CN101633963B - 乙型肝炎病毒ymdd基序突变检测特异性引物、液相芯片及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测特异性引物、液相芯片和方法，该液相芯片主要包括有：ASPE引物；包被有特异的anti-tag序列的微球；用于扩增具有突变位点rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S、和/或rtN236T的目标序列的引物。本发明所述检测液相芯片及检测方法的检测灵敏度高，信噪比强，检测结果更加准确可靠。并且可以将6个突变位点检测可在同一个反应中完成，操作方便，并且避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及与乙型肝炎核苷类似物治疗耐药性相关的病毒YMDD基序突变检测特异性引物、液相芯片及其检测方法。
技术背景
乙型肝炎是全球广泛分布的传染病，在许多国家呈现地域性分布。全世界有超过20亿的人群感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中3.5～4亿是慢性携带者，而在中国就有1.2亿人。慢性乙型肝炎可引起肝硬化、肝功能衰竭，肝癌等严重的肝脏疾病，全世界每年约有100万的人因此而死亡。而中国是慢性乙型肝炎的重灾区，超过8％的人口为慢性携带者，每年因肝病死亡的约有30万人左右。
慢性乙型肝炎治疗近年来得到很大改善，抗病毒药物的种类主要包括两大类，一类是核苷类似物，一类是干扰素。干扰素主要是α干扰素和Pegylated干扰素，前者是乙肝治疗较早使用的药物，后者于2005年许可上市。干扰素的特点是既可以直接抑制病毒，又具有免疫调节作用，能够在抑制乙肝病毒复制的同时使病人达到免疫应答。但干扰素药物需注射使用，抑制病毒的时间比核苷类似物要长，且费用相对较高，不良反应也比较大，因此部分患者不能耐受干扰素。
现在已上市的核苷类似物药物有5种，分别是拉米夫定(Lamivudine，1998年上市)、阿德福韦(Adefovir，2002年上市)、恩替卡韦(Entecavir，2005年上市)、汰比夫定(Telbivudine，2006年上市)和泰诺福韦(Tenofovir，2008年上市)。这类药物通过干扰病毒的逆转录过程和抑制DNA合成来抑制病毒DNA的复制，其特点是直接抑制病毒，因此能使患者的病毒DNA水平快速下降，一、两个月就有明显的效果，但是核苷类似物不具备有免疫调节的作用。此外，此类药物只需口服用药，不良反应较小，费用较低。
核苷类似物药物只能抑制病毒复制，而不能根除病毒，因此需要长期使用。而长期用药则可能引发较高的比例的耐药。临床研究数据显示，拉米夫定治疗1～4年的基因耐药率分别为14％、38％、49％、66％。研究已经证明核苷类似物药物耐药与病毒P基因的YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸)基序变异有直接关系。
目前报道的YMDD变异主要有rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T。其中rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T和rtM204V/I/S与拉米夫定的耐药有关，而rtA181V/T和rtN236T与阿德福韦的耐药有关，其它核苷酸类似物药物由于上市时间较短，暂未发现显著的耐药现象。
YMDD变异导致拉米夫定耐药后，会使病人血清的谷丙转氨酶水平和病毒DNA水平升高，甚至病情恶化。因此建立简单、快速的检测YMDD变异情况的方法可以及时、尽早发现变异，从而调整用药和治疗方案，这对于控制疾病的进程和促进临床治疗是非常有意义的。
目前常用于检测乙肝病毒YMDD变异的技术主要有直接测序法、基于PCR的限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术、固相基因芯片技术等。直接测序法虽然一直被认为是检测基因突变的金标准，但费时费力，不符合临床检测的高通量要求，灵敏度也不高。RFLP同样操作步骤比较复杂，且检测结果受很多方面的影响，因此也不能满足临床大规模、快速、准确检测的需求。固相基因芯片虽然能实现高通量检测，但价格昂贵，敏感性不高，检测结果可重复性差。上面这些技术检测混合感染中的劣势型突变病毒株的能力较弱，因此在临床上均不能做到及时、尽早地发现乙肝病毒的YMDD变异株。
基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术满足了高通量检测的要求。
xTAG技术利用了Tsp DNA聚合酶在3’端的强特异性检测突变位点，并使用高度特异的TAG和anti-TAG序列极大地增强了检测结果的信噪比，因此该技术具有很高的灵敏度和准确性。把液相芯片技术和xTAG技术相结合，不仅能同时对多种突变进行检测，同时也具备了操作方便，快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点，在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容
本发明的目的之一是提供与核苷类似物治疗耐药性相关的乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测乙肝病毒YMDD基序的突变位点rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和/或rtN236T。
一种乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片，包括有：
(1)ASPE引物：每种ASPE引物由3’端的针对目的基序突变的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述针对目的基序突变的特异性序列包括有：分别针对rtL80I/V的SEQ ID NO.1-4；分别针对rtV173L的SEQ ID NO.5-7；分别针对rtL180M的SEQ ID NO.8-10；分别针对rtA181V/T的SEQ ID NO.11-19；分别针对rtM204V/I/S的SEQ ID NO.20-29；和/或分别针对rtN236T的SEQ ID NO.30-33；所述对应的tag序列选自SEQ ID NO.34-66；
(2).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列与(1)中所选的tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.67-99，上述每种微球具有不同颜色编码；
(3).用于扩增具有突变位点rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S、和/或rtN236T的目标序列的引物。
具体优选地，所述ASPE引物包括：由SEQ ID NO.1和34组成的序列、由SEQ ID NO.2和35组成的序列、由SEQ ID NO.3和36组成的序列、由SEQ ID NO.4和37组成的序列、由SEQ IDNO.5和38组成的序列、由SEQ ID NO.6和39组成的序列、由SEQ ID NO.7和40组成的序列、由SEQ ID NO.8和41组成的序列、由SEQ ID NO.9和42组成的序列、由SEQ ID NO.10和43组成的序列、由SEQ ID NO.11和44组成的序列、由SEQ ID NO.12和45组成的序列、由SEQ ID NO.13和46组成的序列、由SEQ ID NO.14和47组成的序列、由SEQ ID NO.15和48组成的序列、由SEQID NO.16和49组成的序列、由SEQ ID NO.17和50组成的序列、由SEQ ID NO.18和51组成的序列、由SEQ ID NO.19和52组成的序列、由SEQ ID NO.20和53组成的序列、由SEQ ID NO.21和54组成的序列、由SEQ ID NO.22和55组成的序列、由SEQ ID NO.23和56组成的序列、由SEQID NO.24和57组成的序列、由SEQ ID NO.25和58组成的序列、由SEQ ID NO.26和59组成的序列、由SEQ ID NO.27和60组成的序列、由SEQ ID NO.28和61组成的序列、由SEQ ID NO.29和62组成的序列、由SEQ ID NO.30和63组成的序列、由SEQ ID NO.31和64组成的序列、由SEQID NO.32和65组成的序列、由SEQ ID NO.33和66组成的序列。
