CN102199672B - 一种检测虫媒脑炎病毒的新技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能够检测常见虫媒脑炎病毒的方法。本发明还涉及用于检测常见虫媒脑炎病毒的扩增引物和延伸引物，以及包含这些引物的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及病毒分子生物学领域，具体而言涉及脑炎病毒的检测方法。本发明还涉及用于检测脑炎病毒的扩增引物和延伸引物，以及包含这些引物的试剂盒。
背景技术
虫媒病毒性脑炎是由嗜神经性虫媒病毒引起中枢神经系统疾病。嗜神经性虫媒病毒是一组以吸血昆虫为传播媒介的病毒，其中多种病毒可以造成急性脑炎，该疾病非常危险，病死率高，会造成严重的公共卫生问题。嗜神经性虫媒病毒主要包括：黄病毒属(Flavivirus)的日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)和圣路易脑炎病毒(St.Louts encephalitis virus，StLEV)、蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TBEV)和西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)；甲病毒属(Alphavirus)的东方马脑炎病毒(easternequine encephalomyelitis virus；EEEV)、西方马脑炎病毒(western equineencephalomyelitis virus，WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineEncepha-lomyelitis virus，VEEV)和弹状病毒科(Rhabdoviriade)狂犬病毒属(Lyssavirus)的狂犬病毒(Rabies virus，RabV)等。
虫媒脑炎病毒致病力强、病情严重、病死率高。目前实验室诊断方法主要有以下几种：
(一)特异性IgM检测
病毒感染发病早期即产生特异性IgM，病后2～3周达到高峰，故单份血清可做出早期诊断。
(二)常规血清学试验
1.血凝抑制试验：虽然敏感性较高，但特异性较低。
2.补体结合试验：补体结合抗体仅存在于lgG中，病后出现迟，容易延误诊断。
3.中和试验：中和试验特异性和敏感性都高，但操作繁杂，需用大量动物或组织培养管，需时较久，不适于临床诊断常规使用。
(三)病毒分离与鉴定
体外病毒培养一般较难，且需要周期较长。敏感性低。
(四)病毒RNA检测
目前较常使用RT-PCR的方法对病毒RNA进行检测，但是较难达到多重检测。目前也有一些研究通过质谱原理进行多重的病毒检测。原理通过在PCR扩增引物上加入不同质量的特异序列标签，通过紫外照射使质量标签从产物上释放，最后利用质量光谱法进行分析。从而通过检测到的不同质量标签来进行鉴定病毒。但是在自动化和高通量方面仍然存在阻碍，且操作较复杂。
由于在临床上虫媒病毒脑炎的症状较相似，因此对一份样本进行多种病毒的同时检测是很必要的。针对目前的虫媒病毒脑炎的诊断现状，我们希望开发一种敏感性高，特异性好，可以同时完成多重检测的自动化检测技术。
发明内容
本发明涉及一种能够检测常见虫媒脑炎病毒的方法，所述病毒可选自以下8种虫媒脑炎病毒：日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒。
所述方法包括如步骤：
1)使用扩增引物对对样品cDNA进行PCR扩增，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测病毒基因组序列的保守区；
2)以步骤1)中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应，例如单碱基延伸反应，获得延伸产物，优选延伸产物与所述延伸引物之间分子量差异不小于9道尔顿，且各类型的延伸产物间的分子量差异不小于30道尔顿，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；
3)用质谱系统对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对(例如，使用由Sequenom公司提供的Typer4.0分析软件进行比对)确定待检测的脑炎病毒的具体类型，优选用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或纯化的延伸产物进行质谱检测，所述谱峰和所述扩增引物对和延伸引物信息优选被导入Typer4.0分析软件(由Sequenom公司提供)中以进行检测结果的分析。
