CN101148665A - 钠离子通道scn1a基因突变及基因突变检测方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种钠离子通道SCN1A基因突变，还涉及基因突变的检测方法和用途，SCN1A的15号外显子发生G248A点突变，SCN1A的26号外显子发生T443A点突变，该检测方法包括如下步骤：①抽取DNA样本；②根据SCN1A或SCN2A基因外显子序列设计引物；③PCR反应，扩增所需产物；④采用一个或多个变性温度下，用变性高效液相色谱分析上述产物。该方法具有检测速度快、检测成本低、检出率高的优点。属于分子生物学和神经病学领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因突变，尤其涉及一种钠离子通道SCN1A基因突变，本发明还涉及该基因突变的检测方法和用途。属于分子生物学和临床神经病学技术领域。
背景技术
目前癫痫的发病率5％，是神经系统常见病、多发病，但对癫痫的确切分类诊断和个体化治疗还一直是临床工作中的难点。目前癫痫的诊断仅能依靠临床表现和脑电图结果来进行，主观性较强；而且，癫痫的临床表现千差万别，临床病例资料收集要求较高，要求准确、详尽、精确，由于癫痫患者的很多临床表现来自于自身感受，患者家属有时很难细致描述其表现形式，况且一些临床下发作或发作持续时间短的发作往往不易被发现，造成癫痫的分类诊断十分困难，结果导致临床上经常出现由于病史询问不详细或家属提供的病历资料不准确造成误诊的现象，癫痫的类型诊断不明直接影响了治疗药物的选择和治疗效果；另外，即使分类明确，但由于癫痫的治疗具有明显的个体化特征，且患者的遗传背景不同，对抗癫痫药物的反应也明显不同；再则，目前的癫痫药物治疗多是临床医生的经验性选药，不同的医生对癫痫的认识水平不同和经验不同，造成了药物选择的千差万别，使患者的治疗效果以及治疗的连续性受到很大影响。为使癫痫的治疗更加个体化、正规化，提高治疗效率，目前急需对癫痫进行分子水平诊断，明确癫痫亚型，并进一步根据分子诊断结果进行相关药物的筛选，避免不适当的药物加重患者病情、贻误治疗时机，例如有些癫痫的患者根据经验选药治疗后，癫痫发作却明显加重，就很有可能与患者的钠通道基因突变有关。所以通过对癫痫患者进行分子诊断，并有针对性地进行个体化的药物治疗，对提高癫痫的诊断水平和治疗效果以及患者的生活质量尤其重要。
研究发现，神经元的离子通道异常是导致神经元异常放电的重要因素之一，钠离子通道是神经元动作电位的主要通道，其中70％以上钠离子通道电流来自于钠通道α亚单位1型(sodium channelαsubunit type 1，SCN1A)和钠通道α亚单位2型(sodium channelαsubunit type 2，SCN2A)，故SCN1A和SCN2A突变所致神经元膜电位变化与癫痫发病的关系最为密切，在临床上十分重要。而且目前多种的抗癫痫药物均是作用于钠离子通道，所以对SCN1A和SCN2A基因突变进行检测，最可能发现基因异常、明确癫痫亚型的诊断和进行治疗药物的筛选。
目前，现有对SCN1A和SCN2A基因突变的检测中，使用的方法主要采用单链构象多态性分析(SSCP)和直接测序，其实验操作步骤繁琐，准确性较大程度上依赖于试验者的技能，存在主观性强、成本高、费时、费力的缺点。变性高效液相色谱分析(Denaturing HighPerformance Liguid Chromatography，DHPLC)是新发展起来的一种杂合双链突变检测技术，目前仅应用在基因分型、癌症的突变检测、人类基因多态性、地中海贫血、帕金森病的基因诊断等方面，如中国公报公开“2004100067063.5”、《一种检测多药耐药基因多态性的方法》及“200410004781.8”、《帕金森氏病相关的parkin基因突变及其检测方法》两项发明专利申请，《遗传》第26卷第5期的《DHPLC检测胃癌卫星不稳定》等。较少应用于其他基因突变的研究，尤其是尚无人将其应用于SCN2A基因突变的检测。现有检测钠离子通道基因突变的技术中多是将PCR产物进行直接测序，该方法成本高、费时、费力，不适合大批样本的筛查。且以往DHPLC的基因分析中对样本都是在单温度下的变性分析，突变的检出率受到很大影响，容易造成突变位点的遗漏，导致假阴性。
而且，基础研究的最终目的是为了服务于临床，提高疾病的治疗效果。但目前有关SCN1A和SCN2A基因突变的检测，仅仅停留在突变检出、在动物模型上验证神经元电生理变化的层次上，尚无人进行癫痫患者常规基因突变的筛选，也无人将检测与临床相结合进行癫痫亚型诊断，更无人在明确基因突变的基础上进行治疗方案的选择，指导临床药物治疗。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题，即本发明的第一个目的，是为了提供一种钠离子通道的SCN1A的基因突变。
本发明所要解决的第二个技术问题，即本发明的第二个目的，是为了提供一种速度快、成本低、检出率高的钠离子通道SCN1A基因突变检测方法。
本发明的第三个问题，即本发明的第三个目的，是为了将钠离子通道的SCN1A的基因突变应用在临床抗癫痫药物的筛选、指导药物治疗上。
为解决本发明的第一个技术问题，钠离子通道SCN1A基因15号外显子第248个碱基由G突变为A，即发生G248A点突变，导致946位的氨基酸发生变化，由精氨酸变为组氨酸；SCN1A的26号外显子第443个碱基由T突变为A，即发生T443A点突变，导致1765位的氨基酸发生变化，由苯甲氨酸变为亮氨酸。基因突变序列分别见序列1和序列2。
为解决本发明的第二个技术问题，可采取如下技术措施：
钠离子通道基因突变的检测方法，包括如下步骤：
①抽提DNA样本；
②根据SCN1A或SCN2A基因外显子序列设计PCR引物；
③PCR扩增SCN1A或SCN2A基因外显子；
④在一个或多个变性温度下，利用变性高效液相色谱分析上述产物；
⑤对上述分析的阳性样本进行基因测序。
本发明的一个实施方式是：在DHPLC检测中，根据双螺旋百分比-温度曲线和温度-碱基对曲线，确定融解域的个数，来选择相应数量的变性温度，使片段所有融解域的碱基对发生部分变性。
在DHPLC检测中的一个或多个变性温度的确定分如下情况：
a.在双螺旋百分比-温度曲线中，双螺旋百分比从100％～0％的温度变化小于5℃，融解域只有一个，则选用单温度进行部分变性分析；
b、双螺旋百分比-温度曲线中双螺旋百分比从100％～0％的温度变化大于或等于5℃，或温度-碱基对曲线呈阶梯状，融解域有多个，则选择多个变性温度，根据双螺旋百分比-碱基对曲线，使每一个融解域分别发生部分变性。
所述的SCN1A的PCR引物序列具体如表1：
表1 PCR扩增SCN1A外显子的引物序列和退火温度表
| 外显子引物序列 | 碱基顺序(5’→3’) | 扩增长度(bp) | 退火温度(℃) |
| Exon 1上游引物Exon 1下游引物 | AAAATGTGCAGGATGACAAGGATATAGTAGGGGTCCAGGT | 275 | 56 |
| Exon 2上游引物Exon 2下游引物 | CTTCTATGTTGTGTTCCTGTAGTGCTTACAGATCATGTAC | 200 | 56 |
| Exon 3上游引物Exon 3下游引物 | CTAAGCTGCAGTTTGGGCTTGCCAATGAGCATTGTCCTCT | 330 | 52 |
| Exon 4上游引物Exon 4下游引物 | CTATTCCACTGATGGAGTGATGGAAGAGTGGCATATGTGA | 467 | 54 |
| Exon 5上游引物Exon 5下游引物 | GTGTTTGTGTGTGAACTCCCAATCACATGATGGGTCCGTC | 160 | 56 |