用于扩增目标序列的引物包括有：SEQ ID NO.100～SEQ ID NO.101；SEQ ID NO.102～SEQ ID NO.103扩增出一条具有另外五个突变位点的目标序列。
优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，更优选为，间隔臂序列为5-10个T。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对乙肝病毒YMDD基序rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和/或rtN236T突变进行检测的方法。
一种使用上述液相芯片对乙肝病毒YMDD基序rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T突变检测的方法，主要包括以下步骤：
(1)PCR扩增待测样品DNA，得PCR反应产物；
(2)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；
(3)再用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
(4)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
(5)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
(6)通过荧光检测仪检测。
本发明的另一目的，是提供一种用于乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液的特异性引物。
具体方案如下：
一种用于乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液的特异性引物，该引物包括：分别针对rtL80I/V的SEQ ID NO.1-4；分别针对rtV173L的SEQ ID NO.5-7；分别针对rtL180M的SEQID NO.8-10；分别针对rtA181V/T的SEQ ID NO.11-19；分别针对rtM204V/I/S的SEQ IDNO.20-29；和/或分别针对rtN236T的SEQ ID NO.30-33。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高，并且因其具有很高的灵敏度，可以检测出测序法无法检测到的低比例的混合突变。所制备的乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。
2.本发明设计的ASPE特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。
3.本发明的检测方法步骤简单，使用多重ASPE技术，6个突变位点检测可在同一个反应中完成，操作方便，并且避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片，主要包括有：
一、特异性引物序列和ASPE引物
针对与核苷类似物治疗耐药性相关的乙肝病毒YMDD基序的六个常见突变位点rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T分别设计特异性的引物序列。ASPE引物由Tag+特异性引物序列组成。ASPE引物序列如下表所示：(SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.33为特异性序列)
表1ASPE引物序列
表2ASPE特异性引物5’端的Tag序列
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列(如表2所示)，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成1000pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的三十三种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表3所示：
表3微球上对应的anti-tag序列
选择的33种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。
所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，在中国，poly(dT)的合成技术比较成熟，成本相对较低。
微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA]中，2-8℃避光保存。
三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物：
除rtL80I/V外，rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T五个突变位点相近。利用Primer5.0在乙肝病毒基因组的保守序列设计两对引物(见表4)，其中SEQ ID NO.100～SEQ ID NO.101扩增出一条具有rtL80I/V突变位点的目标序列，SEQ ID NO.102～SEQ IDNO.103扩增出一条具有另外五个突变位点的目标序列。
表4扩增出具有突变位点的目标序列的引物
| SEQ ID NO. | 类型 | 扩增引物 |
| 100 | Forward Primer 1 | 5′GAGTCTAGACTCGTGGTGGACT 3′ |
| 101 | Reverse Primer 1 | 5′GGACAAACGGGCAACATACC 3′ |
| 102 | Forward Primer 2 | 5′CACTTGTATTCCCATCCCATC 3′ |
| 103 | Reverse Primer 2 | 5′GCGTCAGCAAACACTTGGCA 3′ |
所有PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用乙型肝炎肝拉米夫定耐药性检测液相芯片对临床样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
| 5M NaOH | Fisher SS256-500 | --- | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | Sigma T3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、待测样本的准备(血清中病毒核酸的提取)：
参照Omega病毒DNA提取试剂盒说明，提取得到待检的病毒DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0在乙肝病毒基因组的保守序列设计两对引物，多重PCR分别扩增出乙肝病毒包含rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T所在位点的两条序列，长度分别为和234bp和599bp。引物序列(SEQ ID NO.100～SEQ ID NO.103)见上述表4所示。
PCR反应体系如下：
10×缓冲液(含Mg2+) 5μL
dNTP(各2.5mM) 4μL
Taq酶(5U/μL) 0.5μL
多重PCR引物工作液(各100nM) 1μL
模板DNA 10μL
ddH2O 29.5μL
共 50μL
PCR扩增程序为：94℃3min；94℃20s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下：
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.33的ASPE引物贮存液5ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至1ml，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2μL
MgCl2(50mM) 0.5μL
Biotin-dCTP(400.μM) 0.25μL
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100μM) 1μL
