JP4257335B2 - 塩基ミスマッチに対する識別方法 - Google Patents

Description

本発明は、塩基ミスマッチに対する識別方法に関し、詳細にはハードルＤＮＡおよび人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブを用いた、１塩基ミスマッチに対する識別方法に関する。

核酸配列における変異を識別する標準的な方法は、相補的な核酸ターゲット鎖の１つのオリゴヌクレオチド鎖による特異的な認識に依存する。プローブおよびターゲットが同一ではない場合、二本鎖の相互の親和性は低下する。親和性の低下は、二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を測定することによって容易にモニタできる、二重鎖の熱安定性における低下によって明らかになる。パーフェクトマッチのプローブと第１ターゲットとの二重鎖の融解温度と、このパーフェクトマッチのプローブと１つのヌクレオチドで第１ターゲットとは異なる第２ターゲットとの二重鎖の融解温度との差（△Ｔｍ）は、ＤＮＡでの配列の変異を識別するために有用であると証明されている。非特許文献１では、１個の塩基が異なる短いオリゴマーの間の差異を識別した。次に、非特許文献２では、β−グロビン遺伝子中の点突然変異を調べるために、非特許文献１に記載の方法を使用した。その結果、二重鎖の熱安定性は、プローブとターゲットとの間の配列に基づいて、合理的に正確に予測されうる。

ハイブリダイゼーションは有用であり有力な技術になりうるが、パーフェクトマッチの二重鎖、およびミスマッチの二重鎖、特に１塩基ミスマッチを有する場合、の間の安定性の違いは非常に小さく、２つの二重鎖間のＴｍの差が０．５℃ほどにしかならないという点で限界がある（非特許文献３および非特許文献４を参照）。さらに重要なことは、オリゴマープローブの長さが長くなるほど、全体の二重鎖の安定性に対する１塩基ミスマッチによる否定的な影響が減少することが分かったということである。関連性の少ない遺伝子を除外しても、１つの遺伝子に対するハイブリダイゼーションの特異性を増大させるために、プローブの長さを伸ばすことが望ましいため、これは重要な制限である。したがって、密接に関連した遺伝子を特異的に識別する能力は、ゲノムのだんだんと狭くなっていく領域に対してハイブリダイゼーション研究の焦点を合わせたいとする要求に対応していない。要求されていることは、プローブとターゲットとの間で形成された二重鎖の融解温度の差を大きくすることにより、密接に関連した遺伝子を識別する能力を改善する方法である。

特許文献１は、修飾オリゴヌクレオチドを用いた配列変異を含む、コントロール核酸ターゲットと変異核酸ターゲットとを区別する能力を改善する、核酸のハイブリダイゼーション方法が開示されている。１塩基ミスマッチに対する識別を向上させるために、塩基類似体として、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロールを用いて人為的ミスマッチが導入されている。しかし、前記塩基類似体の合成は困難であり、かつ本発明のハードルＤＮＡの添加によるブロッキング効果に関する記載はない。
米国特許第６，７６４，６９３号明細書 Ｗａｌｌａｃｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９、ｐ．８７９、１９８１ Ｃｏｒｎｅｒ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８０、ｐ．２７８、１９８３ Ｔｉｂａｎｙｅｎｄａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：１９、１９８４ Ｅｂｅｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２０８３、１９９２

本発明者らは、前記問題点を鑑み鋭意研究した結果、ハードルＤＮＡの添加およびプローブ塩基の変異を利用することにより、塩基ミスマッチに対する識別能力が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、ハードルＤＮＡおよび人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブを用いた、塩基ミスマッチに対する識別方法を提供することである。

