CN103911431A - 一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途 - Google Patents

一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途 Download PDF

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CN103911431A CN201410070306.4A CN201410070306A CN103911431A CN 103911431 A CN103911431 A CN 103911431A CN 201410070306 A CN201410070306 A CN 201410070306A CN 103911431 A CN103911431 A CN 103911431A
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李睿书
陆萍
凌冰
刘达庄
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    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本发明涉及一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途，具体提供了人类血小板12个抗原组成系统基因分型的参比质粒、该参比质粒的用途、含有以上参比质粒的试剂盒以及该试剂盒的用途。本发明为临床上的人类血小板抗原基因分型提供了便利，有助于血小板输注无效患者针对性开展血小板制品同型输注，并为评估基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度提供了重要的参考依据。

Description

一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途
【技术领域】
本发明涉及分子生物学和临床诊断技术领域，具体地说，是一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途。
【背景技术】
随着输血医学的发展，成分输血不断推广使用，血小板输注已经成为临床输血治疗的重要手段之一。人类血小板抗原（HPA）是分布在血小板膜糖蛋白上的一类具有型特异性的抗原。目前，血清学方法已检出34个血小板抗原，其中12个抗原组成系统，包括HPA-1a、HPA-1b、HPA-2a、HPA-2b、HPA-3a、HPA-3b、HPA-4a、HPA-4b、HPA-5a、HPA-5b、HPA-15a、HPA-15b。在临床产生的HPA抗体中，针对这些抗原的抗体占据绝大多数，充分体现了其临床重要性。HPA在临床上具有特定意义，可介导机体产生同种抗体，由同种免疫可引发多种疾病，如血小板输注无效、输血后紫癜、新生儿同种免疫性血小板减少症等。为此，准确进行HPA的基因分型，开展血小板同型输注，对于临床输血具有重要的意义，也是输血领域的发展方向。
目前已报道的基因分型方法种类很多，主要是基于检测SNP，以PCR反应为基础。由于绝大多数HPA基因多态性都表现为单核苷酸多态性（SNP），因此检测SNP的方法基本都适用于HPA的基因分型，其共同特点是均以聚合酶链式反应（PCR）为基础，不同之处在于PCR引物设计和检测产物的方法。然而，对于HPA基因分型参比体系的研究鲜有报道，可能与一些HPA基因型别在人群中频率极低，对应的基因参比品难以获得有关。 
在基因分型实验中遇到某些低频或高频等位基因时，往往缺乏标准参比品（质控DNA）作为对照。但是，由于SNP只有一个碱基的差异，某些方法难免出现引物非特异错配，最终导致实验结果不够准确。因此，为促进临床血小板同型输注，规避输血风险，提供一种HPA基因分型参比品，用于评估HPA基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度，具有十分重要的意义。 
中国期刊《中国输血杂志》，2011年05月第24卷第05期，刊出的论文“人类血小板抗原基因分型参考品的制备及鉴定”，构建了22型人类血小板抗原基因分型参考品，并对其进行了测序鉴定，其方法是提取人血液基因组DNA，以其为模板，通过特异性引物扩增出各HPA（1a~16a）基因片段，胶回收后克隆至pUCm-T载体，随后转化E.coli DH5α，提取质粒酶切鉴定并测序；再以构建成功的HPA-1a~16a质粒为模板，通过定点突变获得HPA-1b~16bw基因片段，经克隆、转化后，作酶切鉴定并测序。最终获得了HPA-1a~16a、HPA-1b~16bw基因片段，克隆出各型HPA基因分型参考品质粒，其序列与GenBank中公布的数据完全一致。结论：各型HPA基因分型参考品质粒的成功构建，解决了基因频率较低型别（HPA-1b~16bw）质控DNA难以获得的实际问题，为HPA基因分型方法的研究奠定了基础。但是该论文构建了参比质粒后，仅使用测序方法鉴定了其准确性，首先并未进一步使用其他方法来验证构建的质粒的准确性；其次并未进一步应用这些参比质粒进行基因分型实验，。因此本领域技术人员根据该文献报道的内容并不能毫无疑义且直接地确定这些参比质粒在不同抗原组成系统中的分型结果判定方法，难以确定其可有效地用于基因分型中作为阴阳性对照的效力，也难以以该质粒来评估基因分型方法的准确性、特异性和灵敏度。 
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人类血小板抗原基因分型参比质粒。
本发明的再一的目的是，提供上述人类血小板抗原基因分型参比质粒的用途。 
