CN1858244A

CN1858244A - 具有增强的结合特异性的多核苷酸探针,其上固定有该探针的微阵列及设计该探针的方法

Info

Publication number: CN1858244A
Application number: CNA2005100679742A
Authority: CN
Inventors: 吴祉令; 许楠
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Current assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 2004-04-30
Filing date: 2005-04-30
Publication date: 2006-11-08
Also published as: EP1591538B1; EP1591538A1; KR100580649B1; JP2005318895A; US20050244871A1; DE602005023236D1; KR20050104973A; JP4243262B2

Abstract

本发明提供了寡核苷酸探针、其上固定有所述探针的微阵列和设计该探针的方法。在所述寡核苷酸探针中，包括靶位点核苷酸5′端方向的第一个核苷酸到5′末端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)，与包括靶位点核苷酸3′端方向第一个核苷酸到3′末端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)之间的差别不高于5℃。

Description

具有增强的结合特异性的多核苷酸探针，其上固定有该探针的微阵列及设计该探针的方法

技术领域

本发明涉及对目标核酸具有增强的结合特异性的寡核苷酸探针、其上固定有该探针的微阵列，以及设计该探针的方法。

背景技术

“多核苷酸微阵列”是指将多核苷酸基团紧密固定在基板上分离的(discrete)已知区域的一种微阵列，这种微阵列在本领域是公知的。关于这种微阵列，例如参见美国专利5,445,934和5,744,305。一般地，固定在基板上的多核苷酸特异性结合待分析的核酸，例如，与所述核酸杂交，并且可以通过这种特异性结合分析目标核酸。这种固定在基板上并与目标核酸杂交的多核苷酸被称为探针多核苷酸(或寡核苷酸)。

常规地，在设计多核苷酸探针时一般考虑热力学变量，包括与目标核酸杂交的温度、长度、分子内同型二聚体的形成、是否存在与另一多核苷酸探针的序列同源性，以及靶位点的位置。其中，所述热力学变量是为了考虑探针序列和目标核酸之间的杂交能量，并且选取杂交温度在一确定范围内的探针。当杂交温度高时，特异性结合增加，当杂交温度低时，非特异性结合增加。因此，在设计探针的常规过程中，在合适的范围内任意选取杂交温度。探针的长度一般为15-50bp，但并不局限于此。不优选在探针分子内形成同型二聚体或者存在与另一探针的序列同源性，优选可避免上述情况的序列。而且，考虑到位阻效应等，优选将靶位点一般设成与探针中心相应。

然而，根据选择多核苷酸探针的常规方法，考虑的是整个探针的杂交温度。因此，尽管整个探针的杂交温度相同或相似，当5′端一侧的寡核苷酸基于与具有目标序列的靶位点相应的核苷酸进行杂交的温度明显不同于3′端一侧的寡核苷酸基于与具有目标序列的靶位点相应的核苷酸进行杂交的温度时，存在非特异性结合的可能性。

在为解决上述问题而进行的深入研究中，本发明人发现：当目标核酸和包括靶位点核苷酸5′端方向第一个核苷酸到5′端核苷酸的多核苷酸序列杂交的温度与目标核酸和包括靶位点核苷酸3′端方向第一个核苷酸到3′端核苷酸的多核苷酸序列杂交的温度相似或彼此相同时，可以明显减少非特异性结合，从而完成本发明。

发明内容

本发明提供了一种具有增强的结合特异性的多核苷酸探针。

本发明也提供了一种具有固定于基板上的探针的微阵列。

本发明也提供了一种设计上述具有增强的结合特异性的多核苷酸探针的方法。

本发明一方面提供了一种寡核苷酸探针，在该寡核苷酸探针中，包括靶位点核苷酸5′端方向第一个核苷酸到5′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列杂交的温度(Tm)和包括靶位点核苷酸3′端方向第一个核苷酸到3′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列杂交的温度(Tm)之间的差异不高于5℃。

