CN1451760A - Hla分型用寡核苷酸芯片的制备及用法 - Google Patents
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Abstract
HLA分型用寡核苷酸芯片的制备及用法涉及针对HLA基因设计不同的寡核苷酸探针，以玻璃载玻片为固相载体，将合成的寡核苷酸探针按一定排列方式结合于玻片表面，用于对HLA基因进行分型，以及该方法的试剂组成与在临床和科学研究中的应用。
Description
HLA基因复合体位于人类第6号染色体6p21.3区域，具有高度的多态性。它在抗原识别与提呈、免疫应答与调控等方面起着极其重要的作用，是影响器官移植物长期存活和造血干细胞移植成败的关键因素之一(曹孟德主编，HLA分子生物学及临床应用，河南医科大学出版社，1998)。HLA存在多个基因座位，在所有HLA基因座位中，以A、B、DR座位对移植的影响最大。HLA-A、B属于I类抗原，其多态性主要集中在基因的第二、第三外显子；HLA-DRB1属于II类抗原，其多态性主要集中在基因的第二外显子。由于HLA抗原的高度同源性，传统的血清学分型方法会出现较多的交叉反应，造成分型的困难(Bodmer TG，Marsh SGE，Albert ED，et al.Vox Sang 1997，73：105-130；Otten HG，Tilanus MG，Barnstiji M，et al.Tissue Antigens 1995，45：36-41)。目前国际上越来越倾向于采用DNA分型方法代替传统血清学分型。DNA分型方法主要有五种，即DNA-限制性片段长度多态性分析(DNA-RFLP)、PCR-序列特异性引物法(PCR-SSP)、PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、PCR-DNA测序及PCR-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)法(Wake C，Long E，Mach B，et al.Nature 1989，300：372-374；Uryn N.Tissue Antigens 1990，35：20-32；Olerup O，Zetterquist H.Tissue Antigens 1992，39：225-235；Pera C，Dffins L，Marabito A，et al.Tissueantigens 1997，50：372-379)。为配合HLA分型的标准化，国际组织相容性学会(IHWC)选择PCR-SSOP作为重点推广的方法之一。SSOP是人工合成的具有HLA型特异性的探针，与PCR扩增的HLA基因片段在一定条件下特异性杂交，通过放射自显影判断结果。PCR-SSOP法一般是将PCR扩增的DNA片段点样在许多小块尼龙膜上，然后再将不同种类的放射标记探针与之杂交，最后根据阳性探针的不同组合得出HLA基因的型别(Peponnet C，Schaeffer V，Lepage V，et al.Tissue antigens 1995，45：129-138；Bugawan TL，Apple R，Erlich HA.Tissue antigens 1994，44：137-147)。不难看出，PCR-SSOP法也较为烦琐，无法实现HLA分型的高通量。寡核苷酸芯片技术是新近发展起来的一种基因检测技术，它可以将成百上千个寡核苷酸探针有规律地排列在一张很小的玻片上，这些探针可与放射性标记或荧光素标记的样品DNA中的互补序列相结合，通过放射自显影或荧光检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。本发明正是在利用PCR-SSOP思路的基础上，将经过选择的探针点样于玻片上，分别与PCR扩增的HLA-A、B基因的2，3外显子以及HLA-DRB1基因的2外显子产物进行杂交，一次性地获得各位点的多态情况，从而实现对HLA-A、B、DRB1基因的快速、简捷、高通量分型。目前国内外还没有一种方法利用玻片为载体将寡核苷酸探针固相化于其表面，用以对HLA基因进行分型检测的报道。
本发明的目的是针对HLA-A基因设计了一套探针(见表1)；针对HLA-B基因设计了一套探针(见表2)；针对HLA-ADRB1基因设计了一套探针(见表3)。分别将用于HLA-A、B、DRB1基因分型的成套探针系统共价固相化于玻片表面不同区域，制作成三种不同的HLA寡核苷酸芯片，并提供包含试验操作所必需的所有组份，组成了一套完整的试剂盒。分别用于HLA-A、B、DRB1基因分型检测。另外，本试剂盒由于采用高密度点样技术，荧光引物标记技术以及激光共聚扫描技术，使试剂盒的操作大为简化，比传统的检测方法的效率大大提高。