前記本発明の課題を解決するために、本発明は、多型性部位を有するターゲットＤＮＡに完全に相補的なプローブの１個の塩基を、ミスマッチの野生型塩基で人為的に置換することによって第１プローブを合成し、前記ターゲットＤＮＡの多型性部位に対応する位置に１塩基ミスマッチを有する他のプローブの１個の塩基を、ミスマッチの野生型塩基に人為的に置換することによって第２プローブを合成するステップと、前記第１プローブと完全に相補的な配列を有し前記第１プローブより短い第１ハードルＤＮＡ、および前記第２プローブと完全に相補的な配列を有し前記第２プローブより配列が短い第２ハードルＤＮＡを合成するステップと、前記第１プローブおよび前記第２プローブを基板上に固定化させるステップと、固定化された前記第１プローブおよび前記第２プローブを、前記第１ハードルＤＮＡおよび前記第２ハードルＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせるステップと、前記ターゲットＤＮＡを混成化させるステップとを含み、前記第１プローブおよび前記第２プローブは、人為的ミスマッチ塩基を同じ位置（ただし、該位置は多型性部位ではない）に少なくとも１個含むことを特徴とする、塩基ミスマッチに対する識別方法を提供する。

本発明によれば、ハードルＤＮＡの添加およびプローブ塩基の変異を用いることにより、塩基ミスマッチに対する識別能力を向上させることができる。

以下、添付された図面を参照しつつ、本発明の望ましい実施形態を詳細に説明する。

本発明の目的を達成するために、本発明は、多型性部位を有するターゲットＤＮＡに完全相補的なプローブの１個の塩基を、ミスマッチの野生型塩基で人為的に置換することによって第１プローブを合成し、前記ターゲットＤＮＡの多型性部位に対応する位置に１塩基ミスマッチを有する他のプローブの１個の塩基を、ミスマッチの野生型塩基で人為的に置換することによって第２プローブを合成するステップと、前記第１プローブとそれぞれ完全に相補的な配列を有し前記第１プローブより配列が短い第１ハードルＤＮＡ、および前記第２プローブと完全に相補的な配列を有し前記第２プローブより配列が短い第２ハードルＤＮＡを合成するステップと、前記第１プローブおよび前記第２プローブを基板上に固定化させるステップと、固定化された前記第１プローブおよび前記第２プローブを、前記第１ハードルＤＮＡおよび第２ハードルＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせるステップと、前記ハイブリダイズさせるステップで得られた前記第１プローブと前記第１ハードルＤＮＡとのハイブリッド、および前記第２プローブと前記第２ハードルＤＮＡとのハイブリッドを、それぞれターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせるステップとを含む、塩基ミスマッチに対する識別方法を提供する。このとき、ターゲットＤＮＡは、ハードルＤＮＡと競合してプローブＤＮＡに結合する。

本発明の一実施形態において、ＤＮＡチップ中の１塩基ミスマッチに対する識別能力を向上させるために、ハードルＤＮＡおよび１塩基が修飾されたプローブが用いられる。図１は、本発明の一実施形態による、ハードルＤＮＡおよび人為的ミスマッチが導入されたプローブを用いる、１塩基ミスマッチに対する識別を向上させる方法を表す模式図である。図１から分かるように、第１プローブおよびターゲットＤＮＡは、人為的にミスマッチさせた１個の塩基（図１で、長い白抜き矢印で表示した箇所）以外のすべての部分において互いに相補的であり、第２プローブおよびターゲットＤＮＡは、ターゲットＤＮＡ上の１塩基ミスマッチ（図１で、白抜き文字で表示した塩基）、および人為的に導入した塩基ミスマッチ（図１で、長い白抜き矢印で表示した箇所）を含む。また、第１ハードルＤＮＡは、第１プローブと完全に相補的であり、第１プローブよりも短い。第２ハードルＤＮＡは、第２プローブと完全に相補的であり、第２プローブよりも短い。第１ハードルＤＮＡおよび第２ハードルＤＮＡは、同じ長さの配列を有する。

本特許出願の目的のために、「ターゲットＤＮＡ」は、染色体または染色体の一部分であるか、またはプラスミド、オリゴヌクレオチド、もしくは他の核酸フラグメントなどの組み換え核酸分子であり得、自然発生するか、または合成されうる。ターゲットがＤＮＡである場合、ＤＮＡは、本発明に使われるために、単一鎖のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションできる、変性された形態かまたは単一鎖の形態で提供されるということが分かっている。

