CN104862308A - 一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒 - Google Patents
一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104862308A CN104862308A CN201410066908.2A CN201410066908A CN104862308A CN 104862308 A CN104862308 A CN 104862308A CN 201410066908 A CN201410066908 A CN 201410066908A CN 104862308 A CN104862308 A CN 104862308A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- primer pair
- tamoxifen
- primer
- test kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒。本发明保护一种引物组,由引物对甲和引物对乙组成;引物对甲由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成;引物对乙由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成。本发明还保护一种用于鉴定CYP2D6基因的100C>T点突变和CYP2D6基因的775delA突变的试剂盒,包括所述引物组。本发明提供的试剂盒可用于检测与他莫昔芬敏感性相关的两个SNP位点,进而可以用于临床指导他莫昔芬的个体化使用,提高临床治疗的针对性和可预见性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒。
背景技术
他莫昔芬(tamoxifen,TAM)作为一种雌激素受体调节的药物,在临床上常用于乳腺癌的辅助治疗、化疗等环节,能有效降低雌激素受体(ER)阳性乳腺癌患者的死亡率,提高其生活质量。TAM结构与雌激素相似,存在Z型和E型2个异构体。Z型异构体进入细胞内,与ER竞争结合,形成受体复合物,阻止雌激素作用的发挥,从而抑制乳腺癌细胞的增殖。
CYP2D6(cytochrome P450,family2,subfamily D,polypeptide6)为细胞色素P450酶系亚族蛋白。CYP2D基因存在于第22号染色体上,由CYP2D6、CYP2D7P、CYP2D8P组成,其中CYP2D7P和2D8P是假基因,只有CYP2D6基因能够在肝脏及其它组织中表达,发挥代谢作用。
TAM在体内的代谢由多种药物代谢酶参与。大约90%的TAM由CYP3A4/5灭活代谢成为N-去甲基TAM(血浆中的主要代谢产物),另外10%TAM由CYP2D6激活代谢则转化为4羟基-TAM,一种与ER的亲和力是TAM的5-100倍的代谢产物。N-去甲基TAM和4羟基-TAM分别由CYP2D6和CYP3A4/5代谢为4-羟基-N-去甲基TAM(endoxifen)。最终4羟基-TAM和endoxifen均由磺酰基转移酶(SUL T1A1)结合后排出体外。Endoxifen(4-羟基-N-去甲基TAM(endoxifen)是一个抗雌激素活性与4-羟基TAM相当但血浆稳态浓度是其10倍的代谢产物。由于它的形成依赖于CYP2D6,所以CYP2D6的基因多态性对TAM代谢和临床疗效有重要意义。
临床研究表明,CYP2D6基因第100位碱基的C>T突变(又称100C>T点突变)和775位碱基A的缺失(又称775delA突变)可以导致酶活性显著下降。
个体基因的差异是一种普遍现象,所以个体化给药不仅是势在必行,而且必须从基因差异入手,采用药物基因组学的方法。药物基因组学通过对病人的基因检测,如对一些疾病相关基因的SNP检测,进而对特定药物具敏感性或抵抗性的患病人群进行SNP差异检测,指导临床开出“基因合适”的药方,使患者得到最佳治疗效果,从而达到真正“用药个体化”的目的。在分子诊断水平上建立以PCR为基础的基因型分析方法,在治疗病人各种疾病前检测其基因型,更精确地选择适当的治疗药物和合适的剂量以减少不良反应的发生,对病人的治疗具有很大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒。
本发明保护一种引物组,由引物对甲和引物对乙组成;所述引物对甲由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成;所述引物对乙由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。
本发明还保护所述引物组在制备用于鉴定CYP2D6基因的100C>T点突变和CYP2D6基因的775delA突变的试剂盒中的应用。
本发明还保护所述引物组在制备用于指导他莫昔芬用药的试剂盒中的应用。
本发明还保护一种用于鉴定CYP2D6基因的100C>T点突变和CYP2D6基因的775delA突变的试剂盒,包括所述引物组。所述试剂盒还可包括阳性对照质粒。所述阳性对照质粒可为将具有CYP2D6基因的100C>T点突变的DNA分子插入出发质粒得到的重组质粒甲和将具有CYP2D6基因的775delA突变的DNA分子插入出发质粒得到的重组质粒乙。所述重组质粒甲具体可为将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点(如SmaI和HindIII酶切位点之间)得到的重组质粒。所述重组质粒乙具体可为将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点(如SmaI和HindIII酶切位点之间)得到的重组质粒。所述试剂盒还可包括阴性对照。所述阴性对照具体可为水,如去离子水。所述试剂盒还可包括用于提取基因组DNA的试剂或试剂盒。所述试剂盒还可包括用于进行DNA测序的试剂、试剂盒或仪器。
