CN103210093A

CN103210093A - 一种检测消化道病原体的方法

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Publication number: CN103210093A
Application number: CN2011800421378A
Authority: CN
Inventors: 姜永强; 陈唯军; 杨银辉; 刘利成; 管彦芳; 朴静子
Original assignee: Beijing Bgi Gbi Biotech Co ltd; Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2031-01-26
Also published as: CN103210093B; WO2012100369A1

Abstract

本发明涉及一种能够检测常见消化道病原体的方法。本发明还涉及用于检测常见消化道病原体的扩增引物和延伸引物，以及包含这些引物的试剂盒。

Description

一种检测消化道病原体的方法

技术领域

本发明涉及病原微生物分子生物学领域，真体而言涉及消化道病原体的检测方法。本发明还涉及用于检测消化道病原体的扩增引物和延伸引物，以及包含这些引物的试剂盒。背景技术消化道病原体感染引起的传染性疾病是临床上的常见病、多发病。消化道传染性疾病通常是指由细菌、病毒等病原体导致的消化道传播疾病，一年四季均可发病，以夏秋季发病较为多见，常见的有霍乱、伤寒、病毒性肝炎、细菌性痢疾及其他感染性腹泻等。由于消化道感染的病原体经常造成水源和食品污染，由此可引起传染病暴发流行和集体发病等突发事件，直接危害人类健康和社会经济的发展。消化道传染病的病原体主要包括单核细胞李氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌等肠道致病菌，以及埃可病毒、脊髓炎病毒和柯 ^奇病毒等肠道病毒属的病毒。特别是近年来引起手足口病（HFMD )的重要病原体肠道病毒 71型，已在世界范围内多次暴发与流行，导致了严重的并发症和后遗症，并造成人死亡。因此，消化道病原体的感染和流行越来越值得密切关注。

及时准确地检出消化道感染的病原体，对于早期发现传染源、控制疾病流行及有效治疗均具有重要意义。

目前，医院及实验室常规使用病原体分离培养、生理生化、血清型水平鉴定等方法对消化道常见病原体进行检测。

传统的分离方法操作比较繁瑣，对操作人员技术水平要求比较高，且检测的周期长，如从分离过程开始计算，整个鉴定程序需 5天以上，实验安全性和结果准确性 ^保证。

血清学检测方法，包括 ^固定试验（CF )、中和¾ ^酶联免疫吸附法 ( ELISA ). ^固定试验（CF )的假阳性率高，容易误诊；中和耗时、繁瑣且费用高； ELISA检测中抗^ ^在交叉^ ί，并且蛋白质样品不能长期保存。

分子生物学技术如 PCR、实时荧光 PCR技术等的引入大大改善了检测和鉴定病原体的现状，提高了鉴定水平，但是经过长期的反复验证，证明这些方法均存在假阳性结果。 PCR显示阳性的结果常需要测序才能进一步确认; 实时荧光 PCR技术由于荧光标记种类和仪器检测通道限制等原因，在一个体系中只能对少数几种病原体进行同时检测，适应大量病原 ^测的需要。

目前，也有一些实猃室利用质博技术进行多重病原体检测，其原理是在 PCR扩增引物上加入不同质量的特异序列标签（ MassTag)，经过紫外照射使质量标签从产物上释放，继而通量光旙法分析检测到的不同质量标签，从而对病原体进行鉴定。此方法自动化程度不高，操作较为复杂，难以向临床推广。

针对消化道感染病原体的特点，建立起高效、快速、筒便、特异的检测方法，以适应疫情筛查和临床检测的需求，是当前消化道传染性疾病防治工作的重占发明内容

本发明涉及一种能够检测常见消化道病原体的方法，所述病原体包括但不限于以下 13种消化道病原体：痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、单核细胞李氏菌、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒 71型、肠道病毒通用型、戊型肝炎病毒、埃可病毒、诺如病毒、星状病毒和呼肠病毒。根据病原体基因组核酸类型（0 或者1«>^ )差异，将 13种病原体设计分成 2 个反应体系。