在一个实施方案中，还优选在步骤1和步骤2)之间包括除dNTP步骤：除去所述扩增产物中的dNTP；并且/或者还优选在步骤2和步骤3)之间包括纯化步骤：纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物。本领域技术人员可以理解，不除去扩增产物中的dNTP可以实现本发明的目的，但除去扩增产物中的dNTP在优选单碱基延伸方案中可以排除未消耗dNTP对延伸反应的影响。并且纯化延伸产物也不是实现本发明所必须，但纯化延伸产物可以有利于质谱系统对延伸产物分析，从而得到更加高质量的谱峰。
在一个实施方案中，本发明的方法所使用的扩增引物对的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14以及SEQ ID NO：15和16中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的5′端还包含标签序列，例如SEQ ID NO：25。在一些实施方案中，本发明的方法所使用的延伸引物的核苷酸序列包含SEQID NO：17-24中的一个或多个。
在一个优选实施方案中，样品选自脑脊液、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒媒介生物。在一个优选实施方案中，待检测的虫媒脑炎病毒选自日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒中的一种或多种。
采用本方法解决了目前的检测方法灵敏度低，特异性差，很难做到多重检测，成本高，周期长，自动化程度低的缺陷。
与目前的检测方法相比，本发明的方法具有如下优点：
1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要使用荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；
2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；
3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即，不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；
4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多种虫媒脑炎病毒，从而大大减少了工作量，提高了检测通量。
同时，本发明的技术方案采用了质谱技术，特别是基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)，通过设计一套全新的扩增引物对和延伸引物，实现了对上述8种虫媒脑炎病毒的检测。其与其它现有方法相比，能够同时准确检测出8种虫媒脑炎病毒(WNV、JEV、StLEV、TBEV、VEEV、EEEV、Rabv和WEEV)，具有高通量、自动化、低成本的特点，有显著的优点。
本发明还涉及用于检测8种常见虫媒脑炎病毒中一种或多种的扩增引物对和/或延伸引物。在一些实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ IDNO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14以及SEQ ID NO：15和16中的一对或多对。
在一些实施方案中，在所述扩增引物的5′端还包含标签序列。在一些实施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO：17-24中的一个或多个。
本发明还涉及包含用于检测8种常见虫媒脑炎病毒中一种或多种的扩增引物对和/或延伸引物的试剂盒。在一些实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14以及SEQ ID NO：15和16中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的5′端还包含标签序列。在一些实施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO：17-24中的一个或多个。
本发明中使用标签序列的目的仅是为了增加与标签序列相连的引物序列的分子量，以排除这些引物在后续试验的影响，本领域技术人员可以根据需要以及通常的引物设计原则选择使用不同的标签序列，而实现本发明的目的。因此，在一些实施方案中可以使用任何可以达到上述目的，且不会与检测目的物相互作用的标签序列。
