CN107447030A - 阿尔茨海默症apoe基因检测的试剂盒 - Google Patents

阿尔茨海默症apoe基因检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒属于生物检测技术领域，主要涉及一种试剂盒；本发明的试剂盒内包括单位PCR检测试剂，单位PCR检测试剂包括缓冲液、蛋白酶K、氯化镁储备溶液、引物、探针和聚合酶，所述引物为检测APOE基因的rs429358和rs7412基因片段的试剂的引物对；本发明基于APOE基因APOE相关的新突变点，只需要少量DNA样品 就足以测定APOE基因的多态性，可用于测定APOE相关基因多态性的基因诊断方法中。

Description

阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒
技术领域
一种试剂盒属于生物检测技术领域，主要涉及阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒。
背景技术
阿尔茨海默症（Alzheimer disease，AD）,是老年人常见病，60岁以上发病率约为5%,且随着年龄的增长发病率急剧上升,已成为严重威胁老年人生活质量的主要疾病之一。据统计，到2050年AD患者预期可达到2500万,将成为家庭和社会发展的重要制约因素。因此，AD研究是当今世界生物医学领域的重大课题。
随着研究的不断深入，越来越多的危险因素呗发现，使对阿尔茨海默病的成因有了更为深入的了解，但同时也增加了在临床上诊断病因的难度。其中，遗传因素在阿尔茨海默症发病机制中起重要作用，目前也已经发现并签订了多个易感基因。
阿尔茨海默病分为两类，根据研究显示，其发病率和发病风险随着年龄的增大而升高，因此临床上常以65岁为分界点，65岁以前发病的为早发型阿尔茨海默病，65岁以后发病的为晚发型阿尔茨海默病。然而，也有研巧将早期阿尔茨海默病称为家族性阿尔茨海默病，将晚发型阿尔茨海默病称为散发型阿尔茨海默病；家族型阿尔茨海默病发病人数较少，仅占所有阿尔茨海默病患者人数的５%，大多数患者为散发型患者。目前为止，国际上己经确定并认可的阿尔茨海默病的致病基因和易感基因共４个，分别为淀粉样前体蛋白（AmyloidPrecursor Protein，APP）基因、早老素1（Presenilins 1，PSEN1）基因，早老素2（Presenilins2，PSEN2）基因和载脂蛋白E（Apoliprotein E，APOE）基因。其中，早发性患者致病基因主要为APP、PSEN1和PSEN2，而晚发性患者的主要易感基因是ApoE。
载脂蛋白E（Apoliprotein E，APOE）基因位于人类19号染色体19q13.2区域，基因序列全长3.7kb，共有４个外显子和３个内含子。ApoE基因具有多态性，３种等位基因可产生３种蛋白产物，３种蛋白产物区别主要在于氨基酸的两个位点－－氨基酸序列第112位和158位，３种蛋白产物E2、Ｅ3、Ｅ3在这两个位点分别为112Cys/158Cys、112Cys/158Arg、112Arg/158Arg。
载脂蛋白Ｅ基因（ApoE）编码载脂蛋白Ｅ前体，含有317个氨基酸残基，经过加工后的载脂蛋白Ｅ包含299个氨基酸残基，分子量为34.2KD，是一种具有脂蛋白转运、代谢、修复细胞膜、神经发育、修复损伤等多种功能的脂质转运蛋白。多项研究显示载脂蛋白ApoE3能够促进神经细胞突起的生长，而APOE4的作用则相反，它能够抑制神经细胞突起的生长，并且能够促使阿尔茨海默病患者大脑中产生大量的αβ淀粉样蛋白，研究结果表明载脂蛋白ApoE4可能是容易引起疾病发生的有害蛋白。
发明内容
本发明公开了阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，实现对阿尔茨海默症的易感基因片段快速准确检测。
本发明的目的是这样实现的：
阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，试剂盒内包括单位PCR检测试剂，单位PCR检测试剂包括缓冲液、蛋白酶K、氯化镁储备溶液、引物、探针和聚合酶，所述引物为检测APOE基因的rs429358和rs7412基因片段的试剂的引物对。
所述rs429358基因片段的试剂的PCR引物对为：
5'-GAACTGCCACTTCAGCTGTC−3'；
5'-GAACTGCCACTTCAGCTGTC−3'；
所述rs7412基因片段的试剂的PCR引物对为：
5'-AGAATGGCATAACTCAAAATCC−3'；
5'-CAGACCCTCTTCCACCTTCTAT−3'。
所述rs429358基因片段的探针序列为：
5'- CACCTCCCIGGCTCACACGATTCAC-3'；
5'-CCACCTCAGCCTCTGAGTAGTTGGGG-3'；
所述rs7412基因片段的探针序列为：