反应体系 1包括 4种消化道致病菌：痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、单核细胞李氏菌。

体系 2包括 9种消化道病毒：脊^ 炎病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒 71型、肠道病毒通用型、戊型肝炎病毒、埃可病毒、诺如病毒、星状病毒、呼肠病毒。

所述方法包括如步骤：

1 )使用扩增引物对对样品 cDNA或 DNA进行 PCR扩增，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测消化道病原体基因组序列的保守区；

2 )以步骤 1 ) 中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应，例如单碱基延伸反应，获得延伸产物，优选各延伸引物之间的分子量差异不小于 9道尔顿，且各延伸产物之间以及延伸产物与相应延伸引物之间的分子量差异不小于 30道尔顿，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域； 3 )用质谱系统对所述延伸产物进行质傳检测确定样品的谱峰，通过将所述与延伸引物分子量 ¾mt应延伸产物分子量信息比对（例如，使用由 Sequenom公司提供的 Typer4.0分析软件进行比对）确定待检测的消化道病原体的具体类型，优选用基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或纯化的延伸产物进行质讲检测，所述诸峰和所述扩增 I 物对和延伸？ I物信息优选被导入 Typer4.0分析软件（由 Sequenom公司提供 ) 中以进行检测结果的分析。

在一个实施方案中，还优选在步骤 1和步驟 2 )之间包括除 dNTP步骤：除去所述扩增产物中的 dNTP; 并且 /或者还优选在步骤 2和步骤 3 ) 之间包括纯化步骤：纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物。本领域技术人员可以理解，不除去扩增产物中的 dNTP可以实现本发明的目的，但除去扩增产物中的 dNTP优选在碱基延伸方案中可以排除未消耗 dNTP对延伸反应的影响。并且纯化延伸产物也不是实现本发明所必须，但纯化延伸产物可以有利于质谱系统对延伸产物分析，从而得到更加高质量的谱峰。

在一个实施方案中，本发明的方法所使用的扩增引物对的核苷酸序列包含 SEQ ID NO: 1和 2、 SEQ ID NO: 3和 4、 SEQ ID NO: 5和 6、 SEQ ID NO: 7和 8、 SEQ ID NO: 9和 10、 SEQ ID NO: 11和 12、 SEQ ID NO: 13和 14、 SEQ ID NO: 15和 16、 SEQ ID NO: 17和 18、 SEQ ID NO: 19 和 20、 SEQ ID NO: 21和 22、 SEQ ID NO: 23和 24以及 SEQ ID NO: 25和 26 中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的 5，端还包含标签序列，例如 SEQ ID NO: 40。在一些实施方籴中，本发明的方法所使用的延伸引物的核苷酸序列包含 SEQ ID NO: 27-39中的一个或多个。在一些实施方案中，本发明的方法所使用的扩增引物对和延伸引物是针对反应体系 1或 2的病原体。

在一个优选实施方案中，样品选自来自人体的样品（例如血清、全血、粪便、唾液、汗液、毛发）、土壤、食物、水、纯病原体培养物和携带此类病原体的媒介生物。在一个优选实施方案中，待检测的消化道病原体选自痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、单核细胞李氏菌、脊髓炎病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒 71型、肠道病毒通用型、戊型肝炎病毒、埃可病毒、病毒、星状病毒和呼肠病毒中的一种或多种。

采用本方法解决了目前的检测方法灵敏度低，特异性差，做到多重检测，成本高，周期长，自动化程度低的缺陷。

与目前的检测方法相比，本发明的方法具有如下优点:

1 )使用的试剂耗材相对简单，反应体系稳定，不需要使用荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂，且不易造成环境污染；

2 )反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用，降低成本；

3 ) 由于质谱技术直接检测 DNA的分子量（质荷比）且直接确定碱基的类型（即不需要经过任何形式的信号转换），因此，理论上只要有一个拷贝的扩增 DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；

