CN109402132B - 一种编码scn1a基因突变体的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码SCN1A基因突变体的核酸及其应用，属于基因工程技术领域。该突变体与野生型相比，具有c.79_82del杂合突变，其编码的多肽的氨基酸序列具有p.Arg27Alafs*64突变。通过检测该新突变体是否存在，可有效筛选出易患SCN1A相关癫痫的生物样品。本发明的检测方法快速、准确、高效。

Description

一种编码SCN1A基因突变体的核酸及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码SCN1A基因突变体的核酸及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码SCN1A突变体的核酸、分离的SCN1A突变体多肽、含SCN1A突变体核酸的重组细胞，以及筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的方法。

背景技术

在所有已知的癫痫相关基因中，SCN1A基因是人类癫痫最常见的突变基因，被称为“超级罪犯基因”。SCN1A基因突变可引起一系列以癫痫为主要表现的综合征，统称为SCN1A相关癫痫。SCN1A相关癫痫的疾病谱广泛，从轻症的单纯性热性惊厥(FS)和全面性癫痫伴热性惊厥附加症，到重症的Dravet综合征和全面性强直阵挛发作的儿童难治性癫痫(ICE-GTC)。Dravet综合征等难治性癫痫的表型通常与渐进性痴呆有关；不常见的表型还包括站立不能的肌阵挛性癫痫(MAE或Doose综合征)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、婴儿痉挛症、与疫苗相关的脑病和癫痫。即使在同一个家庭，SCN1A相关癫痫患者的表现可截然不同。鉴于SCN1A相关癫痫的临床表现多样，因此，发现并确定SCN1A基因上的致病突变对于疾病筛查、早期诊断、治疗、预后判断十分重要。

虽然已经发现了SCN1A基因的一些突变会导致SCN1A相关癫痫，但是仍有许多患者病因未明。该基因上的新突变被不断发现，并有可能是导致该SCN1A相关癫痫的病因，但判断这些新突变的致病性还需要更多的临床证据支持。

因而，目前对SCN1A相关癫痫，尤其是发现SCN1A的新致病突变，建立基因突变位点与临床表型的相关性，以及基因突变的检测方法仍有待深入。

发明内容

本发明的目的在于提供一种SCN1A基因突变体，并提出一种能够有效筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的方法。

本发明是基于发明人的下列工作完成的：

根据国际癫痫医学领域的最新研究进展，研究癫痫致病基因和致病突变常采用第二代测序法分析癫痫相关基因或全基因组的外显子序列。第二代测序是利用设计的DNA序列探针将目标基因或全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序。利用该技术流程寻找癫痫类疾病致病基因的研究已成研究热点。Zhou等(Zhou P,He N,Zhang J W,et al.Novel mutations and phenotypes of epilepsy-associated genesin epileptic encephalopathies[J].Genes Brain&Behavior,2018(Suppl 2):e12456.)利用第二代测序技术发现35名Dravet综合征患者携带SCN1A致病突变，并发现多个致病新变异。Liu等(Liu J,Tong L,Song S,et al.Novel and de novo,mutations in pediatricrefractory epilepsy[J].Molecular Brain,2018,11(1):48.)利用第二代测序技术发现了11个与Dravet综合征相关的SCN1A基因变异新位点。由此可见，第二代测序技术正在推动SCN1A相关癫痫诊断及其机制研究的迅速发展。

因而，发明人针对一个癫痫患儿及其双亲，采用福建福君基因生物科技有限公司提供的癫痫相关的446基因panel，通过目标区域捕获的高通量第二代测序技术，并联合Sanger测序验证的方法进行致病突变挖掘和验证，最终确定了SCN1A相关癫痫的一个新的杂合致病突变位点——SCN1A基因的c.79_82del突变。

发明人一方面提出了一种分离的编码SCN1A突变体的核酸。所述核酸的基因序列与SEQ ID NO:1相比，具有c.79_82del突变。该突变体与SCN1A相关癫痫的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物体是否易患SCN1A相关癫痫。

另一方面提出了一种所述SCN1A基因突变体的检测试剂盒，及其在筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品中的应用。所述的检测试剂盒包括适于检测与SEQ ID NO:1相比具有c.79_82del突变的SCN1A基因突变体的试剂。所述试剂包括具有如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列的特异性引物。

所述的试剂盒用于筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的方法，该方法利用适于检测与SEQ ID NO:1相比具有c.79_82del突变的SCN1A基因突变体的试剂，检测生物样品是否存在SCN1A基因突变，从而筛选出易患SCN1A相关癫痫的生物样品。具体包括以下步骤：

(1)从生物样品提取核酸样本，所述的生物样品是指来源于人体的各类样品，包括但不限于血液、唾液、组织、毛发或口腔黏膜。所述生物样品可用于分离获得所述编码SCN1A基因突变体核酸，或者是通过反转录反应获得cDNA样本以构成所述核酸样本；

(2)利用SCN1A基因的第1外显子特异性的引物或探针，对核酸样本进行PCR扩增，针对所得的扩增产物构建核酸测序文库并进行测序；所述SCN1A基因的第1外显子特异性的引物或探针，具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

(3)将测序核苷酸图谱与人参考基因组序列比对，发现SCN1A基因编码区的第79-82位碱基缺失，该变异导致编码序列从第27位密码子发生移码突变，第27位密码子由精氨酸突变为丙氨酸，新编码序列的第64位为终止密码子，翻译终止，即发生p.Arg27Alafs*64突变。

