发明内容
本发明的目的之一是提供CYP2D6基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2D6基因的两种正常基因型CYP2D6*1和CYP2D6*2以及五种国内常见突变基因型CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复(Gene Duplication)突变。
一种CYP2D6基因突变检测液相芯片,包括有:
(A).针对CYP2D6 C2850T、CYP2D6 Deletion的突变位点的ASPE引物:每种ASPE引物由3’端的针对目的基因突变位点的特异性引物序列和5’端的tag序列组成,所述特异性引物序列分别为:SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、和SEQ ID20;所述tag序列选自SEQ ID NO.1-10中的任3种序列;
(B).分别包被有特异的anti-tag序列的3种微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列,上述每种微球具有不同颜色编码;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.21~SEQ IDNO.30中的序列,且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对;
(C).用于扩增具有CYP2D6C2850T、以及CYP2D6Deletion突变位点的CYP2D6基因目标序列的扩增引物。优选地,扩增引物包括有:SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38,和SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42;更优选地,还包括有可使扩增效果更好的用于巢式PCR的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32。
优选地,所述(A)中ASPE引物为:针对CYP2D6C2850T的野生型和突变型由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.18组成的序列、及针对CYP2D6Deletion的由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.20组成的序列。
优选地,还包括(D):针对CYP2D6 C100T、CYP2D6 G1846A、CYP2D6 A2549del、和/或CYP2D6 Dulplicatio突变位点的ASPE引物,每种ASPE引物由3’端的针对目的基因突变位点的特异性引物序列和5’端的tag序列组成,所述特异性引物序列为:针对CYP2D6 C100T的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12;针对CYP2D6 G1846A的SEQ ID NO.13及SEQ IDNO.14;针对CYP2D6 A2549del的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16、和针对CYP2D6Dulplicatio的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.19组成的序列中的一组或多组;所述tag序列选自SEQ ID NO.1-10中的序列,该所选tag序列与(A)中所选tag序列不相同;还包括与(D)中ASPE引物对应的包被有特异的anti-tag序列的种微球,所述anti-tag序列与(D)中的所选的对应tag序列互补配对;还包括用于扩增具有CYP2D6 C100T、CYP2D6 G1846A、CYP2D6A2549del、CYP2D6 Dulplication中一个或多个突变位点的CYP2D6基因目标序列的扩增引物,优选地,所述扩增引物为:SEQ NO.31-32以及针对CYP2D6 C100T的SEQ ID NO.33及SEQID NO.34、针对CYP2D6 G1846A的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、针对CYP2D6 A2549del的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、和针对CYP2D6 Dulplication的SEQ ID NO.39及SEQ IDNO.40中的一组或多组。
更优选地,所述(D)中,ASPE引物为:针对CYP2D6C100T的野生型和突变型由SEQID NO.1和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.12组成的序列、针对CYP2D6 G1846A的野生型和突变型由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.13组成的序列及由SEQID NO.4和SEQ ID NO.14组成的序列、针对CYP2D6 A2549del的野生型和突变型由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.16组成的序列、和针对CYP2D6 Dulplication由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.19组成的序列中的一组或多组。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP2D6基因突变进行检测的方法。
一种使用上述液相芯片对CYP2D6基因突变检测的方法,主要包括以下步骤:
(1)PCR扩增待测样品DNA;
(2)PCR扩增产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理;
(3)用所述ASPE引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记;
(4)将对应ASPE引物tag序列的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应;
(5)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应;
(6)通过荧光检测仪检测。
本发明的主要优点在于:
1.所述CYP2D6基因突变检测液相芯片可针对CYP2D6 C2850T、CYP2D6 Dulplication、CYP2D6 Deletion的突变位点同时检测,具有非常好的信号-噪声比,与测序法的吻合率高达100%,比同类相关的产品具有更高的特异性和准确率。tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE序列的结合,能够避免交叉反应,实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE特异性引物序列具有非常好的特异性,能准确区分各种型别的基因型。本发明所设计的各种特异性ASPE引物,能够在均一的反应条件下进行杂交反应,且各种引物、探针之间基本不存在非特异性结合。
3.本发明还可进一步同步对CYP2D6 C100T、CYP2D6 G1846A、和/或CYP2D6 A2549del突变位点进行检测,提高检测准确率,体现了精确的同时定性、定量分析特征,从而使检测的灵敏度进一步得到提高,检测结果更加准确可靠。同时,多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
具体实施方式
实施例1 CYP2D6基因突变检测液相芯片,主要包括有:
一、ASPE引物