4 )质溽技术本身具有高度自动化的特点，与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多种呼吸道病原体，节省时间、人力、物力，提高检测通量。

同时, 本发明的技术方案采用了质技术，特别是基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间质谱系统（MALDI-TOF-MS ), 通过设计一套全新的扩增引物对和延伸引物，实现了对上述 13种消化道病原体的检测。其与其它现有方法相比，能够同时准确检测出 13种消化道病原体，具有高通量、自动化、低成本的特点，有显著的优点。

本发明还涉及用于检测 13种常见消化道病原体中一种或多种的扩增引物对和 /或延伸引物。在一些实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列包舍 SEQ ID NO: 1和 2、 SEQ ID NO: 3和 4、 SEQ ID NO: 5和 6、 SEQ ID NO: 7和 8、 SEQ ID NO: 9和 10、 SEQ ID NO: 11和 12、 SEQ ID NO: 13和 14、 SEQ ID NO: 15和 16、 SEQ ID NO: 17和 18、 SEQ ID NO: 19 和 20、 SEQ ID NO: 21和 22、 SEQ ID NO: 23和 24以及 SEQ ID NO: 25和 26中的一对或多对。

在一些实施方案中，在所述扩增引物的 5'端还包含标签序列。在一些实施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含 SEQ ID NO: 27-39中的一个或多个。

本发明还涉及包含用于检测 13种常见消化道病原体中一种或多种的扩增引物对和 /或延伸引物的试剂盒。在一些实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列包含 SEQ ID NO: 1和 2、 SEQ ID NO: 3和 4、 SEQ ID NO: 5 和 6、 SEQ ID NO: 7和 8、 SEQ ID NO: 9和 10、 SEQ ID NO: 11和 12、 SEQ ID NO: 13和 14、 SEQ ID NO: 15和 16、 SEQ ID NO: 17和 18、 SEQ ID NO: 19和 20、 SEQ ID NO: 21和 22、 SEQ ID NO: 23和 24 以及 SEQ ID NO: 25和 26中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的 5'端还包含标签序列。在一些实施方案中，所伸引物的核苷酸序列包含 SEQ ID NO: 27-39中的一个或多个。在一些实施方案中，本发明的试剂盒中的扩增引物对和延伸引物是针对^ ί体系 1或 2的病原体。

本发明中使用标签序列的目的仅是为了增加与标签序列相连的引物序列的分子量，以排除这些引物在后续试验的影响，本领域技术人员可以根据需要以及通常的引物设计原则选择使用不同的标签序列，而实现本发明的目的。因此，在一些实施方案中可以使用任何可以达到上述目的，且不会与检测目的物相互作用的标签序列。

在一些实施方案中，上述的试剂盒中的其他试剂为用于 PCR扩增反应的酶和试剂，用于延伸反应的酶和试剂，以及 /或者用于纯化延伸产物的树脂。所述延伸反应可以是单碱基延伸反应、双^ JJ^伸反应或多¾ ^伸反应。

在一些实施方案中，本发明涉及上述的扩增引物对和 /或延伸引物用于对样品中的消化道病原体进行检测的用途；或者上述试剂盒用于对样品中的消化道病原体进行检测的用途。在一些实施方案中，本发明涉及上述的扩增引物对和 /或延伸引物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测样品中的消化道病原体。

以下表 1和表 2中分别示例性显示了针对所迷 13种常见的消化道病原体的 PCR扩增引物，以及针对所述 13种消化道病原体的延伸引物。

表 1: 针对所述 13种常见的消化道病原体的 PCR扩增引物

SEQ ID NO. 引物名称引物序列 5'-3' 引物说明

1 invAF CAAATGGGTTGTTCAACAGC 伤寒沙门氏菌正向引物

2 invAR TGCCGGTTTTATCGTGACTC 伤寒沙门氏菌反向引物

3 iapF ACGTGAGAAATTCCGCTACC 单核细胞李氏菌正向引物

4 iapR GCACTACAAGAATCTCTGAATCTC 单核细胞李氏菌反向引物

5 ctxAF AGCACCCCAAAATGAACTCG 霍乱孤菌正向引物 · · '