发明人发现SCN1A基因的SEQ ID NO:1所示序列中的1个新致病突变位点，即编码序列的第79-82位碱基缺失，导致编码序列从第27位密码子发生移码突变，导致翻译终止，使蛋白质截短，功能丧失。基于此，本发明提供了SCN1A基因突变的检测方法。通过该方法能够筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品。

其中，所述的核酸包括DNA、RNA或cDNA。

第三方面提出了一种分离的SCN1A突变体多肽，所述多肽是由编码SCN1A突变体的核酸编码的，与SEQ ID NO:2相比，其氨基酸序列具有p.Arg27Alafs*64突变。

进一步的，提出了一种筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的方法。通过检测生物样品中野生型KANSL1基因编码的多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的表达量是否低于正常水平，可以作为生物体是否患Koolen-de Vries综合征的辅助判断方法。

第四方面，提出了一种重组细胞，所述的重组细胞是由编码SCN1A基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。

进一步的，所述的重组细胞在筛选治疗SCN1A相关癫痫的药物中的应用。利用所述的重组细胞能够有效筛选治疗SCN1A相关癫痫的药物。

区别于现有技术，上述技术方案的有益效果如下：

(1)本发明快速、准确、高效、简便，能够有效筛选出易患SCN1A相关癫痫的生物样品。

(2)本发明可用于SCN1A相关癫痫患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，并且检测结果可以为SCN1A相关癫痫的早期诊断、鉴别诊断、治疗方案的制定提供科学依据。

附图说明

图1为具体实施方式所述的SCN1A相关癫痫患者的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体，图标上的隔断斜线代表已故；

图2为具体实施方式所述的含突变位点的患者的正向引物测序图，图中方框所示为基因突变区域；

图3为具体实施方式所述的不含突变位点的正常健康人的正向引物测序图，图中方框所示为可能发生基因突变的区域。

具体实施方式

SCN1A基因突变体

第一方面，本发明提出了一种分离的编码SCN1A突变体的核酸。根据实施例，与SEQID NO:1相比，所述核酸具有c.79_82del突变。在本发明中所使用的表达方式“编码SCN1A基因突变体的核酸”，是指与编码SCN1A基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与SCN1A基因突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据实施例，所述的编码SCN1A基因突变体的核酸为DNA。

根据实施例，发明人确定了SCN1A基因的新突变体，该突变体与SCN1A相关癫痫的发病密切相关，从而通过检测上述突变体在生物样品中是否存在，可以达到有效地预测生物体是否易患SCN1A相关癫痫的目的。

对于本发明中提及的核酸，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本发明中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。本领域技术人员可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

编码SCN1A基因突变体的核酸，是发明人通过外显子组测序分析联合Sanger测序验证的方法确定的SCN1A相关癫痫致病基因上的新致病突变。该致病突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。

