CN103261437B - 用于hpa基因分型的方法及所用引物 - Google Patents

用于hpa基因分型的方法及所用引物 Download PDF

Info

Publication number
CN103261437B
CN103261437B CN201080070818.0A CN201080070818A CN103261437B CN 103261437 B CN103261437 B CN 103261437B CN 201080070818 A CN201080070818 A CN 201080070818A CN 103261437 B CN103261437 B CN 103261437B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
hpa
amplimer
primer sets
extension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201080070818.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103261437A (zh
Inventor
李晓艳
杨光辉
魏晓明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Bgi Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Bgi Medicine Co Ltd filed Critical Shenzhen Bgi Medicine Co Ltd
Publication of CN103261437A publication Critical patent/CN103261437A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103261437B publication Critical patent/CN103261437B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes

Abstract

本发明公开了一种用于HPA基因分型的方法，其包括以HPA基因型别特异性引物对样品进行PCR扩增，并利用延伸引物对扩增产物进行延伸，随后通过质谱对获得的延伸产物进行检测，从而确定样品的HPA型别。本发明还公开了用于该基因分型方法的特定序列的引物以及包含该引物的试剂盒。

Description

用于HPA基因分型的方法及所用引物
技术领域
本发明涉及一种用于检测HPA型别的方法，具体而言，本发明涉及HPA基因分型检测的方法。本发明还涉及HPA基因型别特异性的扩增引物和延伸引物以及包含这些引物的试剂盒。
背景技术
血小板是哺乳动物血液中的有形成分之一，无细胞核有细胞器。它通过膜表面的糖蛋白(GP)与细胞外介质蛋白相互作用发挥其功能，在止血及维持血管内皮细胞的完整性方面具有重要作用。
自1959年第一个人类血小板抗原(human platelet antigen，HPA)被鉴定以来，至2009年底已检出的血小板抗原数为27个。其中12个对偶抗原被归类为6个HPA系统(HPA-1～HPA-5、HPA-15)；另15个抗原由于未发现其对偶抗原，而暂命名为HPA-6w～HPA-14w、HPA-16w～HPA-21w。
HPA抗原命名原则是以HPA为字头，然后连接数字表示。在由2个对偶抗原组成的遗传系统中，对偶基因分别用英文小写字母a和b表示。字母a代表其中基因频率大于50％的等位基因.字母b代表基因频率小于50％的另一等位基因。如果某血小板抗原的对偶抗原尚未被发现，将给予暂时命名，在等位基因数字后加后缀w表示，如HPA-6bw，HPA-7bw等。只有在2个对偶抗原全被检测出来后才能被称为系统。27种HPA中，除HPA-14的多态性是编码基因1909～1911位AAG三核苷酸缺失外，其它HPA抗原的多态性均因编码基因的单核苷酸多态性导致相应糖蛋白中单个氨基酸置换。HPA在人群中呈多态性分布，不同种族间某些HPA的基因频率的差异具统计学意义。
被正式命名的HPA等位基因，位于第5、6、17和22染色体上的6个遗传座位。一个HPA等位基因，可以编码一个或数个HPA抗原表位。
血小板输注在临床中有着重要的作用。HPA不相合可导致血小板输注无效(PTR)、输血后紫癜(PTP)以及新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(NAITP)等。
建立准确的HPA分型技术在血小板减少症的诊断和血小板输注中具有重要作用，但由于特异性同种抗血清的缺乏，利用抗原抗体的免疫学反应进行HPA定型很困难。目前常用的方法是进行HPA基因分型，如聚合酶链式反应序列特异引物分型技术(PCR-SSP)、限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、基于DNA扩增和Sanger测序法(PCR-SBT)和基因芯片技术(DNA microarray)等。PCR-SSP法，有些受损DNA样本会对检测结果产生影响；PCR-RFLP如果酶解不完全将得错误结果，此外，并非每个HPA等位基因都有适当的酶切点；其他的分型方法都有或费用，或技术方面的问题。
发明内容
本发明设计了一套全新的同时检测18种HPA型别的特异性引物及使用该引物进行检测和定型的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于HPA基因分型的方法，包括：