6 ctxAR CAGTCCTCATCCAGATGAAC 霍乱弧菌反向引物

7 ipaBF TCAATGCAACTCGAAAAAGA 痢疾杆菌正向引物 ipaBR GATTTCTGCTGGGTTGATAG 痢疾杆菌反向引物

ECHOF TGGGACGCTTCAATACTGACATGG 埃可病毒正向引物

ECHO CAGTTAGGATTAGCCGCATTCA 埃可病毒反向引物

COXA16F GGTGCAGAAACACCATCATC 柯萨奇病毒正向引物

COXA16R GCAGTAAAGCAAGGCATACCA 柯萨奇病毒反向引物 astrvF GGAATTCTGATATCCGGCAGA 星状病毒正向引物 asrevR CATTCTGATGCGCCTCTAAG 星状病毒反向引物

REVF TTGGATCTCTGCAACGCAAG 呼肠病毒正向引物

REVR CGACGTAATCCTGATGACGA 呼肠病毒反向引物

EV71F ACCCTATCTCCCTGGATGGT 肠道病毒 71型正向引物

EV71R GCAGCCCAAAAGAACTTCAC 肠道病毒 71型反向引物

NVG5F GTCCCTTGACAAGACCACTTC i ^。病毒正向引物

NVG5R CTGTGAAGGATTCCCCGTT 1¾ 病毒反向引物

HEVF TAAAGCTTCACTGTCGGCTC 戊型肝炎病毒正向引物

HEVR GAATTGATTTCGTCGGCTGG 戊型肝炎病毒反向引物

PLVF ACGTTCACTCCTGACGACAA 炎病毒正向 1物

PLVR TGCCATTTCCAAAGAGGTAATCC ^k J 炎病毒反向 51物

EV71-cmnF TTGATACTCAGTCCGGGGAAACAG 肠道病毒通用型正向引物

EV71-cmnR TCAATAGCAGGCATAACGCTCC ^道病毒通用型反向引物表 2: 针对所述 13种消化道病原体的延伸引物

34 UEPREV TGAAGCATTTGCCTCACCATA 呼肠病毒

35 UEPEV71 AAGTTGTGCAAGGATGCTAG 肠道病毒 71型

36 UEPNVG5 CACATGCGGAAAAACGAC 口病毒

37 UEPHEV AGACGACGGGGCGAGAGTAAAATA 戊型肝炎病毒

38 UEPPLV GACATCACCTGCCCGTAG 炎病毒

39 UEPEV71-cmn AGTTATGTCTTGATCAAGCACT 肠道病毒通用型本发明的方法具有快速、高效、平行化、自动化、高通量的优势，实现了对 13种常见消化道感染病原体中的一种或多种进行同时检测，可以对消化道病原体进行快速、筛查，为病原定、临床疾病诊断、环测、食物中毒检测、进出口食品检疫、流行病学调查和卫生监督等提供高效的检测方法，为控制疫情的暴发和应急预防提供检测依据。附图说明下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围进行限定。本领域技术人员参考如下对附图和优选实施方案的详细描述，显然可以明了本发明的各种目的和各个有利方面。

峰图中引物峰潘高度和产物峰语高度与实验中加入的引物浓度、检测样品消化道病原体载量等有关，具体实验需要具体分析，以下峰图仅作为参考并且是为了更好地描述优选实施方案。

图 1是对单核细胞李氏菌（ iap )质粒样品的检测结果峰图，其中显示在质量 6740.4处有明显的而在质量 6469.2处的峰（对应于延伸引物峰）明显消失，这表明样品中含有单核细胞李氏菌（iap )质粒。

