KR100682923B1 - 허들 ｄｎａ와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를이용한 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상 방법 - Google Patents
허들 ｄｎａ와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를이용한 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100682923B1 KR100682923B1 KR1020050006085A KR20050006085A KR100682923B1 KR 100682923 B1 KR100682923 B1 KR 100682923B1 KR 1020050006085 A KR1020050006085 A KR 1020050006085A KR 20050006085 A KR20050006085 A KR 20050006085A KR 100682923 B1 KR100682923 B1 KR 100682923B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- probe
- dna
- base
- hurdle
- mismatch
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/185—Modifications characterised by incorporating bases where the precise position of the bases in the nucleic acid string is important
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/113—Heteroduplex formation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 다형성 부위(polymorphic site)를 갖는 타겟 DNA에 완전 상보적인 프로브에 인위적으로 염기 하나를 미스매치의 자연적 염기로 치환시켜 제 1 프로브를 합성하고, 상기 타겟 DNA의 다형성 부위에 상응하는 위치에 하나의 미스매치 염기를 포함하는 다른 프로브에 인위적으로 염기 하나를 미스매치의 자연적 염기로 치환시켜 제 2 프로브를 합성하는 단계; 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브와 각각 완전하게 상보적인 서열을 가지며, 각각의 프로브보다는 짧은 서열의 길이를 갖는 제 1 허들(hurdle) DNA 및 제 2 허들 DNA를 합성하는 단계; 상기 합성된 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 기판 위에 고정화시키는 단계; 상기 고정화된 제 1 프로브 및 제 2 프로브와 상기의 제 1 허들(hurdle) DNA 및 제 2 허들 DNA를 각각 혼성화시키는 단계; 및 상기 타겟 DNA를 혼성화시키는 단계를 포함하는 다형성 부위를 갖는 타겟에 대한 구별을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 허들 DNA 첨가와 프로브 염기의 변형을 통해 단일 염기 미스매치에 대한 구별 능력을 향상시킬 수 있다.
Description
도 1은 허들 DNA와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를 이용하는 본 발명의 단일 염기 미스매치에 대한 구별을 향상시키는 방법의 일 구체예를 나타내는 모식도이다.
도 2는 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상을 위해 요구되는 인공적인 미스매치 염기가 도입된 각 프로브 DNA와 허들 DNA의 혼성체(hybrid)와 인공적인 미스매치 염기가 도입된 각 프로브 DNA와 타겟 DNA의 혼성체의 상대적인 안정성을 나타낸 모식도이다.
도 3은 인공적인 미스매치 염기가 도입되지 않은 각 프로브 DNA와 허들 DNA의 혼성체와 인공적인 미스매치 염기가 도입되지 않은 각 프로브 DNA와 타겟 DNA의 혼성체의 상대적인 안정성을 나타낸 모식도이다.
도 4는 1개의 인공적인 미스매치 염기가 도입된 각 프로브와 각 허들 DNA 및 타겟 DNA와의 혼성체의 Tm 값을 보여준다.
도 5는 표 1의 4종류의 프로브 세트에 CY-3 표지된 타겟 DNA를 혼성화한 후의 형광 강도를 측정한 것이다.
도 6은 표 1의 각 프로브 세트의 PM(perfect matched)/MM(mismatched) 비를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 표 2의 각 프로브 세트의 PM/MM 비를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 허들 DNA와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를 이용한 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상 방법에 관한 것이다.
핵산 서열에 있어서의 변이를 식별하는 표준 방법은 상보적인 핵산 타겟 가닥에서 하나의 올리고뉴클레오티드 가닥에 의한 특이적인 인식에 의존한다. 프로브와 타겟이 동일하지 않은 경우, 서로에 대한 두 가닥들의 친화도는 감소된다. 감소된 친화도는 이중쇄 융해 온도(Tm)를 측정하여 용이하게 모니터될 수 있는 이중쇄 열 안정성에 있어서의 감소로 분명히 알 수 있다. 완전하게 매치된 프로브와 제1 타겟 및 완전하게 매치된 동일한 프로브와 하나의 뉴클레오티드에서 제1 타겟과 차이가 있는 제2 타겟 사이의 이중쇄 융해 온도의 차이(△Tm)는 DNA에서 서열 변이를 식별하는데 유용하게 사용되는 것으로 밝혀졌다. 하나의 염기에서 차이가 있는 짧은 올리고머들을 구별하는 방법이 Wallace, B. R. 등에 의한 문헌(Nucleic Acids Research 9:879(1981))에 기재되어 있다. 다음으로, Corner, B. J. 등의 문헌(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:278(1983))에서는 β-글로빈 유전자에서 점 돌연변이를 조사하기 위하여 Wallace 방법을 사용하였다. 그 결과, 이중쇄의 열 안정성은 서열의 미스매치를 바탕으로 합리적으로 정확하게 예측할 수 있다.