(1)用一对或多对扩增引物对目的样品进行PCR扩增，其中所述扩增引物是根据目标HPA基因设计的；
(2)用一条或多条延伸引物对步骤(1)获得的扩增产物进行延伸；所述延伸反应优选是单碱基延伸反应；
(3)对步骤(2)获得的延伸产物进行质谱检测，从而确定样品中的HPA基因型别。
优选地，其中所述扩增引物为选自SEQ ID NO:1-36的寡核苷酸序列，更优选地在所述寡核苷酸序列的5’端添加标签，更优选地所述标签为acgttggatg；优选地，所述延伸引物为选自SEQ ID NO:37-54的寡核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，在进行步骤(2)之前对步骤(1)的扩增产物进行纯化，并且/或者在进行步骤(3)之前对步骤(2)的延伸产物进行纯化，优选地使用树脂进行纯化；
在一个优选的实施方案中，所述质谱检测使用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统进行。
在一个优选的实施方案中，所述质谱检测后确定样品中HPA基因型别的方法为将获得的谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对。优选通过TYPER4.0分析软件(SEQUENNOM公司)进行分析比对。
在另一个实施方案中，本发明的HPA基因分型方法，还包括：
在进行步骤(2)之前，对扩增产物进行处理以除去所述扩增产物中含有的dNTP，优选地使用虾碱式磷酸酶(SAP酶)进行处理；优选地，在进行步骤(2)时，在其3'端包含一个型别特异性多态性位点标记，更优选地使用ddNTP进行单碱基延伸反应。
在另一个优选的实施方案中，前述方法步骤(2)所得到的延伸产物和所述的延伸引物之间分子量差异不小于9D，且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于30D。
在一个优选实施方案中，所述目的样品选自血样，优选的来自哺乳动物，尤其是人。
在一个实施方案中，所述HPA基因型别选自HPA-1、HPA-2、HPA-4、HPA-5、HPA-6w、HPA-7w、HPA-8w、HPA-9w、HPA-10w、HPA-11w、HPA-13w、HPA-14w、HPA-15、HPA-16w、HPA-17w、HPA-18w、HPA-20w和HPA-21w。
在一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：54任一项所示序列的寡核苷酸，优选地所述SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36任一项所示序列的寡核苷酸的5’端含有标签序列，更优选地所述标签为acgttggatg。
在一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36任一项所示序列的寡核苷酸用于扩增反应的用途，优选地所述具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36任一项寡核苷酸的5’端含有标签序列，更优选地所述标签为acgttggatg。
在一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：37至SEQ ID NO：54任一项所示序列的寡核苷酸用于延伸反应的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了一对或多对选自SEQ ID NO:1-36的扩增引物和一条或多条选自选自SEQ ID NO:37-54的延伸引物用于制备试剂盒的用途，优选地所述试剂盒用于HPA基因分型检测；优选地，所述选自SEQ ID NO:1-36的扩增引物的5’端含有标签序列，更优选地所述标签为acgttggatg
在一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：一对或多对选自SEQID NO:1-36的扩增引物对，一条或多条选自选自SEQ ID NO:37-54的延伸引物，以及PCR试剂和扩增反应试剂。
优选地，所述的试剂盒还包括SAP酶和ddNTP。
在另一个实施方案中，本发明涉及所述试剂盒用于检测HPA基因分型的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于HPA基因分型的方法，其特征在于使用质谱检测目的样品的HPA基因，以确定样品中待检测的HPA基因型别。
在另一个实施方案中，本发明涉及质谱分析用于进行HPA基因分型的用途。
应理解所述标签只是为了增加与tag相连的引物序列的分子量，以排除这些引物在后续试验的影响，本领域技术人员可以根据需要以及通常的引物设计原则选择使用不同的tag，而实现本发明的目的。因此，在一些实施方案中可以使用任何可以达到上述目的，且不会与检测目的物相互作用的tag序列。
本发明提供一套用于检测HPA基因型的特异性引物，分为扩增引物和延伸引物，其序列及序列编号见表1、表2：
表1 HPA PCR扩增引物
其中扩增引物对HPA-1-F和HPA-1-R用于扩增HPA-1，扩增引物对HPA-2-F和HPA-2-R用于扩增HPA-2，以此类推。
表2 质谱延伸引物
其中延伸引物HPA-1-U用于延伸HPA-1，延伸引物HPA-2-U用于延伸HPA-2，以此类推。
