JP4243262B2 - オリゴヌクレオチドプローブ、前記プローブが固定化されているマイクロアレイ及び前記プローブを設計する方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドプローブ、前記プローブが固定化されているマイクロアレイ及び前記プローブを設計する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4243262B2 JP4243262B2 JP2005133690A JP2005133690A JP4243262B2 JP 4243262 B2 JP4243262 B2 JP 4243262B2 JP 2005133690 A JP2005133690 A JP 2005133690A JP 2005133690 A JP2005133690 A JP 2005133690A JP 4243262 B2 JP4243262 B2 JP 4243262B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- nucleotide
- oligonucleotide
- sequence
- target site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 title claims description 43
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 title claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 title description 78
- 238000002493 microarray Methods 0.000 title description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 68
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 68
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 40
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 40
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 37
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 30
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 38
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 36
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 34
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 18
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 18
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 11
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 4
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001424413 Lucia Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003499 nucleic acid array Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本発明は、標的核酸との結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブ、前記プローブが固定化されているマイクロアレイ及び前記プローブを設計する方法に関する。
「ポリヌクレオチドマイクロアレイ」とは、基板上にポリヌクレオチドのグループが高密度で固定化されているものであり、前記ポリヌクレオチドグループは、それぞれ一定の領域に固定化されているマイクロアレイを意味する。このようなマイクロアレイは当業界で周知のものである。マイクロアレイについては、例えば、特許文献１及び２に開示されている。基板上に固定化されているポリヌクレオチドは、一般的に分析しようとする核酸と特異的結合、例えば、ハイブリダイゼーション結合を行い、このような特異的結合を通じて標的核酸を分析する。基板上に固定化されており、標的核酸とハイブリダイゼーション結合を行えるポリヌクレオチドを、プローブポリヌクレオチド（または、オリゴヌクレオチド）という。
従来ポリヌクレオチドプローブの設計は、一般的に、標的核酸との融解温度を含む熱力学的変数、長さ、分子内のホモダイマーの形成如何、他のポリヌクレオチドプローブとの配列相同性の存否及び標的部位の位置などを考慮して設計された。それらのうち、熱力学的変数は、プローブ配列と標的核酸との混成化エネルギーを考慮するものであり、一定の範囲の融解温度を持つプローブを選択した。このような融解温度が高い場合には、特異的結合が増加し、低い場合には、非特異的結合が増加する傾向がある。したがって、従来のプローブ設計過程では、適当な範囲の融解温度を任意的に選択した。プローブの長さは、一般的に１５ないし５０ｂｐの長さが使われるが、これに限定されるものではない。プローブ分子内のホモダイマー形成や他のプローブとの配列相同性が存在する場合には望ましくなく、これを回避できる配列を持つことが望ましい。また、標的部位の位置は、一般的に立体的効果などを考慮してプローブの中央に対応するように位置させることが望ましい。