本发明另一方面提供了一种设计具有增强的靶位点结合特异性的寡核苷酸探针的方法，该方法包括：计算包括靶位点核苷酸5′端方向第一个核苷酸到5′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)和在包括靶位点核苷酸3′端方向第一个核苷酸到3′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)之间的差别；以及选取差别不高于5℃的寡核苷酸探针。

附图说明

参照附图，通过详细描述本发明实施例，本发明的上述以及其它特征和优势将会变得更加明显，其中：

图1A显示根据常规方法设计的野生型寡核苷酸探针和突变型寡核苷酸探针，此时，将与目标样品E01-11(SEQ ID NO.9)第342位的C互补的核苷酸位点用作靶位点；

图1B阐明了根据本发明的方法设计的野生型寡核苷酸探针和突变型寡核苷酸探针，此时，将与目标样品E01-11(SEQ ID NO.9)第342位的C互补的核苷酸位点用作靶位点；

图2A阐明了根据常规方法设计的野生型寡核苷酸探针和突变型寡核苷酸探针，此时，将与目标样品E02-22(SEQ ID NO.10)第147位的C互补的核苷酸位点用作靶位点；

图2B阐明了根据本发明的方法设计的野生型寡核苷酸探针和突变型寡核苷酸探针，此时，将与目标样品E02-22(SEQ ID NO.10)第147位的C互补的核苷酸位点用作靶位点；

图3A的MA图阐明了源于正常人的基因组DNA在对照微阵列上的杂交结果，所述对照微阵列上固定有根据常规方法设计的探针WP1和MP1；

图3B的MA图阐明了目标核酸在微阵列上的杂交结果，所述微阵列上固定有根据本发明方法设计的探针WP2和MP2；

图4A的MA图阐明了源于正常人的基因组DNA在对照微阵列上的杂交结果，所述对照微阵列上固定有根据常规方法设计的探针WP3和MP3；以及

图4B的MA图阐明了目标核酸在微阵列上的杂交结果，所述微阵列上固定有根据本发明方法设计的探针WP4和MP4。

具体实施方式

本发明的一种实施例提供了一种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针上包括从相应于靶位点的核苷酸的5′端方向第一个核苷酸到5′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)和包括从相应于靶位点的核苷酸的3′端方向第一个核苷酸到3′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)之间的差别在0-5℃的范围内。

在本发明中，所述寡核苷酸探针是用于分析目标核酸的基因类型的杂交探针，可以根据与目标核酸进行杂交反应后获得的杂交反应程度来分析。在本发明中，所述目标核酸为具有待分析的靶位点的核酸或核酸样品。所述靶位点为目标核酸中发现变异核苷酸的位置。变异的例子包括等位变异、单核苷酸多态性(SNP)等，但并非局限于此。而且，变异的原因包括自然突变和人工突变，并且在本发明中使用的变异并非专门局限于它的原因。

在本发明中，杂交温度(Tm)是指，在多核苷酸的两条链经退火杂交的情况下，获得最大值的半数的双链多核苷酸时的温度，或者在双链多核苷酸受热解离的情况下，一半的双链多核苷酸发生解离时的温度。杂交温度取决于多核苷酸中的碱基数量、长度、溶液中盐的浓度等。本文中，杂交温度(Tm)为处于现有技术中通常采用的溶液条件下的温度。

在本发明的寡核苷酸探针中，排除与靶位点相应的核苷酸以外的5′端方向寡核苷酸序列与其相应目标核酸的寡核苷酸序列的杂交温度和排除与靶位点相应的核苷酸以外的3′端方向寡核苷酸序列与其相应目标核酸的寡核苷酸序列的杂交温度彼此相似。杂交温度的差别优选0-7℃，更优选0-5℃。只要杂交温度的差别在上述范围内，在5′端方向的寡核苷酸的长度和在3′端方向的寡核苷酸的长度可以相同或不同。然而，一般采用设计成使靶位点相应于该寡核苷酸中心附近的寡核苷酸。因此，在5′端方向的寡核苷酸的长度和在3′端方向的寡核苷酸的长度相似或彼此相同。

