CN107828889B

CN107828889B - 一种用于hla-drb1*03基因定性检测的pcr扩增引物及试剂盒

Info

Publication number: CN107828889B
Application number: CN201711116051.0A
Authority: CN
Inventors: 倪鑫; 王国亮; 邰隽; 张�杰; 吴逊尧; 桂晋刚; 赵靖; 王�华; 王桂香; 王生才; 唐力行
Original assignee: Beijing Childrens Hospital
Current assignee: Beijing Childrens Hospital
Priority date: 2017-11-13
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2037-11-13
Also published as: CN107828889A

Abstract

本发明涉及一种可用于临床检测的基因检测方法及试剂盒，本方法针对HLA‑DRB1*03低分辨型基因，能够实现准确、快速、简便、廉价的检测，可为复发性喉乳头瘤等临床相关疾病的治疗及预后提供重要信息。

Description

一种用于HLA-DRB1*03基因定性检测的PCR扩增引物及试剂盒

技术领域

本发明属于基因诊断领域，涉及一种基因检测的方法及试剂盒，以及在临床相关疾病中的应用。

技术背景

复发性呼吸道乳头状瘤病(recurrent respiratory papilloma，RRP)是喉部上皮组织最常见的良性肿瘤，主要病原为人乳头状瘤病毒6和11亚型。反复切除是该病主要的治疗手段，但不能阻止复发。在疾病活动期，多数患者可能每2-3个月就需要接受一次手术，有的患儿一生甚至要接受上百次手术，为患者及家庭带来了沉重的负担。另外，RRP的频繁复发，增加了病灶向下呼吸道播散的可能，进而使疾病变得更具侵袭性。

目前尚没有有效的治愈RRP的手段，但已先后开发出多种药物用于辅助治疗，在降低手术次数、减少手术间隔时间等方面表现了较好的效果，但也存在一定的不良反应。目前尚没有有效的可预测RRP患者复发次数及复发间隔的指标，难以满足临床需要。由于临床医师不能预先判定疾病的复发频度以及侵袭性，以及对药物不良反应的顾虑，很难决定针对某个患者是否采用药物辅助治疗。因此，准确并尽早判定患者的病情，对易复发患者及难治性患者及时给予药物辅助治疗以降低复发次数和恶变风险，而对复发次数较少的患者仅采用单纯的手术治疗以避免药物治疗的不良反应，具有重要的临床价值和社会意义。

国外多个针对高加索人和美国黑人的研究表明，RRP的发病及严重程度与HLA-DRB1*03 型存在高度的相关性。首先，HLA-DRB1*03在RRP患者中的频率显著高于对照人群中的频率；其次，重症RRP患者的HLA-DRB1*03基因频率显著高于轻症RRP患者。本发明人所在课题组的研究也表明，我国RRP患者同样表现显著高的HLA-DRB1*03型(03:01亚型) 频率，而且HLA-DRB1*03亚型与RRP的严重程度具有显著的正相关性。因此，通过检测 RRP患者是否具有HLA-DRB1*03亚型基因，可提前预测RRP患者的疾病严重程度，并可用于RRP的指导治疗，具有重要的临床价值。而目前临床尚无开展该项检测，截止本专利申请日尚未检索到类似的专利申请。

HLA(Human leukocyte antigen,人类白细胞抗原)是人类的主要组织相容性系统，在细胞免疫中发挥重要作用。HLA基因复合体位于人类第6号染色体，具有高度的多态性，是目前所知人体最复杂的多态系统。针对HLA的基因分型已广泛应用于器官和细胞移植、疾病关联研究等。根据序列的差异大小，HLA各基因可分为不同的型和亚型。根据分辨率的不同， HLA各基因的分型还可采用高分辨率分型和低分辨率分型两种分辨率。具有相同低分辨率型的特定HLA分子具有相同的空间结构和高度相似的氨基酸序列，而具有相同高分辨率亚型的特定HLA分子具有相同的空间结构和完全相同的氨基酸序列。目前针对HLA基因的分型方法主要包括PCR-SSP(PCR序列特异性引物法)、PCR-SSOP(PCR序列特异性寡核苷酸探针法)、测序法和流式检测法等。这些方法均是针对全部或特定HLA基因的所有可能型或亚型的全面性检测方法。如果基于临床特定疾病的需要，仅仅检测受试者是否为某种特定HLA基因的亚型(例如单纯检测受试者是否为HLA-DRB1*03亚型)，上述方法显得昂贵而费时，难以满足临床的需求。

根据国际免疫遗传学数据库(the international ImMunoGeneTics database,IMGT)2016年 10月14日查询的结果，HLA-DRB1基因共有13个低分辨型，HLA-DRB1*03低分辨型又可进一步分为136个高分辨亚型。根据中华骨髓库2016年发布的常见且确认的HLA等位基因表 (common alleles and well documented alleles,CWD)CWD 2.2版本，基于84万余份中国人的 HLA数据，HLA-DRB1*03低分辨型中，仅仅包括6个高分辨亚型，其中03:01亚型(85936频次，占总体的5.11381％)，其它5个亚型有03:05、03:06、03:08、03:11和03:27亚型(合计113 频次，占总体的0.00674％)。即03:01亚型占我国所有HLA-DRB1*03低分辨型的99.87％。因此，单纯检测我国人群的HLA-DRB1*03低分辨型是否阳性，即可准确预测我国RRP患者的预后并用于指导治疗。即使对HLA-DRB1*03低分辨型阳性个体进一步测序分析其高分辨亚型，其总体成本也明显低于现有的对HLA-DRB1位点各种可能的亚型进行全面检测的成本。

目前，尚无针对HLA-DRB1基因的特定低分辨型(包括HLA-DRB1*03低分辨型)或特定高分辨型(包括HLA-DRB1*03:01高分辨型)的检测方法。一个重要的原因就是HLA基因的高度多态性，使针对特定HLA-DRB1基因型的直接检测显得较为困难。根据IMGT数据库检索的结果，HLA-DRB1基因包含13个低分辨亚型，并可进一步分为136个高分辨型。如此众多的基因型，其差异仅仅局限于该基因的第二外显子区(含270个碱基)。各型的DNA序列之间仅有数个碱基的差异，而且差异的碱基分布也较为分散。因此，针对HLA-DRB1*03:01基因型，设计特异性的PCR扩增引物，具有较大的难度。本发明一方面根据我国人群HLA-DRB1*03亚型的组成特点，并在仔细分析HLA-DRB1各亚型基因序列差异的基础上，通过大量的前期实验，成功的实现了用简单PCR方法对受检者HLA-DRB1*03亚型的定性检测，并可近似判定我国人群HLA-DRB1基因的高分辨亚型。

本发明设计了特异性针对HLA-DRB1*03低分辨率亚型的PCR引物，采用常规PCR的方法，可准确、快速、简便、廉价的检测待测标本是否具有HLA-DRB1*03亚型基因，可用于RRP等疾病的预后和指导治疗。

参考文献：

1.复发性呼吸道乳头状瘤辅助治疗新进展.中国眼耳鼻喉科杂志,2015；15(4):294‐297.

2.HLA class II polymorphisms and susceptibility to recurrentrespiratory papillomatosis. J Virol 2003；77:1927-39.

3.HLA-DQ alleles in white and African American patients withjuvenile-onset recurrent respiratory papillomatosis.Arch Otolaryngol HeadNeck Surg 2003；129:1221-4.

4.HLA alleles,IFN-gamma responses to HPV-11E6,and disease severity inpatients with recurrent respiratory papillomatosis.Hum Immunol.2004；65(8):773-82.

5.中国常见及确认的HLA等位基因表(CWD)2.2版本.中华骨髓库CWD表编撰组.2016年2月15日.