しかし、従来のポリヌクレオチドプローブの選択方法によれば、融解温度は、プローブ全体についてのみ考慮されたため、融解温度が同一または類似していても、標的部位に対応するヌクレオチドを基準として５’及び３’末端側のオリゴヌクレオチドの融解温度が顕著に異なる場合には、非特異的結合が発生する可能性があった。
本発明者らは、このような従来技術の問題点を解決するために集中的に研究していたところ、標的部位に対応するヌクレオチドから５’側に、最初のヌクレオチドから５’末端までのヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列、または３’側に、最初のヌクレオチドから５’末端までのヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列の標的核酸との融解温度が類似しているか、または同じ場合には、非特異的結合を顕著に減少させることができるということを見出して、本発明を完成するに至った。
米国特許第５，４４５，９３４号明細書
米国特許第５，７４４，３０５号明細書
本発明の目的は、結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記プローブが基板上に固定化されているマイクロアレイを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供することである。
本発明の一形態によれば、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差が０℃ないし７℃であるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
本発明の他の形態によれば、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列（但し標的部位の塩基は含まない）、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列（但し標的部位の塩基は含まない）、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差を計算して、その差が０℃ないし５℃となるオリゴヌクレオチドプローブを選択する段階を含む、標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供する。
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブによれば、標的核酸とのハイブリダイゼーション反応で非特異的反応が起きることを減少できる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡマイクロアレイの基板に固定化されて使われる。
本発明のマイクロアレイによれば、基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドプローブは、標的部位に対応するヌクレオチドから、５’末端側配列及びそれと相補的な配列の融解温度と、３’末端側配列及びその相補的配列の融解温度との差が小さいために、マイクロアレイを利用する分析方法で、強いハイブリダイゼーション信号を得ることができる。
また、本発明の標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法によれば、標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを製作できる。
以下、添付した図面を参照して本発明の望ましい実施形態について詳細に説明する。
本発明の一形態は、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差が０℃ないし７℃であるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
本発明において、オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸とハイブリダイゼーション反応を行い、得られるハイブリダイゼーション反応の程度を利用して標的核酸の遺伝子型を分析するのに使われるハイブリダイゼーションプローブを意味する。本発明において、標的核酸とは、分析しようとする標的部位を持っている核酸または核酸試料を意味する。「標的部位」とは、ヌクレオチドの変異が見つけられる標的核酸中の特定のヌクレオチド位置をいう。前記変異には、対立形質変異、単一ヌクレオチド多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）などが含まれるが、それらの例に限定されるものではない。また、変異を誘発させる原因には天然及び人工的な突然変異が含まれ、本発明で使われる変異は、それを誘発する原因によって特に限定されるものではない。
本発明において、融解温度（Ｔｍ）とは、２本のポリヌクレオチドがアニーリングによってハイブリダイゼーションされる場合、得られる２本鎖ポリヌクレオチドの最大値の半分に相当する２本のポリヌクレオチドが得られる温度、または２本のポリヌクレオチドが熱によって解離される場合、前記２本鎖ポリヌクレオチドの半分が解離する温度を意味する。融解温度は、ポリヌクレオチド中の塩基含有量、長さ、及び溶液中の塩の濃度によって変わることがある。本発明における融解温度（Ｔｍ）は、当業界で一般的に使われている溶液条件における融解温度を意味する。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、標的部位に対応するヌクレオチドを除外した５’末端側のオリゴヌクレオチド配列及びこれに対応する標的核酸の融解温度と、標的部位に対応するヌクレオチドを除外した３’末端側のオリゴヌクレオチド配列及びこれに対応する標的核酸の融解温度とが、互いに類似している。このような融解温度の差は、望ましくは０℃ないし７℃、さらに望ましくは０℃ないし５℃である。融解温度の差が前記条件を満足する限り、前記５’末端側のオリゴヌクレオチドと、前記３’末端側のオリゴヌクレオチドとの長さは同じであっても、異なってもよい。しかし、一般的に立体的効果などを考慮して、標的部位がオリゴヌクレオチドの中央部位近くに対応するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブが使われる。したがって、望ましくは、前記５’末端側のオリゴヌクレオチドと前記３’末端側のオリゴヌクレオチドとの長さは、類似または同一である。