在本发明中，寡核苷酸的长度在本领域通常采用的范围内并且无专门限定。寡核苷酸的长度为，例如，15-50bp，优选15-40bp，更优选20-30bp。

本发明的寡核苷酸探针通过固定在DNA微阵列上可有效地用于分析目标核酸。本发明固定在DNA微阵列上的寡核苷酸探针具有彼此相似的杂交温度，从而改进了采用这种微阵列获得的杂交反应结果。

因此，本发明的另一实施例提供了一种微阵列，其上固定有根据本发明一种实施例的寡核苷酸探针。即，在固定于本发明微阵列上的寡核苷酸探针中，包括靶位点核苷酸5′端方向第一个核苷酸到5′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)以及包括靶位点核苷酸3′端方向第一个核苷酸到3′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)之间的差别可以在0-5℃的范围内。在固定于本发明微阵列上的探针中，与野生型目标核酸完全匹配的野生型探针(wp)与其互补序列的杂交温度和与突变型目标核酸完全匹配的突变型探针(mp)与其互补序列的杂交温度之间的差别也可以在0-5℃的范围内。

本发明的另一实施例提供了一种设计具有增强的靶位点结合特异性的寡核苷酸探针的方法，该方法包括：计算包括从相应于靶位点的核苷酸的5′端方向第一个核苷酸到5′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补多核苷酸序列的杂交温度(Tm)和包括从相应于靶位点的核苷酸的3′端方向第一个核苷酸到3′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)之间的差别；并选取差别为0-5℃的寡核苷酸探针。

在本发明中，计算具有已知序列的寡核苷酸的杂交温度的方法在本领域中是公知的。与计算杂交温度的方法相关，自1996年以来，JohnSantaLuchia，Jr.已经重复地报道了核苷酸反应的实验结果并且根据每种情况的杂交温度(Tm)已经被广泛利用。而且，可以利用从市场上购买的可视OMP程序(可购自DNA Software，Inc.，USA)或者公开的公众网MELTSIM( http://bioinformatics.org/meltsim/)等计算杂交温度。

在本发明的方法中，除杂交温度差别之外，可以考虑在设计探针时通常考虑的因素。这类考虑因素包括热力学变量，包括与目标核酸杂交的温度，长度、分子内同型二聚体的形成、是否存在与其它多核苷酸探针的序列同源性，以及靶位点位置。

现参照以下实施例更加详细地描述本发明。以下实施例用于解释说明而并非是用于限定本发明的范围。

实施例

对照例：根据常规方法设计寡核苷酸探针

在该对照例中，根据设计寡核苷酸探针的常规方法设计一种寡核苷酸探针。

在设计探针时，要考虑寡核苷酸整个序列的热力学变量，包括杂交温度，与探针中心相应的靶位点，以及通过搜索杂交使非特异性结合最小。

首先，选取包括待分析突变位点并具有18-28bp长度的候选探针序列。接着，在每个探针和目标样品之间进行杂交模拟反应以选取Tm为65-80℃的探针。使所选取的探针和除预定位点之外的其它目标序列位点发生杂交反应，排除同源性为50％或更高的探针。另外还研究这些探针形成分子内同型二聚体的可能性，排除有可能形成同型二聚体的探针。在上述探针中，选取GC含量为20-80％的探针。选取与完全互补序列杂交(完全匹配)获得的Tm和与靶位点的非互补序列杂交(错配)获得的Tm之间的差别为3或更大值的探针。在所选取的探针中，选取在完全匹配Tm和错配Tm之间具有最大差别的探针。

因此，当将与目标样品E01-11(SEQ ID NO.9)第342位的C互补的核苷酸位点用作靶位点时，得到完全匹配的野生型探针(WP1：SEQ ID NO.1)和仅对靶位点不匹配的突变型探针(MP1：SEQ ID NO.2)。以WP1和MP1上与靶位点相应的核苷酸位点为基准，其5′端方向的序列的Tm与其3′端方向的序列的Tm相差8.3(参见图1A)。当将与目标样品E02-22(SEQ ID NO.10)第147位的C互补的核苷酸位点用作靶位点时，得到完全匹配的野生型探针(WP3：SEQ ID NO.5)和仅对靶位点不匹配的突变型探针(MP3：SEQID NO.6)。以WP3和MP3上与靶位点相应的核苷酸位点为基准，其5′端方向的序列的Tm与其3′端方向的序列的Tm相差7.0(参见图2A)。