Tsp酶(5U/μl) 0.25μL
混合的ASPE引物工作液(各500nM) 1μL
酶切处理的PCR扩增产物 5μL
ddH2O 10μL
共 20μL
PCR程序为：96℃2min；94℃30s，52℃1min，74℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，选择上述33种微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果大于100为cut-off值：
(1)当突变型探针HBV-L80I-m的MFI值大于100时，判定该样品存在L80I突变；
(2)当突变型探针HBV-L80V-m的MFI值大于100时，判定该样品存在L80V突变；
(3)当突变型探针HBV-V173L-m1或HBV-V173L-m2的MFI值大于100时，判定该样品存在V173L突变；
(4)当突变型探针HBV-L180M-m的MFI值大于100时，判定该样品存在L180M突变；
(5)当突变型探针HBV-A181V-m1、HBV-A181V-m2或HBV-A181V-m3的MFI值大于100时，判定该样品存在A181V突变；
(6)当突变型探针HBV-A181T-m1、HBV-A181T-m2或HBV-A181T-m3的MFI值大于100时，判定该样品存在A181T突变；
(7)当突变型探针HBV-M204V-m1或HBV-M204V-m2的MFI值大于100时，判定该样品存在M204V突变；
(8)当突变型探针HBV-M204I-m1或HBV-M204I-m2的MFI值大于100时，判定该样品存在M204I突变；
(9)当突变型探针HBV-M204S-m1或HBV-M204S-m2的MFI值大于100时，判定该样品存在M204S突变；
(10)当突变型探针HBV-N236T-m1或HBV-N236T-m2的MFI值大于100时，判定该样品存在N236T突变；
(11)如不存在以上几种突变，则判定该样品为YMDD野生型。
以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的检测方法检测结果的吻合率。本方法检测15份样本(接受拉米夫定治疗约1年)的乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测结果与测序结果吻合率达到93.3％(不吻合的一例可能是因为测序法的灵敏度不足)。可见本发明所提供的乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片能够准确地检测出rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T六个位点的突变，且结果稳定可靠。
表5乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测分析结果
| 样本序号 | 液相芯片检测结果 | 测序检测结果 |
| 1 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 2 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 3 | rtV173L/rtL180M/rtM204I突变病毒与野生型病毒混合感染 | rtV173L/rtL180M/rtM204I突变病毒与野生型病毒混合感染 |
| 4 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 5 | rtL180M/rtM204V突变病毒 | rtL180M/rtM204V突变病毒 |
| 6 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 7 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 8 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 9 | rtM204V突变病毒与野生型病毒混合感染 | 野生型病毒 |
| 10 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 11 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 12 | rtM204V突变病毒与野生型病毒混合感染 | rtM204V突变病毒与野生型病毒混合感染 |
| 13 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 14 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
| 15 | 野生型病毒 | 野生型病毒 |
实施例3 Tag序列及Anti-Tag序列的选择：
一、液相芯片制备的设计
以rtL180M突变的检测液相芯片为例，针对rtL180M的野生型和突变型设计的ASPE引物3’端的特异性引物，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.66中的3条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQ ID NO.67-SEQID NO.99。具体设计如下表(表5)所示。ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、扩增引物等如实施例1所述。
表7
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对血清样品1-10进行检测，检测结果如下(表中数据为检测荧光值)：
三、数据分析：
根据上述检测的荧光值，可以看出Group1、Group2和Group3这三组的液相芯片对相同样品的检测结果一致。因此，ASPE引物中，ASPE特异性引物5’端的Tag序列并不是唯一的，而是可以在本发明SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.66中进行选择，相应的，包被于微球上的Anti-tag序列须根据互补配对的原则，从SEQ ID NO.67-SEQ ID NO.99中选择对应的序列。
其它针对不同的基序突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测特异性引物、液相芯片及方法
<160>103
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cagacacatc cagcgataa 19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cagacacatc cagcgatag 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
cagacacatc cagcgatat 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cagacacatc cagcgatac 19
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aaacggactg aggcccac 18
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
aaacggactg aggcccag 18
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
aaacggactg aggcccaa 18
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gcctcagtcc gtttctct 18
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gcctcagtcc gtttctcc 18
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gcctcagtcc gtttctca 18
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tcagtccgtt tctcttggc 19