图 2是对肠道病毒 71型（ EV71 )质粒样品的检测结果峰图，其中显示在质量 6548.1处有明显的峰谱，而在盾量 6221.0处的峰 (对应于延伸引物峰 ) 明显消失，这表明样品中含有肠道病毒 71型（EV71 )质粒。

图 3是对临床混合感染病原体样本的检测结果峰图，其中显示了检测到的各个峰。从图中可以看出， EV71 ( T )和 EV71_cmn ( T )两个位置有明显的峰存在，因明样本中存在肠道病毒 71型和肠道病毒通用型。具体实施方式本发明提供了一种对样品中的消化道病原体进行检测的方法，其包括以下步骤：

1 )使用扩增引物对对样品 cDNA或 DNA进行 PCR扩增，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测病原体基因组序列的保守区；

2 )以步骤 1 ) 中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应，例如单碱基延伸反应，获得延伸产物，优选各延伸引物之间分子量差异不小于 9道尔顿，且各延伸产物之间 5½伸产物与相应延伸引物之间的分子量差异不小于 30道尔顿，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；

3 )用质谱系统对所述延伸产物进行质讲检测确定样品的谱峰，并通过将所述与延伸引物分子量 Sjf†应延伸产物分子量信息比对（例如，使用由 Sequenom公司提供的 Typer4.0分析软件进行比对）确定待检测的消化道病原体的具体类型，优选用基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或纯化的延伸产物进行质潘检测，所述躇峰和所述扩增引物对和延伸引物信息优选被导入 Typer4.0分析软件（由 Sequenom公司提供）中以进行检测结果分析。

在上述方法的步骤 1 )中，本领域技术人员可以按照常规的 PCR扩增方法进行 PCP扩增。对于具体的 PCR扩增，本领域技术人员可以根据扩增目的核酸、引物以及其他条件选择 PCR扩增条件。如果要检测病原基因组类型为 RNA,将所述样品中的 RNA并反转录成 cDNA的方法是本领域技术人员可以用常规方法实现的，步驟 1 )中的样品可以是检测的样品，例如来自人体或动物体的样品（例如血清、全血、粪便、唾液、汗液、毛发）、土壤、食物、水、纯病原体培养物和携带此类病原体 ^媒介生物- 在上述方法的步骤 2 )中，本领域技术人员可以按照常规的½延伸法进行延伸反应。对于具体的延伸反应，本领域技术人员可以根据延伸目的核酸、延伸引物以及其他条件选择延伸反应条件。

在上述方法的步 3 )中，可以通过质谱系统完成对所述延伸产物或纯化的延伸产物的质谱检测和分析。例如本领域中常用的质谱系统有 Sequenom MALDI-TOF质和 Typer4.0分析软件、布鲁克 ·道尔顿的基质辅助激光解吸附电离（MALDI ) 飞行时间质谱仪 ( MALDI-TOF ), 岛津公司的基质辅助激光解离离子源-线性飞行时间质谱等

在一个实施方案中，还优选在步骤 1和步骤 2 )之间包括除 dNTP步骤：除去所述扩增产物中的 dNTP,可以通过本领域已知的任何方法除去所述 dNTP , 但优选通过使用 SAP 酶处理所述扩增产物来除去 dNTP。在一个实施方案中，还优选在步骤 2和步骤 3 )之间包括纯化步骤：纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物，可以通过本领域已知的任何方法纯化延伸产物，但优选使用离子交换树脂进行纯化。