CYP2D6基因的两种正常基因型为CYP2D6*1和CYP2D6*2,其中CYP2D6*2为C2850T突变。五种国内常见突变基因型为CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复突变。CYP2D6*3为A2549del缺失突变,CYP2D6*4为C100T和G1846A共同突变,CYP2D6*5为整个基因缺失突变,CYP2D6*10为C100T突变,此外还有整个基因的重复突变。针对CYP2D6基因的两种正常基因型CYP2D6*1和CYP2D6*2以及五种国内常见突变基因型CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复突变分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
表1 ASPE引物序列(Tag+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分,5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列,3’端为针对突变型或野生型的特异性序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物序列,选择tag序列,最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构,选择的十种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表2所示:
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的十种微球购自美国Luminex公司,将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序,即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T(使用其它的间隔臂的实验结果依然稳定可靠,具体数据省略)。
微球包被的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5ul的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0),1mmol/L EDTA中,2-8℃避光保存。
三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物
CYP2D6基因的两种正常基因型为CYP2D6*1和CYP2D6*2,五种国内常见突变基因型为CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因重复突变。利用Primer5.0设计六对引物(见表3),使用巢式PCR检测C100T、G1846A、A2549del和C2850T的位点突变,首先通过SEQ NO.31-32引物序列扩增出同时含有C100T、G1846A、A2549del和C2850T的片段,进而通过SEQ NO.33-SEQ NO.38扩增出3条含有突变位点的目标序列,SEQ NO.39-SEQ NO.42进行多重PCR扩增出2条含有突变位点的目标序列。
表3 扩增出具有突变位点的目标序列的引物
实施例2 运用CYP2D6基因突变检测液相芯片对临床样本的检测
所述各种溶液的配方如下:
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) |
Sigma M-2933 |
0.05M |
2.44g |
5M NaOH |
Fisher SS256-500 |
--- |
5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
1MTris-HCl,pH8.0 |
SigmaT3038 |
0.2M |
50ml |
5M NaCl |
Sigma S5150 |
0.4M |
20ml |
Triton X-100 |
Sigma T8787 |
0.16% |
0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取:
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明,得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计六对引物,分两管进行PCR反应,一管为巢式PCR,使用SEQ NO.31-32扩增同时含C100T、G1846A、A2549del和C2850T位点的片段,然后分别采用SEQ NO.33-34扩增含C100T位点片段,采用SEQ NO.35-36扩增含G1846A位点片段,采用SEQ NO.37-38扩增含A2549del和C2850T位点片段,产物大小分别为343bp、257bp、691bp;另一管为多重PCR一步扩增,如有CYP2D6重复突变,则SEQ NO.39-40可扩增到3.2kb片段,否则无扩增产物;如有CYP2D6*5突变,则SEQ NO.41-42可扩增到3.5kb片段,否则无扩增产物。引物序列(SEQNO.31-42)见上表3。
首先配制巢式PCR引物工作液:分别各取SEQ NO.31-38的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为巢式PCR引物工作液。巢式PCR反应体系如下:
10×缓冲液(含Mg2+) 5ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
多重PCR引物工作液(各12.5pmol/mL) 8ul
模板DNA(10ng/ul) 1ul
ddH2O 31.5ul
共 50ul
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃30s,66℃30s,72℃3.5min,10个循环,94℃30s,56℃30s,72℃45s,25个循环;72℃10min;4℃保存备用。
配制多重PCR引物工作液:分别各取SEQ NO.39-42的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下:
10×缓冲液(含Mg2+) 5ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
多重PCR引物工作液(各25pmol/mL) 4ul
模板DNA(10ng/ul) 1ul
ddH2O 35.5ul
共 50ul
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃20s,60℃30s,72℃3.5min,30个循环;72℃10min;4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明,详细步骤如下:
1.各取巢式PCR反应产物和多重PCR反应产物3.75ul,混匀,加入3ul ExoSAP-IT酶;
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min,使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液:分别各取C100T-W、C100T-M、G1846A-W、G1846A-M、A2549del-W、A2549del-M、C2850T-W、C2850T-M、Dulplication和Deletion相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中,加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul,混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下:
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10.ul
共 20ul
PCR程序为:96℃2min;94℃30s,58℃1min,72℃2min,30个循环;4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物,选择相应的最优的十种微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码,同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag),这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合;