비록, 혼성화가 유용하고 유력한 기술이 될 수 있지만, 완전히 매치된 이중쇄와 단지 하나의 염기에서만 미스매치된 이중쇄 사이의 안정성 차이는 두 이중쇄 사이의 Tm의 차이가 0.5℃ 정도밖에 나지 않을 정도로 너무 작다는 점에 한계가 있다(Tibanyenda, N. 등, Eur. J. Biochem. 139:19(1984)) 및 Ebel, S. 등 Biochem. 31:12083(1992)을 참고). 더욱 중요한 것은, 올리고머성 프로브의 길이가 길어질수록 전체 이중쇄 안정성에 대한 염기 하나의 미스매치에 의한 영향은 감소함을 알았다. 관련성이 적은 유전자는 제외시키더라도 단일 유전자에 대한 혼성화 특이성을 증진시키기 위하여 프로브의 길이를 증가시키는 것이 바람직하기 때문에 이것은 중요한 제한이다. 따라서, 밀접하게 관련된 유전자를 특이적으로 구별하는 능력은 게놈의 점점 더 좁은 영역에 관한 혼성화 연구에 촛점을 두고 있는 요구를 따라가지 못하고 있다. 요구되는 것은 프로브와 타겟 사이에서 형성된 이중쇄의 융해 온도의 차이를 증가시킴으로써 밀접하게 관련된 유전자를 구별하는 능력을 개선시키는 방법이다.
미국 특허 제 6,764,693 호에는 변형된 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 대조군 핵산 타겟과 서열 변이를 포함하는 변이체 핵산 타겟을 구별하는 능력을 개선하는 개선된 핵산 혼성화 방법이 기재되어 있다. 염기 유사체로서 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤을 이용하여 인공적인 미스매치를 유도하여 단일 염기 미스매치에 대한 구별을 향상시키고 있으나, 염기 유사체의 합성이 어려우며 또한, 본 발명의 허들(hurdle) DNA 첨가에 의한 블록킹 효과에 대한 기재는 없다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 단일 염기 미스매치에 대한 구별을 향상하는 방법을 연구하던 중, 허들 DNA 첨가와 프로브 염기의 변형을 이용함으로써 단일 염기 미스매치에 대한 구별이 향상됨을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 허들 DNA와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를 이용한 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
다형성 부위(polymorphic site)를 갖는 타겟 DNA에 완전 상보적인 프로브에 인위적으로 염기 하나를 미스매치의 자연적 염기로 치환시켜 제 1 프로브를 합성하고, 상기 타겟 DNA의 다형성 부위에 상응하는 위치에 하나의 미스매치 염기를 포함하는 다른 프로브에 인위적으로 염기 하나를 미스매치의 자연적 염기로 치환시켜 제 2 프로브를 합성하는 단계;
상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브와 각각 완전하게 상보적인 서열을 가지며, 각각의 프로브보다는 짧은 서열의 길이를 갖는 제 1 허들(hurdle) DNA 및 제 2 허들 DNA를 합성하는 단계;
상기 합성된 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 기판 위에 고정화시키는 단계;
상기 고정화된 제 1 프로브 및 제 2 프로브와 상기의 제 1 허들(hurdle) DNA 및 제 2 허들 DNA를 각각 혼성화시키는 단계; 및
상기 타겟 DNA를 혼성화시키는 단계를 포함하는 다형성 부위를 갖는 타겟에 대한 구별을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 DNA 칩에서 단일 염기 미스매치에 대한 구별을 향상시키기 위해 허들 DNA와 변형된 염기를 갖는 프로브를 이용하는 것이다. 도 1은 허들 DNA와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를 이용하는 본 발명의 단일 염기 미스매치에 대한 구별을 향상시키는 방법의 일 구체예를 나타내는 모식도이다. 도 1에서 보는 바와 같이, 제 1 프로브와 타겟 DNA는 인위적으로 미스매치시킨 하나의 염기 (도 1에서 T-T, 화살표)를 제외한 나머지 모든 부분이 상보적이며, 제 2 프로브는 타겟 DNA와 하나의 미스매치 염기(도 1에서 C-C 결합으로 표시됨)와 인위적으로 도입한 미스매치된 염기 (도 1, T-T, 화살표)를 포함한다. 또한, 제 1 허들(hurdle) DNA는 제 1 프로브와 완전 상보적이며, 제 1 프로브보다는 짧은 서열의 길이를 가지며, 제 2 허들 DNA는 제 2 프로브와 완전 상보적이며, 제 2 프로브보다는 짧은 서열의 길이를 갖는다. 또한, 제 1 허들 DNA와 제 2 허들 DNA는 동일한 길이의 서열을 갖는다.