4、有益效果
与现有技术相比，上述技术方案采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)系统进行检测，较以前HPA DNA测序方法而言，能够准确检测出18种HPA基因型(HPA型别为HPA-1、HPA-2、HPA-4、HPA-5、HPA-6w、HPA-7w、HPA-8w、HPA-9w、HPA-10w、HPA-11w、HPA-13w、HPA-14w、HPA-15、HPA-16w、HPA-17w、HPA-18w、HPA-20w、HPA-21w中的一种或多种)并对其分型。反应可在微量体系中进行，减少样品和各种消耗品的使用；试剂耗材相对简单且稳定；自动化高通量检测，成本低，适合大规模检测。质谱可以在一块板的384个孔中同时操作，简单方便，所以通量大，速度快，两天就可以出结果，简单快速。
附图说明
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围进行限定。本领域技术人员参考如下对附图和优选实施方案的详细描述，显然可以明了本发明的各种目的和各个有利方面。
图1为样本HPA-5、9w、10w、18w、20w、21w共计6种HPA抗原的质谱检测峰图。
图1中，横坐标表示各型延伸引物和产物的分子量大小，其中左边的虚线表示延伸引物分子量所在位置(由于完全消耗，所以无峰型)，右边虚线表示延伸产物分子量所在位置(由于有延伸，所以有峰型)；纵坐标表示引物的信号强度。例如HPA-20W，左边无虚线表示延伸引物完全消耗，右边峰处有一条虚线C，表示在突变位点基因为C。HPA-21W，左边无虚线表示延伸引物完全消耗，右边峰处有一条虚线G，表示在突变位点基因为G。HPA-9W，右边峰处有一条虚线G，表示在突变位点基因为G。HPA-18W，右边峰处有一条虚线G，表示在突变位点基因为G。HPA-10W，右边峰处有一条虚线G，表示在突变位点基因为G。HPA-5W，右边峰处有一条虚线G，表示在突变位点基因为G。
图2为样本HPA-1、2、14w、8w、16w、17w共计6种HPA抗原的质谱检测峰图。
图3为样本HPA-4、6w、7w、11w、13w、15共计6种HPA抗原的质谱检测峰图。该样本峰图置信度高，延伸产物的峰型清晰，分型结果明确。
图4为样本的HPA-18w质谱检测峰图，其显示，在质量6660.4处的峰(对应于产物峰)很高，而在质量6373.2处的峰(对应于引物峰)不存在，在质量7700.3处的峰(对应于另一产物峰)不存在。这表明样品中HPA-18w在突变位点基因为G，因此基因型为aa。
图5为样品的HPA-5质谱检测峰图，其显示，在质量7284.8处的峰(对应于产物峰)很高，而在质量6997.5处的峰(对应于引物峰)不存在，在质量7268.8处的峰(对应于另一产物峰)不存在。这表明样品中HPA-5在突变位点基因为G，因此基因型为aa，图中质量7064处的峰为HPA-10的产物峰。
具体实施方式
在本发明的实施例中，采用本发明的特异性引物及质谱检测方法，对从血液从提取的DNA样本进行检测，获得样本中HPA型别结果。
实施例1：
(1)特异性引物的设计
每一个系统的HPA基因型是由一个位置的碱基突变决定的，引物设计的区域就是根据所在碱基的DNA序列设计的，具有特异性。根据所选择的待检测HPA型别的基因中包含突变位点的保守区域，设计出针对每型的扩增引物,扩增引物均带了10个碱基acgttggatg的标签序列；设计延伸引物，延伸引物的长度为17-25个碱基；延伸引物与延伸产物之间，各个型别的延伸产物的分子量差异不小于9道尔顿。按照引物间，引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。
用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：每条延伸引物的分子量相互间的差别要大于30道尔顿，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9道尔顿，延伸引物与延伸产物的分子量要在4500—8500Da之间。
一种HPA型别设计一条质谱延伸引物，一个质谱反应中加入多条质谱延伸引物。将多个检测型别的扩增引物与扩增引物混合，延伸引物与延伸引物混合。这样可以同时检测多个HPA型别，提高了效率，节省了成本。本发明中，在18个HPA系统中，除HPA-14w是由缺失3个核苷酸引起外，其余HPA均为相关基因的SNP所致。HPA-1、2、14w、8w、16w、17w属于一个质谱反应；HPA-4、6w、7w、11w、13w、15属于一个质谱反应；HPA-5、9w、10w、18w、20w、21w属于一个质谱反应；同时进行三个质谱反应可以检测18个HPA基因型别。
本实施例中使用的扩增引物为一对或多对在5’端添加了标签后的表1所述扩增引物，延伸引物为一条或多条表2所述延伸引物。
(2)PCR扩增
在本方法的步骤(2)中，对待检测血液样本进行PCR扩增，扩增反应的条件为本领域技术人员所熟知，在本发明的实施例中也详细描述了示例性的反应条件。并且根据所使用的本发明引物的具体序列，对扩增反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
在本发明的扩增步骤中，使用的扩增引物对选自具有SEQ ID NO:1至SEQIDNO:36所示序列的多核苷酸。
示例性PCR扩增过程为：
反应条件为94℃，15min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增45循环；最终72℃延伸3min。