扩增引物和延伸引物可以如下方式进行设计、制备：根据所选择的 13 种待检测消化道病原体的基因序列，设计出针对每种消化道病原体的特异性扩增引物，设计的扩增引物区域在每种病原体的种内相对保守， ^^种间具有特异性。在所述扩增引物的 3'端具有与其所针对的病原体类型的基因序列完全匹配的至少 15 个碱基，在所述扩增引物的 5，端可以具有标签序列 ( Tag )，例如实施例中使用的 SEQ ID NO: 40 ( acgttggat )。加标签序列的目的为增加引物序列的分子量，以排除其在后续步骤中的影响。设计延伸引物，所^!伸引物的长度为 17-28个并 iLji其 3'端包括延伸内的 5 个具有病原体类型特异的高度保守性位点标记。同时，各延伸引物之间的分子量差异不小于 9道尔顿，且各病原体类型的延伸产物之间及延伸产物与相应延伸引物之间的分子量差异不小于 30道尔顿；按照引物间、引物与扩增产物 /延伸产物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质讲检测的延伸引物满足如下条件：各延伸产物之间以及延伸产物与各个延伸引物之间的分子 * 相互间的差别不小于 30道尔顿，各延伸引物之间的分子量差异不小于 9道尔顿，延伸引物与延伸产物的分子量在 4500—8500道尔顿之间。按照引物间、引物与产物间不形成二聚体，引物自身不形成发卡结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计上述引物。本发明中针对所述 13种常见消化道病原体的扩增引物对参见表 1，延伸引物参见表 2。实施例 1:

在本实施例中，提供了对 2种病原体盾粒（单核细胞李氏菌、肠道病毒 71 型）进亍检测的方法，包括如下步骤： ( 1 )通过 PCR扩增获得待测病原体质粒目的序列的扩增产物。使用的扩增引物组参 Μ 1 (待检测病原体所在体系 1或 2中的对应引物组合 )，其中每条引物在制备时需在其 5'端加上 10个碱基的标签序列（ acgttggatg )，目的为增加引物序列的^ 量，以排除其在后续步骤中的影响。

PCR扩增所使用的体系如下，其中所有试剂均购买自 Sequenom公司：

PCR反应条件为： 94 , 15分钟； 94 变性 20秒， 56 退火 30秒， 72€ 延伸 1分钟，共扩增 45循环；最终延伸 3分钟。其中使用的模板 DNA 是人工构建的病原体质粒。

本实施例中使用的病原体质粒按照如下方法进行制备：守基因区，将扩增产物分别克隆入 PMD-T载体 (Takara PMD-T连接试剂盒)，然后转化入大肠杆菌 DH5a。转化后的大肠杆菌经蓝白斑筛选以及二次扩大培养后，用于质粒提取。使用质粒提取试剂盒（购自 AXYGEN公司) ^取并纯化质粒。通过 DNA测序对质粒进行鉴定。分别测定制备好的各型质粒的 OD值。根据 OD值将各型质粒稀释为 500 pg/μΚ 5 pg/μΐ和 0.5 pg/μΐ三种浓度的存储液。然后根据摩尔公式： 1 ng质粒的拷贝数 -〖1 x 10-9/12 X 330 x (载体分子量 + 插入片断分子量)] X 6.02 10²³计算出 1 ng质粒的拷贝数。再根据这个值将各型质粒稀释为 1000拷贝 /μ1。本实施例中的质粒浓度均为 1000拷贝 /μ1。本实施例中，将无菌双蒸水作为阴性对照，将对照样本与待测质粒样照相同的过程进行反应和测试，以^ ^r测的有效性。

( 2 )通过坏碱性磷酸酶（SAP酶）处理，除去步驟 ( 1 )获得的扩增产物中含有的 dNTP。 SAP酶反应体系如下，所有试剂购买自 Sequenom公司：

SAP酶反应条件为 37Ό温育 40分钟，以去除 PCR扩增反应中剩余的 dNTP; 85"C温育 5分钟，以使 SAP酶失活。

( 3 )以步骤（2 )中获得的产物为模板，通过延伸反应，在延伸引物的 3，端连接一个½, 从而得到延伸产物。使用的延伸引物参 2中的相应反应体系 1或 2的延伸引物。延伸^ 体系如下，所有试剂购买自 Sequenom 公司：

*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整（即根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。

延伸反应条件： 94V , 30秒；变性 5秒, 退火 5秒， 80* 延伸 5秒，共扩增 40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行 5个小循环；最终 72 X：延伸 3分钟。