本発明において、オリゴヌクレオチドプローブの長さは、当業界で一般的に使われている範囲の長さが使われ、特別に限定されるものではない。例えば、１５ｂｐないし５０ｂｐ、さらに望ましくは１５ｂｐないし４０ｂｐ、最も望ましくは２０ｂｐないし３０ｂｐである。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定化されて、標的核酸の分析に効果的に利用される。望ましくは、前記ＤＮＡマイクロアレイ基板上に固定化される本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、プローブ相互間にも類似した融解温度を持っており、それにより、前記マイクロアレイを利用して得られるハイブリダイゼーション反応の結果の品質を改善させることができる。
したがって、本発明のさらに他の形態は、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブが固定化されているマイクロアレイを提供する。すなわち、本発明のマイクロアレイに固定化されるオリゴヌクレオチドプローブは、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差が０℃ないし７℃であることが望ましく、より望ましくは０℃ないし５℃である。本発明のマイクロアレイに固定化される前記プローブは、野生型標的核酸に完全マッチするように結合する野生型プローブ（ｗｐ）及びその相補的配列との融解温度と、突然変異型標的核酸に完全マッチするように結合する突然変異型プローブ（ｍｐ）及びその相補的配列との融解温度の差も、０℃ないし７℃であることが望ましく、より望ましくは０℃ないし５℃である。
本発明のさらに他の形態は、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差を計算し、その差が０℃ないし７℃、望ましくは０℃ないし５℃となるオリゴヌクレオチドプローブを選択する段階を含む、標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供する。
本発明において、配列が知られたオリゴヌクレオチドの融解温度の計算方法は、当業界で周知のものである。このような融解温度の計算方法の例としては、サンタルチア（Ｊｏｈｎ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊｒ．）が、１９９６年以後持続的にヌクレオチドの反応実験の結果を発表しており、それら各場合による融解温度（Ｔｍ）などが広く使われている。また、このような融解温度の計算のために、商業的に利用可能なプログラムであるビジュアルＯＭＰ（ＤＮＡ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．製、米国）または公衆ウェブサイトに開放されているＭＥＬＴＳＩＭ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｍｅｌｔｓｉｍ／）などを使用できる。
本発明の方法において、前記融解温度の差と共に、従来のプローブ設計において一般的に考慮される事項が考慮される。このような考慮事項には、標的核酸との融解温度を含む熱力学的変数、長さ、分子内のホモダイマー形成如何、他のポリヌクレオチドプローブとの配列相同性の存否及び標的部位の位置などが含まれる。
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
比較例：従来方法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計
本比較例では、従来のオリゴヌクレオチドプローブの設計方法によってオリゴヌクレオチドを設計した。
本比較例では、従来のオリゴヌクレオチドプローブの設計方法によってオリゴヌクレオチドを設計した。
プローブ設計に考慮された事項は、融解温度を含むオリゴヌクレオチド全配列に対する熱力学的変数、標的部位はプローブの中央に対応させること、及びハイブリダイゼーション検索を通じて非特異的結合を最小化することなどが考慮された。
まず、分析しようとする突然変異部位を含む長さ１８ｂｐ〜２８ｂｐのプローブ候補配列を選択した。次いで、全体プローブと標的試料とのハイブリダイゼーションシミュレーションを実施して、Ｔｍが６５℃〜８０℃であるプローブを選択した。選択されたプローブを、選定された領域ではない他の標的配列部位に対してハイブリダイゼーションシミュレーションを実施して、相同性が５０％以上であるものを除外した。また、それらプローブに対しプローブ分子内のホモダイマーを形成する可能性があるかどうかを、シミュレーションを実施して確認し、ホモダイマー形成の可能性があるものは除外した。それらのうち、ＧＣ含有量が２０％〜８０％であるものを選択した。配列が完全に相補的な配列とのハイブリダイゼーション結果（完全マッチ）によるＴｍと、標的部位が相補的でない配列とのハイブリダイゼーション結果（ミスマッチ）によるＴｍとの差が３℃以上であるものを選択した。以上のように選択されたプローブのうち、完全マッチＴｍとミスマッチＴｍとの差が最も大きいものを選択した。