在一些实施方案中，上述的试剂盒中的其他试剂为用于PCR扩增反应的酶和试剂，用于延伸反应的酶和试剂，以及/或者用于纯化延伸产物的树脂。所述延伸反应优选是单碱基延伸反应。
在一些实施方案中，本发明涉及上述的扩增引物对和/或延伸引物用于对样品中的虫媒脑炎病毒进行检测的用途；或者上述试剂盒用于对样品中的虫媒脑炎病毒进行检测的用途。在一些实施方案中，本发明涉及上述的扩增引物对和/或延伸引物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测样品中的虫媒脑炎病毒。
以下表1和表2中分别示例性显示了针对所述8种常见的虫媒脑炎病毒的PCR扩增引物，以及针对所述8种虫媒脑炎病毒的延伸引物。
表1：针对所述8种常见的虫媒脑炎病毒的PCR扩增引物
| SEQ ID NO： | 引物序列5′→3′ | 扩增引物说明 |
| 1 | GACGTCACAGATGTCATCAC | 西尼罗病毒正向引物 |
| 2 | GTATCCCACATCCATTGCTC | 西尼罗病毒反向引物 |
| 3 | GAGGTCATGAAACCATTCCC | 日本脑炎病毒正向引物 |
| 4 | AGTGGACTGAACACTGAAGC | 日本脑炎病毒正向引物 |
| 5 | AAAGAGGGAAGCAGCATTGG | 圣路易脑炎病毒正向引物 |
| 6 | AAAGTCCCACGCTGTGTCC | 圣路易脑炎病毒反向引物 |
| 7 | GCTACTCCCTTTTTGGAACC | 蜱传脑炎病毒正向引物 |
| 8 | AGAAATGCAGTTACCTCCAG | 蜱传脑炎病毒反向引物 |
| 9 | TCACACAATGTAGCTGGCAC | 委内瑞拉马脑炎病毒正向引物 |
| 10 | TGTGCTGCAAAGTGACAGAC | 委内瑞拉马脑炎病毒反向引物 |
| 11 | TGCGCTCTTCATTGGGCAAA | 东方马脑炎病毒正向引物 |
| 12 | TGATCCTGGATATTGGGAGCG | 东方马脑炎病毒反向引物 |
| 13 | TTCAGCCGCCTCGTATTCTT | 狂犬病毒正向引物 |
| 14 | GAATTCTTCGGGAAAGGGAC | 狂犬病毒反向引物 |
| 15 | TTCACTTGGCCGTTCAGCAT | 西方马脑炎正向引物 |
| 16 | AAACCAtGGAAACGACAGCG | 西方马脑炎反向引物 |
表2：针对所述8种虫媒脑炎病毒的延伸引物。
| SEQ ID NO： | 引物序列5′→3′ | 脑炎病毒类型 |
| 17 | AGCTGCTGGAAAGAACCT | 西尼罗河病毒 |
| 18 | TCCCTATGGACCAGAAATGA | 日本脑炎病毒 |
| 19 | GCTTTGGCGACCACATGGAAA | 圣路易脑炎病毒 |
| 20 | CTCCCTTTTTGGAACCATTGGTG | 蜱传脑炎病毒 |
本发明的方法和引物可以实现对8种虫媒脑炎病毒中的一种或多种的检测，例如在脑脊液、血清和全血、纯病毒培养物以及携带此类病毒媒介生物等中。这有利于在流行病调查中对虫媒脑炎病毒感染地域差异性进行研究，对于研究虫媒脑炎病毒的流行病学特征具有重要的价值。
附图说明
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围进行限定。本领域技术人员参考如下对附图和优选实施方案的详细描述，显然可以明了本发明的各种目的和各个有利方面。
峰图中引物峰谱高度和产物峰谱高度与实验加入引物浓度、检测样品病毒载量等有关，具体实验需要具体分析，以下峰图仅作为参考并且是为了更好地描述优选方案。
图1是对于TBEV质粒样品的检测结果。图1为质谱检测峰图，其中显示在质量7267.8(对应于产物)处有明显的峰谱，而在质量6996.5(对应于引物)处峰谱明显消失。这表明样品中含有病毒质粒TBEV。
图2是对于EEEV质粒样品的检测结果。图2为质谱检测峰图，其中显示在质量6310.2(对应于产物)处有明显的峰谱，而在质量6023(对应于引物)处峰谱明显消失。这表明样品中含有病毒质粒EEEV。
图3是对WNV质粒样品的检测结果。图3为质谱检测峰图，其中显示分子质量在5803.8(对应产物)处有明显的峰谱，而在质量5532.6(对应于引物)处峰谱明显消失。这表明样品中含有病毒质粒WNV。
图4是JEV质粒样品的检测结果。其中显示分子质量在6357.2处(对应产物)有明显的峰谱，而在质量6110处(对应引物)峰谱明显消失。这表明样品中含有病毒质粒JEV。
图5是StLEV质粒样品的检测结果。其中显示分子质量在6742.2(对应产物)有明显的峰谱，而在质量6455.2处(对应引物)峰谱明显降低。这表明样品中含有病毒质粒StLEV。