尽管WP1整个序列的Tm和MP1整个序列的Tm相差仅为1.5，以与靶位点相应的核苷酸位点为基准的5′端方向的序列的Tm和3′端方向的序列的Tm相差8.3，该差别相对较大。因此，存在非特异性结合的可能性。尽管WP3整个序列的Tm和MP3整个序列的Tm之间的差别仅为1.6，以与靶位点相应的核苷酸位点为基准的5′端方向的序列的Tm和3′端方向的序列的Tm相差7.0，该差别相对较大。因此，存在非特异性结合的可能性。与特异性结合相比，由于非特异性结合具有低结合力，其导致由杂交引起的荧光强度降低。而且，非特异性结合阻止与目标核酸的特异性结合。

因此，根据设计寡核苷酸探针的常规方法，结合特异性降低了。

实施例1：根据本发明设计寡核苷酸探针

在本实施例中，除在对照例中考虑的因素之外，还要计算以与靶位点相应的核苷酸为基准时5′端方向的寡核苷酸的Tm和3′端方向的寡核苷酸的Tm，并比较这些值以选取具有最小差别可能性的寡核苷酸探针。具体地，进行与对照例相同的过程，不同的是进行所有探针和目标样品的杂交反应以选取Tm为65-80℃的探针，随后选出靶位点(例如，突变位点)右侧Tm和左侧Tm相差5或更小值的探针。

因此，当将与目标样品E01-11(SEQ ID NO.9)第342位的C互补的核苷酸位点用作靶位点时，得到完全匹配的野生型探针(WP2：SEQ ID NO.3)和仅对靶位点不匹配的突变型探针(MP2：SEQ ID NO.4)。WP2和MP2上与靶位点相应的核苷酸位点5′端方向的序列的Tm和3′端方向的序列的Tm相差1.4(参见图1B)。当将与目标样品E02-22(SEQ ID NO.10)第147位的C互补的核苷酸位点用作靶位点时，得到完全匹配的野生型探针(WP4：SEQID NO.7)和仅对靶位点不匹配的突变型探针(MP4：SEQ ID NO.8)。WP4和MP4上与靶位点相应的核苷酸位点5′端方向的序列的Tm和3′端方向的序列的Tm相差0.8(参见图2B)。

WP2整个序列的Tm和MP2整个序列的Tm仅差1.6，而与靶位点相应的核苷酸位点的5′端方向的序列的Tm和3′端方向的序列的Tm相差1.4，这种差别相对较小。因此非特异性结合的可能性小。WP4整个序列的Tm和MP4整个序列的Tm仅差1.7，而与靶位点相应的核苷酸位点5′端方向的序列的Tm和3′端方向的序列的Tm相差0.8，该差别相对较小。因此，非特异性结合的可能性小。当与根据常规方法设计的探针相比时，由于非特异性结合的比率变得相对较低，由杂交引起的荧光强度将增加。

实施例2：本发明的寡核苷酸探针对杂交结果的影响

在本实施例中，使用对照例和实施例1所设计的寡核苷酸探针，即，与野生型目标核酸互补的探针WP1、WP2、WP3和WP4以及与突变型目标核酸互补的探针MP1、MP2、MP3和MP4，将这些探针固定在微阵列上并进行杂交反应，随后分析结果。