其中，野生型SCN1A基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：

ATGGAGCAAACAGTGCTTGTACCACCAGGACCTGACAGCTTCAACTTCTTCACCAGAGAATCTCTTGCGGCTATTGAAAGACGCATTGCAGAAGAAAAGGCAAAGAATCCCAAACCAGACAAAAAAGATGACGACGAAAATGGCCCAAAGCCAAATAGTGACTTGGAAGCTGGAAAGAACCTTCCATTTATTTATGGAGACATTCCTCCAGAGATGGTGTCAGAGCCCCTGGAGGACCTGGACCCCTACTATATCAATAA GAAAACTTTTATAGTATTGAATAAAGGGAAGGCCATCTTCCGGTTCAGTGCCACCTCTGCCCTGTACATTTTAACTCCCTTCAATCCTCTTAGGAAAATAGCTATTAAGATTTTGGTACATTCATTATTCAGCATGCTAATTATGTGCACTATTTTGACAAACTGTGTGTTTATGACAATGAGTAACCCTCCTGATTGGACAAAGAATGTAGAATACACCTTCACAGGAATATATACTTTTGAATCACTTATAAAAATTATTGCAAGGGGATTCTGTTTAGAAGATTTTACTTTCCTTCGGGATCCATGGAACTGGCTCGATTTCACTGTCATTACATTTGCGTACGTCACAGAGTTTGTGGACCTGGGCAATGTCTCGGCATTGAGAACATTCAGAGTTCTCCGAGCATTGAAGACGATTTCAGTCATTCCAGGCCTGAAAACCATTGTGGGAGCCCTGATCCAGTCTGTGAAGAAGCTCTCAGATGTAATGATCCTGACTGTGTTCTGTCTGAGCGTATTTGCTCTAATTGGGCTGCAGCTGTTCATGGGCAACCTGAGGAATAAATGTATACAATGGCCTCCCACCAATGCTTCCTTGGAGGAACATAGTATAGAAAAGAATATAACTGTGAATTATAATGGTACACTTATAAATGAAACTGTCTTTGAGTTTGACTGGAAGTCATATATTCAAGATTCAAGATATCATTATTTCCTGGAGGGTTTTTTAGATGCACTACTATGTGGAAATAGCTCTGATGCAGGCCAATGTCCAGAGGGATATATGTGTGTGAAAGCTGGTAGAAATCCCAATTATGGCTACACAAGCTTTGATACCTTCAGTTGGGCTTTTTTGTCCTTGTTTCGACTAATGACTCAGGACTTCTGGGAAAATCTTTATCAACTGACATTACGTGCTGCTGGGAAAACGTACATGATATTTTTTGTATTGGTCATTTTCTTGGGCTCATTCTACCTAATAAATTTGATCCTGGCTGTGGTGGCCATGGCCTACGAGGAACAGAATCAGGCCACCTTGGAAGAAGCAGAACAGAAAGAGGCCGAATTTCAGCAGATGATTGAACAGCTTAAAAAGCAACAGGAGGCAGCTCAGCAGGCAGCAACGGCAACTGCCTCAGAACATTCCAGAGAGCCCAGTGCAGCAGGCAGGCTCTCAGACAGCTCATCTGAAGCCTCTAAGTTGAGTTCCAAGAGTGCTAAGGAAAGAAGAAATCGGAGGAAGAAAAGAAAACAGAAAGAGCAGTCTGGTGGGGAAGAGAAAGATGAGGATGAATTCCAAAAATCTGAATCTGAGGACAGCATCAGGAGGAAAGGTTTTCGCTTCTCCATTGAAGGGAACCGATTGACATATGAAAAGAGGTACTCCTCCCCACACCAGTCTTTGTTGAGCATCCGTGGCTCCCTATTTTCACCAAGGCGAAATAGCAGAACAAGCCTTTTCAGCTTTAGAGGGCGAGCAAAGGATGTGGGATCTGAGAACGACTTCGCAGATGATGAGCACAGCACCTTTGAGGATAACGAGAGCCGTAGAGATTCCTTGTTTGTGCCCCGACGACACGGAGAGAGACGCAACAGCAACCTGAGTCAGACCAGTAGGTCATCCCGGATGCTGGCAGTGTTTCCAGCGAATGGGAAGATGCACAGCACTGTGGATTGCAATGGTGTGGTTTCCTTGGTTGGTGGACCTTCAGT TCCTACATCGCCTGTTGGACAGCTTCTGCCAGAGGTGATAATAGATAAGCCAGCTACTGATGACAATGGAACAACCACTGAAACTGAAATGAGAAAGAGAAGGTCAAGTTCTTTCCACGTTTCCATGGACTTTCTAGAAGATCCTTCCCAAAGGCAACGAGCAATGAGTATAGCCAGCATTCTAACAAATACAGTAGAAGAACTTGAAGAATCCAGGCAGAAATGCCCACCCTGTTGGTATAAATTTTCCAACATATTCTTAATCTGGGACTGTTCTCCATATTGGTTAAAAGTGAAACATGTTGTCAACCTGGTTGTGATGGACCCATTTGTTGACCTGGCCATCACCATCTGTATTGTCTTAAATACTCTTTTCATGGCCATGGAGCACTATCCAATGACGGACCATTTCAATAATGTGCTTACAGTAGGAAACTTGGTTTTCACTGGGATCTTTACAGCAGAAATGTTTCTGAAAATTATTGCCATGGATCCTTACTATTATTTCCAAGAAGGCTGGAATATCTTTGACGGTTTTATTGTGACGCTTAGCCTGGTAGAACTTGGACTCGCCAATGTGGAAGGATTATCTGTTCTCCGTTCATTTCGATTGCTGCGAGTTTTCAAGTTGGCAAAATCTTGGCCAACGTTAAATATGCTAATAAAGATCATCGGCAATTCCGTGGGGGCTCTGGGAAATTTAACCCTCGTCTTGGCCATCATCGTCTTCATTTTTGCCGTGGTCGGCATGCAGCTCTTTGGTAAAAGCTACAAAGATTGTGTCTGCAAGATCGCCAGTGATTGTCAACTCCCACGCTGGCACATGAATGACTTCTTCCACTCCTTCCTGATTGTGTTCCGCGTGCTGTGTGGGGAGTGGATAGAGACCATGTGGGACTGTATGGAGGTTGCTGGTCAAGCCATGTGCCTTACTGTCTTCATGATGGTCATGGTGATTGGAAACCTAGTGGTCCTGAATCTCTTTCTGGCCTTGCTTCTGAGCTCATTTAGTGCAGACAACCTTGCAGCCACTGATGATGATAATGAAATGAATAATCTCCAAATTGCTGTGGATAGGATGCACAAAGGAGTAGCTTATGTGAAAAGAAAAATATATGAATTTATTCAACAGTCCTTCATTAGGAAACAAAAGATTTTAGATGAAATTAAACCACTTGATGATCTAAACAACAAGAAAGACAGTTGTATGTCCAATCATACAACAGAAATTGGGAAAGATCTTGACTATCTTAAAGATGTAAATGGAACTACAAGTGGTATAGGAACTGGCAGCAGTGTTGAAAAATACATTATTGATGAAAGTGATTACATGTCATTCATAAACAACCCCAGTCTTACTGTGACTGTACCAATTGCTGTAGGAGAATCTGACTTTGAAAATTTAAACACGGAAGACTTTAGTAGTGAATCGGATCTGGAAGAAAGCAAAGAGAAACTGAATGAAAGCAGTAGCTCATCAGAAGGTAGCACTGTGGACATCGGCGCACCTGTAGAAGAACAGCCCGTAGTGGAACCTGAAGAAACTCTTGAACCAGAAGCTTGTTTCACTGAAGGCTGTGTACAAAGATTCAAGTGTTGTCAAATCAATGTGGAAGAAGGCAGAGGAAAACAATGGTGGAACCTGAGAAGGACGTGTTTCCGAATAGTTGAACATAACTGGTTTGAGACCTTCATTGTTTTCATGATTCTCCTTAG TAGTGGTGCTCTGGCATTTGAAGATATATATATTGATCAGCGAAAGACGATTAAGACGATGTTGGAATATGCTGACAAGGTTTTCACTTACATTTTCATTCTGGAAATGCTTCTAAAATGGGTGGCATATGGCTATCAAACATATTTCACCAATGCCTGGTGTTGGCTGGACTTCTTAATTGTTGATGTTTCATTGGTCAGTTTAACAGCAAATGCCTTGGGTTACTCAGAACTTGGAGCCATCAAATCTCTCAGGACACTAAGAGCTCTGAGACCTCTAAGAGCCTTATCTCGATTTGAAGGGATGAGGGTGGTTGTGAATGCCCTTTTAGGAGCAATTCCATCCATCATGAATGTGCTTCTGGTTTGTCTTATATTCTGGCTAATTTTCAGCATCATGGGCGTAAATTTGTTTGCTGGCAAATTCTACCACTGTATTAACACCACAACTGGTGACAGGTTTGACATCGAAGACGTGAATAATCATACTGATTGCCTAAAACTAATAGAAAGAAATGAGACTGCTCGATGGAAAAATGTGAAAGTAAACTTTGATAATGTAGGATTTGGGTATCTCTCTTTGCTTCAAGTTGCCACATTCAAAGGATGGATGGATATAATGTATGCAGCAGTTGATTCCAGAAATGTGGAACTCCAGCCTAAGTATGAAGAAAGTCTGTACATGTATCTTTACTTTGTTATTTTCATCATCTTTGGGTCCTTCTTCACCTTGAACCTGTTTATTGGTGTCATCATAGATAATTTCAACCAGCAGAAAAAGAAGTTTGGAGGTCAAGACATCTTTATGACAGAAGAACAGAAGAAATACTATAATGCAATGAAAAAATTAGGATCGAAAAAACCGCAAAAGCCTATACCTCGACCAGGAAACAAATTTCAAGGAATGGTCTTTGACTTCGTAACCAGACAAGTTTTTGACATAAGCATCATGATTCTCATCTGTCTTAACATGGTCACAATGATGGTGGAAACAGATGACCAGAGTGAATATGTGACTACCATTTTGTCACGCATCAATCTGGTGTTCATTGTGCTATTTACTGGAGAGTGTGTACTGAAACTCATCTCTCTACGCCATTATTATTTTACCATTGGATGGAATATTTTTGATTTTGTGGTTGTCATTCTCTCCATTGTAGGTATGTTTCTTGCCGAGCTGATAGAAAAGTATTTCGTGTCCCCTACCCTGTTCCGAGTGATCCGTCTTGCTAGGATTGGCCGAATCCTACGTCTGATCAAAGGAGCAAAGGGGATCCGCACGCTGCTCTTTGCTTTGATGATGTCCCTTCCTGCGTTGTTTAACATCGGCCTCCTACTCTTCCTAGTCATGTTCATCTACGCCATCTTTGGGATGTCCAACTTTGCCTATGTTAAGAGGGAAGTTGGGATCGATGACATGTTCAACTTTGAGACCTTTGGCAACAGCATGATCTGCCTATTCCAAATTACAACCTCTGCTGGCTGGGATGGATTGCTAGCACCCATTCTCAACAGTAAGCCACCCGACTGTGACCCTAATAAAGTTAACCCTGGAAGCTCAGTTAAGGGAGACTGTGGGAACCCATCTGTTGGAATTTTCTTTTTTGTCAGTTACATCATCATATCCTTCCTGGTTGTGGTGAACATGTACATCGCGGTCATCCTGGAGAACTTCAGTGTTGCTACTGAAGAAAGTGCAGAGCCTCTGAGTGAGGA TGACTTTGAGATGTTCTATGAGGTTTGGGAGAAGTTTGATCCCGATGCAACTCAGTTCATGGAATTTGAAAAATTATCTCAGTTTGCAGCTGCGCTTGAACCGCCTCTCAATCTGCCACAACCAAACAAACTCCAGCTCATTGCCATGGATTTGCCCATGGTGAGTGGTGACCGGATCCACTGTCTTGATATCTTATTTGCTTTTACAAAGCGGGTTCTAGGAGAGAGTGGAGAGATGGATGCTCTACGAATACAGATGGAAGAGCGATTCATGGCTTCCAATCCTTCCAAGGTCTCCTATCAGCCAATCACTACTACTTTAAAACGAAAACAAGAGGAAGTATCTGCTGTCATTATTCAGCGTGCTTACAGACGCCACCTTTTAAAGCGAACTGTAAAACAAGCTTCCTTTACGTACAATAAAAACAAAATCAAAGGTGGGGCTAATCTTCTTATAAAAGAAGACATGATAATTGACAGAATAAATGAAAACTCTATTACAGAAAAAACTGATCTGACCATGTCCACTGCAGCTTGTCCACCTTCCTATGACCGGGTGACAAAGCCAATTGTGGAAAAACATGAGCAAGAAGGCAAAGATGAAAAAGCCAAAGGGAAATAA(SEQ ID NO:1)。