従来の方法において、第１ハードルＤＮＡおよび第２ハードルＤＮＡを使用せずに、１塩基ミスマッチを識別するために、プローブに人為的に塩基ミスマッチが導入されている。しかし、本発明の方法においては、ターゲットＤＮＡをプローブとハイブリダイズさせる前に、ハードルＤＮＡをプローブとハイブリダイズさせる。第１ハードルＤＮＡは、ターゲットＤＮＡより長さが短いため、第１ハードルＤＮＡと第１プローブとのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）は、ターゲットＤＮＡと第１プローブとのハイブリッドの融解温度より低い。したがって、好適なハイブリダイゼーション条件下で、ターゲットＤＮＡによる、あらかじめ第１プローブとハイブリダイズされた第１ハードルＤＮＡの置換が起きる。また、第２ハードルＤＮＡも、ターゲットＤＮＡよりは長さが短いが、第２ハードルＤＮＡと第２プローブとのハイブリッドの融解温度は、ターゲットＤＮＡおよび第２プローブのハイブリッドの融解温度と同じかまたはより高い（図４参照）。これは、第２プローブは１塩基ミスマッチを含むためである。したがって、好適なハイブリダイゼーション条件下で、ターゲットＤＮＡによる、あらかじめ第２プローブとハイブリダイズされた第２ハードルＤＮＡの置換が起こらない。このため、第２ハードルＤＮＡは、相補的ではないターゲットＤＮＡが第２プローブとハイブリダイズされることを防止する。

すなわち、第１ハードルＤＮＡは、ターゲットＤＮＡにより容易に置換されるが、第２ハードルＤＮＡは、ターゲットＤＮＡにより容易に置換されない。そのため、ターゲットＤＮＡは、第２プローブよりも第１プローブに対してより容易にハイブリダイズする。したがって、１塩基ミスマッチに対する識別能力が改良されうる。これは、蛍光標識されたターゲットＤＮＡを実験に用い、相対的な蛍光強度の差異、すなわち、第１プローブにハイブリダイズされたターゲットＤＮＡの蛍光強度に対する、第２プローブにハイブリダイズされたターゲットＤＮＡの蛍光強度の比率を測定すれば、さらに容易に観察できる。したがって、蛍光強度の差が大きければ大きいほど、１塩基ミスマッチに対する識別能力は、向上しうる。

また、前記１塩基ミスマッチは、ターゲットＤＮＡの多型性部位に相当する場所に位置することができる。ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）は、いろいろなヒトからの細胞核中の染色体が有する３０億個の塩基配列のうち、１個、または数十個の塩基変異をいう。かかるＳＮＰにより現れる代表的な疾患が鎌形赤血球貧血症（ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｎｅｍｉａ）であるが、これは、特定部位の１個の塩基が他の塩基に置換されて起こる。遺伝子の特定位置で発生する１塩基ミスマッチを識別するためには、本発明の方法が必要とされる。

本発明の一実施形態において、前記第１プローブおよび前記第２プローブは、同じ位置で人為的ミスマッチ塩基をさらに含むことができる。図２は、１塩基ミスマッチに対する識別能力を向上させるために、人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブＤＮＡとハードルＤＮＡとのハイブリッド、および人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリッドの、相対的な安定性を表した模式図である。本発明の方法において、１塩基ミスマッチを識別するために、ハードルＤＮＡだけを用いた場合、第１プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドの融解温度と、第２プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドの融解温度との差が相対的に低く、１塩基ミスマッチを効率的に識別できないこともある。したがって、１塩基ミスマッチをより効率的に識別するために、プローブ内に人為的に塩基ミスマッチを導入するのである（図２および４で、長い白抜き矢印で表示された位置において、本来のプローブ配列でのＡを、Ｔ（白抜き文字で表している）に変形）。すなわち、第１プローブおよび第２プローブの同じ位置に人為的ミスマッチ塩基を導入すれば、下記実施例で示すように、１塩基ミスマッチに対する識別能力が向上する。