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中;
3.微球于≥10000g离心1-2min;
4.弃去上清,微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中,涡旋混匀;
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中,对照孔加25ul的ddH2O;
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中,用ddH2O补足至50ul;
7.用锡箔纸包住96孔板以避光,95℃60s,37℃15min孵育杂交;
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min;
9.去上清,将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中;
10.微球于≥3000g离心2-5min;
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中,加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE);
12.37℃孵育15min,于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体,以荧光检测仪作为检测平台,对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中,掺入不同比例的红光及红外光染色剂,从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子,报告分子以生物素标记,并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测,检测结果如表4和表5所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求:
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI;
2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示);
3.满足以上两个条件的数据,按下列公式计算突变比值:
突变比值=突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值),以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的CYP2D6基因多态性,实验数据符合上述要求,因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下:突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子;30%-70%视为杂合子;80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照,计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP2D6基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的CYP2D6基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP2D6基因的SNP类型,且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
序号NO. |
C100T-W |
C100T-M |
G1846A-W |
G1846A-M |
A2549del-W |
A2549del-M |
C2850T-W |
C2850T-M |
Dulplication |
Deletion |
阴性对照 |
22 |
23 |
23 |
19 |
30 |
1 |
28 |
25 |
14 |
11 |
1 |
2642 |
38 |
6211 |
53 |
2535 |
49 |
3272 |
4456 |
16 |
27 |
2 |
2145 |
39 |
6085 |
31 |
1226 |
1068 |
6181 |
25 |
32 |
20 |
3 |
2150 |
29 |
6153 |
33 |
2461 |
31 |
6547 |
40 |
33 |
11 |
4 |
1339 |
1238 |
6192 |
20 |
2293 |
16 |
6972 |
31 |
34 |
30 |
5 |
1320 |
1015 |
5862 |
29 |
2244 |
1 |
6697 |
31 |
19 |
21 |
6 |
2478 |
36 |
6387 |
24 |
2313 |
20 |
6093 |
31 |
19 |
15 |
7 |
1382 |
1244 |
6112 |
22 |
2067 |
13 |
6775 |
34 |
21 |
19 |
8 |
24 |
2460 |
6007 |
28 |
2369 |
41 |
6670 |
34 |
33 |
20 |
9 |
2339 |
37 |
5943 |
27 |
2187 |
30 |
6522 |
25 |
27 |
27 |
10 |
1318 |
1459 |
5855 |
22 |
2248 |
7 |
6501 |
30 |
31 |
13 |
11 |
2043 |
24 |
6112 |
37 |
2485 |
3 |
3141 |
3840 |
17 |
19 |
12 |
2216 |
31 |
6312 |
24 |
2018 |
7 |
6821 |
27 |
33 |
11 |
13 |
1203 |
1152 |
5817 |
21 |
2480 |
42 |
6626 |
27 |
18 |
20 |
14 |
29 |
2065 |
3117 |
3484 |
2441 |
25 |
6733 |
40 |
23 |
21 |
15 |
2416 |
41 |
6240 |
24 |
2210 |
19 |
6437 |
41 |
29 |
29 |
16 |
1480 |
1192 |
6025 |
26 |
2052 |
27 |
6314 |
32 |
18 |
11 |
17 |
27 |
2426 |
6287 |
38 |
2104 |
37 |
6504 |
31 |
32 |
19 |
18 |
2381 |
2148 |
5808 |
30 |
2097 |
15 |
6445 |
33 |
25 |
13 |
19 |
32 |
2001 |
6371 |
21 |
2160 |
41 |
6991 |
26 |
18 |
2581 |
20 |
2181 |
41 |
5564 |
31 |
2353 |
14 |
6106 |
34 |
31 |
22 |
表5样本CYP2D6基因突变分析结果
序号NO. |
C100T |
G1846A |
A2549del |
C2850T |
Dulplication |
Deletion |
液相芯片检测结果 |
测序检测结果 |
1 |
1% |
1% |
2% |
58% |
× |
× |
*1/*2杂合子 |
*1/*2杂合子 |
2 |
1% |
0% |
47% |
0% |
× |
× |
*1/*3杂合子 |
*1/*3杂合子 |
3 |
0% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*1纯合子 |
*1/*1纯合子 |
4 |
48% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*10杂合子 |
*1/*10杂合子 |
5 |
43% |
0% |
0% |
0% |
× |
× |
*1/*10杂合子 |
*1/*10杂合子 |
6 |
1% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*1纯合子 |
*1/*1纯合子 |
7 |
47% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*10杂合子 |
*1/*10杂合子 |
8 |
100% |
0% |
2% |
0% |
× |
× |
*10/*10纯合子 |
*10/*10纯合子 |
9 |
1% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*1纯合子 |
*1/*1纯合子 |
10 |
53% |
0% |
0% |
0% |
× |
× |
*1/*10杂合子 |
*1/*10杂合子 |
11 |
0% |
0% |
0% |
55% |
× |
× |
*1/*2杂合子 |
*1/*2杂合子 |
12 |
0% |
0% |
0% |
0% |
× |
× |
*1/*1纯合子 |
*1/*1纯合子 |
13 |
49% |
0% |
2% |
0% |
× |
× |
*1/*10杂合子 |
*1/*10杂合子 |
14 |
100% |
53% |
1% |
0% |
× |
× |
*4/*10杂合子 |
*4/*10杂合子 |
15 |
1% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*1纯合子 |
*1/*1纯合子 |
16 |
45% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*10杂合子 |
*1/*10杂合子 |
17 |
100% |
0% |
2% |
0% |
× |
× |
*10/*10纯合子 |
*10/*10纯合子 |
18 |
47% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*10杂合子 |
*1/*10杂合子 |
19 |
99% |
0% |
2% |
0% |
× |
√ |
*10/缺失型杂合子 |
*10/缺失型杂合子 |
20 |
1% |
0% |
1% |
0% |
× |
× |
*1/*1纯合子 |
*1/*1纯合子 |
实施例3 CYP2D6 C2850T、CYP2D6 Deletion基因突变检测液相芯片对临床样本的检测
使用CYP2D6 C2850T、CYP2D6 Deletion基因突变检测液相芯片对血清样品1-20进行检测,ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表6 样本检测结果(MFI)
序号NO. |
C2850T-W |
C2850T-M |
Deletion |
阴性对照 |
26 |
26 |
9 |
1 |
3277 |
4517 |
18 |
2 |
6245 |
45 |
12 |
3 |
6581 |
41 |
26 |
4 |
7065 |
37 |
28 |
5 |
6757 |
40 |
18 |
6 |
6152 |
34 |
12 |
7 |
6861 |
40 |
25 |
8 |
6712 |
30 |
15 |
9 |
6588 |
32 |
29 |
10 |
6516 |
37 |
23 |
11 |
3172 |
3846 |
24 |
12 |
6869 |
37 |
28 |
13 |
6718 |
33 |
21 |
14 |
6758 |
31 |
22 |
15 |
6491 |
43 |
25 |
16 |
6382 |
33 |
23 |
17 |
6529 |
38 |
9 |
18 |
6475 |
27 |
11 |
19 |
6996 |
38 |
2541 |
20 |
6126 |
40 |
21 |
表7 样本CYP2D6 C2850T、CYP2D6 Deletion基因突变分析结果
序号NO. |
C2850T |
Deletion |
液相芯片检测结果 |
测序检测结果 |
1 |
58% |
× |
*1/*2 |
*1/*2 |
2 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
3 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
4 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
5 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
6 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
7 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
8 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
9 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
10 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
11 |
55% |
× |
*1/*2 |
*1/*2 |
12 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
13 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
14 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
15 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
16 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
17 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
18 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
19 |
0% |
√ |
*1/缺失型杂合子 |
*1/缺失型杂合子 |
20 |
0% |
× |
*1/*1 |
*1/*1 |
从实施例2和实施例3的结果可见,实施例3中只含有CYP2D6 C2850T、CYP2D6 Deletion基因突变液相芯片检测结果与实施例2的一致。
实施例4 不同的ASPE引物的液相芯片对CYP2D6基因突变的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以CYP2C9基因CYP2D6*2(C2850T)位点突变的检测液相芯片为例,针对C2850T的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物,而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQID NO.1-SEQ ID NO.10中的6条,相应的,包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.30。具体设计如下表(表8)所示。ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表8 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对血清样品21-40进行检测,检测结果如下:
表9 样本检测结果(MFI)与基因多态性分析