本发明的主要内容是：分别以一条经测序已确定型别的标准HLA基因为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，行不对称PCR扩增，PCR产物避光4℃保存。0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，适当温度杂交1小时。依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA基因的型别。
本发明的实施实现了对HLA-A、B、DRB1基因快速、简捷、高通量分型，具有重大的社会和经济效益。
本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
下面结合附图说明本发明的具体实施方法：
图1芯片外观
图2HLA-A分型芯片杂交结果示例
图3HLA-B分型芯片杂交结果示例
图4HLA-DRB1分型芯片杂交结果示例
实施例方法1：HLA-A、B、DRB1基因分型的成套探针与引物设计与合成
1.HLA-A.扩增HLA-A基因2，3外显子的引物，序列为：PA2+：5’GAAACG(C)GCCTCTGT(C)GGGGAGAAGCAA3’；PA2-：5’CCTCGCTCTGGTTGTAGTAG3’-Cy3；PA3+：5’CCGGTTTCATTTTCAGTT3’，PA3-：5’TGT TGG TCC CAA TTG TCT CCC CTC 3’-Cy3。用于HLA-A分型的寡核苷酸探针共25条，序列如下：(见表1)
表1 HLA-A亚型探针
名称 序列(5′-3′)。 长度(nt) Exon Tm(℃)
Ay1 GGC CGG TGC GTG GAC GGG 18 3 80
Ay2 CGG GGA GAC ACG G 13 2 59
Ay3 ACC AGG AGA CAC GGA AT 17 2 62
Ay4 AGA CCA CCA AGC ACA AG 17 3 61
Ay5 GTA TTT CTA CAC CTC CGT G 19 2 60
Ay6 ACG AGG AGA CAG GGA AA 17 2 62
Ay7 CGT GTG GCG GAG CAG TTG 18 3 74
Ay8 AGA GAG CCT GCG GAT CG 17 3 69
Ay9 GAG GGC CGG TGC GTG 15 3 72
Ay10 TGG GAC CTG CAG ACA CG 17 2 68
Ay11 CCG GCA GTG GAG AGC CC 17 2 75
Ay12 GAC ACG GAA TGT GAA GGC 18 2 66
Ay13 GAC CGG AAC ACA CGG 15 2 62
Ay14 GTA TTT CAC CAC ATC CGT 18 2 60
Ay15 GAG ACG GCC CAT GAG GC 17 3 72
Ay16 GAG GCG GTC CAT GCG 15 3 69
Ay17 TGG AGG GCG AGT GCG T 16 3 71
Ay18 CAC ACC GTC CAG AGG ATG T 19 3 68
Ay19 GGG TAC CAG CAG GAC GC 17 3 69
Ay20 CGT GGA CGG GCT CC 14 3 65
Ay21 TAC CTG GAT GGC ACG T 16 3 62
Ay22 TAT GAA CAG CAC GCC 15 3 57
Ay23 GAG AGG CCT GAG TAT 15 2 49
CA1+ CGA CGC CGC GAG CCA GA 17 2 80
CA3- CGA CGC AGC GGG CCA GA 17 2 80
2.HLA-B：扩增HLA-A基因2，3外显子的引物，分长片段和短片段引物，长片段引物序列为：PB+：5’GGGAGGAGCGAGGGGACC(G/C)CAG3’，PB-：5’GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT3’；短片段引物为：其中扩增外显子2的引物为：PB2+：5’CACTCCATGAGGTATTTC3’，PB2-：5’CCTCGCTCTGGTTGTAGTAG3’-Cy3；扩增外显子3的引物为：PB3+：5’GTTTCATTTTCAGTTTAGGCCA3’，PB3-：5’TCCTTCCCGTTCTCCAGG3’-Cy3。用于HLA-B分型的寡核苷酸探针共45条，序列如下：(见表2)
表2 HLA-B分型探针
探针名称 序列(5’-3’) 序列长度 序列位置 Tm值℃)
B1 TACTACAACCAGAGCGAG 18 exon2 56
B2 ACACGGAACATGAAGGCC 18 exon2 59
B3 GAAGTACAAGCGCCAGGC 18 exon2 59
B4 ATCTGCAAGGCCAAGGCA 18 exon2 59
B5 ACTTACCGAGAGAGCCTG 18 exon2 59
B6 AGCGGAGCGCGGTGCGCA 18 exon2 56
B7 CGGAACCTGCGCGGCTAC 18 exon2 59
B8 CGGACCCTGCTCCGCTAC 18 exon2 59
B9 CGGATCGCGCTCCGCTAC 18 exon2 59
B10 ACACCGCCATGTCCCGGC 18 exon2 59
B11 GCTTCATCACCGTGGGCT 18 exon2 59
B12 CGTGGACGGCACCCAGTT 18 exon2 59
B13 GGACGACACCCAGT TCGT 18 exon2 59
B14 TCCGAGAGGGGAGCCGCT 18 exon2 59
B15 CCGAGGACGGAGCCCCGG 18 exon2 59
B16 GAGGATGGCGCCCCGGGC 18 exon2 59
B17 GCCGTGGGTGGAGCAGGA 18 exon2 59
B18 GGGCGCCGTGGATAGAGC 18 exon2 59
B19 GGGACCGGAACACACAGA 18 exon2 59
B20 GGGACCGGGAGACACAGA 18 exon2 59
B21 AAGGCCCAGGCACAGACT 18 exon2 59
B22 ACAGATCTCCAAGACCAA 18 exon2 59
B23 CACACTTGGCAGACGATG 18 exon3 59
B24 TCTGCCAAGTGTGAGACC 18 exon3 59
B25 CAGAGCATGTACGGCTGC 18 exon3 59
B26 CAGAGGATGTACGGCTGC 18 exon3 59
B27 GACCTGGGGCCCGAC 15 exon3 59
B28 CATAACCAGTACGCCTACG 18 exon3 59
B29 TAACCAGTTAGCCTACGA 18 exon3 59
B30 GGGCATGACCAGTCCGCC 18 exon3 59
B31 ATAACCAGTTCGCCTACG 18 exon3 59
B32 GGCCCGTGAGGCGGAGCA 18 exon3 59
B33 CGGAGCAGGACAGAGCCT 18 exon3 59
B34 GCAGCTGAGAGCCTACCT 18 exon3 59
B35 TGGAGGGCGAGTGCGTGG 18 exon3 59
B36 TGGAGGGCCTGTGCGTGG 18 exon3 59
B37 TGGAGGGCACGTGCGTGG 18 exon3 59
B38 CGGGTATAACAAGTTCGCC 19 exon3 58
B39 GGGTATAACCAGTATAC 17 exon3 55
B40 TGAGGCGGAGCAGCGGA 17 exon3 58
B41 GAGGAAGGAGCCGCGGG 17 exon2 60
B42 TTTCGACACCGCCATGT 17 exon2 55
B43 CCCTCCAGTGGATGTATG 18 exon3 56
B44 GGTATGACCAGGACGCC 17 exon3 56
B45 ATTGGGACGGGGAGACAC 18 exon2 58
3.HLA-DRB1：扩增HLA-DRB1第二外显子的引物为： PD+5’CCG GAT CCT TCG TGTCCC CAC AGC ACG3’，PD- 5’TCG CCG CTG CAC TGT GAA G3’-Cy3。用于HLA-DRB1分型的寡核苷酸探针共18条，序列如下：(见表3)
表3HLA-DRB1亚型探针探针名称 序列(5’-3’) 长度(nt) 位置 Tm(℃)
Dy1 TGCTGGAAAGATGCATC 17 exon2 62
Dy3 TGGAGCAGGCGCGG 14 exon2 71
Dy4 GCCTAAGAGGGAGTGTC 17 exon2 59
Dy6 AGAAGCGGGGCCGGGT 16 exon2 76
Dy7 GTACTCTACGTCTGAGT 17 exon2 48
Dy8 GAGCAGGTTAAACATGA 17 exon2 55
Dy10 CCTGATGAGGAGTACTGG 18 exon2 60
Dy11 CTCTACGGGTGAGTGTT 17 exon2 57
Dy12 GTTACTGGAGAGACACTT 18 exon2 52
Dy13 GGAAGACGACCGGGCC 16 exon2 72
Dy14 CCTGCTGCGGAGCACTG 17 exon2 72
Dy15 GGAAGACAAGCGGGCC 16 exon2 69
Dy16 GCAGGGTAAGTATAAGTG 18 exon2 55