( 4 )采用离子交换树脂（购买自 Sequenom公司）纯化步骤（3 ) 中获得的延伸产物。在延伸产物中加入 6 m_g树脂， 18.00 μΐ水，垂直摇匀一小时。经步后，树脂将与^ 体系中的阳离子充分结合，从而^½体系脱盐。反应完成后的纯化的延伸产物可在 4 下保存数天，也可在 -20 下保存数周。所得的纯化的延伸产物在 4000 rpm离心 5分钟后，取上清直接用于质讲检测。

( 5 )依照制造商建议的步骤，将纯化的延伸产物在 MALDI-TOF质谱仪（购自 Sequenom公司）上进行盾"^检测。根据提供商的说明书，所得到的质"^图通过 Typer4.0分析软件 (由 Sequenom公司提供）进行分析，得到分型结果。峰图报告-^分为四种： A: 结果可靠； B:结果中度可靠； C: 结果一般可靠； D:结果^ A可靠。前三种表示结果可靠，有相应病原体感染；后一种表示峰图基线不稳，视为结果无效。但是在具体的实验中要根据具本信息和峰图信息具体分析。

以下结合图 1-2, 对上述病原体质粒检测结果进行分析说明。

从图 1可知，当使用单核细胞李氏菌（iap )质粒作为模板 DNA时，质谱检测在质量 6740.4处检测到峰，所述峰经软件分析后，被确认为是单核细胞辛氏菌（iap )延伸产物的峰，而在质量 6469.2处的峰（对应于延伸引物峰）不存在，说明延伸引物已经^ 应消耗，从而确定样品中含有单核细胞李氏菌 ( iap )盾粒。

与此类似，图 2显示了肠道病毒 71型（ EV71 )质粒的检测结果。当使用肠道病毒 71型（ EV71 )质粒作为模板 DNA时，质旙检测在质量 6548.1处检测到峰，所述峰经软件分析后，被确认为是肠道病毒 71型（EV71 )延伸产物的峰，而在质量 6221.0处的峰（对应于延伸引物峰）不存在，说明延伸引物已经^ 应消耗，从而确定样品中含有肠道病毒 71型（EV71 )质粒。

上述这些结果均与已知质粒型别完全一致。

从本实施例可知，本发明所开发的引物和方法可以实现对 13种常见消化道感染病原体（包括痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、单核细胞李氏菌、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒 71型、肠道病毒通用型、戊型肝炎病毒、埃可病毒、诺如病毒、星状病毒、呼肠病毒）的检测和鉴别。实施例 2：

在本实施例中，提供了对临床采集的病原体混合感染样本的检测方法，包括如下步骤：

( 1 )对临床采集的样^ ϋ行前期处理，使用试剂盒 ( QIAGE 公司）提取病原体 DNA和 RNA,利用购自 Takara公司的 PrimeScript® RT reagent Kit 将提取的 RNA样本反转录为 cDNA。

步骤（2 ) - ( 6 ) 同实施例 1中步骤（1 ) - ( 5 ), 不同之处^于 PCR扩增反应体系中使用的模板 DNA为以上步骤（1 ) 中制备的临床样本 DNA和 cDNA, 并且使用的扩增引物和延伸引物体系 2所对应的扩增引物和延伸引物。

以下结合图 3，对上述病原体混合感染样本检测结果进行分析说明。

图 3为使用临床混合感染病原体 cDNA作为模板时质语检测峰图，其中显示了检测到的各个峰。位置有 UEP字样的该处是相应的延伸引物峰位置，同颜色仅有单个碱基的峰谱位置代表延伸该碱基的产物峰位置，如 UEP.EV71表示肠道病毒 71型的延伸引物位置， T表示肠道病毒 71型的延伸产物位置。从图中可以看出， EV71 ( T )和 EV71_cmn ( T)两个位置有明显的峰存在，因明样本中存在肠道病毒 71型和肠道病毒通用型。