本发明还保护一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒,包括所述引物组。所述试剂盒还可包括阳性对照质粒。所述阳性对照质粒可为将具有CYP2D6基因的100C>T点突变的DNA分子插入出发质粒得到的重组质粒甲和将具有CYP2D6基因的775delA突变的DNA分子插入出发质粒得到的重组质粒乙。所述重组质粒甲具体可为将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点(如SmaI和HindIII酶切位点之间)得到的重组质粒。所述重组质粒乙具体可为将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点(如SmaI和HindIII酶切位点之间)得到的重组质粒。所述试剂盒还可包括阴性对照。所述阴性对照具体可为水,如去离子水。所述试剂盒还可包括用于提取基因组DNA的试剂或试剂盒。所述试剂盒还可包括用于进行DNA测序的试剂、试剂盒或仪器。
以上任一所述的CYP2D6基因的100C>T点突变的具体含义为:序列表的序列5所示DNA分子自5’末端第117位核苷酸由C突变为T。以上任一所述的CYP2D6基因的100C>T点突变的具体含义为:以人的基因组DNA为模板,采用所述引物对甲进行PCR扩增,PCR扩增产物自5’末端第117位核苷酸由C突变为T。
以上任一所述的CYP2D6基因的775delA突变的具体含义为:序列表的序列7所示DNA分子自5’末端第325位核苷酸(A)缺失(即序列7所示DNA分子突变为序列6所示DNA分子)。以上任一所述的CYP2D6基因的775delA突变的具体含义为:以人的基因组DNA为模板,采用所述引物对乙进行PCR扩增,PCR扩增产物自5’末端第325位核苷酸(A)缺失(即序列7所示DNA分子突变为序列6所示DNA分子)。
以人基因组DNA为模板,采用所述引物对甲或所述引物对乙进行PCR扩增,特异性良好,不会交叉扩增人类基因组其他区域。
本发明提供的试剂盒可用于检测与他莫昔芬敏感性相关的两个SNP位点,进而可以用于临床指导他莫昔芬的个体化使用,提高临床治疗的针对性和可预见性。应用本发明提供的试剂盒进行检测,具有稳定性高、操作简便、成本低廉、结果准确、可实现高通量等优点。本发明的试剂盒能够实现产业化,能够满足临床检验试剂工作的要求,利于实现安全合理有效的他莫昔芬用药个体化给药。
附图说明
图1为引物对甲的灵敏度检测中的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为引物对乙的灵敏度检测中的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。pMD18-T质粒(又称pMD18-T载体):TaKaRa公司,产品目录号为6011。
实施例1、特异引物对、阳性对照和阴性对照的制备
一、特异引物对的制备
用于检测CYP2D6基因的100C>T点突变的特异引物对由F1和R1组成。
F1(序列表的序列1):5’-TTGGTAGTGAGGCAGGTAT-3’;
R1(序列表的序列2):5’-ACTCAGGACTAACTCATCTTC-3’。
用于检测CYP2D6基因的775delA突变的特异性引物对由F2和R2组成。
F2(序列表的序列3):5’-GACTCTGTACCTCCTATCCA-3’;
R2(序列表的序列4):5’-AGCCACTCTCACCTTCTC-3’。
用于检测CYP2D6基因的100C>T点突变的特异引物对又称为引物对甲(靶序列为531bp)。用于检测CYP2D6基因的775delA突变的特异性引物对又称为引物对乙(靶序列为405bp或404bp)。
分别合成引物对甲和引物对乙。
二、阳性对照的制备
将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的SmaI和HindIII酶切位点之间,得到阳性对照质粒甲。
将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的SmaI和HindIII酶切位点之间,得到阳性对照质粒乙。
三、阴性对照
阴性对照为去离子水。
实施例2、特异引物对的灵敏度检测
一、引物对甲的灵敏度检测
以阳性对照质粒甲为模板,采用引物对甲进行PCR扩增。
PCR扩增体系的总体积为25μl。PCR扩增体系含0.5μM F1、0.5μM R1和1U热启动DNA聚合酶。PCR扩增体系分别含有10ng/μl、5ng/μl、2.5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.1ng/μl或0.05ng/μl阳性对照质粒甲。
PCR扩增的程序均为:95℃5分钟;95℃30秒、56℃30秒、72℃30秒,30个循环;72℃10分钟;15℃,保持。
将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,结果见图1。图1中,t1至t8依次代表阳性对照质粒甲的浓度为10ng/μl、5ng/μl、2.5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.1ng/μl或0.05ng/μl的体系。结果表明,引物对甲的灵敏度为1ng/μl。
分别回收各个目的条带并进行测序,结果准确。
二、引物对乙的灵敏度检测
以阳性对照质粒乙为模板,采用引物对乙进行PCR扩增。
PCR扩增体系的总体积为25μl。PCR扩增体系含0.5μM F2、0.5μM R2和1U热启动DNA聚合酶。PCR扩增体系分别含有50ng/μl、25ng/μl、15ng/μl、10ng/μl、8ng/μl、5ng/μl、2.5ng/μl或1ng/μl阳性对照质粒乙。
PCR扩增的程序均为:95℃5分钟;95℃30秒、53℃30秒、72℃30秒,30个循环;72℃10分钟;15℃,保持。
将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,结果见图2。图2中,T1至T8依次代表阳性对照质粒乙的浓度为50ng/μl、25ng/μl、15ng/μl、10ng/μl、8ng/μl、5ng/μl、2.5ng/μl或1ng/μl的体系。结果表明,引物对乙的灵敏度为1ng/μl。
分别回收各个目的条带并进行测序,结果准确。
实施例3、特异引物对的应用
1、采集8位知情同意的志愿者的血样,提取基因组DNA。
