CN117230184A - 基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的核酸组合及应用 - Google Patents

基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的核酸组合及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的核酸组合及其应用。本发明的核酸组合包括SEQ ID NO.1‑15的引物组合。本发明还提供包含上述引物组合的试剂盒。本发明提供的核酸组合可以与基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱技术相结合，能够简便、准确、高效地检测阿尔兹海默病基因上5个位点的SNP分型，保证检测结果准确可靠，满足临床需求。将一代测序的结果与飞行时间核酸质谱做对比，5个SNP位点的测序结果与飞行时间核酸质谱检测结果一致，从而，本发明的检测方法准确可靠。

Description

基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的核酸组 合及应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的核酸组合及应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease ,AD)是一种中枢神经系统退行性变性疾病，主要的神经病理学改变包括β淀粉样蛋白Aβ沉积形成的细胞外老年斑，微管相关蛋白tau过度磷酸化导致的神经细胞内神经纤维缠结、神经元丢失、淀粉样血管改变等。遗传因素、环境因素、吸烟饮酒等生活方式、心脑血管等基础疾病及年龄增长均为AD发生进展的危险因素，其中60-80%的风险由遗传因素解释。AD在临床前期难以发现和识别，确诊后主要为对症治疗，暂无特效药，因此AD的早期评估、诊断及预防至关重要。
根据发病年龄，AD可分为早发型AD(EOAD，发病年龄＜65岁)和晚发型AD(LOAD，发病年龄≥65岁)，EOAD呈现家族聚集性，LOAD则以散发性为主。截止目前，多个研究报道了单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与AD易感的相关性，已经确定了40多个与AD相关的基因位点。
目前市场上存在多种针对基因多态性检测的技术平台，如Taqman 探针法、SNaPshot法、飞行时间质谱分型、HRM(高分辨率熔解曲线)分型等技术平台。其中，基于时间飞行质谱完成的SNP检测准确率可达99.9%，除了准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短等优势外，还具有较高的性价比，飞行时间质谱平台是国际通用的基因单核苷酸多态性(SNP)的研究平台，该方法凭借其科学性和准确性已经成为该领域的新标准。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供检测阿尔兹海默病基因的核酸组合。
本发明的再一目的在于提供检测阿尔兹海默病基因的试剂盒。
本发明选取与阿尔兹海默病早发型家族性遗传致病相关的基因上的3个位点，分别是PSEN1基因上的rs165932位点，PSEN2基因上的rs8383位点，APP基因的rs466448位点，同时，本发明选取与晚发型相关的基因ApoE上的rs7412和rs429358位点，以上述5个位点为检测位点。
基于上述位点，本发明的提供一种检测阿尔兹海默病基因的核酸组合。
根据本发明具体实施方式的检测阿尔兹海默病基因的核酸组合，其包括用于检测5个基因多态性位点的扩增引物和延伸引物，上述扩增引物和延伸引物各自对应检测的基因名称和SNP位点如表1所示：
用于扩增rs7412位点的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5'-ACGTTGGATGTAAGCGGCTCCTCCGCGAT-3'；
用于扩增rs7412位点的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5'-ACGTTGGATACGCGGCCCTGTTCCACCAG-3'；
用于对rs7412位点进行单碱基延伸的延伸引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
5'-ATGCCGATGACCTGCAGAAG-3'；
用于扩增rs429358位点的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
5'-ACGTTGGATTCGGAACTGGAGGAACAACT-3'；
用于扩增rs429358位点的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
5'-ACGTTGGATCAGCTCCTCGGTGCTCTG-3'；
用于对rs429358位点进行单碱基延伸的延伸引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
5'-GCGCGGACATGGAGGACGTG-3'；
用于扩增rs165932位点的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
5'-ACGTTGGATTGAAACGCTTTTTCCAGCTCTCA-3'；
用于扩增rs165932位点的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