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tcagtccgtt tctcctggc 19
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
tcagtccgtt tctcatggc 19
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ctcagtccgt ttctcttga 19
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ctcagtccgt ttctcctga 19
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ctcagtccgt ttctcatga 19
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
tcagtccgtt tctcttggt 19
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tcagtccgtt tctcctggt 19
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
tcagtccgtt tctcatggt 19
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
cactgtctgg ctttcagtta ta 22
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
cactgtttgg ctttcagtta ta 22
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ctgtctggct ttcagttata tg 22
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
ctgtttggct ttcagttata tg 22
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
cactgtctgg ctttcagtta tg 22
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
cactgtttgg ctttcagtta tg 22
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
ctgtctggct ttcagttata tt 22
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
ctgtttggct ttcagttata tt 22
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
ctgtctggct ttcagttata gt 22
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
ctgtttggct ttcagttata gt 22
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
tgtctttggg tatacattta aa 22
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tgtctttggg tatacatttg aa 22
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
tgtctttggg tatacattta ac 22
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
tgtctttggg tatacatttg ac 22
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
tcaatcaatt acttactcaa atac 24
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
tcaattacct tttcaataca atac 24
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
aatcttacta caaatccttt cttt 24
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ttcacttttc aatcaacttt aatc 24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
cttttacaat acttcaatac aatc 24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
cttttcaatt acttcaaatc ttca 24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
cttttcaaat caatactcaa cttt 24
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
tcatttcaca attcaattac tcaa 24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
tacatcaaca attcattcaa taca 24
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
tatatacact tctcaataac taac 24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
tcaattactt cactttaatc cttt 24
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
tcattcatat acataccaat tcat 24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
caattcattt cattcacaat caat 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
tcatttcaat caatcatcaa caat 24
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
tcaatcatct ttatacttca caat 24
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
taattataca tctcatcttc taca 24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
tcaatcatta cacttttcaa caat 24
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
tacacaatct tttcattaca tcat 24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
cttctcatta acttacttca taat 24
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
cttttcatca ataatcttac cttt 24
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
ttcaatcatt caaatctcaa cttt 24
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
caatatcatc atctttatca ttac 24
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
ctactaattc attaacatta ctac 24
<210>57