首先，将上述探针固定到基板上作为目标核酸(E01-11或E02-22)的探针以完成微阵列。探针WP1和MP1以及探针WP3和MP3以相同的方式固定在对照微阵列上。用点样溶液(spotting solution)制备本发明的微阵列，该点样溶液是用具有环氧基的聚乙二醇(PEG)将探针WP2和MP2以及具有胺基基团的探针WP4和MP4与水溶胶(hydrogel)混合而得到。玻璃表面用biorobot printer(型号PixSys 5500，可购自Cartesian Technologies，Inc.，CA，USA)进行表面处理，使之具有胺基基团，将上述点样溶液点在玻璃表面，随后将玻璃在37℃的潮湿温箱中放4小时。接着，进行控制背景噪音所需的操作。即，为防止目标核酸附着到玻璃表面，通过反应使玻璃表面未点样区域的胺基基团带负电，然后将该玻璃储存在干燥器中。

用荧光物质标记目标核酸。在本实施例中，用Cy3-dUTP作荧光物质并且标记目标核酸的主体(body)或两端。

目标核酸和探针的杂交如下进行：将0.1％6×SSPET(盐水磷酸钠EDTA缓冲液，含有0.1％ Trition X-100)溶剂中的20nM目标核酸与微阵列上的探针于37℃反应16小时。接着，该微阵列用0.05％6×SSPET和0.05％3×SSPET于室温各冲洗5分钟，室温干燥5分钟，随后进行扫描。采用Axon扫描仪(Axon scanner)(型号GenePix 4000B，可购自Axon Instrument，Inc.，CA，USA)进行扫描，用GenePix Pro 3.0程序(可购自AxonInstrument，Inc.，CA，USA)解释扫描数据，从而计算组分比和组分强度。结果显示为图3和4中的MA图。通过将正常型目标核酸与约100个芯片杂交以及将突变型目标核酸与约30个芯片杂交而获得每个数据。在图3和4中，x轴代表组分强度(A)，y轴代表组分比(M)。组分比(M)是针对比值(r)＝(野生型探针(WP)的杂交强度/突变型探针(MP)的杂交强度)应用自然对数(natural logarithm)而得到的。所述突变型探针是与包括突变体的核酸序列进行特异性杂交的探针，包括MP1(SEQ ID NO.2)、MP2(SEQ ID NO.4)、MP3(SEQ ID NO.6)和MP4(SEQ ID NO.8)。所述野生型探针是与野生型核酸序列进行特异性杂交的探针，包括WP1(SEQ ID NO.1)、WP2(SEQ ID NO.3)、WP3(SEQ ID NO.5)和WP4(SEQ ID NO.7)。组分强度(A)是通过对野生型探针(WP)的杂交强度和突变型探针(MP)的杂交强度的最大值应用自然对数而得到的。

图3A的MA图阐明了源于正常人的基因组DNA在对照微阵列上的杂交结果，所述对照微阵列上固定有根据常规方法设计的探针WP1和MP1。图3B的MA图阐明了目标核酸在微阵列上的杂交结果，所述微阵列上固定有根据本发明方法设计的寡核苷酸探针WP2和MP2。图4A的MA图阐明了源于正常人的基因组DNA在对照微阵列上的杂交结果，所述对照微阵列上固定有根据常规方法设计的探针WP3和MP3。图4B的MA图阐明了目标核酸在微阵列上的杂交结果，所述微阵列上固定有根据本发明方法设计的寡核苷酸探针WP4和MP4。在图3B和4B中，G-DNA是将源于正常人的基因组DNA用作目标核酸进行杂交的结果，G-MIMIC是使用合成的G-DNA得到的结果，Hetero和Homo分别为使用具有异型(hetero type)突变体和同型(homo type)突变体的人的基因组DNA得到的结果。

参照图3A、3B、4A和4B，当采用本发明的寡核苷酸探针时，突变型探针的荧光强度与野生型探针的荧光强度的比增加，但荧光强度都维持在相似的数值。即，通过采用本发明的寡核苷酸探针，荧光强度的差别增加了，并因而很容易进行特异性检测。