发明内容

本发明目的是针对HLA-DRB1基因的03低分辨型，提供一种准确、快速、简便、廉价的检测方法和试剂盒，可用于RRP等疾病的预后和指导治疗。

从欧洲IMGT网站(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/index.html)查询分析HLA-DRB1基因各型及亚型的序列信息。由于HLA-DRB1基因的多态性主要集中于第二外显子，发明人针对该区域，设计了可特异性扩增03低分辨型的引物序列(SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2)，同时在序列保守区设计了可扩增HLA-DRB1基因各型及亚型的引物序列(SEQ IDNo.3和SEQ ID No. 4)作为阳性对照。

采用上述发明人设计的HLA-DRB1*03低分辨型的特异性引物以及HLA-DRB1基因阳性对照引物，应用常规的PCR方法，可准确检测出被检样品是否为HLA-DRB1*03低分辨型阳性。较现有的全面检测的方法准确、快速、简便、廉价。

同时，本发明还提供了一种用于HLA-DRB1*03低分辨型定性检测的试剂盒，含有上述发明人设计的引物(SEQ ID No.1至SEQ ID No.4)。该试剂盒还包括：缓冲液(buffer)，镁离子(Mg²⁺)，dNTP和Taq酶；所述Taq酶优选为Taq DNA Polymerase(天根生化科技(北京) 有限公司，ET-101)。

本发明还提供了一种SEQ ID No.1-2或SEQ ID No.1-4所述PCR扩增引物在制备HLA-DRB1*03基因定性检测制剂或产品中的应用。所述制剂或产品可应用于复发性喉乳头瘤等疾病的预后、风险分层以及指导治疗，同时也可应用于非疾病的诊断或治疗目的的基因检测方法。

在优选的技术方案中，应用本发明试剂盒进行PCR扩增反应的条件为：

1. 95℃5分钟；

2. 94℃30秒→59.5℃30秒→72℃30秒(重复30个循环)

3. 72℃5分钟

4. 4℃保持。

本发明的原理：基于HLA-DRB1基因的多态性(13个低分辨型)，设计特异性针对DRB1*03 低分辨型的引物，实现对HLA-DRB1*03低分辨型的定性检测。在我国人群中，HLA-DRB1*03 低分辨型的99.87％为03:01高分辨亚型，DRB1*03低分辨型的定性检测结果可近似的认同为 03:01高分辨亚型的检测结果。

本发明与现有技术相比具有下述优点：

1.由于本发明HLA-DRB1*03低分辨型特异性引物以及检测条件的优化组合，可准确检测特定个体是否为HLA-DRB1*03低分辨型阳性；

2.本发明只针对HLA-DRB1*03低分辨型基因的第二外显子进行特异性扩增，检测用引物数量小，操作简便，准确性和灵敏性高；

3.本发明只需进行常规的PCR反应，无需进行目前其它HLA分型试剂盒在PCR反应基础上还必须进行的酶切或测序反应，检测时间明显减少；

4.本发明采用较少的引物组合进行HLA-DRB1*03低分辨型的定性检测，且引物为自行设计，较目前其它HLA分型试剂盒所需的费用更低。

总结：与目前已有的方法相比，本发明的方法和试剂盒能够准确、快速、简便、廉价的完成受试者HLA-DRB1*03低分辨型的定性检测，在包括RRP等疾病在内的临床相关疾病的预后和指导治疗等方面具有较大的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。应当注意，实施例中未详细说明的常规条件和方法，均按照所属领域人员常规采用的实验条件和方法，或者按照试剂说明书建议的条件和步骤进行。

实施例1：

采用本发明所述引物，对人血样进行HLA-DRB1*03低分辨型的定性检测。具体步骤如下：

1)提取外周血基因组DNA

收集6例(样品编号14、15、19、21、22、23)经测序法检测已知HLA-DRB1基因分型(DRB1*03低分辨型阳性3例、阴性3例)的志愿者的外周血各1毫升，采用Promega公司血液基因组DNA抽提试剂盒，并按照试剂盒操作说明书进行抽提。