본 특허 출원의 목적을 위해서 "타겟 DNA"는 염색체 또는 염색체의 일부분이거나 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 또는 다른 핵산 단편과 같은 재조합 핵산 분자일 수 있고 자연적으로 생성되거나 합성될 수도 있다. 타겟이 DNA인 경우, DNA는 본 발명에 사용되기 위하여, 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화될 수 있는 변성된 또는 단일 가닥 형태로 제공되는 것으로 이해된다.
기존에 사용되던 방법은 상기 제 1 허들 DNA 및 제 2 허들 DNA를 사용하지 않고 프로브에 인공적으로 미스매치 염기를 도입하여 단일 염기 미스매치를 구별하는 것이었다. 그러나, 본 발명은 타겟 DNA를 프로브에 혼성화시키기 전에 허들 DNA를 이용하여 먼저 프로브에 혼성화시키는 것이다. 제 1 허들 DNA는 타겟 DNA보다는 길이가 짧기 때문에 제 1 허들 DNA와 제 1 프로브 간의 융해 온도(Tm)가 타겟 DNA와 제 1 프로브간의 융해 온도보다 낮다. 따라서, 적당한 혼성화 조건하에서 제 1 프로브에 미리 혼성화된 제 1 허들 DNA는 타겟 DNA에 의해 교체가 일어나게 된다. 또한, 제 2 허들 DNA도 타겟 DNA보다는 길이가 짧으나, 제 2 허들 DNA와 제 2 프로브 간의 융해 온도가 타겟 DNA와 제 2 프로브간의 융해 온도보다 높다. 이는 제 2 프로브 내에는 하나의 미스매치 염기가 포함되어 있기 때문에 타겟 DNA가 제 2 허들 DNA보다는 길이는 길지만 융해 온도는 상대적으로 낮은 것이다. 따라서, 적당한 혼성화 조건하에서 제 2 프로브에 미리 혼성화된 제 2 허들 DNA는 타겟 DNA에 의해 교체가 일어나지 않게 된다. 따라서, 제 2 허들 DNA는 상보적이지 않는 타겟 DNA가 제 2 프로브에 혼성화되는 것을 막는 역할을 하는 것이다.
즉, 제 1 허들 DNA는 타겟 DNA에 의해 용이하게 교체가 일어나지만, 제 2 허들 DNA는 타겟 DNA에 의해 용이하게 교체가 일어나지 않으므로, 제 1 프로브에는 타겟 DNA가 더 많이 혼성화되는 반면, 제 2 프로브에는 타겟 DNA가 더 적게 혼성화되어 단일 염기 미스매치에 대한 구별 능력을 향상시킬 수 있는 것이다. 이는 타겟 DNA를 형광으로 표지하여 상기 실험을 수행하면 형광의 상대적인 강도 차이, 즉, 제 1 프로브에 혼성화된 타겟 DNA의 형광 강도대 제 2 프로브에 혼성화된 타겟 DNA의 형광 강도의 비를 측정하면 더욱 용이하게 관찰할 수 있는 것이다. 따라서, 상기 형광 강도의 차이가 크면 클수록, 단일 염기 미스매치에 대한 구별 능력은 증대되는 것이다.