5'-ACGTTGGATTTCAGTTCCGATAAATTCTAC-3'；
用于对rs165932位点进行单碱基延伸的延伸引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
5'-CTGATTACTAATTCAATATC-3'；
用于扩增rs8383位点的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：
5'-ACGTTGGATACAGGAAGCACAGCAGGTTT-3'；
用于扩增rs8383位点的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示：
5'-ACGTTGGATGGAACTGGCTTTTCCTCTCC-3'；
用于对rs8383位点进行单碱基延伸的延伸引物，其核苷酸序如SEQ ID NO.12所示：
5'-CTGAGAAGGTCAGATTAGGG-3'；
用于扩增rs466448位点的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示：
5'-ACGTTGGATCATGCCACTTTCTCCTGGAT-3'；
用于扩增rs466448位点的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示：
5'-ACGTTGGATGGGCTGTGGCTTGGTAACTA-3'；
用于对rs466448位点进行单碱基延伸的延伸引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示：
5'-TGCTCTAGAACTGCCCAGAT-3' 。
在本发明中，扩增引物是用于多重PCR扩增，需要在一个反应管中同时扩增5个靶点，因此其中一个靶点的扩增势必会影响其他靶点的扩增，所以要通过引物设计以及反应条件的优化来提高扩增效率，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。
本发明经过多次实验验证与优化获得了上述扩增引物，其具有特异性好，扩增效率高的特点。
本发明在设计扩增引物的时候，避开了同源序列设计引物，特别是rs7412和rs466448有一段11bp的碱基同源，rs7412与rs429358两个突变位点相差137bp的碱基，为了保证每个位点都有较高的扩增效率，每个位点设计了独立的特异性引物，让PCR产物的长度尽可能的短。
第二方面，本发明提供了一种检测试剂盒，其包括上述核酸组合，优选的，所述试剂盒为基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的试剂盒。
在一些实施例中，上述试剂盒包括5重PCR预混液；5重PCR预混液中包括上述核酸组合中的扩增引物。
在一些实施例中，多重PCR预混液中还含有dNTP Mix；
在一些实施例中，多重PCR预混液中还含有Mg2+、PCR缓冲液和DNA聚合酶；
在一些实施例中，Mg2+以MgCl2的形式添加至多重PCR预混液中；
在一些实施例中，DNA聚合酶可以为TaqDNA聚合酶；
在一些实施例中，上述试剂盒中还包括iPLEX延伸预混液；
在一些实施例中，iPLEX延伸预混液中包括延伸引物组；
在一些实施例中，iPLEX延伸预混液中还包括iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合液和iPLEX酶；
在一些实施例中，上述试剂盒还包括SAP消化预混液，SAP消化预混液含有SAP缓冲液和SAP酶，SAP酶消化除去多余的酶、buffer、Mg2+、dNTP；
第三方面，本发明还提供了一种基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的方法，使用上述核酸组合或上述试剂盒进行检测。
在一些实施例中，为了增加引物的扩增效率，跨内含子设计引物，选用合适的DNA聚合酶，本发明优化了在扩增过程中MgCl2的浓度，以及 dNTP的比例浓度，最终使得5个位点的扩增效率和延伸效果达到最优。
在一些实施例中，多重PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃延伸2min。
在一些实施例中，SAP酶消化的反应程序为：37℃保温40min；85℃保温5min。
在一些实施例中，单碱基延伸的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，52℃退火5s，80℃延伸5s，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。
在一些实施例中多重基因检测具有反应体系复杂，产物种类多样化和易导致交叉污染等特点，使用DP-TOF飞行时间质谱仪进行基因检测，需要进行加样、多重PCR、SAP消化、单碱基延伸、转板撕膜和芯片点样后上机检测的步骤。
本发明的有益效果：
本发明选择5个基因位点，通过设计覆盖5个位点的多重PCR引物和单碱基延伸引物，可在一个反应体系内同步实现5个目的靶点的扩增检测，具有特异性好，扩增效率高的特点。
本发明提供的核酸组合可以与基质辅助激光解离吸附飞行时间质谱技术相结合，能够简便、准确、高效地检测阿尔兹海默病基因上5个位点的SNP分型，保证检测结果准确可靠，满足临床需求。将一代测序的结果与飞行时间核酸质谱做对比，5个SNP位点的测序结果与飞行时间核酸质谱检测结果一致，从而，本发明的检测方法准确可靠。从而，在获得基因型的检测结果后，医生结合临床指标，便于进行进一步进行综合的判断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示5个SNP位点的引物的凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例 1