| Exon 6上游引物Exon 6下游引物 | TTCACACGTGTTAAGTCTTCATCCAGCCCCTCAAGTATTT | 400 | 54 |
| Exon 7上游引物Exon 7下游引物 | GAACCTGACCTTCCTGTTCTTAGTTGGCTGTTATCTTCAG | 243 | 56 |
| Exon 8上游引物Exon 8下游引物 | CTTTTACCCCACTTGCAGAAATGGAGAGTGTGGCTC | 190 | 54 |
| Exon 9上游引物Exon 9下游引物 | GTTGAAGCCACCACTTAGTGCGATAAAAGGTCAGTGCCAT | 305 | 52 |
| Exon 10上游引物 | GTCTCTTCAGGTGCTATGTT | 348 | 54 |
| Exon 10下游引物 | TAAACTCAGCAGTGCCATAC | ||
| Exon 11上游引物Exon 11下游引物 | TGCTGAAATCTCCTTCTACAGCCATGCCTGAACTATTTAA | 508 | 56 |
| Exon 12上游引物Exon 12下游引物 | ACTGTGTCACCATTTGGTTGATGCACTATTCCCAACTCAC | 305 | 56 |
| Exon 13上游引物Exon 13下游引物 | GTATACCTTTTGGTGGTTCTTGGTTGAAAGACTGCTATAC | 374 | 52 |
| Exon 14上游引物Exon 14下游引物 | GTGGGAAAATAGCATAAGCAAACCCTGATTGTTAGAAAGG | 325 | 56 |
| Exon 15上游引物Exon 15下游引物 | ACCATTTCTAGGTAAAGCTCTGCATATCTTAAGTGGGTAC | 458 | 50 |
| Exon 16上游引物Exon 16下游引物 | CTCTTCCCTACATTGGTGTACCCACACCTATAGAATCTTA | 555 | 50 |
| Exon 17上游引物Exon 17下游引物 | TCTATGTCCATCTCACTTACAAGCTGCACTCCAAATGAAA | 190 | 54 |
| Exon 18上游引物Exon 18下游引物 | TATTTCAACACTTTCTGCAGGGTGCTGTATCACCTTTTCTT | 207 | 54 |
| Exon 19上游引物Exon 19下游引物 | CCTCCTATTCCAATGAAATGAGCTACCTTGAACAGAGACA | 319 | 50 |
| Exon 20上游引物Exon 20下游引物 | ATTATTTTTGTGTGTGCAGGGCTATATACAATACTTCAGG | 180 | 48 |
| Exon 21上游引物Exon 21下游引物 | CCAGAGATTACTAGGGGAATCCATCTGGGCTCATAAACTT | 516 | 54 |
| Exon 22上游引物Exon 22下游引物 | TGCATGTCCTTCTTAATAGGGTCGTTTATGCTTTATTCGA | 150 | 52 |
| Exon 23上游引物Exon 23下游引物 | TACAAAATATTCCCCTTTGGTCTCAGTGGGAGAGAAAATA | 195 | 50 |
| Exon 24上游引物 | GGACACAGTTTTAACCAGTT | 170 | 54 |
| Exon 24下游引物 | CCCCCATATCATTTGATACT | ||
| Exon 25上游引物Exon 25下游引物 | AATGCACATGAGAAAACTCCCTGGGATGATCTTGAATCTA | 407 | 54 |
| Exon 26上游引物(1)Exon 26下游引物(1)Exon 26上游引物(2)Exon 26下游引物(2)Exon 26上游引物(3)Exon 26下游引物(3)Exon 26上游引物(4)Exon 26下游引物(4) | TTTCGTGTCCCCTACCCTGTTTATTAGGGTCACAGTCGGGACCCATTCTCAACAGTAAGCAGCTGGAGTTTGTTTGGTTGTGAACCGCCTCTCAATCTGCAGATTAGCCCCACCTTTGAGGTGGGGCTAATCTTCTTTGTAGGCACTGACCTTAAGG | 351354354326 | 58585654 |
其中外显子26的51～362bp上游引物为序列53，下游引物序列为序列54；外显子26的360～674bp上游引物为序列55，下游引物序列为序列56；外显子26的672～987bp上游引物为序列57，下游引物序列为序列58；外显子26的1010～1298bp上游引物为序列59，下游引物序列为序列60。
本发明的检测方法还可以应用于其他钠离子通道相关疾病患者的基因突变检测，如孤独症、良性家族性新生儿婴儿惊厥等。其中钠离子通道SCN2A基因突变的检测，其引物设计如下：
表2 PCR扩增SCN2A外显子的引物序列和退火温度
| 外显子引物序列 | 碱基顺序(5’→3’) | 扩增长度(bp) | 退火温度 |
| Exon 2上游引物Exon 2下游引物 | TCCCTCCCTGTTTCTGTAGCCACCATCATCCCTGGGACTA | 410 | 56 |
| Exon 3上游引物Exon 3下游引物 | ACACTATTTTACAGGGCAATAGTGACGATTTGAAAAAGGAT | 260 | 54 |
| Exon 4和5上游引物Exon 4和5下游引物 | GGCATGGTAGTGCATAAAAGATGAAACATAAAGGGAGGTC | 199 | 56 |
| Exon 6上游引物Exon 6下游引物 | GCTTGGCTATTTTCTCTCAGCAGTGATTTACTCTTCCAGG | 194 | 50 |
| Exon 7上游引物Exon 7下游引物 | TGTGTTTGTGTGTGAACCCCCTCGGTGTTTAACCTAGCTC | 145 | 60 |
| Exon 8上游引物Exon 8下游引物 | CCCCCTTCTGATTTTGTTTGGTCTAAGTCACTTGATTCAC | 401 | 56 |
| Exon 9上游引物Exon 9下游引物 | GCTCTGCTTTGTGGCAACAGGTGAGTGGGACTGGATGAGT | 120 | 62 |
| Exon 10上游引物Exon 10下游引物 | TCCTTTCTTTCCTCTAACCTTCTCTTGAGTTCGGTGTTTT | 225 | 54 |
| Exon 11上游引物Exon 11下游引物 | CTTTGACACCTTTAGTTGGGTCATGTACGTTTTCCCAGCA | 250 | 58 |
| Exon 12上游引物Exon 12下游引物 | TACTTTGCGCCCTTCTAGGCAGGTGGAAGGCGGTTTTCTC | 395 | 62 |
| Exon 13上游引物Exon 13下游引物 | ATGCCAGCTCTTAACTCTCTCCAGTCACAACTCTCTTCAC | 448 | 56 |
| Exon 14上游引物Exon 14下游引物 | TTGGGCTTTGCTGCTTTCAAGTGACGCAGGACTTTTAACA | 212 | 58 |
| Exon 15上游引物Exon 15下游引物 | GTAAGCAGTTTTCATGAGGAAAACTCTCAGTGAGGCTTAC | 290 | 56 |