또한, 상기 미스매치 염기는 표적의 다형성 부위에 해당하는 위치에 해당하는 것일 수 있다. SNP(Single Nucleotide Polymorphism)는 세포핵 속의 염색체가 갖고 있는 30억개의 염기서열 중 개인편차를 나타내는 한 개 또는 수십개의 염기변이를 말한다. 이러한 SNP에 의해 나타나는 대표적인 질환이 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia)인데, 이는 특정 부위의 단일 염기가 다른 염기로 치환되어 나타나는 현상이다. 이러한 유전자의 특정 위치에서 발생하는 하나의 미스매치를 구별하기 위해서는 본 발명의 방법이 필요한 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 제 1 프로브와 제 2 프로브는 인위적으로 치환된 미스매치 염기를 서로 대응되는 동일한 위치에서 추가로 포함할 수 있다. 도 2는 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상을 위해 요구되는 인공적인 미스매치 염기가 도입된 각 프로브 DNA와 허들 DNA의 혼성체(hybrid)와 인공적인 미스매치 염기가 도입된 각 프로브 DNA와 타겟 DNA의 혼성체의 상대적인 안정성을 나타낸 모식도이다. 본 발명의 방법에서 단일 염기 미스매치를 구별하기 위해 허들 DNA 만을 이용했을 경우에는 제 1 프로브와 타겟 DNA 사이의 융해 온도와 제 2 프로브와 타겟 DNA 사이의 융해 온도간의 차이가 상대적으로 낮아 단일 염기 미스매치를 효율적으로 구별하지 못할 수 있다. 따라서, 단일 염기 미스매치를 보다 효율적으로 구별하기 위해 프로브내에 인공적인(artificial) 미스매치 염기를 도입하 는 것이다(도 2에서 화살표로 표시된 위치에 원래의 프로브 서열에서 A 대신 T로 변형하는 것이다). 즉, 제 1 프로브와 제 2 프로브의 서로 대응되는 동일한 위치에 인공적인 미스매치 염기를 도입하면 하기 실시예에서 관찰된 바와 같이 단일 염기 미스매치에 대한 구별 능력이 향상된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 다형성 부위는 뉴클레오티드의 치환, 첨가 및 결실로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기에서는 타겟 DNA에 대한 핵산의 치환에 해당하는 미스매치 염기에 대해서 언급하였지만, 이외에도 핵산의 첨가 및 결실을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 인공적인(artificial) 미스매치 염기는 2개의 뉴클레오티드에서 생성될 수 있다. 프로브에 하나의 인공적인 미스매치 염기를 도입할 수도 있지만, 이에 한정되지 않고 2개 이상의 인공적인 미스매치 염기를 도입하여 단일 염기 미스매치의 구별을 향상시킬 수 있다. 이는 타겟 DNA에 따라 적절하게 적용할 수 있다. 바람직하게는 상기 인공적인 미스매치 염기는 2개의 뉴클레오티드에서 생성되는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 인공적인 미스매치 염기는 연속적으로 배열되거나 또는 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 2개 이상의 인공적인 미스매치 염기를 도입할 경우에는, 하나의 인공적인 미스매치 염기를 도입하고, 미스매치 염기가 도입된 뉴클레오티드에 인접한 뉴클레오티드에 또 다른 미스매치 염기를 도입할 수 있다. 또한, 하나의 인공적인 미스매치 염기를 도입하고, 또 다른 미스매치 염기는 미스매치 염기가 도입된 뉴클레오티드에서 1개 이상 의 뉴클레오티드에 의해 분리해서 도입할 수도 있다. 이는 타겟 DNA에 따라 적절하게 적용할 수 있다. 상기 인공적인 미스매치 염기가 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되는 경우에는 8개 내지 20개의 뉴클레오티드에 의해 분리되는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 다형성 부위와 인공적인 미스매치 염기는 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 허들 DNA가 혼성화되는 영역 내에서 생성되는 미스매치 염기와 인공적인 미스매치 염기는 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있으며, 바람직하게는 3개 내지 15개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 단일 염기 치환된 DNA에 대한 구별 효과
단일 염기 치환된 DNA에 대한 구별 효과를 알아보기 위해, 하기 4종류의 프로브 세트를 이용하였다.
| [1] (정상 프로브 세트) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-ATGACAATGAGTATGCCTA-3'(서열번호 1) 표면 5'-ATGACAATCAGTATGCCTA-3'(서열번호 2) |
| [2] (1개 염기를 인공적으로 변형시킨 프로브 세트) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-ATGTCAATGAGTATGCCTA-3'(서열번호 3) 표면 5'-ATGTCAATCAGTATGCCTA-3'(서열번호 4) |
| [3] (정상 프로브 세트 + 허들 DNA 도입) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-ATGACAATGAGTATGCCTA-3'(서열번호 1) 3'-GTTACTCATACGGAT-5'(허들 DNA)(서열번호 5) 표면 5'-ATGACAATCAGTATGCCTA-3'(서열번호 2) 3'-GTTACTCATACGGAT-5'(허들 DNA)(서열번호 6) |
| [4] (1개 염기를 인공적으로 변형시킨 프로브 세트 + 허들 DNA 도입) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-ATGTCAATGAGTATGCCTA-3'(서열번호 3) 3'-GTTACTCATACGGAT-5'(허들 DNA)(서열번호 5) 표면 5'-ATGTCAATCAGTATGCCTA-3'(서열번호 4) 3'-GTTACTCATACGGAT-5'(허들 DNA)(서열번호 6) |
상기 표 1과 같은 4종류의 서로 다른 DNA 프로브 세트를 1μM의 농도로 아미노-실란 코팅된 웨이퍼 상에 통상적인 고정화 기술을 이용하여 고정화하였다. 프로브 DNA에 대한 허들 DNA의 혼성화는 1μM의 허들 DNA를 DNA 프로브와 40℃에서 1시간 반응시킴으로써 수행하였다.