PCR反应在Bio-Rad公司的PTC-200PCR仪上运行。PCR扩增反应试剂的配置见表3(缓冲液、dNTP混合物和taq酶购自sequenom公司)。
表3 PCR体系
(3)SAP酶处理
通过SAP消化酶处理，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。SAP消化酶反应体系见表4。
表4 SAP消化酶反应体
试剂 体积/反应
H2O(HPLE级) 1.53ul
SAP酶缓冲液 0.17ul
SAP酶 0.30ul
DNA体积 5.0ul
总体积 7.0ul
反应条件为37℃孵育40分钟，去除反应中剩余的dNTP；85℃5分钟使SAP酶失活。
(4)延伸反应
在本发明方法的步骤(4)中，对经过SAP处理的扩增产物进行延伸反应，在延伸反应中使用本发明的延伸引物，所得到的延伸产物与延伸引物的区别仅在于其3’端多了一个碱基(ddNTP)。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又能使整个系统的分辨率提高。
在本发明的方法中使用经过质量修饰的ddNTP，进行质量修饰的主要目的是为了使各延伸产物之间的分子量差距加大，从而提高后续的质谱分析的分辨率。对ddNTP进行质量修饰的方法是已知的。
作为本发明的一个优选实施方式，四种ddNTP为购自sequenom公司的市售产品，其分子量分别是：ddATP271.2，ddTTP327.1，ddCTP247.2，和ddGTP287.2。
在本发明的方法中，所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO:37至SEQIDNO:54任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。
在本发明的具体实施方案中，在9微升的反应体系中进行延伸反应，可以根据待检测的位点而使用一种延伸引物或多种的延伸引物的组合。延伸反应体系如下表5所示。
表5 延伸反应体系
*其中延伸反应mix按照各型引物的分子量大小进行线性关系调整。
反应条件为94℃，30s；94℃变性5s，52℃退火5s，80℃延伸5s，共扩增40循环，在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3min。
(5)树脂纯化
采用树脂纯化延伸反应产物。在延伸反应的产物中加入6mg树脂(购自sequenom公司)，加入18.00ul水，垂直摇匀一小时。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质谱检测。
(6)质谱分析
在本发明方法的步骤(6)中，对经过纯化的延伸产物进行质谱分析，从而确定各延伸产物的分子量。
在本发明的优选实施方式中，质谱仪选择基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。在所述方法中，将纯化产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发，由于基质分子经辐射吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。这样，采用质谱仪检测待检测突变位点不仅方便，而且灵敏度高、准确性高。
获得质谱峰图后，通过sequenom公司自带的分析软件，获得检测的HPA型别。
每一种抗原得到一个峰图，包括引物峰和产物峰，野生型和突变型产物由于分子量不同，产物峰的位置不同。当引物峰峰值为0，野生型产物峰峰高时，说明这种HPA抗原的型别是野生型aa；当引物峰峰值为0，突变型产物峰峰高时，说明这种HPA抗原的型别是突变型bb；当引物峰峰值为0，野生型产物峰和突变型产物峰同时峰高时，说明这种HPA抗原的型别是ab。图4和5分别示出了对其中两种HPA质谱图的分析。
实施例2 HPA基因型别的分型检测
本发明的方法中，多种HPA型别是同时检测的，将不同的引物同时放入一个管里面进行检测，如果存在18种HPA基因型别：HPA-1、HPA-2、HPA-4、HPA-5、HPA-6w、HPA-7w、HPA-8w、HPA-9w、HPA-10w、HPA-11w、HPA-13w、HPA-14w、HPA-15、HPA-16w、HPA-17w、HPA-18w、HPA-20w和HPA-21w中的一个就能检测出来。
本发明所述的HPA型别检测分三个孔进行，每个孔用于检测6种HPA基因型别，每个孔中所含引物(即反应过程中使用所有的扩增产物和延伸产物)及反应步骤和条件相同，按实施例1中所述将PCR体系加入384孔板孔中，混匀，加入DNA样品，进行PCR扩增，纯化，延伸，再次纯化，然后进行质谱检测(参见前述实施例1中所述的反应步骤和条件)，检测完成后分别对每个管进行质谱检测和分析。
其中所有的引物峰和产物峰之间分子量差异不小于9Da。峰图报告结果分为4种:A:结果可靠B:中度可靠C:一般可靠D:低度可靠。前三种视为该延伸反应有效，第四种由于攻谱峰图基线不平而致，视为该延伸反应无效。质谱检测峰图结果如图1-3中所示。
图1为样本HPA-5、9w、10w、18w、20w、21w共计6种HPA抗原的质谱检测峰图。
图2为样本HPA-1、2、14w、8w、16w、17w共计6种HPA抗原的质谱检测峰图。
图3为样本HPA-4、6w、7w、11w、13w、15共计6种HPA抗原的质谱检测峰图。该样本峰图置信度高，延伸产物的峰型清晰，分型结果明确。