5'-TTCATTGTTAATATAAAAGTACAAAATT -3'；
5'-CAACCTATGAATTAAGAACTTCTATATATTGCCAG-3'。
基因片段利用DNA提取液进行提取得到，所述DNA提取液包括：
1mol/Tris-HCL缓冲液500μl；
含量为10%SDS变性剂，用量50μl；
浓度为10mg/ml的蛋白酶K10μl；
以及适量的DNA溶解液，所述DNA溶解液纯化水。
PCR实际中所述缓冲液28.9μl；
蛋白酶K浓度为10mg/ml，用量为30μl；
氯化镁储备溶液浓度为0.5mol/L，用量为10μl；
rs429358基因片段的PCR引物浓度为20pmol / L，用量为2μl；
rs7412基因片段的PCR引物浓度为20pmol / L，用量为2μl；
rs429358基因片段的探针浓度为0.3pmol/L，用量为2ul；
rs7412基因片段的探针浓度为0.3pmol/L，用量为2ul；
聚合酶混合液10μl。
所述聚合酶由下列物质混合而成：
TaKaRa Ex Taq Buffer(10×)2.3μl；
1.8mmol/l的TaKaRa dNTP Mixture溶液1.5μl；
10U/μl的TaKaRa Ex Taq 0.3μl；
浓度为0.5mol/L的MgCl2溶液0.1μl；
纯化水 5.8μl。
所述试剂盒包括5-10个单位PCR检测试剂，保存温度范围为-20±5℃。
本发明的有益效果体现在：本发明基于ApoE基因rs429358和rs7412位点与Apoe的相关性，设计了用于扩增含有ApoE基因多态性位点的特异引物对以及探针，并提供包含该引物对的检测试剂盒，用于阿尔茨海默症的辅助诊断和治疗，本发明可用于分析人APOE基因的rs429358和rs7412位点C/T等位基因，即在其DNA互补链上为G/A等位基因，应用于对APOE的 辅助性诊断和对个体有多大的APOE患病风险进行评估。以利于开展APOE的早期干预和治疗；利用本发明阐述APOE基因的基因片段，可用作药物设计分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节VRK2表达的活性分子，促进APOE新药开发；本发明可应用于APOE基因rs429358和rs7412位点多态性的检测，使检测具有灵敏度高的优点，有利于APOE的基因诊断；本发明基于APOE基因APOE相关的新突变点，只需要少量DNA样品就足以测定APOE基因的多态性，可用于测定APOE相关基因多态性的基因诊断方法中。
附图说明
图1为ApoE基因经引物扩增后产物酶切图谱；
图中，M为DNA分子量标志物，1为C/C型；2，4，5位T/C型；3,6位T/T型。
具体实施方式
下面本发明具体实施方式作进一步详细描述。
(一)血液样本收集和基因组DNA的提取
根据下列方法制备基因组DNA。
(1)在洁净的1.5ml离心管内加红细胞裂解液1.0ml，再加入抗凝全血200μl，混匀，十分钟内8000rpm离心2分钟；用加样枪吸去上层血红蛋白液，用振荡器将沉淀充分弹开混匀；按STE缓冲液：Tris-Hcl缓冲液：蛋白酶K=150:30:15的比例配置消化液，每管添加消化液200μl，充分混匀，50℃消化1小时；添加Tris-Hcl提取液和无水乙醇，充分颠倒混匀后转移至离心吸附柱，8000rpm离心一分钟，弃滤液；加600μl70% 乙醇至离心吸附柱，8000rpm离心1分钟，弃滤液。重复此步骤1次；将离心柱10000rpm再离心2分钟以去除液体残留，将离心柱置另一洁净1.5mlEP管，打幵离心柱管盖，室温放置2-3分钟后（挥发残留乙醇），于柱中央加入56°预温灭菌双蒸水60μl，室温放置1-3分钟后于10000rpm离心1分钟，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
(二)APOE基因rs429358和rs7412位点SNP与APOE的相关
统计方法：利用SPSS 18.0软件中Pearson卡方检验计算rs429358和rs7412位点的基因型频率，Hardy-weinberg平衡检测，统计学的显著性水 平设定为P<0.05。采用单因素Logistic回归分析计算APOE的患病风险OR值及其95％置信区间(CI)。
结果
1)健康人APOE基因rs429358位点多态性分布
测定500个健康人的基因多态性，发现253人有C的纯合子(50.6％)， 202人有C和T的杂合子(40.4％)，45人有T的纯合子(9％)。
健康人APOE基因rs7412位点多态性分布
测定500个健康人的基因多态性，发现268人有C的纯合子(53.6％)， 196人有C和T的杂合子(39.2％)，36人有T的纯合子(7.2％)。
2)病人APOE基因rs429358位点多态性分布
测定320个病人的基因多态性，发现181人有C的纯合子(56.5％)，121人有C和T的杂合子(37.8％)，18人有T的纯合子(5.6％)。
