CN1451760A - Hla分型用寡核苷酸芯片的制备及用法 - Google Patents

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Abstract

HLA分型用寡核苷酸芯片的制备及用法涉及针对HLA基因设计不同的寡核苷酸探针，以玻璃载玻片为固相载体，将合成的寡核苷酸探针按一定排列方式结合于玻片表面，用于对HLA基因进行分型，以及该方法的试剂组成与在临床和科学研究中的应用。

Description

HLA分型用寡核苷酸芯片的制备及用法
HLA基因复合体位于人类第6号染色体6p21.3区域，具有高度的多态性。它在抗原识别与提呈、免疫应答与调控等方面起着极其重要的作用，是影响器官移植物长期存活和造血干细胞移植成败的关键因素之一(曹孟德主编，HLA分子生物学及临床应用，河南医科大学出版社，1998)。HLA存在多个基因座位，在所有HLA基因座位中，以A、B、DR座位对移植的影响最大。HLA-A、B属于I类抗原，其多态性主要集中在基因的第二、第三外显子；HLA-DRB1属于II类抗原，其多态性主要集中在基因的第二外显子。由于HLA抗原的高度同源性，传统的血清学分型方法会出现较多的交叉反应，造成分型的困难(Bodmer TG，Marsh SGE，Albert ED，et al.Vox Sang 1997，73：105-130；Otten HG，Tilanus MG，Barnstiji M，et al.Tissue Antigens 1995，45：36-41)。目前国际上越来越倾向于采用DNA分型方法代替传统血清学分型。DNA分型方法主要有五种，即DNA-限制性片段长度多态性分析(DNA-RFLP)、PCR-序列特异性引物法(PCR-SSP)、PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、PCR-DNA测序及PCR-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)法(Wake C，Long E，Mach B，et al.Nature 1989，300：372-374；Uryn N.Tissue Antigens 1990，35：20-32；Olerup O，Zetterquist H.Tissue Antigens 1992，39：225-235；Pera C，Dffins L，Marabito A，et al.Tissueantigens 1997，50：372-379)。为配合HLA分型的标准化，国际组织相容性学会(IHWC)选择PCR-SSOP作为重点推广的方法之一。SSOP是人工合成的具有HLA型特异性的探针，与PCR扩增的HLA基因片段在一定条件下特异性杂交，通过放射自显影判断结果。PCR-SSOP法一般是将PCR扩增的DNA片段点样在许多小块尼龙膜上，然后再将不同种类的放射标记探针与之杂交，最后根据阳性探针的不同组合得出HLA基因的型别(Peponnet C，Schaeffer V，Lepage V，et al.Tissue antigens 1995，45：129-138；Bugawan TL，Apple R，Erlich HA.Tissue antigens 1994，44：137-147)。不难看出，PCR-SSOP法也较为烦琐，无法实现HLA分型的高通量。寡核苷酸芯片技术是新近发展起来的一种基因检测技术，它可以将成百上千个寡核苷酸探针有规律地排列在一张很小的玻片上，这些探针可与放射性标记或荧光素标记的样品DNA中的互补序列相结合，通过放射自显影或荧光检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。本发明正是在利用PCR-SSOP思路的基础上，将经过选择的探针点样于玻片上，分别与PCR扩增的HLA-A、B基因的2，3外显子以及HLA-DRB1基因的2外显子产物进行杂交，一次性地获得各位点的多态情况，从而实现对HLA-A、B、DRB1基因的快速、简捷、高通量分型。目前国内外还没有一种方法利用玻片为载体将寡核苷酸探针固相化于其表面，用以对HLA基因进行分型检测的报道。
本发明的目的是针对HLA-A基因设计了一套探针(见表1)；针对HLA-B基因设计了一套探针(见表2)；针对HLA-ADRB1基因设计了一套探针(见表3)。分别将用于HLA-A、B、DRB1基因分型的成套探针系统共价固相化于玻片表面不同区域，制作成三种不同的HLA寡核苷酸芯片，并提供包含试验操作所必需的所有组份，组成了一套完整的试剂盒。分别用于HLA-A、B、DRB1基因分型检测。另外，本试剂盒由于采用高密度点样技术，荧光引物标记技术以及激光共聚扫描技术，使试剂盒的操作大为简化，比传统的检测方法的效率大大提高。
本发明的主要内容是：分别以一条经测序已确定型别的标准HLA基因为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，行不对称PCR扩增，PCR产物避光4℃保存。0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，适当温度杂交1小时。依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA基因的型别。
本发明的实施实现了对HLA-A、B、DRB1基因快速、简捷、高通量分型，具有重大的社会和经济效益。
本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
下面结合附图说明本发明的具体实施方法：
图1芯片外观
图2HLA-A分型芯片杂交结果示例
图3HLA-B分型芯片杂交结果示例
图4HLA-DRB1分型芯片杂交结果示例
实施例方法1：HLA-A、B、DRB1基因分型的成套探针与引物设计与合成