Claims (20)

1.一种用于HPA基因分型的方法，所述方法分为三个处理同时进行，每个处理用于检测6种HPA基因型别，各处理的步骤相同，均包括：
(1)用扩增引物组对目的样品进行PCR扩增，其中所述扩增引物是根据目标HPA基因设计的；
(2)用延伸引物组对步骤(1)获得的扩增产物进行延伸；
(3)对步骤(2)获得的延伸产物进行质谱检测，从而确定样品中的HPA基因型别，
其中，
三个处理所采用的扩增引物组和延伸引物组不同，分别为：
第一扩增引物组和第一延伸引物组，用于同时检测HPA-5、HPA-9w、HPA-10w、HPA-18w、HPA-20w、HPA-21w的6种HPA基因型；
第二扩增引物组和第二延伸引物组，用于同时检测HPA-1、HPA-2、HPA-14w、HPA-8w、HPA-16w、HPA-17w的6种HPA基因型；
第三扩增引物组和第三延伸引物组，用于同时检测HPA-4、HPA-6w、HPA-7w、HPA-11w、HPA-13w、HPA-15的6种HPA基因型，
其中，
所述第一扩增引物组由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:35，SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:36所示的6对扩增引物组成；
所述第一延伸引物组由SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的6条延伸引物组成；
所述第二扩增引物组由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:32，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:33所示的6对扩增引物组成；
所述第二延伸引物组由SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51所示的6条延伸引物组成；
所述第三扩增引物组由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:29，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:31所示的6对扩增引物组成；
所述第三延伸引物组由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49所示的6条延伸引物组成。
2.权利要求1所述的方法，在SEQ ID NO：1-36所示的扩增引物的5’端添加标签。
3.权利要求2所述的方法，所述标签为acgttggatg。
4.权利要求1所述的方法，其中在进行步骤(2)之前对步骤(1)的扩增产物进行纯化，并且/或者在进行步骤(3)之前对步骤(2)的延伸产物进行纯化。
5.权利要求4所述的方法，使用树脂进行纯化。
6.权利要求1所述的方法，所述质谱检测使用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统。
7.权利要求1所述的方法，在进行步骤(2)之前，对扩增产物进行处理以除去所述扩增产物中含有的dNTP。
8.权利要求7所述的方法，使用SAP酶进行处理。
9.权利要求1所述的方法，在进行步骤(2)时，使用ddNTP进行延伸反应。
10.权利要求1所述的方法，在步骤(2)中，各延伸产物与各延伸引物之间的分子量差异不小于9D。
11.权利要求1所述的方法，在步骤(2)中，各延伸引物之间的分子量差异不小于30D。
12.一种引物组合物，其包含：
第一扩增引物组和第一延伸引物组，所述第一扩增引物组和第一延伸引物组一起使用，用于同时检测HPA-5、HPA-9w、HPA-10w、HPA-18w、HPA-20w、HPA-21w的6种HPA基因型；
第二扩增引物组和第二延伸引物组，所述第二扩增引物组和第二延伸引物组一起使用，用于同时检测HPA-1、HPA-2、HPA-14w、HPA-8w、HPA-16w、HPA-17w的6种HPA基因型；以及
第三扩增引物组和第三延伸引物组，所述第三扩增引物组和第三延伸引物组一起使用，用于同时检测HPA-4、HPA-6w、HPA-7w、HPA-11w、HPA-13w、HPA-15的6种HPA基因型，
其中，
所述第一扩增引物组由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:35，SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:36所示的6对扩增引物组成；
所述第一延伸引物组由SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的6条延伸引物组成；