その結果、標的試料Ｅ０１−１１（配列番号９）の３４２番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、完全マッチする野生型プローブ（ＷＰ１：配列番号１）と、標的部位のみマッチしていない突然変異型プローブ（ＭＰ１：配列番号２）とを得た。ＷＰ１及びＭＰ１の標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は８．３℃であった（図１Ａ参照）。また、標的試料Ｅ０２−２２（配列番号１０）の１４７番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、完全マッチする野生型プローブ（ＷＰ３：配列番号５）と、標的部位のみマッチしていない突然変異型プローブ（ＭＰ３：配列番号６）とを得た。ＷＰ３及びＭＰ３の標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は７．０℃であった（図２Ａ参照）。
ＷＰ１及びＭＰ１の全体Ｔｍは１．５℃しか差がないが、標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は８．３℃で、相対的に大きい差が発生するために、非特異的結合が発生する可能性がある。ＷＰ３及びＭＰ３もまた全体Ｔｍは１．６℃しか差がないが、標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は７．０℃で、相対的に大きい差が発生するために、非特異的結合が発生する可能性がある。このような非特異的結合は、特異的結合に比べて結合力は低いために、ハイブリダイゼーションの結果測定される蛍光強度を低める。また、非特異的結合が発生する場合、標的核酸との特異的結合が妨害されるという問題も発生する。
したがって、このような従来方法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法によれば、結合特異性が低いという短所がある。
実施例１：本発明によるオリゴヌクレオチドプローブの設計
本実施例では、前記比較例で考慮された事項に、標的部位に対応するヌクレオチドの５’末端側と３’末端側とのオリゴヌクレオチドのＴｍを計算し、これを比較してその差ができるだけ小さなオリゴヌクレオチドプローブを選択した。具体的には、比較例のように、全体プローブと標的試料とのハイブリダイゼーションシミュレーションを実施してＴｍが６５℃〜８０℃であるプローブを選択した後、標的部位、例えば、突然変異部位を基点として右側と左側とのＴｍの差が５℃以下であるものを選択する過程をさらに含むことを除いては、比較例と同一である。
本実施例では、前記比較例で考慮された事項に、標的部位に対応するヌクレオチドの５’末端側と３’末端側とのオリゴヌクレオチドのＴｍを計算し、これを比較してその差ができるだけ小さなオリゴヌクレオチドプローブを選択した。具体的には、比較例のように、全体プローブと標的試料とのハイブリダイゼーションシミュレーションを実施してＴｍが６５℃〜８０℃であるプローブを選択した後、標的部位、例えば、突然変異部位を基点として右側と左側とのＴｍの差が５℃以下であるものを選択する過程をさらに含むことを除いては、比較例と同一である。
その結果、標的試料Ｅ０１−１１（配列番号９）の３４２番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、完全マッチする野生型プローブ（ＷＰ２：配列番号３）と、標的部位のみマッチしていない突然変異型プローブ（ＭＰ２：配列番号４）とを得た。ＷＰ２及びＭＰ２の標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は１．４℃であった（図１Ｂ参照）。また、標的試料Ｅ０２−２２（配列番号１０）の１４７番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、完全マッチする野生型プローブ（ＷＰ４：配列番号７）と、標的部位のみマッチしていない突然変異型プローブ（ＭＰ４：配列番号８）とを得た。ＷＰ４及びＭＰ４の標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は０．８℃であった（図２Ｂ参照）。
ＷＰ２及びＭＰ２の全体Ｔｍは、１．６℃しか差がないと同時に、標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差もやはり１．４℃で、差が相対的に小さいために、非特異的結合が発生する可能性が少ない。ＷＰ４及びＭＰ４もまた全体Ｔｍは１．７しか差がないと同時に、標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差も０．８℃で、差が相対的に小さいために、非特異的結合が発生する可能性が少ない。非特異的結合の比率が相対的に低くなるために、ハイブリダイゼーションの結果測定される蛍光強度が、従来方法によって設計されたプローブに比べて増加すると推定される。
実施例２：本発明のオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーション結果に及ぼす影響
本実施例では、前記比較例及び実施例１で製作されたオリゴヌクレオチドプローブ、すなわち、野生型標的核酸に相補的なプローブＷＰ１、ＷＰ２、ＷＰ３及びＷＰ４と、突然変異型標的核酸に相補的なプローブＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３及びＭＰ４とをマイクロアレイで固定化し、ハイブリダイゼーション反応を行った後、その結果を分析した。
本実施例では、前記比較例及び実施例１で製作されたオリゴヌクレオチドプローブ、すなわち、野生型標的核酸に相補的なプローブＷＰ１、ＷＰ２、ＷＰ３及びＷＰ４と、突然変異型標的核酸に相補的なプローブＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３及びＭＰ４とをマイクロアレイで固定化し、ハイブリダイゼーション反応を行った後、その結果を分析した。