病人APOE基因rs7412位点多态性分布
测定320个病人的基因多态性，发现166人有C的纯合子(51.8％)，137人有C和T的杂合子(42.8％)，17人有T的纯合子(5.3％)。
3)病例和健康对照组比较
比较APOE病例和健康对照组APOE基因rs429358和rs7412位点C/T多态性的频 率分布，详见表1和表2。
表1 APOE基因rs429358和rs7412位点的基因型和等位基因频率风险性在APOE 和健康对照人群中的比较
表2 APOE基因rs7412位点的基因型和等位基因频率风险性在APOE 和健康对照人群中的比较
由表1可见，APOE基因的SNP位点(rs429358和rs7412)的C等位基因，即在其DNA互补链上为G等位基因，当突变为T，互补链上为A时，在患者群体中的基因型分布频率与健康对照有显著差别(P＝0.041,P=0.037)，等位基因频率与健康对照亦有显著差别(P＝0.046,P=0.043)。表明这是APOE患病的一个较高风险的等位基因。与APOE显著相关的SNP(rs429358和rs7412)位点，可能通过影响转录因子、miRNA靶标位点结合或通过相邻连锁的功能SNP而发挥作用。
如上所述可得出结论，APOE基因位点rs429358和rs7412的多态性与APOE具显著相关性。
(三)SNP的识别确定
本发明采用PCR-RFLP对APOE 基因的rs429358基因序列(SEQ.ID.NO.1)和rs7412(SEQ.ID.NO.2)位点进行检测。
l) rs429358扩增片段全长为569bp。特异性引物序列如下：
F1：5'-GAACTGCCACTTCAGCTGTC−3'；(SEQ.ID.NO.3)；
R1：5'-GAACTGCCACTTCAGCTGTC−3'； (SEQ.ID.NO.4)；
Rs7412扩增片段全长为467bp。特异性引物序列如下：
F2：5'-AGAATGGCATAACTCAAAATCC−3'；(SEQ.ID.NO.5)；
R2：5'-CAGACCCTCTTCCACCTTCTAT−3'；(SEQ.ID.NO.6)；
rs429358基因片段的探针序列为：
5'-CACCTCCIGGCTCACACGATTFL3'；(SEQ.ID.NO.7)
5'-CCACCTCAGCCTCTGAGTAGTTGGGG-3'；(SEQ.ID.NO.8)
所述rs7412基因片段的探针序列为：
5'-TTCATTGTTAATATAAAAGTACAAAATT-FL-3'；(SEQ.ID.NO.9)
5'-CAACCTATGAATTAAGAACTTCTATATATTGCCAG-3'(SEQ.ID.NO.10)
2)通过PCR扩增APOE基因，具体流程为：
提取基因组并测量DNA浓度，稀释DNA至100-200ng/μl；在的PCR管中加入1μlDNA和5μlTE，制备成DNA工作液，利用PCR仪，在98℃变性10分钟；
利用2μlMLPA buffer、1.5μl probemix混合，制成混合液，将变形后的DNA液体放入所述混合液体，继续PCR程序，95℃5min，然后60℃10小时；
用3miul Ligase-65 buffer、3ul Ligase-65和30μl纯化水配置反应混合液，将配置好的反应混合液在50℃温度下加入PCB反应管中，升温达95℃保持5min，然后降温至25℃；
按照下列组分配置PCR试剂液：
缓冲液28.9μl；
蛋白酶K浓度为10mg/ml，用量为30μl；
氯化镁储备溶液浓度为0.5mol/L，用量为10μl；
rs429358基因片段的PCR引物浓度为20pmol / L，用量为2μl；
rs7412基因片段的PCR引物浓度为20pmol / L，用量为2μl；
rs429358基因片段的探针浓度为0.3pmol/L，用量为2ul；
rs7412基因片段的探针浓度为0.3pmol/L，用量为2ul；
聚合酶混合液10μl，所述聚合酶由下列物质混合而成：
TaKaRa Ex Taq Buffer(10×)2.3μl；
1.8mmol/l的TaKaRa dNTP Mixture溶液1.5μl；
10U/μl的TaKaRa Ex Taq 0.3μl；
浓度为0.5mol/L的MgCl2溶液0.1μl；
纯化水 5.8μl。
将添加反应混合液的基因液体加入试剂中，进行PCR程序，循环30次，（95℃，5min，95℃，30sec，退火），72℃、10min，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
<110> 苏州康吉诊断试剂有限公司
<120> 阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒
<130> 233042065