其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：

MEQTVLVPPGPDSFNFFTRESLAAIERRIAEEKAKNPKPDKKDDDENGPKPNSDLEAGKNLPFIYGDIPPEMVSEPLEDLDPYYINKKTFIVLNKGKAIFRFSATSALYILTPFNPLRKIAIKILVHSLFSMLIMCTILTNCVFMTMSNPPDWTKNVEYTFTGIYTFESLIKIIARGFCLEDFTFLRDPWNWLDFTVITFAYVTEFVDLGNVSALRTFRVLRALKTISVIPGLKTIVGALIQSVKKLSDVMILTVFCLSVFALIGLQLFMGNLRNKCIQWPPTNASLEEHSIEKNITVNYNGTLINETVFEFDWKSYIQDSRYHYFLEGFLDALLCGNSSDAGQCPEGYMCVKAGRNPNYGYTSFDTFSWAFLSLFRLMTQDFWENLYQLTLRAAGKTYMIFFVLVIFLGSFYLINLILAVVAMAYEEQNQATLEEAEQKEAEFQQMIEQLKKQQEAAQQAATATASEHSREPSAAGRLSDSSSEASKLSSKSAKERRNRRKKRKQKEQSGGEEKDEDEFQKSESEDSIRRKGFRFSIEGNRLTYEKRYSSPHQSLLSIRGSLFSPRRNSRTSLFSFRGRAKDVGSENDFADDEHSTFEDNESRRDSLFVPRRHGERRNSNLSQTSRSSRMLAVFPANGKMHSTVDCNGVVSLVGGPSVPTSPVGQLLPEVIIDKPATDDNGTTTETEMRKRRSSSFHVSMDFLEDPSQRQRAMSIASILTNTVEELEESRQKCPPCWYKFSNIFLIWDCSPYWLKVKHVVNLVVMDPFVDLAITICIVLNTLFMAMEHYPMTDHFNNVLTVGNLVFTGIFTAEMFLKIIAMDPYYYFQEGWNIFDGFIVTLSLVELGLANVEGLSVLRSFRLLRVFKLAKSWPTLNMLIKIIGNSVGALGNLTLVLAIIVFIFAVVGMQLFGKSYKDCVCKIASDCQLPRWHMNDFFHSFLIVFRVLCGEWIETMWDCMEVAGQAMCLTVFMMVMVIGNLVVLNL FLALLLSSFSADNLAATDDDNEMNNLQIAVDRMHKGVAYVKRKIYEFIQQSFIRKQKILDEIKPLDDLNNKKDSCMSNHTTEIGKDLDYLKDVNGTTSGIGTGSSVEKYIIDESDYMSFINNPSLTVTVPIAVGESDFENLNTEDFSSESDLEESKEKLNESSSSSEGSTVDIGAPVEEQPVVEPEETLEPEACFTEGCVQRFKCCQINVEEGRGKQWWNLRRTCFRIVEHNWFETFIVFMILLSSGALAFEDIYIDQRKTIKTMLEYADKVFTYIFILEMLLKWVAYGYQTYFTNAWCWLDFLIVDVSLVSLTANALGYSELGAIKSLRTLRALRPLRALSRFEGMRVVVNALLGAIPSIMNVLLVCLIFWLIFSIMGVNLFAGKFYHCINTTTGDRFDIEDVNNHTDCLKLIERNETARWKNVKVNFDNVGFGYLSLLQVATFKGWMDIMYAAVDSRNVELQPKYEESLYMYLYFVIFIIFGSFFTLNLFIGVIIDNFNQQKKKFGGQDIFMTEEQKKYYNAMKKLGSKKPQKPIPRPGNKFQGMVFDFVTRQVFDISIMILICLNMVTMMVETDDQSEYVTTILSRINLVFIVLFTGECVLKLISLRHYYFTIGWNIFDFVVVILSIVGMFLAELIEKYFVSPTLFRVIRLARIGRILRLIKGAKGIRTLLFALMMSLPALFNIGLLLFLVMFIYAIFGMSNFAYVKREVGIDDMFNFETFGNSMICLFQITTSAGWDGLLAPILNSKPPDCDPNKVNPGSSVKGDCGNPSVGIFFFVSYIIISFLVVVNMYIAVILENFSVATEESAEPLSEDDFEMFYEVWEKFDPDATQFMEFEKLSQFAAALEPPLNLPQPNKLQLIAMDLPMVSGDRIHCLDILFAFTKRVLGESGEMDALRIQMEERFMASNPSKVSYQPITTTLKRKQEEVSAVIIQRAYRRHLLKRTVKQASFTYNKNKIKGGANLLIKEDMIIDRINENSITEKTDLTMSTAACPPSYDRVTKPIVEKHEQEGKDEKAKGK(SEQ ID NO:2)。

与野生型SCN1A基因的SEQ ID NO:1所示序列相比，发明人发现的SCN1A基因新突变体具有c.79_82del突变，即SCN1A基因突变体的cDNA中第79-82位碱基AGAC缺失，由此，其所编码的产物与野生型SCN1A(SEQ ID NO:2)相比，具有p.Arg27Alafs*64突变，即该突变是由c.79_82del突变而引起的移码突变，导致从第27位氨基酸开始，在编码63个错误的氨基酸后出现终止密码子,翻译终止。

发明人首次提出SCN1A基因的c.79_82del杂合突变导致患者出现SCN1A相关癫痫的症状，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可达到有效地预测生物体是否易感SCN1A相关癫痫的目的。

第二方面，发明人根据获得的突变基因提出了一种分离的多肽。根据实施例，与野生型SCN1A相比，所述分离的多肽具有p.Arg27Alafs*64突变。该多肽是由前述分离的编码SCN1A基因突变体的核酸编码的。

筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的方法

第三方面，本发明提供了检测编码SCN1A基因突变体的核酸的试剂盒，以及筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的方法。所述的试剂盒包括适用于检测SCN1A基因突变体的试剂，所述SCN1A基因突变体为与SEQ ID NO:1所示序列相比，具有c.79_82del突变。所述的试剂包括特异性引物，引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。通过筛选具有所述SCN1A突变体的生物样品，能够有效地筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品。

根据实施例，该筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的方法包括以下实施步骤：

第一，从所述生物样品提取核酸样本。生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品SCN1A基因是否存在突变的核酸样本即可。所述的生物样品包括但不限于血液、唾液、组织、毛发或口腔黏膜。所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中SCN1A基因是否存在突变的样本，包括但不限于从生物样品中提取的基因组DNA、总RNA和mRNA。根据实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的效率。

第二，确定所述核酸样本的核酸序列。确定所述核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。可采用但不限于核酸测序的方法确定核酸样本的核酸序列，并且核酸测序的方法和设备并不受特别限制。可采用第二代测序技术，也可以采用第一代、第三代等各种性能的测序技术。根据实施例，采用第二代测序技术确定核酸样本的核酸序列的步骤还包括：针对核酸样本，构建测序文库，利用测序设备对测序文库进行测序，达到获得包含SCN1A基因信息的测序结果。所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪。所述的构建测序文库的试剂和方法包括但不限于Nextera、TruSeq、Yeasen，具体流程可参见厂家说明书，本领域技术人员可以根据不同的测序平台进行适当选择。根据实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集SCN1A基因外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据实施例，设计并合成特异性扩增SCN1A基因外显子区域的引物，利用所述引物扩增基因组DNA样本，利用扩增产物构建核酸测序文库。所述利用SCN1A基因外显子特异性引物进行PCR扩增的方法，可有效提高筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的效率。

根据实施例，SCN1A基因外显子特异性引物不受特别限制，针对c.79_82del突变，发明人进行了优选设计，所述SCN1A基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列：

上游引物F：TAAACTCAACACAGAAACCAT(SEQ ID NO:3)

下游引物R：AAAAAACACTCACTTTCTTATTG(SEQ ID NO:4)

需要说明的是，这里所使用的术语“核酸序列”泛指所有包含SCN1A基因编码信息的核酸序列和信息数据，包括但不限于测序直接获得的核酸序列信息、测序数据进行组装后得到的完整的核酸序列信息、测序设备产生的原始测序数据(reads)、测序数据经计算机处理后的数据信息(Bam文件等)。

第三，所述核酸序列与基因组参考序列的比对。具体地，基于核酸样本的核酸序列或其互补序列与SEQ ID NO:1相比，如具有c.79_82del突变，则提示生物体易患SCN1A相关癫痫。核酸序列与SEQ ID NO:1进行比对的方法并不受特别限制，可以采用人工比对，也可以给予任意计算机软件，根据实施例，可以采用Novocraft公司的NovoAlign软件比对。

需要说明的是，本发明采用第二代测序技术，针对一个SCN1A相关癫痫综合征患者进行446个与癫痫相关基因的外显子测序分析，并联合Sanger测序对患者本人及其父母进行验证，最终发现了SCN1A相关癫痫的一个新突变位点——SCN1A基因的c.79_82del突变。与第一代测序技术、经典的连锁分析策略相比，高通量的第二代测序技术具有通量高、速度快、检测成本低等优点，可以快速、准确的定位SCN1A相关癫痫的致病突变位点，进而为阐明SCN1A相关癫痫的分子发病机制，为疾病筛查、早期诊断、治疗、预后判断提供科学的依据。

第四方面，作为本发明的衍生应用，还可建立筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的方法，即通过检测生物样品中野生型KANSL1基因编码的多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的表达量是否低于正常水平，可以作为生物体是否患Koolen-de Vries综合征的辅助判断方法。

作为对本发明的衍生应用，提出了一种重组细胞，所述的重组细胞是由编码SCN1A基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。其中，所述的受体细胞的种类不受特别的限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。所述的遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。所述的遗传载体可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。所述的重组细胞能够表达遗传载体所携带的SCN1A基因突变体。

进一步的，利用所述的重组细胞能够有效筛选治疗SCN1A相关癫痫的药物。

下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进行详细说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1确定SCN1A相关癫痫致病突变

1、样本来源

来自中国福建省的一个名7岁早发性癫痫女患者(先证者)，其家族中三代内仅先证者一人患病，发明人挑选患者及其父母进行癫痫的分子诊断。先证者于7月龄时首次癫痫发作，伴轻度智力障碍(IQ＝67)和语言障碍。该癫痫患者的家系谱如图1所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体，图标上的隔断斜线代表已故。获得所有参与者的知情同意书，并进行静脉血采集。

2、基因组DNA提取

取上述家系所有成员的外周血，分别采用HiPure Blood&Tissue DNA Kit(Magen)全血DNA提取方法从外周血样品中提取基因组DNA，用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得各基因组DNA的OD_260nm/OD_280nm均应位于1.7-2.0之间，用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得各基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。

3、目标外显子捕获测序

发明人利用Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒结合Illumina第二代测序技术，对上述SCN1A相关癫痫患者的临床外显子组序列进行了测序。