2、分别以步骤1提取的各个基因组DNA为模板,采用引物对甲进行PCR扩增(初始PCR扩增体系中,基因组DNA的含量为30ng);设置用阳性对照质粒甲代替基因组DNA的阳性对照处理,设置用阴性对照代替基因组DNA的阴性对照处理。
PCR扩增体系的总体积25μl,含0.5μM F1、0.5μM R1和1U热启动DNA聚合酶。
PCR扩增的程序均为:95℃5分钟;95℃30秒、56℃30秒、72℃30秒,30个循环;72℃10分钟;15℃,保持。
3、分别以步骤1提取的各个基因组DNA为模板,采用引物对乙进行PCR扩增(初始PCR扩增体系中,基因组DNA的含量为30ng);设置用阳性对照质粒乙代替基因组DNA的阳性对照,设置用阴性对照代替基因组DNA的阴性对照。
PCR扩增体系的总体积25μl,含0.5μM F2、0.5μM R2和1U热启动DNA聚合酶。
PCR扩增的程序均为:95℃5分钟;95℃30秒、53℃30秒、72℃30秒,30个循环;72℃10分钟;15℃,保持。
4、将步骤2和步骤3的PCR扩增产物分别进行2%琼脂糖凝胶电泳,然后回收目标条带并测序。各个样本均显示单一的扩增条带,且经测序扩增产物均为目标序列,也就是说对于人基因组来说,引物对的特异性良好,不存在非特异性扩增。阳性对照质粒均与预期结果一致,阴性对照均未显示任何PCR扩增条带。
各个志愿者的基因型结果见表1。
表1各个志愿者的基因型结果(“-”代表缺失)
100C>T点突变 | 775delA突变 | |
志愿者1 | CC | AA |
志愿者2 | CC | A- |
志愿者3 | CT | AA |
志愿者4 | CC | AA |
志愿者5 | TT | AA |
志愿者6 | CC | -- |
志愿者7 | CC | A- |
志愿者8 | CT | AA |
结果表明,采用本发明的试剂盒和方法,能够简便、准确地对CYP2D6基因的两个突变位点进行检测和判读,从而指导他莫昔芬用药。
Claims (5)
1.引物组,由引物对甲和引物对乙组成;所述引物对甲由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成;所述引物对乙由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。
2.权利要求1所述引物组在制备用于鉴定CYP2D6基因的100C>T点突变和CYP2D6基因的775delA突变的试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述引物组在制备用于指导他莫昔芬用药的试剂盒中的应用。
4.一种用于鉴定CYP2D6基因的100C>T点突变和CYP2D6基因的775delA突变的试剂盒,包括权利要求1所述引物组。
5.一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒,包括权利要求1所述引物组。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410066908.2A CN104862308A (zh) | 2014-02-26 | 2014-02-26 | 一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410066908.2A CN104862308A (zh) | 2014-02-26 | 2014-02-26 | 一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104862308A true CN104862308A (zh) | 2015-08-26 |
Family
ID=53908484
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410066908.2A Pending CN104862308A (zh) | 2014-02-26 | 2014-02-26 | 一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104862308A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008121899A2 (en) * | 2007-03-29 | 2008-10-09 | Vanda Pharmaceuticals Inc. | Method of predicting a predisposition to qt prolongation |
WO2010096834A2 (en) * | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Indiana University Research & Technology Corporation | Materials and methods for treating patients with tamoxifen |
CN101824467A (zh) * | 2009-12-29 | 2010-09-08 | 广州益善生物技术有限公司 | Cyp2d6基因突变检测液相芯片及检测方法 |
CN102643905A (zh) * | 2012-04-01 | 2012-08-22 | 周宏灏 | 焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒及方法 |
-
2014
- 2014-02-26 CN CN201410066908.2A patent/CN104862308A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008121899A2 (en) * | 2007-03-29 | 2008-10-09 | Vanda Pharmaceuticals Inc. | Method of predicting a predisposition to qt prolongation |