준비된 4종류의 DNA 프로브에 CY-3로 표지된 타겟 올리고머(5'-TAGGCATACTCATTGTCAT-3')(서열번호 7, 이 서열은 표1에 개시된 정상 프로브 세트의 제1프로브와 완전 상보적이며(perfectly matched), 제2프로브와는 1염기에서 미스매치임) 를 2nM의 농도로 40℃에서 1시간 동안 혼성화 반응을 실시하였다. 1시간 반응 후, 3×SSC 용액에서 5분간 약한 교반하에 세정을 실시하였고, 이어서 1×SSC 용액에서 5분간 추가 세정을 실시하였다. 세정을 완료한 칩은 건조 후, 스캐너(CY-3 파장 532 nm)를 이용하여 형광 강도를 측정하여, 제1프로브에 결합된 타겟 DNA의 신호와 제2프로브에 결합된 타겟 신호의 비(PM(perfectly matched)/MM(mismatched)비)를 측정하였다. 실험에서 계산된 Tm 값은 1998년도 Santalucia 변수를 이용하여 계산하였다.
도 3은 인공적인 미스매치 염기가 도입되지 않은 각 프로브 DNA와 허들 DNA의 혼성체와 인공적인 미스매치 염기가 도입되지 않은 각 프로브 DNA와 타겟 DNA의 혼성체의 상대적인 안정성을 나타낸 모식도이다. 도 3에서 보여주는 바와 같이, 상기 프로브 세트 3번을 이용하여 Tm 값을 계산한 결과, 제1프로브와 타겟간의 Tm 값이 제1프로브와 제1허들 DNA간의 Tm 값 보다 높아 더욱 안정하므로 제1허들 DNA는 타겟에 의해 용이하게 치환될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 제2프로브와 타겟간의 Tm 값이 제2프로브와 제2허들 DNA간의 Tm 값보다 높아 더욱 안정하므로 제2허들 DNA는 타겟에 의해 용이하게 치환될 수 있음을 알 수 있다. 이는 제1허들 DNA는 용이하게 치환되고, 제2허들 DNA는 용이하게 치환되지 않아야 하는 본 발명의 목적과는 상반되는 결과이다. 그러나, 상기 결과는 본 발명의 일예를 기초로 한 것이며, 상기 프로브 세트에서 제1허들 DNA 및 제2허들 DNA의 길이를 길게 하면 본 발명의 목적을 달성할 수 있을 것이다.
따라서, 단일 염기 미스매치에 대한 구별 능력을 향상시키기 위해, 제1프로브 및 제2프로브의 서로 대응되는 동일한 위치에 1개의 염기 변형을 도입하였다. 도 4는 1개의 인공적인 미스매치 염기가 도입된 각 프로브와 각 허들 DNA 및 타겟 DNA와의 혼성체의 Tm 값을 보여준다. 도 4에 보여주는 바와 같이, 화살표로 표시된 부분에 1개의 염기 변형(A→T)을 도입하여 Tm 값을 계산한 결과, 제1프로브와 제1허들 DNA간의 Tm 값은 동일하지만, 제1프로브와 타겟간의 Tm 값은 63.5℃에서 55.2℃로 감소하였으나, 여전히 제1프로브와 타겟간의 Tm 값이 제1프로브와 제1허 들 DNA간의 Tm 값 보다 높아 더욱 안정하므로 제1허들 DNA는 타겟에 의해 용이하게 치환될 수 있음을 알 수 있다. 반면에, 제2프로브와 제2허들 DNA간의 Tm 값은 동일하지만, 제2프로브와 타겟간의 Tm 값은 54.7℃에서 44.2℃로 감소하여, 제2프로브와 타겟간의 Tm 값이 제2프로브와 제2허들 DNA간의 Tm 값보다 낮아 불안정하므로 제2허들 DNA는 타겟에 의해 용이하게 치환되지 않는다는 것을 알 수 있다. 이는 제1허들 DNA는 용이하게 치환되고, 제2허들 DNA는 용이하게 치환되지 않아야 하는 본 발명의 목적과 일치하는 결과이다. 또한, 상기 결과는 각각의 프로브 세트에 타겟을 혼성화한 후의 PM/MM비를 측정한 결과와도 부합한다는 것을 알 수 있다(도 5 참고).