从本实施例可知，本发明所开发的引物和方法可以实现对临床样本中 13 种常见消化道混合感染病原体的多重检测。

Claims

权利要求书

1. 对样品中的消化道病原体进行检测的方法，其包括以下步骤：

1 )使用扩增引物对对扩增样品的 cDNA或 DNA进行 PCR, 从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测消化道病原体基因组序列的保守区；

2 )以步骤 1 ) 中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应获得延伸产物，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域，所述延伸反应优选是单碱基延伸反应；但不限于单碱伸，可以是 ¾ ½ ^伸^ ί或多?¾JJ伸；

3 )对所述延伸产物进行质语检测确定样品的谱峰，通过将所述语峰与延伸引物分子量应延伸产物分子量信息比对确定待检测的消化道病原体的具体类型。
2. 权利要求 1的方法，其中在所述步骤 1 )之后和步驟 2 )之前还包括除去所述扩增产物中的 dNTP的步驟，优选通过使用虾碱性磷酸酶（ SAP酶）处理所述扩增产物来除去 dNTP;
3. 权利要求 1或 2的方法，其中在所述步骤 2 )之后和步骤 3 )之前还包括纯化步骤：純化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物，优选使用离子交换树脂进行纯化。
4. 权利要求 1-3任一项的方法，其中在所述步骤 3 )中用基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或所述纯化的延伸产物进行质讲检测。
5. 权利要求 1-4任一项的方法，其中所述消化道病原体选自痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、单核细胞李氏菌、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒 71型、肠道病毒通用型、戊型肝炎病毒、埃可病毒、诺如病毒、星状病毒和呼肠病毒中的一种或多种。
6. 权利要求 1-5任一项的方法，其中所述扩增引物对包含 SEQ ID NO: 1和 2、 SEQ ID NO: 3和 4、 SEQ ID NO: 5和 6、 SEQ ID NO: 7 和 8、 SEQ ID NO: 9和 10、 SEQ ID NO: 11和 12、 SEQ ID NO: 13和 14、 SEQ ID NO: 15和 16、 SEQ ID NO: 17和 18、 SEQ ID NO: 19和 20、 SEQ ID NO: 21和 22、 SEQ ID NO: 23和 24以及 SEQ ID NO: 25 和 26中的一对或多对，或者 5，端包含标签序列的 SEQ ID NO: 1和 2、 SEQ ID NO: 3和 4、 SEQ ID NO: 5和 6、 SEQ ID NO: 7和 8、 SEQ ID NO: 9和 10、 SEQ ID NO: 11和 12、 SEQ ID NO: 13和 14、 SEQ ID NO: 15和 16、 SEQ ID NO: 17和 18、 SEQ ID NO: 19和 20、 SEQ ID NO: 21 和 22、 SEQ ID NO: 23和 24以及 SEQ ID NO: 25和 26中的一对或多对，其中所述标签序列优选是 SEQ ID NO: 40; 并且 /或者所述延伸引物包含 SEQ ID NO: 27-39中的一个或多个。
7. 权利要求 1-6任一项的方法，其中所述样品选自来自人体的样品、土壤、食物、水、纯病原体培养物和携带此类病原体的媒介生物，所述来自人体的样品例如血清、全血、粪便、唾液、汗液、毛发。
8. 一种试剂盒，其包含权利要求 6中定义的扩增引物对和 /或延伸引物，或者还包含其他试剂，其中所述其他试剂优选是用于 PCR扩增反应的酶和试剂，用于延伸反应的酶和试剂，以及 /或者用手纯化延伸产物的树脂。 ^
9. 权利要求 6中定义的扩增引物对和 /或延伸引物用于对样品中的消化道病原体进行检测的用途；或者用于制备试剂盒的用途，所述 _ 试剂盒用于检测样品中的消化道病原体；或者权利要求 8的试剂盒甩于对样品中的消化道病原体进行检测的用途。

10. SEQ ID NO: 1-39中的任一条核苷酸序列。