| Exon 16上游引物Exon 16下游引物 | CGTGTTTCAAGAGTATTTGCATGATGGGAAATCTTGCCAT | 312 | 54 |
| Exon 17上游引物Exon 17下游引物 | GAGCATTAACACTGTTCTTGGAGGAAAATGTTTTTGCTAC | 414 | 50 |
| Exon 18上游引物(1)Exon 18下游引物(1)Exon 18上游引物(2)Exon 18下游引物(2) | GCAATAGAATGTTTTGATCACCTTTCTATGGTGGTATGGTTGGGAAAGCCTTTGTTAGGAAGCAGAACAGGAAGGAAACACGCAA | 155492 | 56 |
| Exon 19上游引物Exon 19下游引物 | TGTGTTTTTTTGTGGGATTGGGATACTCAAGACCACATAT | 186 | 52 |
| Exon 20上游引物Exon 20下游引物 | CCCACCAACACAAATATACCTGGATCATGCATCACCTACC | 242 | 56 |
| Exon 21上游引物Exon 21下游引物 | GCACCTGATAAGAGCTTGCACAGCAAAGTGCAGCATACTC | 293 | 60 |
| Exon 22上游引物Exon 22下游引物 | GGCTGAACTGTGTAGACATTCTGACAAACTCTAAGGCATT | 214 | 54 |
| Exon 23上游引物Exon 23下游引物 | TTCCTTCTCATCCTGTGCCAGGTGGATATCTCATTATGAG | 385 | 54 |
| Exon 24上游引物Exon 24下游引物 | GCCTGTATTGAATACATGTCTTCCCTCTAACTAGACTTAC | 178 | 54 |
| Exon 25上游引物Exon 25下游引物 | AAGCATGTGAGATTTGAAGGTTCAGAGCAAGGATGAAGTT | 327 | 54 |
| Exon 26上游引物Exon 26下游引物 | TAGCCAGCAAAGAACACAATCTGTGAAACGGTTAGGTAAT | 211 | 58 |
| Exon 27上游引物Exon 27下游引物 | CAATCACTGGTTTTGCAAGGGGAGTTTGGGATGAATGAGA | 542 | 54 |
| Exon 28上游引物(1)Exon 28下游引物(1)Exon 28上游引物(2)Exon 28下游引物(2)Exon 28上游引物(3)Exon 28下游引物(3) | AGGAGCAAAGGGGATCCGCACGGGATCAAACTTCTCCCAAGAGCCTCTGAGTGAGGATGATTGATGGGTGTTCCATCACACGCAAACAAGAGGAGGTGTCAGTTTGCTGACCAGAGGTCT | 500476485 | 565460 |
其中外显子18的1～262bp上游引物为序列91，下游引物为序列92；外显子18的159～480bp上游引物为序列93，下游引物为序列94；外显子28的101～600bp上游引物为序列113，下游引物为114；外显子28的601～1057bp上游引物为序列115，下游引物为116；外显子28的936～1401bp上游引物为序列117，下游引物为118。
钠离子通道基因SCN1A和SCN2A位于2q24，SCN1A包含26个外显子，SCN2A包含28个外显子，其中外显子1不编码。目前已经发现SCN1A上有数十个突变位点，并认为其与全面性癫痫性伴热性惊厥附加症(Generalized epilepsy with febrile seizure syndrome，GEFS+)尤其是婴儿严重肌阵挛性癫痫(Severe myoclonic epilepsyof infantile，SMEI)关系密切，而SCN2A目前发现其基因突变位点较少，主要与良性家族性新生儿婴儿惊厥(Benign familialneonatal-infantile seizures，BFNIS)和一部分的以部分性发作为主的癫痫综合征有关。本发明涉及的基因突变的检测方法除可应用于上述疾病的诊断外，还可以应用于其他钠离子通道相关疾病患者的基因突变检测，如孤独症等。
为本发明的第三个技术问题，可以采取如下措施：
对于有SCN1A和SCN2A基因突变的患者建议选择作用于钠离子通道以外的药物或选择具有多种作用机制的抗癫痫药物进行治疗。避免使用作用于钠离子通道的药物(如：拉莫三嗪、巴比妥、卡马西平、苯妥英)，以免加重病情；尽量选用作用于其他通道的药物(如：苯二氮卓类、vigabatrin、tiagabine)或者有多重作用机制的药物(如：丙戊酸、托吡酯)进行抗癫痫治疗。
与现有技术相比较，本发明具有的技术效果：
1、根据温度-碱基对曲线采用一个或多个变性温度的DHPLC检测技术，使基因突变检测更加迅速、低成本化，而且不易遗漏突变位点，大大提高了突变的检出率，增加检测准确性。因此是一种高效、自动、快捷、成本低、准确的基因筛查方法。
2、本发明中可根据基因突变的位点有针对性地选择抗癫痫药物，避免了因药物使用不当造成病情加重，提高了癫痫的治疗有效率和治愈率，大大改善了患者生活质量，减轻了患者家庭和社会的负担，实用性强，具有很高的临床应用价值。
附图说明
图1为双螺旋百分比从100％~0％的温度变化＜5℃的片段的双螺旋百分比-温度曲线图；
图2为双螺旋百分比从100％~0％的温度变化为52℃~62℃，温度差＞5℃时的片段的双螺旋-温度曲线图；
图3为呈阶梯状的温度-碱基对曲线图；
图4为选择三个变性温度57.1℃、55.3℃和54.8℃进行检测的色谱图；
图5为应用实施例中患者关某的家系图；
图6为应用实施例中患者关某的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，所得产物一个458bp片断；
图7为应用实施例中患者关某SCN1A的15号外显子的DHPLC分析色谱图；
图8为应用实施例中患者关某SCN1A的15号外显子PCR扩增产物的基因测序图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的描述。
实施例1：
本实施例以SCN1A为待测基因，其具体检测方法如下：
1、抽提DNA。
用基因组DNA纯化试剂盒提取癫痫患者外周血DNA：
(1)预先将癫痫患者全血轻轻混匀，取500μl加入1.5ml离心管中；
(2)加入1ml纯化树脂于全血中，翻转混匀5-6次(须预先摇匀纯化树脂，若室温低于25℃或出现结晶则务必预热纯化树脂和GN结合液：37℃温浴2分钟)；
(3)室温下温浴3分钟，在温浴过程中至少要翻转一次；
(4)5,000rpm离心3秒；弃上清，收集沉淀；
(5)加入1ml GN结合液，振荡混匀；
(6)5,000rpm离心3秒；弃上清，收集沉淀；
(7)加入0.5ml漂洗液漂洗纯化树脂，振荡混匀；
(8)5,000rpm离心3秒；弃上清，收集沉淀；
(9)重复上面7-8步骤1次(如果纯化树脂仍然呈黄色或褐色，再次重复上面7-8步骤1次)；
(10)加入0.8ml无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱；
(11)13,000rpm离心1分钟；
(12)倒掉废液收集管中的乙醇，再次13,000rpm离心1分钟，尽量去除乙醇；
(13)将纯化柱套入1.5ml离心管中；
(14)加入100μl TE缓冲液于纯化树脂上(注意不得粘在管壁上)；
(15)室温下放置3分钟(若洗脱温度过低则在37温育两分钟)；
(16)13,000rpm离心2分钟；
(17)离心管中收集的液体即洗脱下来的基因组DNA；
(18)取2μl电泳(1％琼脂糖，120V，20分钟)检测并目测定量；