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctgggcgcg gacatggagg acgtg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgcgatgcc gatgacctgc agaag 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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gaactgccac ttcagctgtc 20
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agaatggcat aactcaaaat cc 22
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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ttcattgtta atataaaagt acaaaatt 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caacctatga attaagaact tctatatatt gccag 35

Claims (7)

1.阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，试剂盒内包括单位PCR检测试剂，其特征在于：单位PCR检测试剂包括缓冲液、蛋白酶K、氯化镁储备溶液、引物、探针和聚合酶，所述引物为检测APOE基因的rs429358和rs7412基因片段的试剂的引物对。
2.根据权利要求1所述阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，其特征在于：所述rs429358基因片段的试剂的PCR引物对为：
5'-GAACTGCCACTTCAGCTGTC−3'；
5'-GAACTGCCACTTCAGCTGTC−3'；
所述rs7412基因片段的试剂的PCR引物对为：
5'-AGAATGGCATAACTCAAAATCC−3'；
5'-CAGACCCTCTTCCACCTTCTAT−3'。
3.根据权利要求1所述阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，其特征在于：
所述rs429358基因片段的探针序列为：
5'- CACCTCCCIGGCTCACACGATTCAC-3'；
5'-CCACCTCAGCCTCTGAGTAGTTGGGG-3'；
所述rs7412基因片段的探针序列为：
5'-TTCATTGTTAATATAAAAGTACAAAATT-FL-3'；
5'-CAACCTATGAATTAAGAACTTCTATATATTGCCAG-3'。
4.根据权利要求1所述阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，其特征在于：基因片段利用DNA提取液进行提取得到，所述DNA提取液包括：
1mol/Tris-HCL缓冲液500μl；
含量为10%SDS变性剂，用量50μl；
浓度为10mg/ml的蛋白酶K10μl；
以及适量的DNA溶解液，所述DNA溶解液纯化水。
5.根据权利要求1所述阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液28.9μl；
蛋白酶K浓度为10mg/ml，用量为30μl；
氯化镁储备溶液浓度为0.5mol/L，用量为10μl；
rs429358基因片段的PCR引物浓度为20pmol / L，用量为2μl；
rs7412基因片段的PCR引物浓度为20pmol / L，用量为2μl；
rs429358基因片段的探针浓度为0.3pmol/L，用量为2ul；
rs7412基因片段的探针浓度为0.3pmol/L，用量为2ul；
聚合酶混合液10μl。
6.根据权利要求1所述阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，其特征在于：所述聚合酶由下列物质混合而成：
TaKaRa Ex Taq Buffer(10×)2.3μl；
1.8mmol/l的TaKaRa dNTP Mixture溶液1.5μl；
10U/μl的TaKaRa Ex Taq 0.3μl；
浓度为0.5mol/L的MgCl2溶液0.1μl；
纯化水 5.8μl。
7.根据权利要求1所述阿尔茨海默症APOE基因检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括5-10个单位PCR检测试剂，保存温度范围为-20±5℃。
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