其它针对不同的SNP位点的液相芯片,ASPE引物运用不同的Tag序列,其结果依然稳定可靠,具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明,但该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更,均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>CYP2D6基因突变检测液相芯片及检测方法
<160>42
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aaacaaacttc acatctcaa taat 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tcaatcataa tctcataatc caat 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttactcaaaa tctacacttt ttca 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
aatcatacct ttcaatcttt taca 24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aatccttttt actcaattca atca 24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
caattaacta catacaatac atac 24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ctatcttcat atttcactat aaac 24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
aatctacaaa tccaataatc tcat 24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ctacaaacaa acaaacatta tcaa 24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cttttcatct tttcatcttt caat 24
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
cagggggcct ggtgg 15
<210>12
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cagggggcct ggtga 15
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
ggcgaaaggg gcgtcc 16
<210>14
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ggcgaaaggg gcgtct 16
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
gggtcccagg tcatcct 17
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
gggtcccagg tcatccg 17
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cttcaatgat gagaacctgc 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
cttcaatgat gagaacctgt 20
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
atggcgtttc atacttat 18
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
gccagcacgt tgacacct 18
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
attattgaga tgtgaagttt gttt 24
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
attggattat gagattatga ttga 24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
tgaaaaagtg tagattttga gtaa 24
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
tgtaaaagat tgaaaggtat gatt 24
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
tgattgaatt gagtaaaaag gatt 24
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
gtatgtattg tatgtagtta attg 24
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
gtttatagtg aaatatgaag atag 24
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
atgagattat tggatttgta gatt 24
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
ttgataatgt ttgtttgttt gtag 24
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
attgaaagat gaaaagatga aaag 24
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
ccgaccaggc ccctccaccg 20
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
cggccctgac actccttctt gc 22
<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
gcaggttcac tcacagcag 19
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
cctggtcgaa gcagtatgg 19
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
gctggagcag tgggtgac 18
<210>36
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
cctgaggaag cgagggtc 18
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
tccaggtgaa cgcagagc 18
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
aggaggtcag gcttacagg 19
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
cctcagcctc gtcacctcac 20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
cacgtgcagg gcacctagat 20
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
ccgggcacct gtactcctca 20
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
catgagctaa ggcacccaga c 21