(19)置于-20℃冰箱保存。
所用试剂有：(1)UltraPureTM基因组DNA快速提取试剂盒(北京赛百胜基因技术有限公司)，(2)无水乙醇(广州市番禺力强化工厂)，(3)10％TE缓冲液：(北京赛百胜基因技术有限公司)。2、PCR扩增SCN1A的26个外显子
2、PCR扩增SCN1A的外显子：
SCN1A的外显子的引物序列和退火温度见上述的表1。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40sec；退火温度见表1；72℃延伸10min；共32个循环；72℃延伸10min。反应体系：模板4ul+dNTPs 1ul+引物3ul+10×buffer 5ul+Taq酶1ul+ddH2O 36ul＝50ul。
所用试剂有：(1)引物合成：(北京赛百胜基因技术有限公司)，(2)TaqDNA聚合酶：5u/μl(上海申能博彩生物科技有限公司)，(3)dNTP：10mM(北京赛百胜基因技术有限公司)，(4)10×Taq Buffer：(含20mmol/L MgCL2；100mmol/L Tris-盐酸，PH9.0；80mmol/L(NH4)2SO4、0.5％NP-40)(上海申能博彩生物科技有限公司)，(5)ddH2O：(广医二院分子生物实验中心)。
3、DHPLC筛查SCN1A有无突变：
(1)变性温度的确定：在网络数据库查找扩增片段的全序列，输入DHPLC的NavigatorTM软件，得到双螺旋百分比-温度曲线、温度-碱基对曲线和双螺旋百分比-碱基对曲线。根据曲线分为下列两中情况：
a、在双螺旋百分比-温度曲线中，双螺旋百分比从100％~0％的温度变化＜5℃，则可选用该软件推荐半变性温度，可以用单温度进行部分变性分析。如图1所示，所示片段则可以在60℃~62.5℃选择一个温度进行突变的检测。
b、在一些条件下，需要调整半变性温度，设置几个半变性温度。比如双螺旋-温度曲线中双螺旋百分比从100％~0％的温度变化＞5℃，或温度-碱基对曲线呈阶梯状，提示该片段有多个融解域(meltingdomain)，则应选择多个变性温度，尽量在最少的温度下使全片段碱基对的双螺旋百分比在50％～99％之间，使每一段序列均可在特定的温度下分别发生部分变性，从而避免遗漏突变，提高突变检出率。如图2所示，需要检测的片段为50bp~530bp这一段。可见双螺旋-温度曲线中双螺旋百分比从100％~0％的温度变化为52℃~62℃，温度差＞5℃，而且温度-碱基对曲线呈阶梯状(参考图3)，在这种情况下，选择单一温度很难使片段的所有部位发生部分变性，所以应根据不同节段的变性温度，分别设定温度使该部位发生解链。根据双螺旋百分比-碱基对曲线，在57.1℃时，50~120bp的双螺旋百分比在50％-99％之间；55.3℃时，120~180bp以及260bp以后的双螺旋百分比在50％-99％之间；而中间的180~260bp刚好在54.8℃时双螺旋百分比在50％-99％之间；所以在检测这一片段时选用了3个温度：57.1℃、55.3℃和54.8℃，以确保这一片段的所有区域发生了部分变性，来提高突变的检出率。(参考图4)
另外，可以在软件推荐的最高温度的基础上，进行上下浮动1度，若峰性已呈“圆钝”，温度已不能再上调，一般以0.5度或1.0度为阶梯调温。
(2)将PCR产物利用PCR机变性复性：先在95℃变性5min，然后以0.025℃/s的速度降温，直至温度降至25℃，以达到复性目的。
(3)将产物放入DHPLC的上样板上；
(4)将扩增片段的完整序列输入Navigator软件，在上述选择的温度下进行变性分析。
(5)分析色谱图，确定有无SCN1A外显子基因突变。
DHPLC流动相为以下4种：A液为0.1M TEAA (三乙氨基乙酸)，B液为0.1M TEAA 25％乙腈，C液为8％乙腈，D液为75％乙腈。由A液和B液形成梯度，C液用于上样，D液冲洗色谱柱。DHPLC色谱分析柱材料采用无孔聚苯乙烯颗粒(美国Transgenomic公司)，分析过程中的梯度是以NavigatorTM软件推算的初始梯度上样，以2％/min的速度增加B液，2％/min的速度减少A液，从而形成梯度。
4、测序证实突变形式：对DHPLC发现突变的外显子进一步通过测序证实，同时确定突变形式和分析突变位点在SCN1A中位置，与现有的突变位点进行比较。
5、确定癫痫亚型，制定治疗方案：根据上述分析结果，有针对性选择治疗药物。对有钠离子通道基因突变的癫痫患者避免使用作用于钠离子通道的药物(如：拉莫三嗪、巴比妥、卡马西平、苯妥英)，以免加重病情，尽量选用作用于突变位点以外的药物(如：苯二氮卓类、vigabatrin、tiagabine)或者有多重作用机制的药物(如：丙戊酸、托吡酯)进行抗癫痫治疗。
本发明中所用的仪器：
(1)台式高速离心机：TGL-16B型(上海安亭科学仪器厂)
(2)台式低速离心机：80-2B型(上海安亭科学仪器厂)
(3)漩涡混合器：XW-80A型(上海医科大学仪器厂)
(4)微量加样器：0.5-10μl，10-100μl，20-200μl，100-1000μl(德国Eppendorf公司)
(5)水平凝胶电泳仪：EPS-301型(北京君意东方电泳设备有限公司)
(6)紫外透射反射仪：WD-9403C型(北京六一仪器厂)
(7)凝胶成像系统：Bio-RAD Laboratories-Segrate(意大利)
(8)DNA蛋白核酸分析仪(Beckmen DU 530)
(9)DNA扩增仪：UNOII Biometra(德国)
(10)电子天平：T-200型(美国双杰兄弟(集团)有限公司)
(11)PH计：Sartorius标准PH计PB-20
(12)电热恒温水浴箱：CU420型(上海益恒实验仪器有限公司)
(13)恒温磁力搅拌器：78HW-1型(杭州仪表电机有限公司)
(14)DHPLC仪(美国Trans genomic公司)
实施例2：
本实施例中待测基因为SCN2A，将引物和退火温度按照表2操作，其他步骤同实施例1。
应用实施例1：
患者关某的临床资料：
家系情况介绍：收集患者关某的家系情况，绘制家系图(见图5)
IV2：先证者：关某，现12岁，为足月顺产，生后无特殊病史，有家族史。
因反复发作性抽搐12年来诊。患者于1993年，6个月时发热39.8℃时出现抽搐，表现为全身强直-阵挛性发作(Generalizedtonic-clonic seizure，GTCS)，持续1～2分钟自然缓解，脑电图检查提示左中央、顶散发尖波及阵发高幅7～8Hz慢波。于1岁左右，仍有发热时上述性质的抽搐共4次，均表现为GTCS发作，于4岁时出现一次无热惊厥，直至7岁时多次出现无热惊厥，且出现频繁头痛，伴可疑意识丧失。表现为GTCS发作或单纯部分性发作继发GTCS发作。服用德巴金治疗疗效不显著。加用拉莫三嗪25mg/d至50mg/d后症状明显加重，发作次数增多，由1～4次/年增多至10余次/年。故将拉莫三嗪减量至停用，改为VPA1.0/d和得理多0.2/d，发作减少，但未完全控制。2004年8月6日再次加用拉莫三嗪至75mg/d时，再次出现发作明显增多，故停用LTG。04年12月起用妥泰和德巴金联合治疗后发作基本控制。神经系统检查：患者较多动，余神经系统未见异常。临床诊断考虑为：癫痫(GEFS+未分型，病因未明)。
II2：30余岁，患21三体综合征。
III14：38岁，2～3岁时于发热40℃时出现GTCS发作，持续1～2分钟，此后再未发作。
IV9：24岁，2～3岁出现GTCS发作，持续1～2分钟，此后再未发作。
临床存在的问题：1)该患者的临床诊断和病因不明确；2)该患者整个病程中从临床上判断发作形式为GTCS、单纯部分性发作，但病程中，曾选用多种抗癫痫药效果欠佳，尤其选用拉莫三嗪治疗时使病情反复加重，具体原因不明。