图6是VEEV质粒样品的检测结果。其中显示分子质量在7667(对应产物)有明显的峰谱，而在质量7395.8处(对应引物)峰谱明显消失。这表明样品中含有病毒质粒VEEV。
图7是RabV质粒样品的检测结果。其中显示分子质量在7118.5(对应产物)有明显的峰谱，而在质量6791.4处(对应引物)峰谱明显消失。这表明样品中含有病毒质粒RabV。
图8是WEEV质粒样品的检测结果。其中显示分子质量在6499.2(对应产物)有明显的峰谱，而在质量6212处(对应引物)峰谱明显降低。这表明样品中含有病毒质粒WEEV。
图9是使用TBEV纯病毒cDNA作为模板时MALDI-TOF MS检测峰图，其中显示在质量7267.8处有明显峰谱，而在质量6996.5(对应于引物)处峰谱明显消失。这表明样品中含有病毒TBEV。
图10为使用混合病毒cDNA作为模板时MALDI-TOF MS检测峰图，其中显示了检测到的各个峰。峰谱位置有UEP三个字母的代表相应的延伸引物位置，仅有病毒简称的峰谱位置代表延伸产物位置，如UEP.TBEV表示TBEV的延伸引物位置，TBEV表示延伸产物峰谱位置。从图中可以看出TBEV，JEV，WEEV，RabV四个位置有明显的峰谱存在，因此表明样本中存在TBEV，JEV，WEEV，RabV四种病毒。
具体实施方式
本发明提供了一种对样品中的虫媒脑炎病毒进行检测的方法，其包括以下步骤：
1)使用扩增引物对对样品cDNA进行PCR扩增，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测病毒基因组序列的保守区；
2)以步骤1)中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应，例如单碱基延伸反应，获得延伸产物，优选延伸产物与所述延伸引物之间分子量差异不小于9道尔顿，且各类型的延伸产物间的分子量差异不小于30道尔顿，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；
3)用质谱系统对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，并通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对(例如，使用由Sequenom公司提供的Typer4.0分析软件进行比对)确定待检测的脑炎病毒的具体类型，优选用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或纯化的延伸产物进行质谱检测，所述谱峰和所述扩增引物对和延伸引物信息优选被导入Typer4.0分析软件(由Sequenom公司提供)中以进行检测结果分析。
在上述方法的步骤1)中，本领域技术人员可以按照常规的PCR扩增方法进行PCP扩增。对于具体的DNA扩增，本领域技术人员可以根据扩增目的核酸、引物以及其他条件选择PCR扩增条件。将所述样品中的RNA并反转录成cDNA的方法是本领域技术人员可以用常规方法实现的，步骤1)中的样品可以是任何可检测的样品，例如脑脊液、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒媒介生物。
在上述方法的步骤2)中，本领域技术人员可以按照常规的DNA延伸方法进行延伸反应。对于具体的DNA延伸，本领域技术人员可以根据延伸目的核酸、延伸引物以及其他条件选择延伸反应条件。
在上述方法的步骤3)中，可以通过质谱系统完成对所述延伸产物或纯化的延伸产物的质谱检测和分析。例如本领域中常用的质谱系统有Sequenom MALDI-TOF质谱仪和Typer4.0分析软件、布鲁克·道尔顿的基质辅助激光解吸附电离(MALDI)飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)，岛津公司的基质辅助激光解离离子源-线性飞行时间质谱等
在一个实施方案中，还优选在步骤1和步骤2)之间包括除dNTP步骤：除去所述扩增产物中的dNTP，可以通过本领域已知的任何方法除去所述dNTP，但优选通过使用SAP酶处理所述扩增产物来除去dNTP。在一个实施方案中，还优选在步骤2和步骤3)之间包括纯化步骤：纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物，可以通过本领域已知的任何方法纯化延伸产物，但优选使用离子交换树脂进行纯化。
