疫分析引物；
（2）2种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物中的tag序列互补配对；两种微球均购自luminex公司，其中CAV和MDV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A019和MTAG-A065。
（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物。
实施例3 CAV、MDV的多重荧光免疫分析方法检测方法的建立
（1）质粒的构建
用天根的核酸自动抽取仪分别提取CAV、MDV病原的DNA，分别用引物对C1和C2、M1和M2进行PCR扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的cDNA连接至pMD-19T载体中，将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。
（2）质粒PCR扩增
用实施例1所述的引物分别对CAV、MDV引物进行单重、两重PCR扩增。
上游引物混合液的制备：将C1和M1以摩尔比1:1比例进行混合；下游引物混合液的制备：将C2和M2以摩尔比1:1比例进行混合。利用两种病原的特异性模板，以及CAV和MDV两重模板，对上述两种病原的特应性区域进行扩增。其中两重模板的制备：将两两质粒以体积比1:1的比例进行混合。
PCR扩增反应体系如下：
2×Multiplex PCR Master Mix 10μl
上游引物混合液 1μl
下游引物混合液 1μl
模板 1μl（＜500ng）
ddH2O 7μl
Total 20μl。
其中上、下游引物的终浓度在1μM。
扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。1：DL2000 DNA marker，2：CAV，3：MDV，4：对CAV+MDV进行的二重PCR，5：PCR blank（PCR空白对照）。
从图1中可以看出，CAV的扩增产物大小约为121bp，MDV的扩增产物大小约为114bp，由于这两种病原的扩增产物大小相近，所以两重 PCR 扩增产物的电泳条带无法分辨。
（3）将所提PCR产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE）工作液杂交，包括以下步骤：
分别包被有特异的anti-tag序列的2种微球，其中anti-tag序列能相应地与CAV和MDV两种病原引物上的tag序列互补配对。两种微球均购自luminex公司，具体的CAV和MDV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A019和MTAG-A065。
荧光编码微球工作液的制备：将2500个/μl荧光编码微球用1.1×TmHybrdization Buffer稀释到1μl约含有125个/种荧光编码微球。
SA-PE工作液制备：将1mg/ml SA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀释到10μg/μl。
充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20μl，样品孔中加入5μl PCR产物，背景孔中加入5μl PCR blank产物，再加入75μl的SA-PE工作液，充分混匀，于金属加热器中37℃孵育30min。
依照检测仪Luminex 200仪器的说明将杂交后的50μl上述反应液进行检测，结果如图2所示，虽然两重模板的扩增产物无法用电泳分辨，但用检测仪Luminex 200仪器读取MFI值时，明显分辩不同类型的病原。
结果判断标准（注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整）如下：
最低检测阈值（cutoff值）的确定：选取10头健康鸡组织样品（每个样品平行重复3次），分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff值。本发明所获得cutoff值为452.6，因此将本发明的cutoff值定为500。只有检测样品的MFI值高于500时，该实验数据才能进行有效分析。
待测样本的分析判断：1）当待测样本的MFI值＞500时，判断为阳性样本；2）待测样本的MFI值≤500时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
实施例4 CAV和MDV的多重荧光免疫分析检测特异性实验
分别用鸡传染性贫血病毒（CAV）、马立克病毒（MDV）、鸡滑液囊支原体（MS）、鸡毒支原体（MG）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）作为模板进行多重荧光免疫分析检测。实验结果如图3所示，只有鸡传染性贫血病毒（CAV）、马立克病毒（MDV）为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。
实施例5：CAV和MDV的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验
将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至101copies/μl，用上述建立的多重荧光免疫分析方法进行检测。CAV和MDV的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验结果如图4所示，实验结果表明，CAV的灵敏度检出限为103copies/ul，MDV的灵敏度检出限为102copies/ul。
实施例6：样品的检测
从鸡场采集的脾、肾、肝等样品，用天根核酸自动抽取仪提取DNA，使用Qiagen的RT-PCR kit进行扩增，以DNA作为模板，采用上述CAV和MDV的多重荧光免疫分析检测方法进行检测，扩增产物与荧光编码微球和SA-PE杂交，在Luminex 200检测仪上读数。具体步骤参照实施例3，实验结果如图5所示。
本发明方法检测结果表明，样品4F、4S、4XW、4W、12和46为阴性样本；11、14、34、22、43、32、24、23为鸡传染性贫血病病毒与马立克病毒两重混合感染样品；其他的均为鸡传染性贫血病病毒样品单独感染样品。通过测序分析，结果一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省实验动物监测所
<120> 种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物、
试剂盒及方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgacatcgga ggagacag 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagcggat agtcatagta ga 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccattccct cttctgcc 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgagcgta aaccgtc 17
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atactttaca aacaaataac acac 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tacttaaaca tacaaactta ctca 24

Claims (10)

1.一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析引物，所述引物核苷酸序列如下所示：
引物C1：5’-CGACATCGGAGGAGACAG-3’ （SEQ ID NO:1），
引物C2：5’-GGAAGCGGATAGTCATAGTAGA-3’ （SEQ ID NO:2）；
引物M1：5’-CCCATTCCCTCTTCTGCC-3’ （SEQ ID NO:3），
引物M2：5’-GCTGAGCGTAAACCGTC-3’ （SEQ ID NO:4）。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述引物C1和C2其中一条引物的5’端被生物素化；
所述引物M1和M2其中一条引物的5’端被生物素化。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于：所述引物C1和C2、M1和M2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于：所述引物C1和C2、M1和M2这2组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:5~6所示的tag序列，且该2组引物对中连接的tag序列互不相同。
5.一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1~4任一所述引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、2种编码不同荧光色的荧光编码微球。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
8.一种检测鸡马立克氏病病毒和鸡传染性贫血病病毒的多重免疫荧光分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）从样品中提取DNA；
2）以提取的DNA为模板，用权利要求3~4任一所述的引物进行PCR扩增；
3）将扩增产物、2种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；
4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病毒的类型；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤2）中PCR扩增的反应体系为：
2×Multiplex PCR Master Mix 10µL
引物混合液 2µL
DNA模板 1µL
ddH2O 7µL
Total 20µL；
步骤2）中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：
2种荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
总体积 100µL；37℃孵育30min。
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