도 5는 표 1의 4종류의 프로브 세트에 CY-3 표지된 타겟 DNA를 혼성화한 후의 형광 강도를 측정한 것이다. 도 6은 표 1의 각 프로브 세트의 PM(perfect matched)/MM(mismatched) 비를 그래프로 나타낸 것이다. 정상(표 1의 프로브 세트 1번); 허들 DNA(표 1의 프로브 세트 3번); 허들 DNA + 염기변형(표 1의 프로브 세트 4번); 및 염기 변형(표 1의 프로브 세트 2번). 도 5 및 6에 보여주는 바와 같이, 허들 DNA와 염기 변형을 도입한 경우가 정상 프로브 세트에 비해 PM/MM비가 현저하게 증가되는 것을 알 수 있다. 염기 변형만 도입한 경우도 정상 프로브 세트에 비해 PM/MM비가 증가되나, 허들 DNA만 도입한 경우에는 정상 프로브 세트와 PM/MM비가 거의 동일하다는 것을 알 수 있다. 그러나, 상기 결과는 프로브 서열 및 길이, 및 허들 DNA 길이에 따라 변할 수 있으므로, 프로브 서열 및 길이, 및 허들 DNA 길이를 변화시키면 허들 DNA만 도입한 경우에도 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 것이다.
실시예 2: 단일 염기 삽입된 DNA에 대한 구별 효과
단일 염기 삽입된 DNA에 대한 구별 효과를 알아보기 위해, 하기 5종류의 프로브 세트를 이용하였다.
| [1] (정상 프로브 세트) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-cccccTCCCCCCTgtcagca-3'(서열번호 8) 표면 5'-cccccTCCCCCCCTgtcagca-3'(서열번호 9) |
| [2] (1개 염기를 인공적으로 변형시킨 프로브 세트) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-cctccTCCCCCCTgtcagca-3'(서열번호 10) 표면 5'-cctccTCCCCCCCTgtcagca-3'(서열번호 11) |
| [3] (2개 염기를 인공적으로 변형시킨 프로브 세트) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-cctccTCCCCCCTgtcaaca-3'(서열번호 12) 표면 5'-cctccTCCCCCCCTgtcaaca-3'(서열번호 13) |
| [4] (1개 염기를 인공적으로 변형시킨 프로브 세트 + 허들 DNA 도입) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-cctccTCCCCCCTgtcagca-3'(서열번호 10) 3'-gaggAGGGGGGAcagtcgt-5'(허들 DNA)(서열번호 14) 표면 5'-cctccTCCCCCCCTgtcagca-3'(서열번호 11) 3'-gaggAGGGGGGGAcagtcgt-5'(허들 DNA)(서열번호 15) |
| [5] (2개 염기를 인공적으로 변형시킨 프로브 세트 + 허들 DNA 도입) | |
| 제1프로브 제2프로브 | 표면 5'-cctccTCCCCCCTgtcaaca-3'(서열번호 12) 3'-gaggAGGGGGGAcagttgt-5'(허들 DNA)(서열번호 16) 표면 5'-cctccTCCCCCCCTgtcaaca-3'(서열번호 13) 3'-gaggAGGGGGGGAcagttgt-5'(허들 DNA)(서열번호 17) |
실험 방법은 실시예 1의 방법과 동일하며, 타겟 DNA 서열은 5'-tgctgacAGGGGGGAggggg-3'(서열번호 18)이다.
도 7은 표 2의 각 프로브 세트의 PM/MM 비를 그래프로 나타낸 것이다. 정상(표 2의 프로브 세트 1번); 1MM(표 2의 프로브 세트 2번); 2MM(표 2의 프로브 세트 3번); 1MM + H(표 2의 프로브 세트 4번); 및 2MM + H(표 2의 프로브 세트 5번). 도 7에 보여주는 바와 같이, 허들 DNA와 2개의 염기 변형을 도입한 경우가 정상 프 로브 세트에 비해 PM/MM비가 현저하게 증가되는 것을 알 수 있다. 또한, 허들 DNA와 1개의 염기 변형을 도입한 경우도 정상 프로브 세트에 비해 PM/MM비가 증가된다는 것을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 허들 DNA 첨가와 프로브 염기의 변형을 통해 단일 염기 미스매치에 대한 구별 능력을 향상시킬 수 있다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd.