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
ttactacaca atatactcat caat 24
<210>58
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
ctttctacat tattcacaac atta 24
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
taacattaca actatactat ctac 24
<210>60
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
tcatttactc aacaattaca aatc 24
<210>61
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
tcatttacct ttaatccaat aatc 24
<210>62
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
atcaaatctc atcaattcaa caat 24
<210>63
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
aatcctttct ttaatctcaa atca 24
<210>64
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
ctttaatcct ttatcacttt atca 24
<210>65
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
tacacatctt acaaactaat ttca 24
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
aatcaatctt cattcaaatc atca 24
<210>67
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
gtatttgagt aagtaattga ttga 24
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
gtattgtatt gaaaaggtaa ttga 24
<210>69
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
aaagaaagga tttgtagtaa gatt 24
<210>70
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
gattaaagtt gattgaaaag tgaa 24
<210>71
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
gattgtattg aagtattgta aaag 24
<210>72
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
tgaagatttg aagtaattga aaag 24
<210>73
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>73
aaagttgagt attgatttga aaag 24
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>74
ttgagtaatt gaattgtgaa atga 24
<210>75
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>75
tgtattgaat gaattgttga tgta 24
<210>76
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>76
gttagttatt gagaagtgta tata 24
<210>77
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>77
aaaggattaa agtgaagtaa ttga 24
<210>78
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>78
atgaattggt atgtatatga atga 24
<210>79
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>79
attgattgtg aatgaaatga attg 24
<210>80
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
attgttgatg attgattgaa atga 24
<210>81
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
attgtgaagt ataaagatga ttga 24
<210>82
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
tgtagaagat gagatgtata atta 24
<210>83
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
attgttgaaa agtgtaatga ttga 24
<210>84
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
atgatgtaat gaaaagattg tgta 24
<210>85
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
attatgaagt aagttaatga gaag 24
<210>86
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
aaagg taaga ttattgatga aaag 24
<210>87
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>87
aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24
<210>88
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
gtaatgataa agatgatgat attg 24
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>89
gtagtaatgt taatgaatta gtag 24
<210>90
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>90
attgatgagt atattgtgta gtaa 24
<210>91
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>91
taatgttgtg aataatgtag aaag 24
<210>92
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>92
gtagatagta tagttgtaat gtta 24
<210>93
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>93
gatttgtaat tgttgagtaa atga 24
<210>94
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
gattattgga ttaaaggtaa atga 24
<210>95
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
attgttgaat tgatgagatt tgat 24
<210>96
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>96
tgatttgaga ttaaagaaag gatt 24
<210>97