相关基因SCN1A的检测：
1、DNA抽提：抽取患者的外周血，用基因组DNA纯化试剂盒(北京赛百胜基因技术有限公司)提取DNA。
2、PCR扩增：利用PCR技术扩增患者的SCN1A所有26个外显子，其中SCN1A的第15号外显子的扩增引物为：上游引物：ACCATTTCTAGGTAAAGCTC，下游引物：TGCATATCTTAAGTGGGTAC，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40sec；50℃退火30sec；72延伸10min；共32个循环；72℃延伸10min。
3、琼脂糖凝胶电泳：将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(见图6)，证实SCN1A的15号外显子的PCR产物为一458bp的片段：
4、DHPLC筛选突变：经过用变性高效液相(DHPLC)进行PCR产物的突变检测。参考图7，患者关某的SCN1A的15号外显子PCR扩增产物的DHPLC结果：可见在变性温度为50℃时，色谱图上并无双峰出现；在变性温度为60.5 ℃时，色谱图的上升支出现挫顿；将变性温度继续升高至61℃，色谱图出现明显的双峰，证明其SCN1A的15号外显子有一突变。
5.测序证实突变：进一步经过测序证实该患者的SCN1A的15号外显子的第248个碱基发生点突变，由G突变为A(见图8)。该突变导致SCN1A通道蛋白第496个氨基酸由精氨酸变为组氨酸，基因突变的序列可见序列1。
病因分析：病因考虑为SCN1A的15号外显子突变，导致钠离子通道的异常。从病程中来看，该患者临床发作形式为GTCS，但根据经验选择对GTCS发作有效的药物拉莫三嗪后，反而发作明显增多，原因在于该药作用于钠离子通道，作用机制单一，由于该患者的SCN1A的基因突变导致对该药的反应异常，使该药作用异常或失去治疗作用。所以根据上述分析，应选用其他作用机制或有多重作用机制的药物进行治疗。
诊断结果：癫痫(全面性癫痫伴热性惊厥附加症2型)。
治疗选药情况：避免使用作用于SCN1A的治疗药物，尤其应注意避免使用拉莫三嗪，以免加重病情。该患者治疗应选用作用于钠通道以外或具有多重作用机制的药物，故选用德巴金(丙戊酸)和妥泰(托吡酯)治疗后痫性发作基本控制，治疗效果良好。
应用实施例2：
用同样的检测方法对另一个病人进行检测，又发现SCN1A的26号外显子第443个碱基由T突变为A，即发生T443A点突变，导致1765位的氨基酸发生变化，由苯甲氨酸变为亮氨酸。该结果同样可应用于临床治疗抗癫痫药物的选择。
序列表
<110>广州医学院第二附属医院
<120>钠离子通道SCN1A基因突变及基因突变检测方法和用途
<160>118
<210>1
<211>357
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>mutation
<222>(248)
<223>n＝a
<400>1
ctgcgagttt tcaagttggc aaaatcttgg ccaacgttaa atatgctaat aaagatcatc 60
ggcaattccg tgggggctct gggaaattta accctcgtct tggccatcat cgtcttcatt 120
tttgccgtgg tcggcatgca gctctttggt aaaagctaca aagattgtgt ctgcaagatc 180
gccagtgatt gtcaactccc acgctggcac atgaatgact tcttccactc cttcctgatt 240
gtgttccncg tgctgtgtgg ggagtggata gagaccatgt gggactgtat ggaggttgct 300
ggtcaagcca tgtgccttac tgtcttcatg atggtcatgg tgattggaaa cctagtg 357
<210>2
<211>3260
<212>DNA
<213>人(Human)
<220>
<221>mutation
<222>(443)
<223>n＝a
<400>2
gtatgtttct tgccgagctg atagaaaagt atttcgtgtc ccctaccctg ttccgagtga 60
tccgtcttgc taggattggc cgaatcctac gtctgatcaa aggagcaaag gggatccgca 120
cgctgctctt tgctttgatg atgtcccttc ctgcgttgtt taacatcggc ctcctactct 180
tcctagtcat gttcatctac gccatctttg ggatgtccaa ctttgcctat gttaagaggg 240
aagttgggat cgatgacatg ttcaactttg agacctttgg caacagcatg atctgcctat 300
tccaaattac aacctctgct ggctgggatg gattgctagc acccattctc aacagtaagc 360
cacccgactg tgaccctaat aaagttaacc ctggaagctc agttaaggga gactgtggga 420
acccatctgt tggaattttc ttntttgtca gttacatcat catatccttc ctggttgtgg 480
tgaacatgta catcgcggtc atcctggaga acttcagtgt tgctactgaa gaaagtgcag 540
agcctctgag tgaggatgac tttgagatgt tctatgaggt ttgggagaag tttgatcccg 600
atgcaactca gttcatggaa tttgaaaaat tatctcagtt tgcagctgcg cttgaaccgc 660
ctctcaatct gccacaacca aacaaactcc agctcattgc catggatttg cccatggtga 720
gtggtgaccg gatccactgt cttgatatct tatttgcttt tacaaagcgg gttctaggag 780
agagtggaga gatggatgct ctacgaatac agatggaaga gcgattcatg gcttccaatc 840
cttccaaggt ctcctatcag ccaatcacta ctactttaaa acgaaaacaa gaggaagtat 900
ctgctgtcat tattcagcgt gcttacagac gccacctttt aaagcgaact gtaaaacaag 960
cttcctttac gtacaataaa aacaaaatca aaggtggggc taatcttctt ataaaagaag 1020
acatgataat tgacagaata aatgaaaact ctattacaga aaaaactgat ctgaccatgt 1080
ccactgcagc ttgtccacct tcctatgacc gggtgacaaa gccaattgtg gaaaaacatg 1140
agcaagaagg caaagatgaa aaagccaaag ggaaataaat gaaaataaat aaaaataatt 1200
gggtgacaaa ttgtttacag cctgtgaagg tgatgtattt ttatcaacag gactccttta 1260
ggaggtcaat gccaaactga ctgtttttac acaaatctcc ttaaggtcag tgcctacaat 1320