本発明の一実施形態において、前記多型性部位は、ヌクレオチドの置換、付加、および欠失からなる群より選択されうる。前記では、ターゲットＤＮＡに対する核酸の置換から起こるミスマッチについて言及したが、核酸の付加および欠失も含まれる。

本発明の一実施形態において、前記人為的ミスマッチ塩基は、２個のヌクレオチドで生じうる。プローブに１個の人為的ミスマッチ塩基が導入されうるが、２個以上の人為的ミスマッチ塩基は、１塩基ミスマッチの識別の向上へ導くことができる。これは、ターゲットＤＮＡによって適切に適用されうる。望ましくは、前記人為的ミスマッチ塩基は、２個のヌクレオチドで生じる。

本発明の一実施形態において、前記人為的ミスマッチ塩基は、連続的に配列されうるか、または１個以上のヌクレオチドにより分離されうる。２個以上の人為的ミスマッチ塩基が導入される場合、１個の人為的ミスマッチ塩基はヌクレオチドに導入され、他の人為的ミスマッチ塩基はミスマッチヌクレオチドに隣接したヌクレオチドに導入されうる。また、１個の人為的ミスマッチ塩基がヌクレオチドに導入され、他の人為的ミスマッチ塩基は、塩基ミスマッチが導入されたヌクレオチドから１個以上のヌクレオチドにより分離されたヌクレオチドに導入されうる。これは、ターゲットＤＮＡによって適切に適用可能である。前記人為的ミスマッチ塩基が１個以上のヌクレオチドにより分離される場合には、８個ないし２０個のヌクレオチドにより分離されることが望ましい。

本発明の一実施形態において、前記多型性部位および前記人為的ミスマッチ塩基は、１個以上のヌクレオチドにより分離されうる。ハードルＤＮＡのハイブリダイゼーションが起こる領域内に存在する塩基ミスマッチと人為的ミスマッチ塩基とは、１個以上のヌクレオチド、望ましくは、３個ないし１５個のヌクレオチドにより分離されうる。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されると解釈されることがあってはならない。

実施例１：１個の塩基で置換されたＤＮＡに対する識別
１個の塩基で置換されたＤＮＡに対する識別の効果を調べるために、下記４種のプローブセットを用いた。

前記表１に示す４種の異なるＤＮＡプローブセットを、１μＭの濃度で、アミノシランによりコートされたウエハ上に、従来の固定化技術を用いて固定化させた。プローブＤＮＡに対するハードルＤＮＡのハイブリダイゼーションは、１μＭのハードルＤＮＡを、ＤＮＡプローブと４０℃で１時間反応させることにより行った。

準備された４種のＤＮＡプローブに、ＣＹ−３で標識されたターゲットオリゴマー（５’−ＴＡＧＧＣＡＴＡＣＴＣＡＴＴＧＴＣＡＴ−３’）（配列番号７、この配列は表１に開示されている正常プローブセットの第１プローブと完全に相補的であり、第２プローブとは、１塩基ミスマッチである。）を２ｎＭの濃度で、４０℃で１時間ハイブリダイズさせた。１時間の反応後、５分間の弱い撹拌の下、３×ＳＳＣ溶液で洗浄を実施し、次いで１×ＳＳＣ溶液で５分間追加洗浄を実施した。チップを乾燥後、スキャナ（ＣＹ−３）波長５３２ｎｍを用いて蛍光強度を測定し、第１プローブに結合したターゲットＤＮＡの信号と第２プローブに結合したターゲットＤＮＡの信号との比（ＰＭ（Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ Ｍａｔｃｈｅｄ）／ＭＭ（ＭｉｓＭａｔｃｈｅｄ）比）を測定した。Ｔｍ値は、１９９８年にＳａｎｔａｌｕｃｉａらが発表したパラメータを用いて計算した。