所述第二扩增引物组由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:32，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:33所示的6对扩增引物组成；
所述第二延伸引物组由SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51所示的6条延伸引物组成；
所述第三扩增引物组由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:29，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:31所示的6对扩增引物组成；
所述第三延伸引物组由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49所示的6条延伸引物组成。
13.权利要求12所述的引物组合物，其中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36所示的扩增引物的5’端含有标签序列。
14.权利要求13所述的引物组合物，所述标签为acgttggatg。
15.权利要求12-14任一项所述的引物组合物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于HPA基因分型检测。
16.一种试剂盒，所述试剂盒用于检测目的样品的HPA基因分型，其包括：
第一扩增引物组和第一延伸引物组，所述第一扩增引物组和第一延伸引物组一起使用，用于同时检测HPA-5、HPA-9w、HPA-10w、HPA-18w、HPA-20w、HPA-21w的6种HPA基因型；
第二扩增引物组和第二延伸引物组，所述第二扩增引物组和第二延伸引物组一起使用，用于同时检测HPA-1、HPA-2、HPA-14w、HPA-8w、HPA-16w、HPA-17w的6种HPA基因型；
第三扩增引物组和第三延伸引物组，所述第三扩增引物组和第三延伸引物组一起使用，用于同时检测HPA-4、HPA-6w、HPA-7w、HPA-11w、HPA-13w、HPA-15的6种HPA基因型；以及
PCR试剂和延伸反应试剂，
其中，
所述第一扩增引物组由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:35，SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:36所示的6对扩增引物组成；
所述第一延伸引物组由SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的6条延伸引物组成；
所述第二扩增引物组由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:32，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:33所示的6对扩增引物组成；
所述第二延伸引物组由SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51所示的6条延伸引物组成；
所述第三扩增引物组由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:29，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:31所示的6对扩增引物组成；
所述第三延伸引物组由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49所示的6条延伸引物组成。
17.权利要求16所述的试剂盒，还包括SAP酶和ddNTP。
18.权利要求16所述的试剂盒，所述目的样品选自血样。
19.权利要求18所述的试剂盒，所述目的样品来自哺乳动物。
20.权利要求19所述的试剂盒，所述目的样品来自人。
CN201080070818.0A 2010-12-20 2010-12-20 用于hpa基因分型的方法及所用引物 Active CN103261437B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2010/002090 WO2012083481A1 (zh) 2010-12-20 2010-12-20 用于hpa基因分型的方法及所用引物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103261437A CN103261437A (zh) 2013-08-21
CN103261437B true CN103261437B (zh) 2015-06-10