本发明选取与阿尔兹海默病早发型家族性遗传致病相关的三个基因上的3个位点，分别是PSEN1基因上的rs165932位点，PSEN2基因上的rs8383位点，APP基因的rs466448位点，同时，选取与晚发型相关的基因ApoE上的rs7412和rs429358位点。
rs7412位点，SEQ ID NO 16:
CACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAG[C>T]GCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGG
rs429358位点，SEQ ID NO.17:
TTCTCCCCGCCTCCCACTGTGCGACACCCTCCCGCCCTCTCGGCCGCAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAGGAGTTGAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTG[T>C]GCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGC
rs165932位点，SEQ ID NO.18:
TTCCTTCGTTAATTCCTCCCTACCACCCATTTACAAGTTTAGCCCATACATTTTATTAGATGTCTTTTATGTTTTTCTTTTTCTAGATTTAGTGGCTGTTTTGTGTCCGAAAGGTCCACTTCGTATGCTGGTTGAAACAGCTCAGGAGAGAAATGAAACGCTTTTTCCAGCTCTCATTTACTCCTGTAAGTATTTGAGAA[G>T]GATATTGAATTAGTAATCAGTGTAGAATTTATCGGAACTGAAGCACATGTAACTATGGTCATTTTCATGGTACTTGTTCTCATCTTAAATGCACAGCATTCCTGGAACTCCTGCAGATCTCTTTGTTTCCTTGCAAGCAATTGTCTTCTACCTGATGTTGATTCAAGAGAGTTTTCAATATGAATAGAAAGAAAGAAAAT
rs8383位点，SEQ ID NO.19:
TCTAGTGCCATATATTTTTAAGACTTTTCTTTCCTTAAAAAATAAAGTACGTGTTTACTTGGTGAGGAGGAGGCAGAACCAGCTCTTTGGTGCCAGCTGTTTCATCACCAGACTTTGGCTCCCGCTTTGGGGAGCGCCTCGCTTCACGGACAGGAAGCACAGCAGGTTTATCCAGATGAACTGAGAAGGTCAGATTAGGG[C>T]GGGGAGAAGAGCATCCGGCATGAGGGCTGAGATGCGCAAAGAGTGTGCTCGGGAGTGGCCCCTGGCACCTGGGTGCTCTGGCTGGAGAGGAAAAGCCAGTTCCCTACGAGGAGTGTTCCCAATGCTTTGTCCATGATGTCCTTGTTATTTTATTGCCTTTAGAAACTGAGTCCTGTTCTTGTTACGGCAGTCACACTGCT
rs466448位点，SEQ ID NO.20:
AAAATTAGGAGAGATCATTCGTATTCGACCCCCGTAAATGAGGACTTCTGACCTCAAACGCTGCCCTTGTTCTTCATTGTGTCTGTCCTGAATTATAGAAATGAACCTTCTGCCATGCCACTTTCTCCTGGATTAAACACAAACCGTCCACTGTCCAGTTAGTGTCCAGATAGTTTAGAATGCTCTAGAACTGCCCAGAT[A>G]TATCCCCTGCTCTTGACCTGAAGTAGCATTTAGTTACCAAGCCACAGCCCACTCCACACAGGGCTTGGAGCGAAGGACTGAAGCCAGGGAGTGCTCTGGCCCTTCTGAGGGCTGCACTGCAGCCTGCCTTCTCTCCCTTGCTCATTGCGCTGACAAGGGTGCCTAGGCCCGGGAAGGATGGCTCAGCCAGCGGGGTACAG
根据上述基因序列设计了多组引物组合，经blast比对每个位点选择4对特性性引物，引物序列如下：
利用上述引物，经PCR富集目标产物，跑胶，结果图1所示，rs7412位点四对引物跑胶结果对应的编号1-4的电泳条带中，4号条带单一最亮；rs429358位点四对引物跑胶结果对应的编号5-8的电泳条带中，6号条带单一最亮；rs165932位点四对引物跑胶结果对应的编号9-12的电泳条带中，12号条带单一最亮；rs8383位点四对引物跑胶结果对应的编号13-16的电泳条带中，15号条带单一最亮；rs466448位点四对引物跑胶结果对应的编号16-20的电泳条带中，18号条带单一最亮，从而，选择条带单一且最亮的条带作为质谱的正反向引物。
在此基础上设计延伸引物，对于位点rs165932，为了减少延伸引物由于3端连续两个A 引起的错配，将此位点的延伸引物反向设计，其余4个位点的延伸引物采用正向设计。
本实施例最终确定的引物序列如下表所示。
表 4 各位点引物对应的序列
位点名称 序列（5'-3' ） SEQ ID NO.