図３は、人為的ミスマッチ塩基が導入されていない通常のプローブＤＮＡとハードルＤＮＡとのハイブリッド、および人為的ミスマッチ塩基が導入されていない通常のプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリッドの相対的な安定性を表した模式図である。図３から分かるように、表１の３番のプローブセットを用いてＴｍ値を計算した結果、第１プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値が、第１プローブと第１ハードルＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値より高いため、第１プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドがより安定であることが分かった。したがって、第１ハードルＤＮＡは、ターゲットＤＮＡにより容易に置換されうる。また、第２プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値は、第２プローブと第２ハードルＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値より高いため、第２プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドがより安定であることが分かった。したがって、第２ハードルＤＮＡは、ターゲットＤＮＡにより容易に置換されうる。これは、第１ハードルＤＮＡはターゲットＤＮＡにより容易に置換され、第２ハードルＤＮＡはターゲットＤＮＡにより容易に置換されないという本発明の目的とは相反する結果である。しかし、前記結果は、本発明の一例から得られた結果である。

したがって、１塩基ミスマッチに対する識別能力を向上させるために、第１プローブおよび第２プローブの同じ位置に１個の塩基変異を導入した。図４は、１つの人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブとハードルＤＮＡのハイブリッドのＴｍ値、および１個の人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値を示している。図４から分かるように、長い白抜き矢印で表示された部分に１つの塩基変異（白抜きの文字Ｔでも表している）を導入してＴｍ値を計算した結果、第１プローブと第１ハードルＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値は変化しなかったが、第１プローブとターゲットとのハイブリッドのＴｍ値は６３．５℃から５５．２℃に低下した。しかし、第１プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値は第１プローブと第１ハードルＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値より高く、より安定であることが分かった。よって、第１ハードルＤＮＡは、ターゲットＤＮＡにより容易に置換されうる。一方、第２プローブと第２ハードルＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値は変化しなかったが、第２プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値は５４．７℃から４４．２℃に低下した。しかし、第２プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値は、第２プローブと第２ハードルＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値より低く、より不安定であることが分かった。よって、第２ハードルＤＮＡは、ターゲットＤＮＡにより容易に置換されない。これは、第１ハードルＤＮＡはターゲットＤＮＡにより容易に置換され、第２ハードルＤＮＡはターゲットＤＮＡにより容易に置換されないという本発明の目的と一致する結果である。また、前記の結果は、プローブにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせた後のＰＭ／ＭＭ比とも一致する（図５参照）。

図５は、表１の４種の異なるプローブセットに、ＣＹ−３で標識されたターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせた後の蛍光強度を測定したものである（図５では、野生型ミスマッチは短い白抜き矢印、人為的ミスマッチは長い黒の矢印で表示した）。図６は、表１の各プローブセットのＰＭ／ＭＭ比を表したグラフ（正常：表１の＃１のプローブセット、ハードルＤＮＡ：表１の＃３のプローブセット、ハードルＤＮＡ＋塩基変異：表１の＃４のプローブセット、および塩基変異：表１の＃２のプローブセット）である。図５および６から分かるように、ハードルＤＮＡおよび塩基変異を導入した場合が、正常プローブセットに比べてＰＭ／ＭＭ比が顕著に増大する。塩基変異だけを導入した場合も、正常プローブセットに比べてＰＭ／ＭＭ比が増大するが、ハードルＤＮＡだけを導入した場合には、正常プローブセットとＰＭ／ＭＭ比がほとんど同一である。しかし、前記結果は、プローブの配列および長さ、ならびにハードルＤＮＡの長さによって変わりうる。すなわちプローブの配列および長さ、ならびにハードルＤＮＡの長さを適切に選択すれば、ハードルＤＮＡだけ導入した場合にも、本発明の効果を得ることができる。