具体如下：

1)利用Illumina公司的Nextera DNA Exome试剂盒将基因组DNA样本随机打断成200-1000bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库。

2)文库经纯化后,用Nanodrop one检测文库，并等量混合，混合后浓度>100ng/μL，用经过Nextera Rapid Capture Enrichment捕获试剂，结合Illumina公司的Nextera DNAExome试剂盒进行杂交富集，再经过扩增，文库检测合格后即可上机测序，获得原始测序数据。其中，测序平台为Illumina Hiseq X Ten，PE150，各样本的20X平均测序覆盖度≥96％。

3)变异检测、注释及数据库比较

使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定靶区域的变异。利用Remove Run Common Variants和RemoveGlobal Common Variants软件用来去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等。利用filterAlamut.py将注释后的变异按照High，Medium，Low排序。在High和Medium分组中，给予变异一个优先级值和分级理由。所有的变异最初都在Low组别中，当一个变异符合某些标准时，则可以被划分为更高级别的变异。并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT软件进行SNP功能预测。

上述流程中分析的目标基因共446个，主要为癫痫相关基因，目标基因包括：

ABAT,ABCB1,ABCC8,ACY1,ADAR,ADGRG1,ADGRV1,ADSL,AGA,AHI1,AKT3,ALDH4A1,ALDH5A1,ALDH7A1,ALG1,ALG12,ALG13,ALG2,ALG3,ALG6,ALG8,ALG9,AMACR,AMT,ANK3,APTX,ARFGEF2,ARG1,ARHGEF15,ARHGEF9,ARL13B,ARSA,ARSB,ARX,ASNS,ASPA,ASPM,ATIC,ATP13A2,ATP1A2,ATP2A2,ATP6AP2,ATP6V0A2,ATPAF2,ATR,ATRX,AUH,B4GALT1,BCKDK,BCS1L,BOLA3,BRAF,BRAT1,BRD2,BTD,BUB1B,C12orf57,C12orf65,CACNA1A,CACNA1H,CACNA2D2,CACNB4,CASK,CASR,CBL,CC2D2A,CCDC88C,CCL2,CDK5RAP2,CDKL5,CDON,CENPJ,CEP152,CEP290,CHD2,CHRNA2,CHRNA4,CHRNB2,CLCN2,CLCN4,CLCNKA,CLCNKB,CLN3,CLN5,CLN6,CLN8,CNTN2,CNTNAP2,COG1,COG7,COG8,COL18A1,COL4A1,COQ2,COQ8A,COQ9,COX10,COX15,CPA6,CPT2,CRH,CSTB,CTSA,CTSD,CTSF,CUL4B,DCX,DEPDC5,DHCR7,DHFR,DLD,DNAJC5,DNM1,DOCK7,DOLK,DPAGT1,DPM1,DPM2,DPM3,DPYD,DYNC1H1,DYRK1A,EEF1A2,EFHC1,EFHC2,EIF2B1,EIF2B2,EIF2B3,EIF2B4,EIF2B5,EMX2,EPM2A,ETFA,ETFB,ETFDH,FARS2,FASN,FGD1,FGF8,FGFR3,FH,FKRP,FKTN,FLNA,FLVCR2,FOLR1,FOXG1,FUCA1,GABBR2,GABRA1,GABRB2,GABRB3,GABRD,GABRG2,GALC,GALNS,GAMT,GATM,GCDH,GCSH,GFAP,GLB1,GLDC,GLI2,GLI3,GLRA1,GLRB,GLUD1,GNAO1,GNE,GNPTAB,GNPTG,GNS,GOSR2,GPC3,GPHN,GRIA3,GRIN1,GRIN2A,GRIN2B,GRN,GUSB,HCN1,HCN2,HCN4,HDAC4,HEXA,HEXB,HGSNAT,HNRNPH1,HNRNPU,HPD,HRAS,HSD17B10,IDS,IDUA,IQSEC2,KANSL1,KAT6B,KCNA1,KCNA2,KCNAB2,KCNB1,KCNC1,KCNH2,KCNH5,KCNJ1,KCNJ10,KCNJ11,KCNMA1,KCNQ2,KCNQ3,KCNT1,KCNV2,KCTD7,KDM5C,KDM6A,KIAA2022,KIF1BP,KMT2D,KPNA7,KRAS,L2HGDH,LAMA2,LARGE1,LBR,LGI 1,LIAS,LIG4,LRPPRC,MAGI2,MAP2K1,MAP2K2,MAPK10,MBD5,MCOLN1,MCPH1,ME2,MECP2,MED12,MED17,MEF2C,MFSD8,MGAT2,MLC1,MOCS1,MOCS2,MOGS,MPDU1,MPI,MTHFR,MTOR,NAGLU,NDE1,NDUFA1,NDUFA2,NDUFS1,NDUFS3,NDUFS4,NDUFS7,NDUFS8,NDUFV1,NEDD4L,NEU1,NF1,NHEJ1,NHLRC1,NIPA2,NIPBL,NOTCH3,NPC1,NPC2,NPHP1,NR2F1,NRAS,NRXN1,NSD1,NTNG1,OFD1,OPHN1,PAFAH1B1,PAK3,PANK2,PAX6,PC,PCDH19,PCNT,PDHA1,PDSS1,PDSS2,PEX1,PEX12,PEX14,PEX2,PEX26,PEX3,PEX5,PEX6,PEX7,PGK1,PHF6,PIGA,PIGO,PIGV,PIK3AP1,PLA2G6,PLCB1,PLP1,PMM2,PNKP,PNPO,POLG,POMGNT1,POMT1,POMT2,PPT1,PQBP1,PRICKLE1,PRICKLE2,PRODH,PRRT2,PSAP,PTCH1,PTPN11,PURA,QARS,QDPR,RAB39B,RAB3GAP1,RAF1,RAI 1,RANGAP1,RARS2,RBFOX1,RBFOX3,RELN,RFT1,RNASEH2A,RNASEH2B,RNASEH2C,ROGDI,RPGRIP1L,RYR3,SAMHD1,SCARB2,SCN10A,SCN1A,SCN1B,SCN2A,SCN2B,SCN3A,SCN3B,SCN4A,SCN4B,SCN5A,SCN8A,SCN9A,SCO2,SDHA,SERPINI1,SETBP1,SGSH,SHH,SHOC2,SIK1,SIX3,SLC12A5,SLC13A5,SLC17A5,SLC19A3,SLC1A3,SLC25A12,SLC25A15,SLC25A19,SLC25A22,SLC2A1,SLC35A1,SLC35A2,SLC35C1,SLC46A1,SLC4A10,SLC6A1,SLC6A5,SLC6A8,SLC9A6,SMARCA2,SMC1A,SMC3,SMPD1,SMS,SNAP25,SNAP29,SOS1,SPRED1,SPTAN1,SRGAP2,SRPX2,ST3GAL3,ST3GAL5,STIL,STX1B,STXBP1,SUMF1,SUOX,SURF1,SYN1,SYNGAP1,SYP,SZT2,TACO1,TBC1D24,TBL1XR1,TBX1,TCF4,TGIF1,TMEM216,TMEM67,TMEM70,TNK2,TPP1,TREX1,TSC1,TSC2,TSEN2,TSEN34,TSEN54,TUBA1A,TUBA8,TUBB2A,TUBB2B,TWNK,UBE2A,UBE3A,UBR5,VANGL1,VDAC1,VPS13A,VPS13B,VRK1,WDR45,WDR62,WWOX,ZEB2,ZIC2,UNC80,TRIP12