<120> Method for increasing discrimination for single base mismatch
using hurdle DNA and artificially mismatched probe
<160> 18
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 1
atgacaatga gtatgccta 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 2
atgacaatca gtatgccta 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 3
atgtcaatga gtatgccta 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 4
atgtcaatca gtatgccta 19
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hurdle DNA
<400> 5
taggcatact cattg 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hurdle DNA
<400> 6
taggcatact cattg 15
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> target DNA
<400> 7
taggcatact cattgtcat 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 8
ccccctcccc cctgtcagca 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 9
ccccctcccc ccctgtcagc a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 10
cctcctcccc cctgtcagca 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 11
cctcctcccc ccctgtcagc a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 12
cctcctcccc cctgtcaaca 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe DNA
<400> 13
cctcctcccc ccctgtcaac a 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hurdle DNA
<400> 14
tgctgacagg ggggaggag 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hurdle DNA
<400> 15
tgctgacagg gggggaggag 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hurdle DNA
<400> 16
tgttgacagg ggggaggag 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hurdle DNA
<400> 17
tgttgacagg gggggaggag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> target DNA
<400> 18
tgctgacagg ggggaggggg 20
Claims (8)
- 다형성 부위(polymorphic site)를 갖는 타겟 DNA에 완전 상보적인 프로브에 인위적으로 염기 하나를 미스매치의 자연적 염기로 치환시켜 제 1 프로브를 합성하고, 상기 타겟 DNA의 다형성 부위에 상응하는 위치에 하나의 미스매치 염기를 포함하는 다른 프로브에 인위적으로 염기 하나를 미스매치의 자연적 염기로 치환시켜 제 2 프로브를 합성하는 단계;상기 제 1 프로브와 완전하게 상보적인 서열을 가지며, 상기 제 1 프로브에 도입된 다형성 부위의 미스매치 염기를 포함하지 않으며, 제 1 프로브보다는 짧은 서열의 길이를 갖는 제 1 허들(hurdle) DNA 및 상기 제 2 프로브와 완전하게 상보적인 서열을 가지며, 상기 제 2 프로브에 도입된 다형성 부위의 미스매치 염기를 포함하지 않으나 다형성 부위가 아닌 다른 부위에 도입된 미스매치 염기는 포함하며, 제 2 프로브보다는 짧은 서열의 길이를 갖는 제 2 허들(hurdle) DNA를 합성하는 단계;상기 합성된 제 1 프로브 및 제 2 프로브를 기판 위에 고정화시키는 단계;상기 고정화된 제 1 프로브 및 제 2 프로브와 상기의 제 1 허들(hurdle) DNA 및 제 2 허들 DNA를 각각 혼성화시키는 단계; 및상기 타겟 DNA를 혼성화시키는 단계를 포함하는 다형성 부위를 갖는 타겟에 대한 구별을 향상시키는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 프로브와 제 2 프로브는 인위적으로 치환된 미스매치 염기를 서로 대응되는 동일한 위치에서 추가로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 다형성 부위는 뉴클레오티드의 치환, 첨가 및 결실로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 인공적인 미스매치 염기는 2개의 뉴클레오티드에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 인공적인 미스매치 염기는 연속적으로 배열되거나 또는 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 인공적인 미스매치 염기는 8개 내지 20개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 다형성 부위와 인공적인 미스매치 염 기는 1개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 다형성 부위와 인공적인 미스매치 염기는 3개 내지 15개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050006085A KR100682923B1 (ko) | 2005-01-22 | 2005-01-22 | 허들 ｄｎａ와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를이용한 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상 방법 |
| EP06000611A EP1683872B1 (en) | 2005-01-22 | 2006-01-12 | Method of increasing discrimination for a single base mismatch using hurdle DNA's and artificially mismatched probes |
| DE602006000713T DE602006000713T2 (de) | 2005-01-22 | 2006-01-12 | Verfahren zur Verbesserung der Unterscheidung von einer einzelnen Basenfehlanpaarung durch die Verwendung von "hurdle" DNAs und Sonden mit artifiziellen Fehlpaarungen |
| JP2006011737A JP4257335B2 (ja) | 2005-01-22 | 2006-01-19 | 塩基ミスマッチに対する識別方法 |
| US11/335,229 US7803540B2 (en) | 2005-01-22 | 2006-01-19 | Method of increasing discrimination for single base mismatch using hurdle DNA and artificially mismatched probe |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050006085A KR100682923B1 (ko) | 2005-01-22 | 2005-01-22 | 허들 ｄｎａ와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를이용한 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20060085111A KR20060085111A (ko) | 2006-07-26 |
| KR100682923B1 true KR100682923B1 (ko) | 2007-02-15 |
Family
ID=35927710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020050006085A KR100682923B1 (ko) | 2005-01-22 | 2005-01-22 | 허들 ｄｎａ와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를이용한 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상 방법 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7803540B2 (ko) |
| EP (1) | EP1683872B1 (ko) |
| JP (1) | JP4257335B2 (ko) |
| KR (1) | KR100682923B1 (ko) |