2)PCR扩增

分别使用不同的引物对步骤1)抽提的DNA进行PCR扩增反应。使用SEQ ID No.1(GTT TCT TGG AGT ACT CTA CGT CTG)和SEQ ID No.2(TCC ACC CGG CCC CGC TTC TG)作为HLA-DRB1*03低分辨型定性引物对，SEQ ID No.3(TTC TTC AAT GGG ACG GAG CG) 和SEQID No.4(GGT CCT TCT GGC TGT TCC AG)作为HLA-DRB1基因阳性对照的引物对。所述PCR扩增反应的反应体系和扩增条件如下：

所述PCR反应体系为50μl，其组成如下表所示：

其中，10×扩增缓冲液、Mg²⁺(25mM)、dNTPs(10mM)、Taq DNA聚合酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

所述PCR扩增条件为：

1. 95℃5分钟；

2. 94℃30秒→59.5℃30秒→72℃30秒(重复30个循环)

3. 72℃5分钟

4. 4℃保持。

扩增所得PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图如附图1所示。结果表明本发明设计的 HLA-DRB1*03低分辨型定性引物和HLA-DRB1基因阳性对照引物均可准确扩增出相应的目的条带；检测结果(HLA-DRB1*03低分辨型定性结果)与受试者经测序法测定的结果(对应的HLA-DRB1*03低分辨型结果)一致。

实施例2：

采用本发明所述引物，对RRP患者行HLA-DRB1*03低分辨型定性检测，并进一步行测序分析。具体步骤如下：

选取20例RRP患者，采用实施例1所述的方法，抽提受试者外周血基因组DNA后行PCR扩增反应，并对扩增反应的结果行2％琼脂糖凝胶电泳，分析各受试者的HLA-DRB1*03低分辨型定性结果。同时，对HLA-DRB1*03低分辨型定性阳性的结果，取对应的PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并与IMGT网站公布的序列进行比对，分析对应的高分辨亚型。另外，将该20例RRP患者的外周血基因组同时送北京博富瑞基因诊断技术有限公司(具有临床高分辨HLA分型检测资质)，进行HLA-DRB1的高分辨分型检测。对比本发明的方法与测序的结果，验证本发明所述引物序列针对HLA-DRB1*03低分辨型的特异性。

HLA-DRB1*03低分辨型定性PCR结果和进一步的序列分析结果如下表所示：

其中，“-”表示HLA-DRB1*03低分辨型定性阴性以及未送检生工测序分型，“+”表示HLA-DRB1*03低分辨型定性阳性，高分辨测序分型1和高分辨测序分型2分别表示博富瑞公司检测的受试者HLA-DRB1的两个等位基因的高分辨测序分型结果。

结果表明本发明设计的HLA-DRB1*03低分辨型定性检测方法及试剂盒能够准确检出受试者携带的HLA-DRB1*03型等位基因，而且不会扩增出非03低分辨型的HLA-DRB1基因，具有很高的特异性和灵敏度。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京儿童医院

<120> 一种用于喉乳头状瘤患者预后和指导治疗的方法及试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttcttgga gtactctacg tctg 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccacccggc cccgcttctg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcttcaatg ggacggagcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtccttctg gctgttccag 20

Claims

1.一组用于HLA-DRB1*03基因定性检测的PCR扩增引物，其特征在于，所述的PCR扩增引物包括HLA-DRB1*03低分辨型特异性引物组合，包括：SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQID No.2所示的下游引物；

所述的PCR扩增引物还包括HLA-DRB1基因阳性对照引物组合，包括：SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物。

2.一种用于HLA-DRB1*03基因定性检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含如权利要求1所述的一组用于HLA-DRB1*03基因定性检测的PCR扩增引物。

3.权利要求1所述PCR扩增引物在制备HLA-DRB1*03基因定性检测产品中的应用。