1.HLA-A.扩增HLA-A基因2，3外显子的引物，序列为：PA2+：5’GAAACG(C)GCCTCTGT(C)GGGGAGAAGCAA3’；PA2-：5’CCTCGCTCTGGTTGTAGTAG3’-Cy3；PA3+：5’CCGGTTTCATTTTCAGTT3’，PA3-：5’TGT TGG TCC CAA TTG TCT CCC CTC 3’-Cy3。用于HLA-A分型的寡核苷酸探针共25条，序列如下：(见表1)
                        表1 HLA-A亚型探针
名称    序列(5′-3′)。              长度(nt)    Exon     Tm(℃)
Ay1    GGC CGG TGC GTG GAC GGG        18          3        80
Ay2    CGG GGA GAC ACG G              13          2        59
Ay3    ACC AGG AGA CAC GGA AT         17          2        62
Ay4    AGA CCA CCA AGC ACA AG         17          3        61
Ay5    GTA TTT CTA CAC CTC CGT G      19          2        60
Ay6    ACG AGG AGA CAG GGA AA         17          2        62
Ay7    CGT GTG GCG GAG CAG TTG        18          3        74
Ay8    AGA GAG CCT GCG GAT CG         17          3        69
Ay9    GAG GGC CGG TGC GTG            15          3        72
Ay10   TGG GAC CTG CAG ACA CG         17          2        68
Ay11   CCG GCA GTG GAG AGC CC         17          2        75
Ay12   GAC ACG GAA TGT GAA GGC        18          2        66
Ay13   GAC CGG AAC ACA CGG            15          2        62
Ay14   GTA TTT CAC CAC ATC CGT        18          2        60
Ay15   GAG ACG GCC CAT GAG GC         17          3        72
Ay16   GAG GCG GTC CAT GCG            15          3        69
Ay17   TGG AGG GCG AGT GCG T          16          3        71
Ay18   CAC ACC GTC CAG AGG ATG T      19          3        68
Ay19   GGG TAC CAG CAG GAC GC         17          3        69
Ay20   CGT GGA CGG GCT CC             14          3        65
Ay21   TAC CTG GAT GGC ACG T          16          3        62
Ay22   TAT GAA CAG CAC GCC            15          3        57
Ay23   GAG AGG CCT GAG TAT            15          2        49
CA1+   CGA CGC CGC GAG CCA GA         17          2        80
CA3-   CGA CGC AGC GGG CCA GA         17          2        80
2.HLA-B：扩增HLA-A基因2，3外显子的引物，分长片段和短片段引物，长片段引物序列为：PB+：5’GGGAGGAGCGAGGGGACC(G/C)CAG3’，PB-：5’GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT3’；短片段引物为：其中扩增外显子2的引物为：PB2+：5’CACTCCATGAGGTATTTC3’，PB2-：5’CCTCGCTCTGGTTGTAGTAG3’-Cy3；扩增外显子3的引物为：PB3+：5’GTTTCATTTTCAGTTTAGGCCA3’，PB3-：5’TCCTTCCCGTTCTCCAGG3’-Cy3。用于HLA-B分型的寡核苷酸探针共45条，序列如下：(见表2)
                      表2 HLA-B分型探针
探针名称    序列(5’-3’)         序列长度    序列位置    Tm值℃)
B1          TACTACAACCAGAGCGAG    18          exon2        56
B2          ACACGGAACATGAAGGCC    18          exon2        59
B3          GAAGTACAAGCGCCAGGC    18          exon2        59
B4          ATCTGCAAGGCCAAGGCA    18          exon2        59
B5          ACTTACCGAGAGAGCCTG    18          exon2        59