WO2010096834A2 (en) * | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Indiana University Research & Technology Corporation | Materials and methods for treating patients with tamoxifen |
CN101824467A (zh) * | 2009-12-29 | 2010-09-08 | 广州益善生物技术有限公司 | Cyp2d6基因突变检测液相芯片及检测方法 |
CN102643905A (zh) * | 2012-04-01 | 2012-08-22 | 周宏灏 | 焦磷酸测序法检测他莫昔芬个体化用药基因多态性的试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
DBSNP: "RefSNP rs1065852", 《NCBI》 * |
DBSNP: "RefSNP rs35742686", 《NCBI》 * |
J.S.L.LIM ET AL.: "Impact of CYP2D6,CYP3A5,CYP2C9 and CYP2C19 polymorphisms on tamoxifen pharmacokinetics in Asian breast cancer patients", 《BJCP》 * |
杨汐 等: "CYP2D6基因多态性与他莫昔芬治疗", 《西南军医》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1636069B (zh) | 基于ercc1表达确定化疗方案的引物和试剂盒 | |
CN108473975A (zh) | 检测肿瘤发展的系统和方法 | |
Oksuz et al. | Therapeutic potential of cyclooxygenase-3 inhibitors in the management of glioblastoma | |
CN107723354B (zh) | 一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重pcr引物、试剂盒和方法 | |
CN104131091A (zh) | 用于检测人类egfr基因突变的引物及方法 | |
CN104962621A (zh) | 用于mthfr基因和mtrr基因位点多态性检测的引物组、其检测方法和应用 | |
CN106148497A (zh) | Braf基因突变检测试剂盒及其应用 | |
CN104531875A (zh) | 一种MyD88基因突变荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法 | |
CN104480215B (zh) | 一种基因联合检测方法及试剂盒 | |
KR101838394B1 (ko) | 뇌실하 영역의 돌연변이 유전자를 이용한 교모세포종 조직 기원의 예측 방법 및 동물 모델 | |
CN102399872A (zh) | 一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒 | |
CN102796811A (zh) | 检测kras突变的试剂及方法 | |
CN106801100A (zh) | 一种基于acacb基因鉴定奶牛产奶性状的方法及其应用 | |
CN104862308A (zh) | 一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒 | |
CN116445621A (zh) | 同时检测肺癌和结直肠癌的dna和rna流程引物组和试剂盒 | |
CN105274220A (zh) | 一种cyp4f2*3的检测引物及其检测体系 | |
Gomez-Roman et al. | P01. 15 Mitochondrial poisoning as a novel therapy for glioblastoma | |
CN106635999A (zh) | Mmhrl1转基因小鼠肝肿瘤细胞系的建立及应用 | |
CN107475383B (zh) | 检测tsc1和tsc2基因启动子甲基化水平的成套试剂与方法 | |
CN104862381A (zh) | 一种用于指导铂类药物用药的试剂盒 | |
JP2021518106A (ja) | 治療用核酸構築物の非侵襲的な検出およびモニタリングのための方法 | |
CN105063177A (zh) | Braf基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒 | |
CN109504774A (zh) | 检测tert基因启动子突变的引物组合物、试剂盒、方法及应用 | |
CN104593515A (zh) | 检测pik3ca基因h点突变的pcr-rflp方法 | |
Santos et al. | ANALYSIS OF A SYNONYMOUS SINGLE NUCLEOTIDE VARIANT IN PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR RECEPTOR ALPHA GENE IN TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160524 Address after: 102209, 8 floor, No. 18 Zhongguancun Avenue, Beijing, Haidian District, 04-416 Applicant after: Beijing auwiesen Gene Technology Co Ltd Address before: 100192 Beijing city Chaoyang District Lin and crafts Road No. 41 608 Applicant before: Wen Jie |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150826 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |