CN106591465A - 一种cyp2d6b基因检测的液相芯片 - Google Patents

一种cyp2d6b基因检测的液相芯片 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，本发明的液相芯片能够快速检测CYP2D6B基因SNP突变型位点的基因，根据检测结果，告诉高血压患者适合于吃那一类药物及药物的剂量和正常相比是增加来是减少来达到个体化用药的效果。提高高血压患者的用药效果，减少药物的毒副作用；能够实现快递大通量的检测，相对于PCR或者基因测序的方法，本发明减少了工作负担，检测过程更快，且不需要长期训练的专家来进行数据解读。

Description

一种CYP2D6B基因检测的液相芯片
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CYP2D6B基因检测的液相芯片。
背景技术
我国高血压患者人数已超1.6亿，治疗高血压病的药物在临床上出现的个体反应差异十分普遍，其主要原因也是由于与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异，因此提高高血压药物治疗的有效性,成为当今临床治疗学热点和难点。液相芯片技术平台通过整合编码微球、激光技术、应用流体学和高速数字信号处理，只需要微量的样本，能一次性检测到500种目的分子；60分钟内可对96个不同样本进行检测。因灵敏度高，信噪比好，价格低廉优势，使临床快速基因型检测成为可能。医生可根据人体与药物治疗相关的遗传信息找到适宜的药物治疗方案，使药物治疗更加安全、有效和经济。
CYP2D6B基因是与高血压β受体抑制剂相关药物有很高的关联性，可以根据该基因的检测结果来指导高血压患者的合理安全用药。但是现有的检测SNP用基因使用分开检测的方法，或者PCR及PCR衍生方法，不能做到高通量快速检测，固相芯片不能实现快速制备及高通量检测，成本高。
发明内容
本发明针对以上问题提出一种快速、高通量检测，成本低的CYP2D6B基因检测的液相芯片。
本发明实现以上目的的方案为：一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，包括：
CYP2D6B基因SNP位点探针，针对CYP2D6B基因SNP位点分别设计的野生型和突变型的HPW引物；
捕获CYP2D6B基因探针的包被微球；
扩增引物；
优选地，所述野生型和突变型的HPW引物，每种HPW引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成。通过引物进行扩增，才能找到目标基因，即CYP2D6B基因。
优选地，所述包被微球的制备过程为：
将微球活化后，离心后吸弃上清，将微球重悬于溶液中，涡漩振荡后超声处理后将微球离心；
重复上述步骤，向悬浮的微球中加入CYP2D6B基因的探针，制备偶联了CYP2D6B基因的探针后的微球；
将偶联了CYP2D6B基因的探针后的微球离心并吸弃上清，将微球重悬于PBS-TBN溶液中，涡漩振荡后超声处理，然后室温避光振荡离心，重复此步骤得到包被微球。
进一步地，所述微球活化的步骤为：
取微球离心后去掉上清夜，将微球重悬于双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球离心；
吸弃上清，加入缓冲液，涡漩振荡后超声波悬浮微球；
加入Sulfo-NHS，用涡漩振荡器混匀，超声处理后加入EDC，用涡漩振荡器混匀，室温震荡反应后得到活化的微球。
优选地，所述特异性引物分别为：针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*1、针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*2、和/或针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*3。针对性地检测突变型和野生型两类。
优选地，所述CYP2D6B基因检测的液相芯片还包括生物素标记的检测CYP2D6B基因的探针。
优选地，所述生物素标记的检测CYP2D6B基因的探针的制备过程为：
首先检测CYP2D6B基因的探针用DMSO溶解，配置NHS-Biotin反应液；
然后检测CYP2D6B基因的探针与NHS-Biotin反应液加入反应管中；
再加入NaHCO3溶液和缓冲液后，将反应管包上铝箔置于振荡器上恒温避光孵育；
最后将反应液透析去除未反应的NHS-Biotin。
本发明的液相芯片检测时间为3个小时之内可以完成检测，在300次实验中，检测准确性在95％以上，重复性100％，灵敏度在87％以上。
具体使用时，微球和基因的探针的体积比是4:1～3:1，微球以CY3和CY5质量比1:1～1:2.5进行配比，NHS-Biotin和基因的探针是2：1～4：1配比。
本发明的有益效果是：
(1)能够快速检测CYP2D6B基因SNP突变型位点的基因，根据检测结果，告诉高血压患者是不是适合于吃β受体抑制剂的抗高血压药物。提高高血压患者的用药效果，减少药物的毒副作用。
(2)能够实现快递大通量的检测，相对于PCR或者基因测序的方法，本发明减少了工作负担，检测过程更快，且不需要长期训练的专家来进行数据解读。
具体实施例
以下通过具体实施例对本发明进行进一步地说明。
实施例
1)CYP2D6B基因SNP位点探针设计：
CYP2D6B基因SNP位点分别设计的野生型和突变型的HPW引物，每种HPW引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成。所述特异性引物分别为：针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*1、针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*2、和/或针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*3；
2)相应的捕获CYP2D6B基因的探针包被微球：
将微球活化，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；取50μL微球离心8—10min：去掉上清夜，将微球重悬于1 00μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约30s，≥15000rpm离心1—2min；
吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约lmin；
加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀，超声处理lmin；
加入10μL 50mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；室温震荡反应约20min。
将50μL微球活化后，在≥15000rpm速度下，离心；吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μL 50mM的MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin，后将微球于≥15000rpm，离心8—12min；重复该步骤；吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2μgCYP2D6B基因的探针，用50mmol/L的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550μL；然后用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr；
偶联了CYP2D6B基因的探针后的微球以≥12000g的速度，离心8—12min，吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS—TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin：室温避光振荡30min；再于以≥12000g的速度，离心8—12min；吸弃上清，将微球重悬于l mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin；微球以≥12000g的速度，离心4-6min，重复该步骤一次；吸弃上清，将微球重悬于500-1000μL PBS-TBN溶液中；每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获CYP2D6B基因的探针偶联微球的浓度均为120个/μl：
3)检测CYP2D6B基因的探针的生物素标记：
依据检测CYP2D6B基因的探针浓度计算出检测CYP2D6B基因的探针溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积；
用DMSO(Dimethyl sulfoxide)溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；
按摩尔比1：100于反应管中分别加入检测CYP2D6B基因的探针与NHS-Biotin反应液；
加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHCO3溶液；加入pH7.4的PBS补至目标体积；包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3.5小时，转速为800rpm-1000rpm；
将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS—Biotin；使用时根据需要将标记好的检测CYP2D6B基因的探针等比例混合。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
CYP2D6B基因序列
ORIGIN
1 ggaagggtca cgcgctcggt gtgctgagag tgtcctgcct ggtcctctgt gcctggtggg
61 gtgggggtgc caggtgtgtc cagaggagcc cagttggtag tgaggcagcc atggggctag
121 aagcactggt gcccctggcc atgatagtgg ccatcttcct gctcctggtg gacctgatgc
181 accggcacca acgctgggct gcacgctacc cgccaggtcc cctgccactg cccgggctgg
241 gcaaccttgc tgcatgtgga cttccagaac acaccatact gcttcgacca gttgcggcgc
301 cgcttcgggg acgtgttcag cctgcagctg gcctggacgc cggtggtcgt gctcaatggg
361 ctggcggccg tgcgcgaggc gatggtgacc cgcggcgagg acacggccga ccgcccgcct
421 gcgcccatct accaggtcct gggcttcggg ccgcgttccc aaggggtgtt cctgtcgcgc
481 tatgggcccg cgtggcgcga gcagaggcgc ttctccgtgt ccaccttgcg caacttgggc
541 ctgggcaaga agtcgctgga gcagtgggtg accgaggagg ccgcctgcct ttgtgccgcc
601 ttcgccgacc aagccggacg cccctttcgc cccaacggtc tcttggacaa agccgtgagc
661 aacgtgatcg cctccctcac ctgcgggcgc cgcttcgagt acgacgaccc tcgcttcctc
721 aggctgctgg acctagctca ggagggactg aaggaggagt cgggcttcct gcgcgaggtg
781 ctgaatgctg tccccgtcct cctgcacatc ccagcgctgg ctggcaaggt cctacgcttc
841 caaaaggctt tcctgaccca gctggatgag ctgctaactg agcacaggat gacctgggac
901 ccagcccagc caccccgaga cctgactgag gccttcctgg caaagaagga gaaggccaag
961 gggagccctg agagcagctt caatgatgag aacctgcgca tagtggtggg taacctgttc
1021 cttgccggga tggtgaccac cttgaccacg ctggcctggg gcctcctgct catgatccta
1081 cacctggatg tgcagctccg tgtccaacag gagatcgacg acgtgatagg gcaggtgcgg
1141 cgaccagaga tgggtgacca ggctcacatg ccctacacca ctgccgtgat tcacgaggtg
1201 cagcgctttg gggacatcat ccccctgagt gtgacccata tgacatccca tgacatcgaa
1261 gtacagggct tccgcatccc taagggaacg acactcatca ccaacctgtc atcggtgctg
1321 aaggatgagg ccgtctggaa gaagcccttc cgcttccacc ccgaacactt cctggatgcc
1381 cagggccact ttgtgaagcc ggaggccttc ctgcctttct cagcaggccg ccgtgcatgc
1441 ctcggggagc ccctggcccg catggagctc ttcctcttct tcacctccct gctgcagcac
1501 ttcagcttct ccgtggccgc cggacagccc cggcccagcc actctcgtgt cgtcagcttt
1561 ctggtgaccc catcccccta cgagctttgt gctgtgcccc gctagaatgg ggtacctagt
1621 ccccagcctg ctccctagcc agaggctcta atgtacaata aagcaatgtg gtagttccaa
//
CYP2D6B基因引物：5’ –TCA ACA CAG CAG GTT CAC TCA CAG CA-3’ 野生型outer 1
5’ –CTG TGG TTF CAC CCA CCA TCC AT-3’ 突变型outer 1
5’ –ACG CTG GGC TGC ACG CTA CCA-3’ 野生型 inner 1
5’ –AGT GGC AGG GGG CCT GGT GA-3’ 突变型inner 1