実施例２：１個の塩基が挿入されたＤＮＡに対する識別
１個の塩基の挿入されたＤＮＡに対する識別を調べるために、下記５種のプローブセットを用いた。

実験方法は、実施例１の方法と同様であり、ターゲットＤＮＡ配列は、５’−ｔｇｃｔｇａｃＡＧＧＧＧＧＧＡｇｇｇｇｇ−３’（配列番号１８）であった。

図７は、表２の各プローブセットのＰＭ／ＭＭ比を表したグラフである（正常：表２の＃１のプローブセット、１ＭＭ：表２の＃２のプローブセット、２ＭＭ：表２の＃３のプローブセット、１ＭＭ＋Ｈ：表２の＃４のプローブセット、および２ＭＭ＋Ｈ：表２の＃５のプローブセット）。図７から分かるように、ハードルＤＮＡおよび２塩基ミスマッチを導入した場合が、正常プローブセットに比べてＰＭ／ＭＭ比が顕著に増大するということが分かる。また、ハードルＤＮＡおよび１塩基ミスマッチを導入した場合も、正常プローブセットに比べてＰＭ／ＭＭ比が増大するということが分かる。

本発明の塩基ミスマッチに対する識別方法は、例えば試料の検査関連の技術分野に効果的に適用可能である。

ハードルＤＮＡおよび人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブを用いる、本発明の塩基ミスマッチに対する識別方法の一実施形態を表す模式図である。 人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブＤＮＡとハードルＤＮＡとのハイブリッド、および人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリッドの、相対的な安定性を表した模式図である。 人為的ミスマッチ塩基が導入されていないプローブＤＮＡとハードルＤＮＡとのハイブリッド、および人為的ミスマッチ塩基が導入されていないプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリッドの相対的な安定性を表した模式図である。 １個の人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブとハードルＤＮＡ、および１個の人為的ミスマッチ塩基が導入されたプローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値を示す図面である。 表１の４種のプローブセットに、ＣＹ−３で標識されたターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせた後のＰＭ／ＭＭ比を測定した結果を表す図面である。 表１の各プローブセットのＰＭ／ＭＭ比を表したグラフである。 表２の各プローブセットのＰＭ／ＭＭ比を表したグラフである。

Claims (7)

1. 多型性部位を有するターゲットＤＮＡに完全に相補的なプローブの１個の塩基を、ミスマッチの野生型塩基で人為的に置換することによって第１プローブを合成し、前記ターゲットＤＮＡの多型性部位に対応する位置に１塩基ミスマッチを有する他のプローブの１個の塩基を、ミスマッチの野生型塩基で人為的に置換することによって第２プローブを合成するステップと、
   前記第１プローブと完全に相補的な配列を有し前記第１プローブより配列が短い第１ハードルＤＮＡ、および前記第２プローブと完全に相補的な配列を有し前記第２プローブより配列が短い第２ハードルＤＮＡを合成するステップと、
   前記第１プローブおよび前記第２プローブを基板上に固定化させるステップと、
   固定化された前記第１プローブおよび前記第２プローブを、前記第１ハードルＤＮＡおよび前記第２ハードルＤＮＡとそれぞれハイブリダイズさせるステップと、
   前記ハイブリダイズさせるステップで得られた前記第１プローブと前記第１ハードルＤＮＡとのハイブリッド、および前記第２プローブと前記第２ハードルＤＮＡとのハイブリッドを、それぞれターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせるステップと、
   を含み、
   前記第１プローブおよび前記第２プローブは、人為的ミスマッチ塩基を同じ位置（ただし、該位置は多型性部位ではない）に少なくとも１個含むことを特徴とする、塩基ミスマッチに対する識別方法。
2. 前記多型性部位は、塩基の置換、付加、および欠失からなる群より選択される１つにより出現していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記人為的ミスマッチ塩基は、２個のヌクレオチドで生じることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記人為的ミスマッチ塩基は、連続的に配列されるか、または１個以上のヌクレオチドにより分離されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記人為的ミスマッチ塩基は、８個ないし２０個のヌクレオチドにより分離されていることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記多型性部位および人為的ミスマッチ塩基は、１個以上のヌクレオチドにより分離されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記多型性部位および人為的ミスマッチ塩基は、３個ないし１５個のヌクレオチドにより分離されていることを特徴とする、請求項６に記載の方法。