Dy17 GCGGGCCCTGGTGGAC 16 exon2 75
Dy18 TGCGGTATCTGCACAGA 17 exon2 63
Dy19 AAGACGCGTCCATAACC 17 exon2 64
CD3- TGGAAAAGCCCGAAGGA 17 exon2 70
CD1+ TGGAACAGCCAGAAGGA 17 exon2 64方法2：活化载玻片片基的制备
将标准规格的玻璃片置于重铬酸钾浓硫酸溶液中浸泡过夜，小心弃去酸液，用去离子水冲洗，在置蒸馏水槽中洗3次后，在氨水溶液(浓氨水∶双氧水∶水＝1∶1∶5)中浸泡2小时，蒸馏水洗3次，再在盐酸溶液(浓盐酸∶双氧水∶水＝1∶1∶5)中浸泡2小时，蒸馏水洗3次，浸入1％硅烷化试剂(硅烷化试剂1毫升+无水乙醇95毫升+蒸馏水5毫升+乙酸0.1毫升)中适当时间，取出后用16毫升乙酸-95％乙醇溶液洗2次，蒸馏水洗一次，置150℃烘烤2小时，即获得氨基片。于干燥器皿中保存。氨基片置3％戊二醛溶液(25％戊二醛6毫升+0.01M磷酸缓冲液PH8.0，44毫升)中，室温下作用4-6小时，取出用0.01M磷酸缓冲液(PH7.4)洗2次，蒸馏水洗3次，晾干，即为活化生物检测板片基，室温下保存。方法3：试剂盒相关组份溶液的配制
点样液(3×SSC，0.01％SDS)、杂交液I(5×SSC，0.1％SDS)，杂交液II(3.0M TMAC，0.01M磷酸钠，1Mm EDTA，0.5％SDS)，洗涤液A(1×SSC，0.2％SDS)、B(0.2×SSC)、C(0.1×SSC)。方法4：探针的点样与制备寡核苷酸芯片
用防水纸制成方形格栅，将其紧密贴于活化的玻片上，这样在玻片表面就形成了8个方形样品孔，每个样品孔的边长为9毫米，见附图1。
将制好的玻片片基排列于点样仪的点样架上。用3×SSC将寡核苷酸探针稀释至30μM，加到样品板的适当位置上。HLA-A、B、DRB1分别按照不同的排列矩阵(见附表4、5、6)开始点样，每点样品体积为8.0nl。将点样好的玻片置于室温过夜，使寡核苷酸探针与玻片发生共价结合制备寡核苷酸芯片。
表4 HLA-A分型芯片探针阵列表
| A1 | A2 | A3 | A4 | A5 |
| A6 | A7 | A8 | A9 | A10 |
| A11 | A22 | A12 | A13 | A14 |
| A23 | A15 | A16 | A17 | A18 |
| A19 | A20 | A21 | N | |
| P | P | P | P | P |
*P阳性对照兼坐标，N阴性对照
表5 HLA-A分型芯片探针阵列表
| B1 | B2 | B3 | B4 | B5 | B6 | B7 | B8 | B9 | B10 | B11 | B12 |
| B1 | B2 | B3 | B4 | B5 | B6 | B7 | B8 | B9 | B10 | B11 | B12 |
| B13 | B14 | B15 | B16 | B17 | B18 | B19 | B20 | B21 | B22 | B23 | B24 |
| B13 | B14 | B15 | B16 | B17 | B18 | B19 | B20 | B21 | B22 | B23 | B24 |
| B25 | B26 | B27 | B28 | B29 | B30 | B31 | B32 | B33 | B34 | B35 | B36 |
| B25 | B26 | B27 | B28 | B29 | B30 | B31 | B32 | B33 | B34 | B35 | B36 |
| B37 | B38 | B39 | B40 | B41 | B42 | B43 | B44 | B45 | N | ||
| B37 | B38 | B39 | B40 | B41 | B42 | B43 | B44 | B45 | N | ||
| P | P | P | P | P | P | P | P | P | P | P | P |
*P阳性对照兼坐标，N阴性对照
表6 HLA-DRB1分型芯片探针阵列表
| D1 | D3 | D4 | D6 | D7 |
| D8 | D10 | D11 | D12 | D13 |
| D14 | D15 | D16 | D17 | D18 |
| D19 | N | P | ||
| P | P | P | P | P |
*P阳性对照兼坐标，N阴性对照实施例一：寡核苷酸芯片检测HLA-A基因
1.荧光标记杂交模板的PCR扩增 以一条经测序已确定型别的标准HLA-A基因(HLA-A*34)为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，不对称PCR扩增其2，3外显子，使扩增产物中荧光标记单链占多数。PCR反应体系为30ul，扩增条件是94℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环。产物避光4℃保存。