B6     AGCGGAGCGCGGTGCGCA        18        exon2        56
B7     CGGAACCTGCGCGGCTAC        18        exon2        59
B8     CGGACCCTGCTCCGCTAC        18        exon2        59
B9     CGGATCGCGCTCCGCTAC        18        exon2        59
B10    ACACCGCCATGTCCCGGC        18        exon2        59
B11    GCTTCATCACCGTGGGCT        18        exon2        59
B12    CGTGGACGGCACCCAGTT        18        exon2        59
B13    GGACGACACCCAGT TCGT       18        exon2        59
B14    TCCGAGAGGGGAGCCGCT        18        exon2        59
B15    CCGAGGACGGAGCCCCGG        18        exon2        59
B16    GAGGATGGCGCCCCGGGC        18        exon2        59
B17    GCCGTGGGTGGAGCAGGA        18        exon2        59
B18    GGGCGCCGTGGATAGAGC        18        exon2        59
B19    GGGACCGGAACACACAGA        18        exon2        59
B20    GGGACCGGGAGACACAGA        18        exon2        59
B21    AAGGCCCAGGCACAGACT        18        exon2        59
B22    ACAGATCTCCAAGACCAA        18        exon2        59
B23    CACACTTGGCAGACGATG        18        exon3        59
B24    TCTGCCAAGTGTGAGACC        18        exon3        59
B25    CAGAGCATGTACGGCTGC        18        exon3        59
B26    CAGAGGATGTACGGCTGC        18        exon3        59
B27    GACCTGGGGCCCGAC           15        exon3        59
B28    CATAACCAGTACGCCTACG       18        exon3        59
B29    TAACCAGTTAGCCTACGA        18        exon3        59
B30    GGGCATGACCAGTCCGCC        18        exon3        59
B31    ATAACCAGTTCGCCTACG        18        exon3        59
B32    GGCCCGTGAGGCGGAGCA        18        exon3        59
B33    CGGAGCAGGACAGAGCCT        18        exon3        59
B34    GCAGCTGAGAGCCTACCT        18        exon3        59
B35    TGGAGGGCGAGTGCGTGG        18        exon3        59
B36    TGGAGGGCCTGTGCGTGG        18        exon3        59
B37    TGGAGGGCACGTGCGTGG        18        exon3        59
B38    CGGGTATAACAAGTTCGCC       19        exon3        58
B39    GGGTATAACCAGTATAC         17        exon3        55
B40    TGAGGCGGAGCAGCGGA         17        exon3        58
B41    GAGGAAGGAGCCGCGGG         17        exon2        60
B42    TTTCGACACCGCCATGT         17        exon2        55
B43    CCCTCCAGTGGATGTATG        18        exon3        56
B44    GGTATGACCAGGACGCC         17        exon3        56
B45    ATTGGGACGGGGAGACAC        18        exon2        58
3.HLA-DRB1：扩增HLA-DRB1第二外显子的引物为：  PD+5’CCG GAT CCT TCG TGTCCC CAC AGC ACG3’，PD-  5’TCG CCG CTG CAC TGT GAA G3’-Cy3。用于HLA-DRB1分型的寡核苷酸探针共18条，序列如下：(见表3)
                     表3HLA-DRB1亚型探针探针名称    序列(5’-3’)      长度(nt)     位置        Tm(℃)