まず、標的核酸（Ｅ０１−１１またはＥ０２−２２）に対するプローブとして、前記プローブを基板上に固定化してマイクロアレイを完成した。対照群マイクロアレイには、ＷＰ１とＭＰ１、及びＷＰ３とＭＰ３プローブを同じ方法によって固定化した。マイクロアレイは、アミン基を持つＷＰ２とＭＰ２、及びＷＰ４とＭＰ４を、エポキシ基を持つポリエチレングリコール（ＰｏｌｙＥｔｈｙｌｅｎＧｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）誘導体を利用したハイドロゲルと混合したスポッティング溶液を使用して製造した。アミン基を持つように表面処理されたガラス表面に、前記のように構成されたスポッティング溶液をバイオロボットプリンタ（モデルＰｉｘＳｙｓ ５５００、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ、米国）を利用してスポッティングした後、３７℃で４時間湿潤しているインキュベータに放置した。次いで、背景ノイズの制御に必要な工程、すなわち、標的核酸をガラス表面に付着させないために、スポッティングされていない位置のガラス表面アミン基が負電荷を持つように、反応を行って乾燥器に保管した。
標的核酸には蛍光物質をラベル化した。本実施例では、蛍光物質としてＣｙ３−ｄＵＴＰを使用し、標的核酸の本体または両末端にラベル化した。
標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーション条件は、０．１％ ６×ＳＳＰＥＴ溶媒（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＳａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ）に溶解させた２０ｎＭ濃度の標的核酸及びマイクロアレイを、３７℃で１６時間反応させた後、マイクロアレイを０．０５％ ６×ＳＳＰＥＴ及び０．０５％ ３×ＳＳＰＥＴで各５分ずつ常温にて洗浄し、５分間常温で乾燥させた後、スキャニングした。この時、スキャニングは、アクソンスキャナー（モデルＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，ＣＡ、米国）を利用し、スキャニングデータを解析するプログラムとして同社のＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ３．０プログラムを使用して比率成分及び強度成分を計算した。その結果を図３及び図４のＭＡグラフで図示した。各データは、正常型標的核酸とは約１００枚のチップとのハイブリダイゼーションを通じて、突然変異標的核酸とは約３０枚のチップとのハイブリダイゼーションを通じて得たものである。図３及び図４で、ｘ軸は強度成分（Ａ）を、ｙ軸は比率成分（Ｍ）を表す。比率成分（Ｍ）は、比率（ｒ）＝（野生型プローブのハイブリダイゼーション強度（ＷＰ）／突然変異型プローブのハイブリダイゼーション強度（ＭＰ））の値に自然対数を取った値である。突然変異型プローブとは、突然変異が含まれる核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブであって、ＭＰ１（配列番号２）、ＭＰ２（配列番号４）、ＭＰ３（配列番号６）及びＭＰ４（配列番号８）が含まれる。野生型プローブは、野生型標的核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブであって、ＷＰ１（配列番号１）、ＷＰ２（配列番号３）、ＷＰ３（配列番号５）とＷＰ４（配列番号７）が含まれる。強度成分（Ａ）は、野生型プローブのハイブリダイゼーション強度（ＷＰ）及び突然変異型プローブのハイブリダイゼーション強度（ＭＰ）の最大値に、常用対数を取って得られる値である。
図３Ａは、従来方法によって設計されたプローブＷＰ１及びＭＰ１が固定化されている対照群マイクロアレイに、正常の人間由来のゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた結果を示すＭＡグラフである。図３Ｂは、本発明の方法によって設計されたオリゴヌクレオチドプローブＷＰ２及びＭＰ２が固定化されたマイクロアレイに対する、標的核酸のハイブリダイゼーション結果を示すＭＡグラフである。また、図４Ａは、従来方法によって設計されたプローブＷＰ３及びＭＰ３が固定化されている対照群マイクロアレイに、正常の人間由来のゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた結果を示すＭＡグラフである。図４Ｂは、本発明の方法によって設計されたオリゴヌクレオチドプローブＷＰ４及びＭＰ４が固定化されたマイクロアレイに対する、標的核酸のハイブリダイゼーション結果を示すＭＡグラフである。図３Ｂ及び図４Ｂで、Ｇ−ＤＮＡは、正常の人間から由来したゲノムＤＮＡ、Ｇ−ＭＩＭＩＣは合成されたＧ−ＤＮＡ、ヘテロ（Ｈｅｔｅｒｏ）及びホモ（Ｈｏｍｏ）は、それぞれ標的部位にヘテロ型またはホモ型突然変異を持つ人間由来のゲノムＤＮＡを、標的核酸として使用した場合の結果である。また、図３Ｂ及び図４Ｂに示すコントロール１及び２は、いずれもＧ−ＤＮＡと同一の実験条件下での再現性を確認するために行った反復実験の結果を示すプロットである。
図３Ａ及び図３Ｂ、並びに図４Ａ及び図４Ｂに示したように、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、蛍光強度はほぼ類似した値に維持しつつ、野生型プローブに対する突然変異型プローブの蛍光強度比が増加した。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、蛍光強度の差が増加して特異的検出が容易になった。
本発明は、標的核酸との結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブ、前記プローブが固定化されているマイクロアレイ及び前記プローブを設計する方法の技術分野に好適に用いられる。
Claims (1)