扩增引物和延伸引物可以如下方式进行设计、制备：根据所选择的8种待检测虫媒脑炎病毒(上述8种病毒)的基因序列，设计出针对每种脑炎病毒的特异性扩增引物，设计的扩增引物区域在每种病毒的种内相对保守，但在种间具有特异性。在所述扩增引物的3′端具有与其所针对的病毒类型的基因序列完全匹配的至少15个碱基，在所述扩增引物的5′端可以具有标签序列(Tag)(例如，10个碱基的acgttggatg(SEQ ID NO：25))。设计延伸引物，所述延伸引物的长度为17-28个碱基，并且在其3′端的包括延伸碱基在内的4个碱基中，包含一个病毒类型特异的多态性位点标记，选择的延伸引物位置是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域。同时，延伸产物和延伸引物之间的分子量差异不小于9道尔顿，且各病毒类型的延伸产物间的分子量差异不小于30道尔顿；按照引物间、引物与扩增产物/延伸产物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质谱检测的延伸引物满足如下条件：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30道尔顿，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9道尔顿，延伸引物与延伸产物的分子量在4500-8500道尔顿之间。本发明中针对所述8种常见虫媒脑炎病毒的扩增引物对参见表1，延伸引物参见表2。
实施例1：
在本实施例中，提供了对8种虫媒脑炎病毒进行检测的方法，该方法包括如下的步骤：
(1)通过PCR扩增获得靶序列扩增产物。其中使用的PCR扩增引物对为5’端均连接有标签序列acgttggatg(SEQ ID NO：25)的如下引物对：SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ IDNO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14以及SEQ ID NO：15和16；使用延伸引物SEQ ID NO：17-24分别见表3。
表3：本实施例中使用的针对所述8种虫媒脑炎病毒的延伸引物。
| SEQ ID NO： | 引物序列5′→3′ | 延伸碱基 |
| 17 | AGCTGCTGGAAAGAACCT | A |
| 18 | TCCCTATGGACCAGAAATGA | C |
| 19 | GCTTTGGCGACCACATGGAAA | G |
| 20 | CTCCCTTTTTGGAACCATTGGTG | A |
| 21 | TGGCACATACGTGCACACGGGAAA | A |
| 22 | CACACGCATTCCAAACATAA | G |
| 23 | TCTTCAGAGATGAGAAAGAACT | T |
使用的模板是人工构建病毒质粒DNA。本实施例中所使用的病毒质粒如下进行制备：使用特异引物扩增每种虫媒脑炎病毒的包含扩增引物扩增基因片段在内的保守基因区，将扩增产物分别克隆入PMD-T载体(TakaraPMD-T连接试剂盒)，然后转化入大肠杆菌DH5α。转化后的大肠杆菌经蓝白斑筛选以及二次扩大培养后，用于质粒提取。使用质粒提取试剂盒(Axygen公司)提取并纯化质粒。通过DNA测序对质粒进行鉴定。在本实施例中，将无菌双蒸水作为阴性对照。将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试，以验证检测的有效性。
分别测定制备好的WNV、JEV、StLEV、TBEV、VEEV、EEEV、RabV和WEEV型质粒的OD值。根据OD值将各质粒稀释为500pg/μl，5pg/μl，0.5pg/μl三种浓度的存储液。然后根据摩尔公式：1ng质粒的拷贝数≈[l*10-9/12*330*(载体分子量+插入片断分子量)]*6.02*1023计算出1ng质粒的拷贝数。根据这个值将各质粒稀释为105、104、5000、103、102拷贝/μL5个浓度梯度以进行灵敏度验证。灵敏度验证结果显示，TBEV、VEEV、EEEV、RabV和WEEV五个质粒的灵敏度为100拷贝/μL，JEV、StLEV、WNV三个质粒的灵敏度为1000拷贝/μL。该实施例实验使用的质粒浓度均为：1000拷贝/μL。选择该浓度仅是为了更好的说明该实施例，而不是局限该发明的检查样品的浓度的阈值范围。
PCR扩增中使用的反应体系如下，其中所有试剂购买自Sequenom公司：
PCR反应条件：94℃，15分钟；94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸3分钟。
(2)通过虾碱性磷酸酶(SAP酶)处理，除去步骤(1)获得的扩增产物中含有的dNTP。SAP酶反应体系如下，所有试剂购买自Sequenom公司：
| 试剂 | 体积/反应 |
| 水(HPLE级) | 1.53ul |
| SAP酶缓冲液 | 0.17ul |
| SAP酶 | 0.30ul |
| PCR扩增产物 | 5.0ul |
| 总体积 | 7.0ul |
SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
(3)以步骤(2)中获得的产物为模板，通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系如下，所有试剂购买自Sequenom公司：
*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即，根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。
延伸反应条件：94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
(4)采用树脂(购买自Sequenom公司)纯化步骤(3)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂，18.00ul水，垂直摇匀一小时。经过本步反应后，树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化的延伸产物可在4℃下保存数天，也可在-20℃下保存数周。所得的纯化的延伸产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。
(5)依照制造商建议的步骤，将纯化的延伸产物在SequenomMALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测。根据提供商的说明书，所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件(由Sequenom公司提供)进行分析，得到分型结果。峰图报告一般分为四种：A：结果可靠；B：结果中度可靠；C：结果一般可靠；D：结果低度可靠。前三种表示结果可靠，有相应病毒感染；后一种表示峰图基线不稳，视为结果无效。但是在具体的实验中要根据具体样本信息和峰图信息具体分析。
以下结合图1-8，对上述分型结果进行分析说明。
从图1可知，当使用TBEV质粒作为模板DNA时，MALDI-TOF质谱检测在质量7267.8处检测到峰，所述峰经软件分析后，被确认为是TBEV延伸产物的峰，从而确认样品中含有TBEV。类似地，当使用EEEV质粒作为模板DNA时，MALDI-TOF质谱检测在质量6310.2处检测到峰，所述峰经软件分析后，被确认为特异于EEEV延伸产物的峰(参见图2)，从而确认样品中含有EEEV。在如图3-8中，分别显示了WNV、JEV、StLEV、VEEV、RabV和WEEV的检测结果，与图1和2中所示类似，这些检测结果与已知的质粒型别完全一致。
从以该实施例可知，本发明所开发的引物和方法可以实现对虫媒脑炎病毒(例如WNV、JEV、StLEV、TBEV、VEEV、EEEV、RabV和WEEV)的检测。
实施例2：
在该实施例中，除样本前期处理外，所有步骤与处理方式均与实施例1中相同。该实施例中的样本为TBEV纯病毒，利用Omega公司的E.Z.N.A.
Viral RNA Kit提取样本RNA，操作步骤按照试剂盒说明进行。利用购自Takara的PrimeScript
RT reagent Kit将提取的RNA样本反转录为cDNA。
步骤同实施例1中步骤(1)-(5)，不同之处仅在于步骤(1)的PCR扩增反应体系中使用模板DNA为上述模板cDNA。
以下结合图9和图10，对TBEV纯病毒培养样本cDNA和TBEV、JEV、WEEV以及RabV纯病毒培养样本混合cDNA检测结果进行分析说明。
从图9可知，当使用TBEV纯病毒cDNA作为模板时，MALDI-TOF MS检测在质量7267.8处检测到峰谱，所述峰经软件分析后，被确认为是TBEV延伸产物的峰，从而确认样品中含有TBEV。
图10为使用混合病毒cDNA作为模板时MALDI-TOF MS检测峰图，其中显示了检测到的各个峰。峰谱位置有UEP三个字母的代表相应的延伸引物位置，仅有病毒简称的峰谱位置代表延伸产物位置，如UEP.TBEV表示TBEV的延伸引物位置，TBEV表示延伸产物峰谱位置。从图中可以看出TBEV，JEV，WEEV，RabV四个位置有明显的峰谱存在，因此表明样本中存在TBEV，JEV，WEEV，RabV四种病毒。从该实施例可以看出，本发明的引物对和方法完全可以实现对样本中虫媒脑炎病毒进行多重检测。
Claims (16)