aagacagtga ccccttgtca gcaaactgtg actctgtgta aaggggagat gaccttgaca 1380
ggaggttact gttctcacta ccagctgaca ctgctgaaga taagatgcac aatggctagt 1440
cagactgtag ggaccagttt caaggggtgc aaacctgtga ttttggggtt gtttaacatg 1500
aaacacttta gtgtagtaat tgtatccact gtttgcattt caactgccac atttgtcaca 1560
tttttatgga atctgttagt ggattcatct ttttgttaat ccatgtgttt attatatgtg 1620
actatttttg taaacgaagt ttctgttgag aaataggcta aggacctcta taacaggtat 1680
gccacctggg gggtatggca accacatggc cctcccagct acacaaagtc gtggtttgca 1740
tgagggcatg ctgcacttag agatcatgca tgagaaaaag tcacaagaaa aacaaattct 1800
taaatttcac catatttctg ggaggggtaa ttgggtgata agtggaggtg ctttgttgat 1860
cttgttttgc gaaatccagc ccctagacca agtagattat ttgtgggtag gccagtaaat 1920
cttagcaggt gcaaacttca ttcaaatgtt tggagtcata aatgttatgt ttctttttgt 1980
tgtattaaaa aaaaaacctg aatagtgaat attgcccctc accctccacc gccagaagac 2040
tgaattgacc aaaattactc tttataaatt tctgcttttt cctgcacttt gtttagccat 2100
cttcggctct cagcaaggtt gacactgtat atgttaatga aatgctattt attatgtaaa 2160
tagtcatttt accctgtggt gcacgtttga gcaaacaaat aatgacctaa gcacagtatt 2220
tattgcatca aatatgtacc acaagaaatg tagagtgcaa gctttacaca ggtaataaaa 2280
tgtattctgt accatttata gatagtttgg atgctatcaa tgcatgttta tattaccatg 2340
ctgctgtatc tggtttctct cactgctcag aatctcattt atgagaaacc atatgtcagt 2400
ggtaaagtca aggaaattgt tcaacagatc tcatttattt aagtcattaa gcaatagttt 2460
gcagcacttt aacagctttt tggttatttt tacattttaa gtggataaca tatggtatat 2520
agccagactg tacagacatg tttaaaaaaa cacactgctt aacctattaa atatgtgttt 2580
agaattttat aagcaaatat aaatactgta aaaagtcact ttattttatt tttcagcatt 2640
atgtacataa atatgaagag gaaattatct tcaggttgat atcacaatca cttttcttac 2700
tttctgtcca tagtactttt tcatgaaaga aatttgctaa ataagacatg aaaacaagac 2760
tgggtagttg tagatttctg ctttttaaat tacatttgct aattttagat tatttcacaa 2820
ttttaaggag caaaataggt tcacgattca tatccaaatt atgctttgca attggaaaag 2880
ggtttaaaat tttatttata tttctggtag tacctgcact aactgaattg aaggtagtgc 2940
ttatgttatt tttgttcttt ttttctgact tcggtttatg ttttcatttc tttggagtaa 3000
tgctgctcta gattgttcta aatagaatgt gggcttcata attttttttt ccacaaaaac 3060
agagtagtca acttatatag tcaattacat caggacattt tgtgtttctt acagaagcaa 3120
accataggct cctcttttcc ttaaaactac ttagataaac tgtattcgtg aactgcatgc 3180
tggaaaatgc tactattatg ctaaataatg ctaaccaaca tttaaaatgt gcaaaactaa 3240
taaagattac attttttatt 3260
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子1的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon1的PCR扩增。
<400>3
aaaatgtgca ggatgacaag 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子1的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon1的PCR扩增。
<400>4
gatatagtag gggtccaggt 20
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子2的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon2的PCR扩增。
<400>5
cttctatgttgt gttcctgt 18
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子2的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon2的PCR扩增。
<400>6
agtgcttaca gatcatgtac 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子3的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon3的PCR扩增.
<400>7
ctaagctgca gtttgggctt 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子3的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon3的PCR扩增
<400>8
gccaatgagc attgtcctct 20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子4的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon4的PCR扩增.