根据本发明的寡核苷酸探针在与目标核酸的杂交反应中可以减小非特异性反应。因此，本发明的寡核苷酸探针可以通过固定在DNA微阵列的基板上来使用。

根据本发明的微阵列，固定在基板上的寡核苷酸探针由于在靶位点核苷酸5′端方向的序列与其互补序列杂交的温度和在靶位点核苷酸3′端方向的序列与其互补序列杂交的温度之间的差别小，在采用所述微阵列的分析方法中可以获得强杂交信号。

此外，根据本发明设计具有增强的靶位点结合特异性的寡核苷酸探针的方法，可以制备具有增强的靶位点结合特异性的寡核苷酸探针。

尽管已经参照实施例对本发明进行了具体显示和描述，本领域普通技术人员应当理解：在不偏离由下面的权利要求书限定的本发明的主题和范围的前提下，可以在形式和细节方面对其进行各种改变。

序列表

<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.Ltd.)

<120>具有增强的结合特异性的多核苷酸探针，其上固定有

该探针的微阵列，以及设计该探针的方法

<130>PN053860

<160>10

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>WP1探针

<400>1

gtggtggaga cccttctgca gtaag 25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MP1探针

<400>2

gtggtggaga ccattctgca gtaag 25

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>WP2探针

<400>3

tggtggagac ccttctgcag taagg 25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MP2探针

<400>4

tggtggagac cattctgcag taagg 25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>WP3探针

<400>5

tcccacctgt cccaacacct caaca 25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MP3探针

<400>6

tcccacctgt ccaaacacct caaca 25

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>WP4探针

<400>7

cccacctgtc ccaacacctc aacaa 25

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MP4探针

<400>8

cccacctgtc caaacacctc aacaa 25

<210>9

<211>419

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

cgtggccctg tggcagccga gccatggttt ctaaactgag ccagctgcag acggagctcc 60

tggcggccct gctcgagtca gggctgagca aagaggcact gatccaggca ctgggtgagc 120

cggggcccta cctcctggct ggagaaggcc ccctggacaa gggggagtcc tgcggcggcg 180

gtcgagggga gctggctgag ctgcccaatg ggctggggga gactcggggc tccgaggacg 240

agacggacga cgatggggaa gacttcacgc cacccatcct caaagagctg gagaacctca 300

gccctgagga ggcggcccac cagaaagccg tggtggagac ccttctgcag taaggagccc 360

tgccccgtcc ccgctcccag gagagcctag aggggccccc ctcagctcct aacgagccc 419

<210>10

<211>326

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

cccttgctga gcagatcccg tccttgccct ctcccaggga ggacccgtgg cgtgtggcga 60

agatggtcaa gtcctacctg cagcagcaca acatcccaca gcgggaggtg gtcgatacca 120

ctggcctcaa ccagtcccac ctgtcccaac acctcaacaa gggcactccc atgaagacgc 180

agaagcgggc cgccctgtac acctggtacg tccgcaagca gcgagaggtg gcgcagcgta 240

agtaatgacc ctaccccgca tcttccctgg gagggcccag gactctcccc taactcatag 300

gtgggggctg gaagcttcac catccc 326

Claims

1.一种寡核苷酸探针，其中，包括靶位点核苷酸5′端方向第一个核苷酸到5′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)，与包括靶位点核苷酸3′端方向第一个核苷酸到3′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)之间的差别不高于5℃。

2.根据权利要求1的寡核苷酸探针，其具有15-50bp的长度。

3.一种微阵列，其上固定有权利要求1或2的寡核苷酸探针。

4.根据权利要求3的微阵列，其中，与野生型目标核酸完全匹配的野生型探针(wp)与其互补序列的杂交温度和与突变型目标核酸完全匹配的突变型探针(mp)与其互补序列的杂交温度之间的差别不高于5℃。

5.一种设计具有增强的靶位点结合特异性的寡核苷酸探针的方法，该方法包括：

计算包括靶位点核苷酸5′端方向第一个核苷酸到5′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)，与包括靶位点核苷酸3′端方向第一个核苷酸到3′端核苷酸的寡核苷酸序列与其互补寡核苷酸序列的杂交温度(Tm)之间的差别；并且

选取温度差别不高于5℃的寡核苷酸探针。