Family

ID=46312984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080070818.0A Active CN103261437B (zh) 2010-12-20 2010-12-20 用于hpa基因分型的方法及所用引物

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN103261437B (zh)
HK (1) HK1185381A1 (zh)
WO (1) WO2012083481A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103911431A (zh) * 2014-02-27 2014-07-09 上海市血液中心 一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途
CN103952481B (zh) * 2014-04-04 2018-01-16 宋竞岩 用于检测等位基因cyp2c19*3的引物组合及检测试剂盒
CN105296601B (zh) * 2014-06-25 2017-12-19 浙江省血液中心 一种人血小板同种抗原系统基因分型的pcr‑sbt方法及试剂
CN106222295B (zh) * 2016-09-29 2019-12-06 上海市血液中心 人血小板血型的多重pcr检测方法及试剂盒
CN108660198B (zh) * 2018-05-15 2022-02-22 广州血液中心 一种血小板膜蛋白cd36抗原基因分型的pcr-sbt方法及试剂
CN110964799B (zh) * 2019-12-20 2022-10-04 江苏伟禾生物科技有限公司 用于检测人类血小板表面抗原hpa与hla-ab基因分型的试剂盒
CN113249493A (zh) * 2021-03-05 2021-08-13 浙江省血液中心 一种人血小板同种抗原系统等位基因分型的实时荧光pcr方法、探针、引物及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101027408A (zh) * 2004-04-01 2007-08-29 桑昆血液供给基金会 血细胞抗原基因分型的方法和用于血细胞抗原基因分型的试剂盒
CN101845520A (zh) * 2010-05-11 2010-09-29 上海市血液中心 一种hpa等位基因分型检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101027408A (zh) * 2004-04-01 2007-08-29 桑昆血液供给基金会 血细胞抗原基因分型的方法和用于血细胞抗原基因分型的试剂盒
CN101845520A (zh) * 2010-05-11 2010-09-29 上海市血液中心 一种hpa等位基因分型检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for genotyping of human platelet-specific antigens;Henk S.P. Garritsen等;《TRANSFUSION》;20090228;第49卷;252-258 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1185381A1 (zh) 2014-02-14
WO2012083481A1 (zh) 2012-06-28
CN103261437A (zh) 2013-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103261437B (zh) 用于hpa基因分型的方法及所用引物
AU2012249531B2 (en) Quantification of a minority nucleic acid species
CN101921834B (zh) 一种abo血型基因分型的pcr-sbt方法及试剂
CN109468384B (zh) 一种同时检测45个y基因座的复合扩增检测试剂盒
KR102006803B1 (ko) 메틸화 dna 다중 검출방법
US7919279B2 (en) Methods and compositions for KIR genotyping
AU2013207385B2 (en) System and method of detecting RNAs altered by cancer in peripheral blood
EP2663654A1 (en) Methods, compositions, and kits for detecting rare cells
CN101838683B (zh) 一种kras基因和/或braf基因的核苷酸突变位点的检测方法
CN103276065A (zh) 用于检测与遗传性耳聋相关的基因snp的引物系统及其用途
CN103352073B (zh) 用于检测与遗传性耳聋相关的基因snp的引物系统及其用途
CN110088296B (zh) 改进的多重和多步扩增反应及其试剂
CN105567822B (zh) 一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组和试剂盒
WO2022033407A1 (zh) 核酸质谱检测dna/rna的产品及检测方法
WO2016165591A1 (zh) 基于焦磷酸测序技术的mgmt基因启动子甲基化检测
CN101440407A (zh) 一种核苷酸突变位点的检测方法
CN110923314A (zh) 一组检测SNP位点rs9263726的引物、crRNA序列及其应用
CN105483267B (zh) 血浆游离DNA双分子标记、标记和检测血浆cfDNA的方法及其用途
CN106555011A (zh) 基因检测或基因分型的组合物及方法
CN105586392A (zh) 评估胎儿样本中母体细胞污染程度的方法
CN105695575A (zh) 55个snp位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒
Deharvengt et al. Molecular assessment of human diseases in the clinical laboratory
CN109154026B (zh) 用于将dlbcl分类的方法和组合物
CN104789673A (zh) rs1800818在检测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征中的应用
US20120053064A1 (en) Determining the identity of terminal nucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SHENZHEN BEIJING GENOMICS INSTITUTE HEALTH TECHNOL

Free format text: FORMER OWNER: BGI-SHENZHEN CO., LTD.

Effective date: 20130903

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20130903

Address after: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 North Road No. 146 North Industrial Zone 11, floor 3, 2

Applicant after: Shenzhen Huada Gene Health Technology Co., Ltd.

Address before: 11, 8 floor, Beishan Industrial Zone, Yantian District, Guangdong, Shenzhen 518083, China

Applicant before: BGI-Shenzhen Co., Ltd.

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1185381

Country of ref document: HK

CB02 Change of applicant information

Address after: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 North Road No. 146 North Industrial Zone 11, floor 3, 2

Applicant after: Shenzhen BGI Medicine Co., Ltd.

Address before: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 North Road No. 146 North Industrial Zone 11, floor 3, 2

Applicant before: Shenzhen Huada Gene Health Technology Co., Ltd.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: SHENZHEN BEIJING GENOMICS INSTITUTE HEALTH TECHNOLOGY CO., LTD. TO: SHENZHEN BGI MEDICINE CO., LTD.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: SHENZHEN BGI CORPORATION

Free format text: FORMER NAME: SHENZHEN BGI MEDICINE CO., LTD.

CP03 Change of name, title or address

Address after: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 Hongan street No. 21 China Comprehensive Park 7 Building 7 layer -14 layer

Patentee after: BGI SHENZHEN CO LTD

Address before: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 North Road No. 146 North Industrial Zone 11, floor 3, 2

Patentee before: Shenzhen BGI Medicine Co., Ltd.

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1185381

Country of ref document: HK