<400>9
ctattccact gatggagtga 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子4的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon4的PCR扩增
<400>10
tggaagagtg gcatatgtga 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子5的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon5的PCR扩增。
<400>11
gtgtttgtgt gtgaactccc 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子5的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon5的PCR扩增。
<400>12
aatcacatga tgggtccgtc 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子6的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon6的PCR扩增。
<400>13
ttcacacgtg ttaagtcttc 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子6的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon6的PCR扩增。
<400>14
atccagcccc tcaagtattt 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子7的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon7的PCR扩增。
<400>15
gaacctgacc ttcctgttct 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子7的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon7的PCR扩增。
<400>16
tagttggctg ttatcttcag 20
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子8的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon8的PCR扩增。
<400>17
cttttacccc acttgcag 18
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子8的序列而设计下游引物，以用作SCN1Aexon8的PCR扩增。
<400>18
aaatggagag tgtggctc 18
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子9的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon9的PCR扩增。
<400>19
gttgaagcca ccacttagtg 20
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子9的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon9的PCR扩增。
<400>18
ataaaaggtc agtgccat 18
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCNtA外显子10的序列而设计上游引物，以用作SCN1Aexon10的PCR扩增。
<400>21
gtctcttcag gtgctatgtt 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子10的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon10的PCR扩增。
<400>22
taaactcagc agtgccatac 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子11的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon11的PCR扩增。
<400>23
tgctgaaatc tccttctaca 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子11的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon11的PCR扩增。
<400>24
gccatgcctg aactatttaa 20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子12的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon12的PCR扩增。
<400>25
actgtgtcac catttggttg 20
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子12的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon12的PCR扩增。
<400>26
atgcactatt cccaactcac 20
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子13的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon13的PCR扩增。
<400>27
gtataccttt tggtggttct 20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子13的序列而设计下游引物，以用作SCN1Aexon13的PCR扩增。
<400>28
tggttgaaag actgctatac 20
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子14的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon14的PCR扩增。
<400>29
gtgggaaaat agcataagca 20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子14的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon14的PCR扩增。
<400>30
aaccctgatt gttagaaagg 20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子15的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon15的PCR扩增。
<400>31
accatttcta ggtaaagctc 20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子15的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon15的PCR扩增。
<400>32
tgcatatctt aagtgggtac 20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子16的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon16的PCR扩增。
<400>33
ctcttccctacattggtgta 20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子16的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon16的PCR扩增。
<400>34
cccacacctatagaatctta 20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子17的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon17的PCR扩增。
<400>35
tctatgtcca tctcacttac 20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子17的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon17的PCR扩增。
<400>36
aagctgcact ccaaatgaaa 20
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子18的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon18的PCR扩增。
<400>37
tatttcaaca ctttctgcagg 21
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子18的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon18的PCR扩增。
<400>38
gtgctgtatc accttttctt 20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子19的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon19的PCR扩增。
<400>39
cctcctattc caatgaaatg 20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子19的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon19的PCR扩增。
<400>40
agctaccttgaacagagaca 20
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子20的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon20的PCR扩增。
<400>41
attatttttg tgtgtgcagg 20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子20的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon20的PCR扩增。
<400>42
gctatataca atacttcagg 20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子21的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon21的PCR扩增。
<400>43
ccagagatta ctaggggaat 20
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子21的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon21的PCR扩增。
<400>44
ccatctgggc tcataaactt 20
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子22的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon22的PCR扩增。
<400>45
tgcatgtcct tcttaatagg 20
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子22的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon22的PCR扩增。
<400>46
gtcgtttatg ctttattcga 20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子23的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon23的PCR扩增。
<400>47
tacaaaatat tcccctttgg 20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子23的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon23的PCR扩增。
<400>48
tctcagtggg agagaaaata 20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子24的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon24的PCR扩增。
<400>49
ggacacagtt ttaaccagtt 20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子24的序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon24的PCR扩增。
<400>50
cccccatatc atttgatact 20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子25的序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon25的PCR扩增。
<400>51
aatgcacatg agaaaactcc 20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子25的序列而设计下游引物，以用作SCN1Aexon25的PCR扩增。
<400>52
ctgggatgat cttgaatcta 20
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子26的51～362bp序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon26的这部分的PCR扩增。
<400>53
tttcgtgtcc cctaccctgt 20
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子26的51～362bp序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon26的这部分的PCR扩增。
<400>54
ttattagggt cacagtcggg 20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子26的360～674bp序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon26的这部分的PCR扩增。
<400>55
acccattctc aacagtaagc 20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子26的360～674bp序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon26的这部分的PCR扩增。
<400>56
agctggagtt tgtttggttg 20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子26的672～987bp序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon26的这部分的PCR扩增。
<400>57
tgaaccgcct ctcaatctgc 20
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子26的672～987bp序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon26的这部分的PCR扩增。
<400>58
agattagccc cacctttga 19
<210>59
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子26的1010～1298bp序列而设计上游引物，以用作SCN1A exon26的这部分的PCR扩增。
<400>59
ggtggggcta atcttctt 18
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN1A外显子26的1010～1298b序列而设计下游引物，以用作SCN1A exon26的这部分的PCR扩增。
<400>60
tgtaggcact gaccttaagg 20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子2的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon2的PCR扩增。
<400>61
tccctccctg tttctgtagc 20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子2的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon2的PCR扩增。
<400>62
caccatcatc cctgggacta 20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子3的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon3的PCR扩增。
<400>63
acactatttt acagggcaat 20
<210>64
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子3的序列而设计下游引物，以用作SCN2Aexon3的PCR扩增。
<400>64
agtgacgatt tgaaaaagga t 21
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子4和5的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon4和Exon5的PCR扩增。
<400>65
ggcatggtag tgcataaaag 20
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子4和5的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon4和Exon5的PCR扩增。
<400>66
atgaaacata aagggaggtc 20
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子6的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon6的PCR扩增。
<400>67
gcttggctat tttctctcag 20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子6的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon6的PCR扩增。
<400>68
cagtgattta ctcttccagg 20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子7的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon7的PCR扩增。
<400>69
tgtgtttgtg tgtgaacccc 20
<210>70
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子7的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon7的PCR扩增。
<400>70
ctcggtgttt aacctagctc 20
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子8的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon8的PCR扩增。
<400>71
cccccttctg attttgtttg 20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子8的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon8的PCR扩增。
<400>72
gtctaagtca cttgattcac 20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子9的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon9的PCR扩增。
<400>73
gctctgcttt gtggcaacag 20
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子9的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon9的PCR扩增。
<400>74
gtgagtggga ctggatgagt20
<210>75
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子10的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon10的PCR扩增。
<400>75
tcctttcttt cctctaacct 20
<210>76
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子10的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon10的PCR扩增。
<400>76
tctcttgagt tcggtgtttt 20
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子11的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon11的PCR扩增。
<400>77
ctttgacacc tttagttggg 20
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子11的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon11的PCR扩增。
<400>78
tcatgtacgt tttcccagca 20
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子12的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon12的PCR扩增。
<400>79
tactttgcgc ccttctaggc 20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子12的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon12的PCR扩增。
<400>80
aggtggaagg cggttttctc 20
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子13的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon13的PCR扩增。
<400>81
atgccagctc ttaactctct 20
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子13的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon13的PCR扩增。
<400>82
ccagtcacaa ctctcttcac 20
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子14的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon14的PCR扩增。
<400>83
ttgggctttg ctgctttcaa 20
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子14的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon14的PCR扩增。
<400>84
gtgacgcagg acttttaaca 20
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<2223>根据SCN2A外显子15的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon15的PCR扩增。
<400>85
gtaagcagtt ttcatgagga 20
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子15的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon15的PCR扩增。
<400>86
aaactctcag tgaggcttac 20
<210>87
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子16的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon16的PCR扩增。
<400>87
cgtgtttcaa gagtatttgc 20
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子16的序列而设计下游引物，以用作SCN2Aexon16的PCR扩增。
<400>88
atgatgggaa atcttgccat 20
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子17的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon17的PCR扩增。
<400>89
gagcattaac actgttcttg 20
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子17的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon17的PCR扩增。
<400>90
gaggaaaatg tttttgctac 20
<210>91
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子18的1～262bp序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon18这部分序列的PCR扩增。
<400>91
gcaatagaat gttttgatca cc 22
<210>92
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子18的1～262bp序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon18这部分序列的PCR扩增。
<400>92
tttct atggt ggtatggttg g 21
<210>93
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子18的159～480bp序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon18这部分序列的PCR扩增。
<400>93
gaaagccttt gttaggaagc ag 22
<210>94
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子18的159～480bp序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon18这部分序列的PCR扩增。
<400>94
aacaggaagg aaacacgcaa 20
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子19的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon19的PCR扩增。
<400>95
tgtgtttttt tgtgggattg 20
<210>96
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子19的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon19的PCR扩增。
<400>96
ggatactcaa gaccacatat 20
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子20的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon20的PCR扩增。
<400>97
cccaccaaca caaatatacc 20
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子20的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon20的PCR扩增。
<400>98
tggatcatgc atcacctacc 20
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子21的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon21的PCR扩增。
<400>99
gcacctgata agagcttgca20
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子21的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon21的PCR扩增。
<400>100
cagcaaagtg cagcatactc 20
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子22的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon22的PCR扩增。
<400>101
ggctgaactg tgtagacatt 20
<210>102
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子22的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon22的PCR扩增。
<400>102
ctgacaaact ctaaggcatt 20
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子23的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon23的PCR扩增。
<400>103
ttccttctca tcctgtgcca20
<210>104
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子23的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon23的PCR扩增。
<400>104
ggtggatatc tcattatgag20
<210>105
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子24的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon24的PCR扩增。
<400>105
gcctgtattg aatacatgtc 20
<210>106
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子24的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon24的PCR扩增。
<400>106
ttccctctaa ctagacttac 20
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子25的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon25的PCR扩增。
<400>107
aagcatgtga gatttgaagg 20
<210>108
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子25的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon25的PCR扩增。
<400>108
ttcagagcaa ggatgaagtt 20
<210>109
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子26的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon26的PCR扩增。
<400>109
tagccagcaa agaacacaat 20
<210>110
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子26的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon26的PCR扩增。
<400>110
ctgtgaaacg gttaggtaat 20
<210>111
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子27的序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon27的PCR扩增。
<400>111
caatcactgg ttttgcaagg 20
<210>112
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子27的序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon27的PCR扩增。
<400>112
ggagtttggg atgaatgaga 20
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子28的101～600bp序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon28这部分序列的PCR扩增。
<400>113
aggagcaaag gggatccgca 20
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子28的101～600bp序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon28这部分序列的PCR扩增。
<400>114
cgggatcaaa cttctcccaa 20
<210>115
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子28的601～1057bp序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon28这部分序列的PCR扩增。
<400>115
gagcctctga gtgaggatga 20
<210>116
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子28的601～1057bp序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon28这部分序列的PCR扩增。
<400>116
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<210>117
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子28的936～1401bp序列而设计上游引物，以用作SCN2A exon28这部分序列的PCR扩增。
<400>117
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<210>118
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据SCN2A外显子28的936～1401bp序列而设计下游引物，以用作SCN2A exon28这部分序列的PCR扩增。
<400>118
agtttgctga ccagaggtct 20
Claims (7)
1.钠离子通道SCN1A基因突变，其特征是：SCN1A的15号外显子第248个碱基由G突变为A，即发生G248A点突变；和SCN1A的26号外显子第443个碱基由T突变为A，即发生T443A点突变。
2.钠离子通道基因突变的检测方法，其特征是：包括如下步骤：
①抽提DNA样本；
②根据SCN1A或SCN2A基因外显子序列设计引物；
③PCR扩增SCN1A或SCN2A基因外显子；
④在一个或多个变性温度下，利用变性高效液相色谱分析上述产物；
⑤对上述分析的阳性样本进行基因测序。
3.根据权利要求2所述的钠离子通道基因突变的检测方法，其特征是：设计的SCN1A基因外显子1～25的上游引物分别为序列3～51中的奇数序列，其外显子1～25的下游引物分别为序列4～52中的偶数序列，其外显子26的51～362bp上游引物为序列53，下游引物序列为序列54；其外显子26的360～674bp上游引物为序列55，下游引物序列为序列56；其外显子26的672～987bp上游引物为序列57，下游引物序列为序列58；其外显子26的1010～1298bp上游引物为序列59，下游引物序列为序列60。
4.根据权利要求2所述的钠离子通道基因突变的检测方法，其特征是：设计的SCN2A基因外显子2和3的上游引物分别为序列61和63，其下游引物分别为序列62和64；外显子4和5的上游引物均为序列65，下游引物序列均为66；外显子6～17的上游引物分别为序列67～89中的奇数序列，外显子6～17的下游引物分别为序列68～90中的偶数序列；外显子18的1～262bp上游引物为序列91，下游引物为序列92；外显子18的159～480bp上游引物为序列93，下游引物为序列94；外显子19～27的上游引物为序列95～111中的奇数序列，外显子19～27的下游引物为序列96～112中的偶数序列；外显子28的101～600bp上游引物为序列113，下游引物为114；外显子28的601～1057bp上游引物为序列115，下游引物为116；外显子28的936～1401bp上游引物为序列117，下游引物为118。
5.根据权利要求2所述的钠离子通道基因突变的检测方法，其特征是：在变性高效液相色谱分析中，根据双螺旋百分比-温度曲线和温度-碱基对曲线，确定融解域的个数，来选择相应数量的变性温度，使片段所有融解域的碱基对发生部分变性。
6.根据权利要求5所述的钠离子通道基因突变的检测方法，其特征是：变性温度的确定分如下情况：
a.在双螺旋百分比-温度曲线中，双螺旋百分比从100％～0％的温度变化小于5℃，融解域只有一个，则选用单温度进行部分变性分析；
b、双螺旋百分比-温度曲线中双螺旋百分比从100％～0％的温度变化大于或等于5℃，或温度-碱基对曲线呈阶梯状，融解域有多个，则选择多个变性温度，根据所选温度下的双螺旋百分比-碱基对曲线，使每一个融解域分别发生部分变性。
7.根据权利要求1所述的钠离子通道基因突变应用于临床抗癫痫药物的筛选。
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2005
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