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>97
tgataaagtg ataaaggatt aaag 24
<210>98
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>98
tgaaattagt ttgtaagatg tgta 24
<210>99
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>99
tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
<210>100
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>100
gagtctagac tcgtggtgga ct 22
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>101
ggacaaacgg gcaacatacc 20
<210>102
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
cacttgtatt cccatcccat c 21
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
gcgtcagcaa acacttggca 20
Claims (6)
1.一种乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
(1).ASPE引物：每种ASPE引物由3’端的针对目的基序突变的特异性引物序列和5’端的tag序列组成，所述针对目的基序突变的特异性引物序列包括有：分别针对rtL80I/V的SEQID NO.1-4；分别针对rtV173L的SEQ ID NO.5-7；分别针对rtL180M的SEQ ID NO.8-10；分别针对rtA181V/T的SEQ ID NO.11-19；分别针对rtM204V/I/S的SEQ ID NO.20-29；和/或分别针对rtN236T的SEQ ID NO.30-33；所述对应的tag序列选自SEQ ID NO.34-66；
(2).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列与(1)中所选的tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.67-99，上述每种微球具有不同颜色编码；
(3).用于扩增具有突变位点rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S、和/或rtN236T的目标序列的引物，所述用于扩增目标序列的引物包括为：SEQ ID NO.100～SEQ ID NO.101；和/或SEQ ID NO.102～SEQ ID NO.103。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
(1).ASPE引物，包括有：针对rtL80I/V的由SEQ ID NO.1和34组成的序列、由SEQ ID NO.2和35组成的序列、由SEQ ID NO.3和36组成的序列、和由SEQ ID NO.4和37组成的序列；分别针对rtV173L的由SEQ ID NO.5和38组成的序列、由SEQ ID NO.6和39组成的序列和由SEQ ID NO.7和40组成的序列；分别针对rtL180M的由SEQ ID NO.8和41组成的序列、由SEQ ID NO.9和42组成的序列和由SEQ ID NO.10和43组成的序列；分别针对rtA181V/T的由SEQ ID NO.11和44组成的序列、由SEQ ID NO.12和45组成的序列、由SEQ ID NO.13和46组成的序列、由SEQ ID NO.14和47组成的序列、由SEQ ID NO.15和48组成的序列、由SEQ ID NO.16和49组成的序列、由SEQ ID NO.17和50组成的序列、由SEQ ID NO.18和51组成的序列和由SEQ IDNO.19和52组成的序列；分别针对rtM204V/I/S的由SEQ IDNO.20和53组成的序列、由SEQ ID NO.21和54组成的序列、由SEQ ID NO.22和55组成的序列、由SEQ ID NO.23和56组成的序列、由SEQ ID NO.24和57组成的序列、由SEQ IDNO.25和58组成的序列、由SEQ ID NO.26和59组成的序列、由SEQ ID NO.27和60组成的序列、由SEQ ID NO.28和61组成的序列和由SEQ ID NO.29和62组成的序列；和/或分别针对rtN236T的由SEQ ID NO.30和63组成的序列、由SEQ ID NO.31和64组成的序列、由SEQID NO.32和65组成的序列和由SEQ ID NO.33和66组成的序列；
(2).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列与(1)中所选的tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.67-99，上述每种微球具有不同颜色编码；
(3).用于扩增具有突变位点rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S、和/或rtN236T的目标序列的引物，所述引物为：SEQ ID NO.100～SEQ ID NO.101；和/或SEQ ID NO.102～SEQ ID NO.103。
3.根据权利要求1-2任一项所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片，其特征是，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。
4.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
5.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液相芯片，其特征是，
所述ASPE引物包括：由SEQ IDNO.1和34组成的序列、由SEQ ID NO.2和35组成的序列、由SEQ ID NO.3和36组成的序列、由SEQ ID NO.4和37组成的序列、由SEQ ID NO.5和38组成的序列、由SEQ ID NO.6和39组成的序列、由SEQ ID NO.7和40组成的序列、由SEQ ID NO.8和41组成的序列、由SEQ ID NO.9和42组成的序列、由SEQ ID NO.10和43组成的序列、由SEQID NO.11和44组成的序列、由SEQ ID NO.12和45组成的序列、由SEQ ID NO.13和46组成的序列、由SEQ ID NO.14和47组成的序列、由SEQ ID NO.15和48组成的序列、由SEQ ID NO.16和49组成的序列、由SEQ ID NO.17和50组成的序列、由SEQ ID NO.18和51组成的序列、由SEQID NO.19和52组成的序列、由SEQ ID NO.20和53组成的序列、由SEQ ID NO.21和54组成的序列、由SEQ ID NO.22和55组成的序列、由SEQ ID NO.23和56组成的序列、由SEQ ID NO.24和57组成的序列、由SEQ ID NO.25和58组成的序列、由SEQ ID NO.26和59组成的序列、由SEQID NO.27和60组成的序列、由SEQ ID NO.28和61组成的序列、由SEQ ID NO.29和62组成的序列、由SEQ ID NO.30和63组成的序列、由SEQ ID NO.31和64组成的序列、由SEQ ID NO.32和65组成的序列、和由SEQ ID NO.33和66组成的序列；
所述引物为SEQ ID NO.100～SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102～SEQ ID NO.103。
6.一种用于乙型肝炎病毒YMDD基序突变检测液的特异性引物，其特征是，包括有针对rtL80I的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3。
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