2.芯片杂交反应 0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA-A芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，42℃杂交1小时。
3.杂交后洗涤 依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。
4.芯片荧光扫描 使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA-A基因的型别。
5.结果 根据标准序列的型别，HLA-A芯片上第Ay13，Ay15号探针应为阳性，如图2所示，应用HLA-A芯片判断的基因型别结果与标准序列完全符合。实施例二：寡核苷酸芯片检测HLA-B基因
1.荧光标记杂交模板的PCR扩增 以一条经测序已确定型别的标准HLA-B基因(B*1801)为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，不对称PCR扩增其2，3外显子，使扩增产物中荧光标记单链占多数。PCR反应体系为30ul，扩增条件是94℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环。产物避光4℃保存。
2.芯片杂交反应 0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA-B芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，42℃杂交1小时。
3.杂交后洗涤 依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。
4.芯片荧光扫描 使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA-B基因的型别。
5.结果 根据标准序列的型别，HLA-B芯片上第1、5、7、12、13、15、18、19、21、25、29、33、34号探针应为阳性，如图3所示，应用HLA-B芯片判断的基因型别结果与标准序列完全符合。实施例三：寡核苷酸芯片检测HLA-DRB1基因
1.荧光标记杂交模板的PCR扩增 以一条经测序已确定型别的标准HLA-DRB1基因(DRB1*11型)为模板，采用1∶15摩尔浓度比的引物，不对称PCR扩增其第2外显子，使扩增产物中荧光标记单链占多数。PCR反应体系为30ul，扩增条件是94℃30s，57.5℃30s，72℃30s，40个循环。产物避光4℃保存。
2.芯片杂交反应0.2％SDS和蒸馏水各洗涤HLA-DRB1芯片2分钟，晾干。1ul荧光标记PCR产物和9ul杂交液(5×SSC，0.1％SDS)混合，均匀加入芯片杂交区。将芯片放入杂交盒，42℃杂交1小时。
3.杂交后洗涤 依次在洗涤液A，B，C液中浸泡芯片各3分钟，取出晾干。
4.芯片荧光扫描 使用Scanarray 3000荧光扫描仪，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断HLA-DRB1基因的型别。
5.结果 根据标准序列的型别，HLA-DRB1芯片上第10、11、17号探针应为阳性，如图4所示，应用HLA-DRB1芯片判断的基因型别结果与标准序列完全符合。
Claims (6)
1.一种HLA基因中分辨率分型方法，其特征在于：按一定排列方式将用于HLA基因分型的探针点样固化于经特殊处理的玻片片基上，用信号分子标记作信号显示，用于临床和血站对人群HLA基因进行分型。试剂盒组份如下：检测用片基、信号标记系统、寡核苷酸探针、各种引物、洗涤液、点样液。
2.根据权利要求1所述的方法，片基上每孔固相化的探针为寡核苷酸探针，其序列根据HLA基因特征设计，其长度范围在12-30个碱基，一般为18个碱基，其Tm值在满足上述基因中等分辨率分型需要。
3.根据权利要求1所述的方法，其各种引物是根据HLA-A、B、DRB1基因序列特点设计，引物序列长度在15-25个碱基之间，分别用于上述基因的扩增。
4.根据权利要求1所述的方法，用于信号显示的信号分子标记是针对HLA-A、B、DRB1基因序列扩增的引物。
5.根据权利要求4，用于信号显示的信号分子可以是荧光分子、化学发光分子、酶、同位素等。
6.根据权利要求1所述的方法，可应用于：医院或血站对人群HLA基因所有座位进行分型，一般应用于HLA-A、B、DRB1基因座位的分型，为组织配型和干细胞移植提供主要参考依据。
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