本发明的另一的目的是，提供一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒。 
本发明的第四个目的是，提供上述人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒的用途。 
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是： 
一种人类血小板抗原基因分型参比质粒，它是通过以下方法构建得到的：
    a）用SEQ ID NO.1-24的引物扩增得到HPA-1a、HPA-2a、HPA-3a、HPA-4a、HPA-5a以及HPA-15a的基因片段；
b）将步骤a）的基因片段分别连入pGM-T载体得到高频等位基因分型参比质粒；
c）对步骤b）的高频等位基因分型参比质粒进行定点突变获得相应低频等位基因分型参比质粒。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是： 
如上所述的人类血小板抗原基因分型参比质粒在人类血小板抗原基因分型或评估人类血小板抗原基因分型方法准确性、特异性或灵敏度中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是： 
一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒，所述的试剂盒至少包含如上所述的人类血小板抗原基因分型参比质粒中的一种。
优选地，所述的试剂盒包含如上所述的所有人类血小板抗原基因分型参比质粒。 
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是： 
如上任一所述的人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒在人类血小板抗原基因分型或评估人类血小板抗原基因分型方法准确性、特异性或灵敏度中的应用。
本发明优点在于：本发明利用分子生物学技术，包括PCR扩增，载体连接，转化克隆，以及定点突变技术建立了HPA基因分型参比质粒，该参比质粒含有正确的HPA基因序列，并在不同的基因分型方法中起到了预期的效果。当使用限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法进行基因分型时，该参比质粒的酶切产物特征性条带差异明显，在琼脂糖凝胶上能很好地进行分辨，极大地方便了结果的判定，保证了判定的准确性。可将以上参比质粒制备成试剂盒，将为临床上HPA基因分型提供便利，有助于同型输注的开展，并为评估基因分型方法（如RFLP、SSP、SSCP、SSOP法等）的准确性、特异性和灵敏度提供重要的参考依据。 
【附图说明】
图1是不同HPA基因型PCR产物片段琼脂糖电泳结果。M：100bp DNA marker；lane 1：HPA-1a；lane 2：HPA-2a；lane 3：HPA-3a；lane 4：HPA-4a；lane 5：HPA-5a；lane 6：HPA-15a。
图2是所有参比质粒测序图谱，红色箭头所示为定点突变处。 
图3是PCR-SSP对HPA-1基因分型琼脂糖电泳结果。每份样品均用商业试剂盒中的 “HPA-1a”和“HPA-1b”进行检测。M：100bp DNA marker；lanes 1, 2：HPA-1a质粒；lanes 3, 4；HPA-1b质粒；lanes 5~8：两份基因组DNA样品。 
图4是针对HPA-1的PCR-RFLP后酶切产物琼脂糖电泳结果。 M：100bp DNA marker；lane 1：HPA-1a质粒；lane 2：HPA-1b质粒；lanes 3, 4：两份基因组DNA样品。 
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、材料
E.coli TOP10菌株、pGM-T连接试剂盒、TIANamp血液DNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、内切酶MspI购自宝生物工程（大连）有限公司；定点突变试剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司；PCR-SSP试剂盒购自美国G&T公司。
二、方法
1、引物设计
引物根据Genbank数据库中的标准HPA基因序列设计，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。
表1 基因克隆和定点突变的引物设计序列 
2、PCR扩增和连接
提取献血者基因组DNA为模板，利用上述引物通过PCR扩增各型HPA高频等位基因片段。反应体系为：模板DNA 2μL，10×PCR buffer（Mg2+ plus）5μL，dNTP 2μL，引物（10μmol/L）各1μL，0.5μL Taq（5U/μL），加水至50μL；反应条件：95°C预变性5分钟；然后95°C 30s，57°C 30s，72°C 30s扩增30个循环；最后72°C延伸5分钟。PCR产物利用胶回收试剂盒纯化回收，并根据说明书连接进pGM-T载体中。
 3、定点突变 
 对于低频等位基因采用赛百盛公司的定点突变试剂盒进行扩增，反应体系为：质粒DNA 1μL，10×buffer 5μL，dNTP 2μL，引物各1μL，Muta-directTMEnzyme 1μL，加水至终体积50μL。反应条件：95°C预变性5分钟；然后95°C 30s，55°C 1min，72°C 3min扩增30个循环；最后0°C放置5分钟。反应完毕，产物用1μL MutazymeTM37°C酶切1h。
 4、克隆与鉴定 
 将质粒及酶切产物转化TOP10感受态细胞，通过蓝白筛选，提取质粒，交由上海生工进行测序分析。