1.对样品中的虫媒脑炎病毒进行非诊断目的检测的方法，其包括以下步骤：
1）使用扩增引物对PCR扩增样品的cDNA，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测病毒基因组序列的保守区；
2）以步骤1）中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应获得延伸产物，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；
3）对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对确定待检测的脑炎病毒的具体类型，
其中所述扩增引物和所述延伸引物为扩增引物对SEQ ID NO:1和2与延伸引物SEQ ID NO:17组合、扩增引物对SEQ ID NO:3和4与延伸引物SEQ ID NO:18组合、扩增引物对SEQ ID NO:5和6与延伸引物SEQ ID NO:19组合、扩增引物对SEQ ID NO:7和8与延伸引物SEQ ID NO:20组合、扩增引物对SEQ ID NO:9和10与延伸引物SEQ ID NO:21组合、扩增引物对SEQ ID NO:11和12与延伸引物SEQ ID NO:22组合、扩增引物对SEQ ID NO:13和14与延伸引物SEQ ID NO:23组合以及扩增引物对SEQ ID NO:15和16与延伸引物SEQ ID NO:24组合中一组或多组，
其中所述虫媒脑炎病毒选自日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒中的一种或多种。
2.对样品中的虫媒脑炎病毒进行非诊断目的检测的方法，其包括以下步骤：
1）使用扩增引物对PCR扩增样品的cDNA，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测病毒基因组序列的保守区；
2）以步骤1）中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应获得延伸产物，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；
3）对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对确定待检测的脑炎病毒的具体类型，
其中所述扩增引物和所述延伸引物为5’端还包含标签序列的扩增引物对SEQ ID NO:1和2与延伸引物SEQ ID NO:17组合、扩增引物对SEQ ID NO:3和4与延伸引物SEQ ID NO:18组合、扩增引物对SEQ ID NO:5和6与延伸引物SEQ ID NO:19组合、扩增引物对SEQ ID NO:7和8与延伸引物SEQ ID NO:20组合、扩增引物对SEQ ID NO:9和10与延伸引物SEQ ID NO:21组合、扩增引物对SEQ ID NO:11和12与延伸引物SEQ ID NO:22组合、扩增引物对SEQ ID NO:13和14与延伸引物SEQ ID NO:23组合以及扩增引物对SEQ ID NO:15和16与延伸引物SEQ ID NO:24组合中一组或多组，
其中所述虫媒脑炎病毒选自日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒中的一种或多种。
3.权利要求1或2的方法，其中在所述步骤1）之后和步骤2）之前还包括除去所述扩增产物中的dNTP的步骤。
4.权利要求3的方法，其中通过使用虾碱性磷酸酶处理所述扩增产物来除去dNTP。
5.权利要求1或2的方法，其中步骤2）中的延伸反应是单碱基延伸反应。
6.权利要求1或2的方法，其中在所述步骤2）之后和步骤3）之前还包括纯化步骤：纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物。
7.权利要求6的方法，其中所述纯化步骤使用离子交换树脂进行。
8.权利要求1或2的方法，其中在所述步骤3）中用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或所述纯化的延伸产物进行质谱检测。
9.权利要求2的方法，其中所述标签序列是SEQ ID NO:25。
10.权利要求1或2的方法，其中所述样品选自纯病毒培养物。
11.一种试剂盒，其包含