Dy1    TGCTGGAAAGATGCATC        17        exon2        62
Dy3    TGGAGCAGGCGCGG           14        exon2        71
Dy4    GCCTAAGAGGGAGTGTC        17        exon2        59
Dy6    AGAAGCGGGGCCGGGT         16        exon2        76
Dy7    GTACTCTACGTCTGAGT        17        exon2        48
Dy8     GAGCAGGTTAAACATGA        17        exon2    55
Dy10    CCTGATGAGGAGTACTGG       18        exon2    60
Dy11    CTCTACGGGTGAGTGTT        17        exon2    57
Dy12    GTTACTGGAGAGACACTT       18        exon2    52
Dy13    GGAAGACGACCGGGCC         16        exon2    72
Dy14    CCTGCTGCGGAGCACTG        17        exon2    72
Dy15    GGAAGACAAGCGGGCC         16        exon2    69
Dy16    GCAGGGTAAGTATAAGTG       18        exon2    55
Dy17    GCGGGCCCTGGTGGAC         16        exon2    75
Dy18    TGCGGTATCTGCACAGA        17        exon2    63
Dy19    AAGACGCGTCCATAACC        17        exon2    64
CD3-    TGGAAAAGCCCGAAGGA        17        exon2    70
CD1+    TGGAACAGCCAGAAGGA        17        exon2    64方法2：活化载玻片片基的制备
将标准规格的玻璃片置于重铬酸钾浓硫酸溶液中浸泡过夜，小心弃去酸液，用去离子水冲洗，在置蒸馏水槽中洗3次后，在氨水溶液(浓氨水∶双氧水∶水＝1∶1∶5)中浸泡2小时，蒸馏水洗3次，再在盐酸溶液(浓盐酸∶双氧水∶水＝1∶1∶5)中浸泡2小时，蒸馏水洗3次，浸入1％硅烷化试剂(硅烷化试剂1毫升+无水乙醇95毫升+蒸馏水5毫升+乙酸0.1毫升)中适当时间，取出后用16毫升乙酸-95％乙醇溶液洗2次，蒸馏水洗一次，置150℃烘烤2小时，即获得氨基片。于干燥器皿中保存。氨基片置3％戊二醛溶液(25％戊二醛6毫升+0.01M磷酸缓冲液PH8.0，44毫升)中，室温下作用4-6小时，取出用0.01M磷酸缓冲液(PH7.4)洗2次，蒸馏水洗3次，晾干，即为活化生物检测板片基，室温下保存。方法3：试剂盒相关组份溶液的配制
点样液(3×SSC，0.01％SDS)、杂交液I(5×SSC，0.1％SDS)，杂交液II(3.0M TMAC，0.01M磷酸钠，1Mm EDTA，0.5％SDS)，洗涤液A(1×SSC，0.2％SDS)、B(0.2×SSC)、C(0.1×SSC)。方法4：探针的点样与制备寡核苷酸芯片
用防水纸制成方形格栅，将其紧密贴于活化的玻片上，这样在玻片表面就形成了8个方形样品孔，每个样品孔的边长为9毫米，见附图1。
将制好的玻片片基排列于点样仪的点样架上。用3×SSC将寡核苷酸探针稀释至30μM，加到样品板的适当位置上。HLA-A、B、DRB1分别按照不同的排列矩阵(见附表4、5、6)开始点样，每点样品体积为8.0nl。将点样好的玻片置于室温过夜，使寡核苷酸探针与玻片发生共价结合制备寡核苷酸芯片。
                     表4 HLA-A分型芯片探针阵列表
  A1   A2   A3   A4   A5
  A6   A7   A8   A9  A10
  A11   A22   A12   A13  A14
  A23   A15   A16   A17  A18
  A19   A20   A21   N
  P   P   P   P  P
   *P阳性对照兼坐标，N阴性对照
                                   表5 HLA-A分型芯片探针阵列表
  B1   B2   B3   B4   B5   B6   B7   B8   B9   B10   B11  B12
  B1   B2   B3   B4   B5   B6   B7   B8   B9   B10   B11   B12
  B13   B14   B15   B16   B17   B18   B19   B20   B21   B22   B23   B24
  B13   B14   B15   B16   B17   B18   B19   B20   B21   B22   B23  B24
  B25   B26   B27   B28   B29   B30   B31   B32   B33   B34   B35   B36
  B25   B26   B27   B28   B29   B30   B31   B32   B33   B34   B35   B36
  B37   B38   B39   B40   B41   B42   B43   B44   B45   N
  B37   B38  B39   B40   B41   B42   B43   B44   B45   N
  P   P   P   P   P   P   P   P   P   P   P   P