- 標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列（但し標的部位の塩基は含まない）、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列（但し標的部位の塩基は含まない）、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差を計算して、その差が０℃ないし５℃となるオリゴヌクレオチドプローブを選択する段階を含む、標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020040030447A KR100580649B1 (ko) | 2004-04-30 | 2004-04-30 | 결합 특이성이 개선된 폴리뉴클레오티드 프로브, 상기프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기프로브를 설계하는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005318895A JP2005318895A (ja) | 2005-11-17 |
| JP4243262B2 true JP4243262B2 (ja) | 2009-03-25 |
Family
ID=34935046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005133690A Expired - Fee Related JP4243262B2 (ja) | 2004-04-30 | 2005-04-28 | オリゴヌクレオチドプローブ、前記プローブが固定化されているマイクロアレイ及び前記プローブを設計する方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050244871A1 (ja) |
| EP (1) | EP1591538B1 (ja) |
| JP (1) | JP4243262B2 (ja) |
| KR (1) | KR100580649B1 (ja) |
| CN (1) | CN1858244A (ja) |
| DE (1) | DE602005023236D1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100682894B1 (ko) | 2004-10-26 | 2007-02-15 | 삼성전자주식회사 | 복수 개의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터프로브를 선택하는 방법 |
| KR100745763B1 (ko) * | 2005-03-08 | 2007-08-02 | 삼성전자주식회사 | 프로브 세트를 설계하는 방법, 그에 의하여 설계된 프로브세트, 상기 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이, 및상기 프로브 세트를 이용한 표적 서열의 동정 방법 |
| JP4957069B2 (ja) * | 2006-05-01 | 2012-06-20 | ソニー株式会社 | プローブ核酸配列設計方法、プローブ核酸、検出表面、プログラム、情報記憶媒体、並びにプローブ核酸設計システム |
| WO2009130797A1 (ja) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | 東洋鋼鈑株式会社 | Abo式血液型を判定するためのプローブセット |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5455935A (en) * | 1991-05-31 | 1995-10-03 | Tandem Computers Incorporated | Clock synchronization system |
| US6472156B1 (en) * | 1999-08-30 | 2002-10-29 | The University Of Utah | Homogeneous multiplex hybridization analysis by color and Tm |
-
2004
- 2004-04-30 KR KR1020040030447A patent/KR100580649B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-04-12 DE DE602005023236T patent/DE602005023236D1/de active Active
- 2005-04-12 EP EP05007987A patent/EP1591538B1/en not_active Not-in-force
- 2005-04-20 US US11/110,281 patent/US20050244871A1/en not_active Abandoned
- 2005-04-28 JP JP2005133690A patent/JP4243262B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-04-30 CN CNA2005100679742A patent/CN1858244A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100580649B1 (ko) | 2006-05-16 |
| KR20050104973A (ko) | 2005-11-03 |
| JP2005318895A (ja) | 2005-11-17 |
| EP1591538A1 (en) | 2005-11-02 |
| CN1858244A (zh) | 2006-11-08 |
| DE602005023236D1 (de) | 2010-10-14 |
| US20050244871A1 (en) | 2005-11-03 |