Claims (7)

1.一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，其特征在于：包括：
CYP2D6B基因SNP位点探针，针对CYP2D6B基因SNP位点分别设计的野生型和突变型的HPW引物；
捕获CYP2D6B基因探针的包被微球；
扩增引物；
2.根据权利要求1所述的一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，其特征在于：野生型和突变型的HPW引物，每种HPW引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成。
3.根据权利要求1所述的一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，其特征在于：所述包被微球的制备过程为：
将微球活化后，离心后吸弃上清，将微球重悬于溶液中，涡漩振荡后超声处理后将微球离心；
重复上述步骤，向悬浮的微球中加入CYP2D6B基因的探针，制备偶联了CYP2D6B基因的探针后的微球；
将偶联了CYP2D6B基因的探针后的微球离心并吸弃上清，将微球重悬于PBS-TBN溶液中，涡漩振荡后超声处理，然后室温避光振荡离心，重复此步骤得到包被微球。
4.根据权利要求3所述的一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，其特征在于：所述微球活化的步骤为：
取微球离心后去掉上清夜，将微球重悬于双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球离心；
吸弃上清，加入缓冲液，涡漩振荡后超声波悬浮微球；
加入Sulfo-NHS，用涡漩振荡器混匀，超声处理后加入EDC，用涡漩振荡器混匀，室温震荡反应后得到活化的微球。
5.根据权利要求2所述的一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，其特征在于：所述特异性引物分别为：针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*1、针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*2、和/或针对CYP2D6B SNP位点的CYP2D6B及CYP2D6B*3。
6.根据权利要求1所述的一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，其特征在于：所述CYP2D6B基因检测的液相芯片还包括生物素标记的检测CYP2D6B基因的探针。
7.根据权利要求6所述的一种CYP2D6B基因检测的液相芯片，其特征在于：所述生物素标记的检测CYP2D6B基因的探针的制备过程为：
首先将检测CYP2D6B基因的探针用DMSO溶解，配置NHS-Biotin反应液；
然后将检测CYP2D6B基因的探针与NHS-Biotin反应液加入反应管中；
再加入NaHCO3溶液和缓冲液后，将反应管包上铝箔置于振荡器上恒温避光孵育；
最后将反应液透析去除未反应的NHS-Biotin。
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