                                   *P阳性对照兼坐标，N阴性对照
  表6 HLA-DRB1分型芯片探针阵列表
  D1   D3   D4   D6   D7
  D8   D10   D11   D12   D13
  D14   D15   D16   D17   D18
  D19   N   P
  P   P   P   P   P
   *P阳性对照兼坐标，N阴性对照实施例一：寡核苷酸芯片检测HLA-A基因
1.荧光标记杂交模板的PCR扩增  以一条经测序已确定型别的标准HLA-A基因(HLA-A*34)为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，不对称PCR扩增其2，3外显子，使扩增产物中荧光标记单链占多数。PCR反应体系为30ul，扩增条件是94℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环。产物避光4℃保存。
2.芯片杂交反应  0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA-A芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，42℃杂交1小时。
3.杂交后洗涤  依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。
4.芯片荧光扫描  使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA-A基因的型别。
5.结果  根据标准序列的型别，HLA-A芯片上第Ay13，Ay15号探针应为阳性，如图2所示，应用HLA-A芯片判断的基因型别结果与标准序列完全符合。实施例二：寡核苷酸芯片检测HLA-B基因
1.荧光标记杂交模板的PCR扩增  以一条经测序已确定型别的标准HLA-B基因(B*1801)为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，不对称PCR扩增其2，3外显子，使扩增产物中荧光标记单链占多数。PCR反应体系为30ul，扩增条件是94℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环。产物避光4℃保存。
2.芯片杂交反应  0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA-B芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，42℃杂交1小时。
3.杂交后洗涤  依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。
4.芯片荧光扫描  使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA-B基因的型别。
5.结果  根据标准序列的型别，HLA-B芯片上第1、5、7、12、13、15、18、19、21、25、29、33、34号探针应为阳性，如图3所示，应用HLA-B芯片判断的基因型别结果与标准序列完全符合。实施例三：寡核苷酸芯片检测HLA-DRB1基因
1.荧光标记杂交模板的PCR扩增  以一条经测序已确定型别的标准HLA-DRB1基因(DRB1*11型)为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，不对称PCR扩增其第2外显子，使扩增产物中荧光标记单链占多数。PCR反应体系为30ul，扩增条件是94℃30s，57.5℃30s，72℃30s，40个循环。产物避光4℃保存。
2.芯片杂交反应0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA-DRB1芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，42℃杂交1小时。
3.杂交后洗涤  依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。
4.芯片荧光扫描  使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA-DRB1基因的型别。
5.结果  根据标准序列的型别，HLA-DRB1芯片上第10、11、17号探针应为阳性，如图4所示，应用HLA-DRB1芯片判断的基因型别结果与标准序列完全符合。

Claims (6)

1.一种HLA基因中分辨率分型方法，其特征在于：按一定排列方式将用于HLA基因分型的探针点样固化于经特殊处理的玻片片基上，用信号分子标记作信号显示，用于临床和血站对人群HLA基因进行分型。试剂盒组份如下：检测用片基、信号标记系统、寡核苷酸探针、各种引物、洗涤液、点样液。
2.根据权利要求1所述的方法，片基上每孔固相化的探针为寡核苷酸探针，其序列根据HLA基因特征设计，其长度范围在12-30个碱基，一般为18个碱基，其Tm值在满足上述基因中等分辨率分型需要。
3.根据权利要求1所述的方法，其各种引物是根据HLA-A、B、DRB1基因序列特点设计，引物序列长度在15-25个碱基之间，分别用于上述基因的扩增。
4.根据权利要求1所述的方法，用于信号显示的信号分子标记是针对HLA-A、B、DRB1基因序列扩增的引物。
5.根据权利要求4，用于信号显示的信号分子可以是荧光分子、化学发光分子、酶、同位素等。
6.根据权利要求1所述的方法，可应用于：医院或血站对人群HLA基因所有座位进行分型，一般应用于HLA-A、B、DRB1基因座位的分型，为组织配型和干细胞移植提供主要参考依据。
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