扩增引物对SEQ ID NO:1和2与延伸引物SEQ ID NO:17组合、扩增引物对SEQ ID NO:3和4与延伸引物SEQ ID NO:18组合、扩增引物对SEQ ID NO:5和6与延伸引物SEQ ID NO:19组合、扩增引物对SEQ ID NO:7和8与延伸引物SEQ ID NO:20组合、扩增引物对SEQ ID NO:9和10与延伸引物SEQ ID NO:21组合、扩增引物对SEQ ID NO:11和12与延伸引物SEQ ID NO:22组合、扩增引物对SEQ ID NO:13和14与延伸引物SEQ ID NO:23组合以及扩增引物对SEQ ID NO:15和16与延伸引物SEQ ID NO:24组合中一组或多组，或者
还包含其他试剂。
12.一种试剂盒，其包含
5’端还包含标签序列的扩增引物对SEQ ID NO:1和2与延伸引物SEQ ID NO:17组合、扩增引物对SEQ ID NO:3和4与延伸引物SEQ ID NO:18组合、扩增引物对SEQ ID NO:5和6与延伸引物SEQID NO:19组合、扩增引物对SEQ ID NO:7和8与延伸引物SEQ IDNO:20组合、扩增引物对SEQ ID NO:9和10与延伸引物SEQ ID NO:21组合、扩增引物对SEQ ID NO:11和12与延伸引物SEQ ID NO:22组合、扩增引物对SEQ ID NO:13和14与延伸引物SEQ ID NO:23组合以及扩增引物对SEQ ID NO:15和16与延伸引物SEQ ID NO:24组合中一组或多组，或者
还包含其他试剂。
13.权利要求11或12的试剂盒，其中所述其他试剂是用于PCR扩增反应的酶和试剂，用于延伸反应的酶和试剂，以及/或者用于纯化延伸产物的树脂。
14.扩增引物对和延伸引物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测样品中的虫媒脑炎病毒，
其中所述扩增引物对和延伸引物选自
扩增引物对SEQ ID NO:1和2与延伸引物SEQ ID NO:17组合、扩增引物对SEQ ID NO:3和4与延伸引物SEQ ID NO:18组合、扩增引物对SEQ ID NO:5和6与延伸引物SEQ ID NO:19组合、扩增引物对SEQ ID NO:7和8与延伸引物SEQ ID NO:20组合、扩增引物对SEQ ID NO:9和10与延伸引物SEQ ID NO:21组合、扩增引物对SEQ ID NO:11和12与延伸引物SEQ ID NO:22组合、扩增引物对SEQ ID NO:13和14与延伸引物SEQ ID NO:23组合以及扩增引物对SEQ ID NO:15和16与延伸引物SEQ ID NO:24组合中一组或多组，
其中所述虫媒脑炎病毒选自日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒中的一种或多种。
15.扩增引物对和延伸引物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测样品中的虫媒脑炎病毒，
其中所述扩增引物对和延伸引物选自
5’端还包含标签序列的扩增引物对SEQ ID NO:1和2与延伸引物SEQ ID NO:17组合、扩增引物对SEQ ID NO:3和4与延伸引物SEQ ID NO:18组合、扩增引物对SEQ ID NO:5和6与延伸引物SEQID NO:19组合、扩增引物对SEQ ID NO:7和8与延伸引物SEQ IDNO:20组合、扩增引物对SEQ ID NO:9和10与延伸引物SEQ ID NO:21组合、扩增引物对SEQ ID NO:11和12与延伸引物SEQ ID NO:22组合、扩增引物对SEQ ID NO:13和14与延伸引物SEQ ID NO:23组合以及扩增引物对SEQ ID NO:15和16与延伸引物SEQ ID NO:24组合中一组或多组，
其中所述虫媒脑炎病毒选自日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒中的一种或多种。
16.SEQ ID NO:1-16和SEQ ID NO:17-24的核苷酸序列，
其中
扩增引物对SEQ ID NO:1和2与延伸引物SEQ ID NO:17组合；扩增引物对SEQ ID NO:3和4与延伸引物SEQ ID NO:18组合；扩增引物对SEQ ID NO:5和6与延伸引物SEQ ID NO:19组合；扩增引物对SEQ ID NO:7和8与延伸引物SEQ ID NO:20组合；扩增引物对SEQ ID NO:9和10与延伸引物SEQ ID NO:21组合；扩增引物对SEQ ID NO:11和12与延伸引物SEQ ID NO:22组合；扩增引物对SEQ ID NO:13和14与延伸引物SEQ ID NO:23组合；扩增引物对SEQ ID NO:15和16与延伸引物SEQ ID NO:24组合。
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