rs7412 正向引物F ACGTTGGATGTAAGCGGCTCCTCCGCGAT 1
反向引物R ACGTTGGATACGCGGCCCTGTTCCACCAG 2
延伸引物 ATGCCGATGACCTGCAGAAG 3
rs429358 正向引物F ACGTTGGATTCGGAACTGGAGGAACAACT 4
反向引物R ACGTTGGATCAGCTCCTCGGTGCTCTG 5
延伸引物 GCGCGGACATGGAGGACGTG 6
rs165932 正向引物F ACGTTGGATTGAAACGCTTTTTCCAGCTCTCA 7
反向引物R ACGTTGGATTTCAGTTCCGATAAATTCTAC 8
延伸引物 CTGATTACTAATTCAATATC 9
rs8383 正向引物F ACGTTGGATACAGGAAGCACAGCAGGTTT 10
反向引物R ACGTTGGATGGAACTGGCTTTTCCTCTCC 11
延伸引物 CTGAGAAGGTCAGATTAGGG 12
rs466448 正向引物F ACGTTGGATCATGCCACTTTCTCCTGGAT 13
反向引物R ACGTTGGATGGGCTGTGGCTTGGTAACTA 14
延伸引物 TGCTCTAGAACTGCCCAGAT 15
上述核酸组合可以通过常规的化学合成方式合成得到。
实施例 2
样本检测：
以1例样本（样本来源：样本为武汉市武昌医院赠送人类基因组样本）为例，样本编号为001，检测结果与一代测序结果进行对比，样本检测的流程如下：
1. DNA提取
采用EDTA抗凝管采集静脉血，按试剂盒说明书操作，用 Qiagen核酸提取仪提取DNA。
2 .PCR反应及条件
利用Eppendof PCR仪，按下述条件进行PCR反应。
表 5 PCR反应体系
将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：95℃ 2分钟；45个循环:95℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 60秒；72℃ 5分钟；4℃保温。
3. SAP反应及条件
在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP（虾碱性磷酸酶）处理，以去除体系中游离的dNTPs。配置如下SAP碱性磷酸酶反应液体系。
表 6SAP反应体系
将碱性磷酸酶处理反应液2 μL与PCR产物5μL混合，再利用Eppendof PCR仪，按下述条件进行SAP反应：37 ℃ 40分钟；85 ℃ 5分钟；4 ℃ 保温。
4. 延伸反应及条件
在碱性磷酸酶处理后，进行单碱基延伸反应。配置如下单碱基延伸反应液：
表 7 单碱基延伸反应液体系
将单碱基延伸反应液2 μL与SAP处理后的PCR产物7 μL混合，再利用Eppendof PCR仪，按下述条件进行延伸反应： 向经过SAP消化反应的反应产物中加入单碱基延伸反应液mix 2μL，共9μL，进行如下反应：95℃预变性30s；95℃变性5sec，52℃退火5sec，80℃延伸5sec，共40个循环，每个循环中插入退火和延伸5个循环；最后72℃后延伸3min。
5 .样本脱盐、上机分析
将树脂用清水洗3遍，洗净后的树脂加入一定量纯水(28g树脂加入16mL纯水)转入CPM中的树脂槽。向96孔板的样本孔中加入HPLC水41μL，封膜，然后离心，放入CPM中。用镊子将芯片板转移到CPM芯片槽中。参照操作说明，设置好参数。
CPM将按程序进行样本脱盐、点样到芯片以及质谱仪获得数据。
由表8的结果可知，质谱检测的结果与一代测序的结果完全相同，试剂盒可以准确检测。
实施例 3
本发明的检测过程包括：DNA加样、PCR扩增、SAP消化、单碱基延伸反应、转板和质谱检测，每个步骤污染都可能对结果产生影响。
由于核酸质谱检测的灵敏度较高，0.5 ng DNA即可正常检测，在加样过程中一旦产生气溶胶，而气溶胶浓度远高于该检测限浓度，那么极易出现假阳性检测结果。选择包含杂合型，5个位点的野生和纯合突变样本各1个，将纯合突变样本DNA或中间产物梯度稀释后，混入到野生DNA中，检测结果污染情况。具体包括以下：
3.1干扰能力验证-基因组交叉污染
基因组交叉污染：分别将纯合突变型和野生型样本（纯合突变型和野生型样本的来源：样本为武汉市武昌医院赠送人类基因组样本）按照1:1、1:4、1:9、1:19、1:49、1:99的质量比混合(PCR体系总DNA质量20ng)，取2μL加入反应体系上机扩增，重复3次，评价基因组交叉污染对结果的影响。
表 9基因组交叉污染评价结果
基因组交叉污染纯合突变型DNA:野生型DNA质量比 rs7412 rs429358 rs165932 rs8383 rs466448
1:1 CT TC CA CT AG
1:1 CT TC CA CT AG
1:1 CT TC CA CT AG
1:4 CC TT CC CC AA
1:4 CC TT CC CC AA
1:4 CC TT CC CC AA
1:9 CC TT CC CC AA
1:9 CC TT CC CC AA
1:9 CC TT CC CC AA
1:19 CC TT CC CC AA
1:19 CC TT CC CC AA
1:19 CC TT CC CC AA
1:49 CC TT CC CC AA
1:49 CC TT CC CC AA
1:49 CC TT CC CC AA
1:99 CC TT CC CC AA
1:99 CC TT CC CC AA
1:99 CC TT CC CC AA
结果显示：加样的时候存在基因组交叉污染会影响检测结果的准确性。
3.2干扰能力验证-SAP产物污染
SAP产物交叉污染：将纯合突变型样本SAP产物(45循环后的产物大约1015拷贝)梯度稀释至101、103、105、107、109、1011、1013拷贝，取2μL野生型样本（野生型样本来源：样本为武汉市武昌医院赠送人类基因组样本）和0.5μL梯度稀释好的突变型样本的SAP产物加入反应体系，重复3次，评价SAP产物交叉污染对结果影响。
结果显示:在实验过程种，SAP产物交叉污染会影响实验结果的准确性。
因此，PCR加样过程中容易产生基因组交叉污染，SAP产物存在交叉污染的可能性，通过注意操作方法，实验室分区，次氯酸钠处理环境等等可减少污染。
实施例 4
4.1重复性实验
每个位点的不同基因型人基因组样本（样本来源：样本为武汉市武昌医院赠送人类基因组样本），设置浓度分别为5ng/μL，包含所有位点的杂合突变分型，重复10次检测，结果见下表：
表 11DNA样本浓度为5ng/μL重复10次检测
基因型 检测位点 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CC rs7412 CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC
TT rs429358 TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT
GG rs165932 GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG
CC rs8383 CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC
AA rs466448 AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA
TT rs7412 TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT
CC rs429358 CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC
TT rs165932 TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT
TT rs8383 TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT
GG rs466448 GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG
CT rs7412 CT CT CT CT CT CT CT CT CT CT
TC rs429358 TC TC TC TC TC TC TC TC TC TC
GT rs165932 GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT
CT rs8383 CT CT CT CT CT CT CT CT CT CT
AG rs466448 AG AG AG AG AG AG AG AG AG AG
由结果可知，检测结果可检测出对应分型，并且一致率达100％，说明书本发明重复性良好。
4.2 灵敏度检测
选取5份人类基因组DNA样本（样本来源：样本为武汉市武昌医院赠送人类基因组样本），包含所有的位点的杂合突变分型，进行梯度稀释，起始DNA浓度分别设置为20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、0.5ng/μL、0.2ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL，然后进行的PCR、消化、延伸和上机测试，五个样本的结果统计如下表所示：
结果显示，在DNA上样量低至0.5ng/μL时，五个样本的5个位点均能检出正确分型，在上样量在≤0.2ng/μL时，一个位点未能检出。说明本试剂盒在上样量为低至0.5ng/μL 的人类基因组DNA的情况下，可以将5个位点一次性全部检出，具有非常高的灵敏度，也适合复杂样本或稀有样本的研究。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.检测阿尔兹海默病基因的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括如下引物序列：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的用于扩增rs7412位点的上游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的用于扩增rs7412位点的下游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的用于对rs7412位点进行单碱基延伸的延伸引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的用于扩增rs429358位点的上游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的用于扩增rs429358位点的下游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的用于对rs429358位点进行单碱基延伸的延伸引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的用于扩增rs165932位点的上游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的用于扩增rs165932位点的下游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的用于对rs165932位点进行单碱基延伸的延伸引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的用于扩增rs8383位点的上游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的用于扩增rs8383位点的下游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的用于对rs8383位点进行单碱基延伸的延伸引物；和
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的用于扩增rs466448位点的上游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的用于扩增rs466448位点的下游引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的用于对rs466448位点进行单碱基延伸的延伸引物。
2.根据权利要求1所述的核酸组合在制备检测试剂盒中的应用。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括5重PCR预混液，所述5重PCR预混液中包括所述核酸组合。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，PCR预混液中还含有Mg2+、PCR缓冲液和DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
7.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括iPLEX延伸预混液。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述iPLEX延伸预混液中包括iPLEX缓冲液、iPLEX终止混合液和iPLEX酶。
9.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括SAP消化预混液。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述SAP消化预混液包括SAP缓冲液和SAP酶。
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