| DE (1) | DE602006000713T2 (ko) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9115389B2 (en) | 2006-06-30 | 2015-08-25 | Rosetta Genomics Ltd. | Method for detecting a target nucleic acid comprising two portions using probes having a first portion complementary to the first portion of the target nucleic acid and a second portion substantially complementary to the second portion of the target nucleic acid |
| KR100813263B1 (ko) * | 2006-08-17 | 2008-03-13 | 삼성전자주식회사 | 표적 서열 검출용 프로브 설계 방법 및 상기 프로브를이용한 표적 서열 검출 방법 |
| US7820389B2 (en) * | 2007-01-10 | 2010-10-26 | Geneohm Sciences, Inc. | Inhibition of mismatch hybridization by a universal competitor DNA |
| CN107003307B (zh) * | 2014-12-18 | 2020-04-07 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 降低干扰的方法 |
| EP3789504A4 (en) * | 2018-04-20 | 2021-12-29 | Epigeneron, Inc. | Method for detecting difference in reference sequence in target nucleic acid region |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6485906B2 (en) | 1998-04-03 | 2002-11-26 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200753B1 (en) * | 1993-06-03 | 2001-03-13 | Intelligene Ltd. | Detection of nucleic acid sequences |
| US20030134291A1 (en) * | 1993-06-25 | 2003-07-17 | Affymetrix, Inc. | Polymorphism detection |
| US5780233A (en) | 1996-06-06 | 1998-07-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Artificial mismatch hybridization |
-
2005
- 2005-01-22 KR KR1020050006085A patent/KR100682923B1/ko active IP Right Grant
-
2006
- 2006-01-12 EP EP06000611A patent/EP1683872B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-12 DE DE602006000713T patent/DE602006000713T2/de active Active
- 2006-01-19 JP JP2006011737A patent/JP4257335B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-19 US US11/335,229 patent/US7803540B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6485906B2 (en) | 1998-04-03 | 2002-11-26 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 논 문 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE602006000713T2 (de) | 2009-04-23 |
| US20060183142A1 (en) | 2006-08-17 |
| US7803540B2 (en) | 2010-09-28 |
| KR20060085111A (ko) | 2006-07-26 |
| EP1683872B1 (en) | 2008-03-19 |
| EP1683872A1 (en) | 2006-07-26 |
| JP4257335B2 (ja) | 2009-04-22 |
| DE602006000713D1 (de) | 2008-04-30 |
| JP2006197936A (ja) | 2006-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4938824B2 (ja) | イネの品種鑑別法 | |
| US8053188B2 (en) | Nucleic acid enrichment | |
| Jehan et al. | Single nucleotide polymorphism (SNP)–methods and applications in plant genetics: a review | |
| AU2002360223B2 (en) | Analysis and detection of multiple target sequences using circular probes | |
| US7919252B2 (en) | Method for detecting a target nucleic acid sequence | |
| GB2456669A (en) | Assay ligates random primers to microarray probes to increase efficiency | |
| KR100682923B1 (ko) | 허들 ｄｎａ와 인공적인 미스매치가 도입된 프로브를이용한 단일 염기 미스매치에 대한 구별 향상 방법 | |
| EP0972078A4 (en) | ITERATIVE RESEQUEN AGE | |
| KR20180077871A (ko) | 쥬빌리 타입 또는 크림슨 타입 수박 품종 판별용 snp 마커 | |
| US20100279890A1 (en) | Fusion gene microarray | |
| CA2421078A1 (en) | Method for determining alleles | |
| WO2003070934A1 (fr) | Methode d'analyse du genotype de la region situee autour du gene sd-1 vegetal et methode d'analyse des caracteristiques d'un vegetal semi-nain utilisant la methode d'analyse du genotypage | |
| KR101249635B1 (ko) | 양극성 장애 진단용 ｅｇｒ2 유전자 ｓｎｐ, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트 | |
| Lee et al. | Development of peptide nucleic acid (PNA) microarray for identification of Panax species based on the nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) and 5.8 S rDNA regions | |
| US20100285970A1 (en) | Methods of sequencing nucleic acids | |
| KR20060131972A (ko) | Ｄｎａ 어레이와 1 염기 다형의 검출 방법 | |
| US20040185461A1 (en) | Oligonucleotides for detecting hybridisation | |
| WO1999039004A1 (en) | Iterative resequencing | |
| KR102237248B1 (ko) | 소나무 개체식별 및 집단의 유전 분석용 snp 마커 세트 및 이의 용도 | |
| JP3499795B2 (ja) | 遺伝子解析法 | |
| JP2007174986A (ja) | 核酸の塩基配列解析方法 | |
| KR102079963B1 (ko) | 소거 프로브 기반 염색체 수적이상 검출방법 및 염색체 수적이상 검출용핵산의 조성물 | |
| KR20230109925A (ko) | 대용량 고효율의 밀 품종 식별을 위한 snp 마커, 프라이머 세트, 및 이의 용도 | |
| Li et al. | Tag/anti-tag liquid-phase primer extension array: a flexible and versatile genotyping platform | |
| KR100620506B1 (ko) | 초다뿌리혹 형성 콩 변이체에 대한 단일뉴클레오타이드 다형성 마커 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130115 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140124 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150116 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160119 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170119 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180119 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190116 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200120 Year of fee payment: 14 |