5、PCR-SSP 
 利用PCR-SSP试剂盒，通过PCR-SSP检测样品基因组DNA和参比质粒。反应体系为：模板DNA 1μL，检测试剂（来自试剂盒）7μL，1μL Taq（0.33 U/μL）；反应条件：95°C预变性5分钟；然后95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s扩增30个循环；最后72°C延伸5分钟。
6、PCR-RFLP 
利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应，检测样品基因组DNA和参比质粒。为确定HPA-1基因型，利用引物“HPA-1a”扩增目标片段。反应体系为：模板DNA 2μL，10×PCR buffer（Mg2+ plus）5μL，dNTP 2μL，引物（10μmol/L）各1μL，0.5μL Taq（5U/μL），加水至50μL；反应条件：95°C预变性5分钟；然后95°C 30s，57°C 30s，72°C 30s扩增30个循环；最后72°C延伸5分钟。然后将1μL PCR产物用10U MspI酶切，37°C 4h。最后进行琼脂糖电泳，紫外灯下观察结果。
三、结果
1、PCR扩增和定点突变
以来自于献血者的基因组DNA为模板，利用PCR扩增，得到了HPA-1a、HPA-2a、HPA-3a、HPA-4a、HPA-5a以及HPA-15a的基因片段，长度分别为：282、385、564、664、678、475bp，与理论预期一致，见图1。同时，低频的HPA-1b、HPA-2b、HPA-3b、HPA-4b、HPA-5b以及 HPA-15b的基因片段通过定点突变技术获得，其分子量与其相对应的高频等位基因相同。
2、鉴定 
 对白色菌斑抽提的质粒进行测序，见图2，其序列与Genebank中公布的HPA-1a~5a、HPA-15a、HPA-1b~5b、HPA-15b的序列完全一致，基因登录号分别M35999、NM_000173、M34480、M35999、X17033、NM_133493。
3、PCR-SSP 
紫外灯下观察PCR-SSP产物，针对HPA-1基因分型结果如图3所示。参比质粒产生了预期的正确条带（lane 1~4），两份基因组DNA样品的基因型分别为HPA-1aa和HPA-1ab（lanes 5~8）。此结果表明，该参比质粒在PCR-SSP基因定型方法中的作用达到了预期。
4、PCR-RFLP 
酶切产物进行2%的琼脂糖电泳，紫外灯下观察结果。HPA-1基因分型结果如图4所示。长度为282bp的PCR产物通过酶切，不同的基因型可以得到不同长度的特征性条带。HPA-1aa对应于204bp而HPA-1bb对应于173bp，杂合子HPA-1ab同时具有以上两条特征性条带。参比质粒产生了预期的正确条带（lanes 1~2），两份基因组DNA样品的基因型分别为HPA-1aa和HPA-1ab（lanes 3~4）。此结果表明，该参比质粒在PCR-RFLP基因定型方法中的作用达到了预期。
同时，我们应用构建的所有系统的参比质粒进行了PCR-SSP基因分型实验，结果参比质粒均产生了预期的正确条带。另外，我们还将参比质粒应用于HPA-2、HPA-3、HPA-5的PCR-RFLP基因分型实验，得到各系统PCR-RFLP基因分型所用内切酶和实验结果如表2所示，根据该结果可以判定基因样品分型结果是否准确，并对基因分型方法的准确性进行评估。 
表2 各系统PCR-RFLP基因分型所用内切酶和实验结果 
注：1、表中酶切产物片段大小对应于其单个等位基因，若为杂合子，则产物同时出现a和b等位基因的对应片段。2、HPA-4和HPA-15系统暂无PCR-RFLP基因分型方法报道。
 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。 
  SEQUENCE LISTING
<110>  上海市血液中心
<120>  一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒及其用途
<130>  /
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Claims (5)

1.一种人类血小板抗原基因分型参比质粒，其特征在于，它是通过以下方法构建得到的：
    a）用SEQ ID NO.1-24的引物扩增得到HPA-1a、HPA-2a、HPA-3a、HPA-4a、HPA-5a以及HPA-15a的基因片段；
b）将步骤a）的基因片段分别连入pGM-T载体得到高频等位基因分型参比质粒；
c）对步骤b）的高频等位基因分型参比质粒进行定点突变获得相应低频等位基因分型参比质粒。
2.权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型参比质粒在人类血小板抗原基因分型或评估人类血小板抗原基因分型方法准确性、特异性或灵敏度中的应用。
3.一种人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒至少包含权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型参比质粒中的一种。
4.根据权利要求3所述的人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的所有人类血小板抗原基因分型参比质粒。
5.权利要求3或4所述的人类血小板抗原基因分型参比品试剂盒在人类血小板抗原基因分型或评估人类血小板抗原基因分型方法准确性、特异性或灵敏度中的应用。
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