发明人发现了SCN1A基因突变体c.79_82del(p.Arg27Alafs*64)。该变异在总人口中的等位基因频率尚未在gonmAD数据库中报道。该变异(p.Arg27Alafs*64)移码突变发生在26个外显子转录本的第1号外显子上，该变异可能导致截断的蛋白产物或激活无义介导的mRNA降解，从而丢失其生物功能。依据ACMG指南，发明人认为该变异是致病变异。由于SCN1A基因是SCN1A相关癫痫的致病基因，因此发明人判断患者易患SCN1A相关癫痫，且患者临床表现与SCN1A相关癫痫相符。

实施例2Sanger法测序验证

分别对实施例1中所述的SCN1A相关癫痫患者家系中的家系成员(包括1个患者和2个正常家系成员)的SCN1A基因进行检测：针对SCN1A基因的c.79_82del突变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证SCN1A基因的c.79_82del突变与SCN1A相关癫痫之间的相关性。

具体步骤如下：

1、DNA提取

参照实施例1中所述的提取DNA的方法。

2、引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，设计得到针对SCN1A基因的c.79_82del突变的外显子特异性引物，具体序列如下：

上游引物F：TAAACTCAACACAGAAACCAT(SEQ ID NO:3)

下游引物R：AAAAAACACTCACTTTCTTATTG(SEQ ID NO:4)

接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应，50μL反应体系包括：10×buffer 5μL、基因组DNA 1μL、上游引物F(SEQ ID NO:3)2μL、下游引物R(SEQ ID NO:4)2μL、10mM dNTP 5μL、Taq酶1μL、ddH₂O 34μL。PCR反应条件：95℃5min，30个循环(95℃15s，60℃30s，72℃45s)，72℃5min，4℃保温。最终获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。

3、测序

将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。测序采用ABI3730型测序仪进行正反向测序。将测序结果与SCN1A基因如SEQ ID NO:1所示核酸序列进行比对。基于比对结果，可以排查SCN1A相关癫痫家系成员中是否存在SCN1A基因的c.79_82del突变位点。比对发现，该家系中患者(先证者)携带了c.79_82del杂合突变，结果见图2；该突变体编码的多肽与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列比较，具有p.Arg27Alafs*64变异；而表型正常的父母均未携带该突变,结果见图3。由此，进一步证明SCN1A基因的c.79_82del(p.Arg27Alafs*64)是SCN1A相关癫痫的新的致病位点，SCN1A基因的c.79_82del的杂合突变能够导致该病。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (6)

1.一种编码SCN1A基因突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO:1相比，所述核酸的基因序列具有c.79_82del突变。

2.一种如权利要求1所述的编码SCN1A基因突变体的核酸在制备检测易患SCN1A相关癫痫的生物样品的试剂中的应用。

3.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽由权利要求1所述的编码SCN1A基因突变体的核酸编码，与SEQ ID NO:2相比，所述的多肽的氨基酸序列具有p.Arg27Alafs*64突变。

4.一种如权利要求3所述的分离的多肽在制备筛选易患SCN1A相关癫痫的生物样品的检测试剂中应用。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞是由权利要求1所述的编码SCN1A基因突变体的核酸构建的遗传载体转化受体细胞获得的。

6.一种如权利要求5所述的重组细胞在筛选治疗SCN1A相关癫痫的药物中的应用。

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