| EP1591538B1 (en) | 2010-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dapprich et al. | The next generation of target capture technologies-large DNA fragment enrichment and sequencing determines regional genomic variation of high complexity | |
| Suchan et al. | Hybridization capture using RAD probes (hyRAD), a new tool for performing genomic analyses on collection specimens | |
| Hild et al. | An integrated gene annotation and transcriptional profiling approach towards the full gene content of the Drosophila genome | |
| JP4721603B2 (ja) | 変異および／または多型の検出方法 | |
| Beuzen et al. | Molecular markers and their use in animal breeding | |
| Dalma‐Weiszhausz et al. | [1] the Affymetrix GeneChip® platform: an overview | |
| EP2339025B1 (en) | Methods for determining the methylation profiles | |
| Dong et al. | Flexible use of high-density oligonucleotide arrays for single-nucleotide polymorphism discovery and validation | |
| Myllykangas et al. | Efficient targeted resequencing of human germline and cancer genomes by oligonucleotide-selective sequencing | |
| JP2006520206A (ja) | プローブ、バイオチップおよびそれらの使用方法 | |
| EP1578932A2 (en) | Synthetic tag genes | |
| Broude et al. | DNA microarrays with stem–loop DNA probes: preparation and applications | |
| Katzman et al. | GC-biased evolution near human accelerated regions | |
| Geraldes et al. | High levels of nucleotide diversity in the European rabbit (Oryctolagus cuniculus) SRY gene | |
| WO2018174821A1 (en) | A sequencing method for detecting dna mutation | |
| Zhou et al. | The zon laboratory guide to positional cloning in zebrafish | |
| WO2008118839A1 (en) | Exon grouping analysis | |
| JP2009516516A (ja) | ヌクレオチド配列を同定するための方法及びプローブ | |
| JP4243262B2 (ja) | オリゴヌクレオチドプローブ、前記プローブが固定化されているマイクロアレイ及び前記プローブを設計する方法 | |
| JP2008526253A (ja) | ウシにおける牛乳産生増大のためのｄｎａマーカー | |
| JP4257335B2 (ja) | 塩基ミスマッチに対する識別方法 | |
| Almomani et al. | Experiences with array-based sequence capture; toward clinical applications | |
| Jia et al. | Development of novel EST microsatellite markers for genetic diversity analysis and correlation analysis of velvet antler growth characteristics in Sika deer | |
| Tang et al. | Simple and effective method for generating single-stranded DNA targets and probes | |
| CN107937493A (zh) | 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080819 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081113 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081209 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081226 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120109 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130109 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140109 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |