KR100620506B1 - 초다뿌리혹 형성 콩 변이체에 대한 단일뉴클레오타이드 다형성 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뿌리혹 형성 표현형에 대한 단일뉴클레오타이드 다형성 유전적 마커, 이를 이용한 뿌리혹 형성 변이체의 동정방법 및 이를 구현하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 복잡한 데이터 수집을 요구하는 뿌리혹 형성의 표현형 결정 및 접종 과정 없이, 식물체의 초기 성장 단계에서 초다뿌리혹 형성 변이체를 신속하게 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 마커는 다른 유전자형 결정 (genotyping) 방법보다 신속하고, 재현성이 우수하며 저가의 유전자형 결정 방법을 제공하는 것을 가능하게 한다.

뿌리혹, 초다뿌리혹, 단일뉴클레오타이드 다형성, SNP, GmNARK, 대두

Description

초다뿌리혹 형성 콩 변이체에 대한 단일뉴클레오타이드 다형성 마커{Single Nucleotide Amplified Polymorphism Marker for Supernodulating Characters in Soybean}

도 1은 신팔달콩 2호 및 SS2-2의 GmNARK (Glycine max nodule autoregulation receptor-like protein kinase) 유전자로부터 유래된 각각의 PCR 증폭 단편의 서열 얼라이먼트이다. 프라이머 서열은 이태릭체로 기재되어 있고, SNP 위치는 대문자로 나타나 있다.

도 2a는 주형 DNA 농도 및 증폭 사이클 수에 따른 본 발명의 SNAP 프라이머쌍의 특이성을 보여주는 사진이다. GmNARK의 A 대립형에 특이적인 프라이머쌍을 이용하였다.

도 2b는 GmNARK의 각각의 대립형에 대한 5종의 프라이머쌍의 특이성을 보여주는 사진이다. 1 내지 5의 숫자는 5종의 프라이머쌍을 나타내고, SP는 신팔달콩 2호, SS는 SS2-2를 각각 나타낸다.

도 3은 SS2-2 x 신팔달콩 2호의 F₂ 자손에서의 초다뿌리혹 형성에 대한 SNAP 마커의 유전자형 결정 (genotyping)을 보여주는 사진이다. GmNARK에 대한 대립형-특이 프라이머를 사용하여 40 라인을 증폭하였고, 밴드의 패턴은 정상 (N) 및 초다뿌리혹 (S)로 평가하였다. 각각의 라인에서, 왼쪽 레인은 A-대립형 특이 SNAP 프라이머로 얻어진 증폭 산물을 나타내고, 오른쪽 레인은 T-대립형 특이 SNAP 프라이머로 얻어진 증폭 산물을 나타낸다. 각각의 대립형에 대하여 두 개의 밴드를 나타내는 라인은 이형접합체임을 보여주는 것이다.

도 4는 8개의 대두 유전자형에서 초다뿌리혹에 대한 SNAP 마커의 증폭 패턴을 보여주는 사진이다. 각각의 유전자형에 대하여, 왼쪽 레인은 A-대립형 특이 SNAP 프라이머로 얻어진 증폭 산물을 나타내고, 오른쪽 레인은 T-대립형 특이 SNAP 프라이머로 얻어진 증폭 산물을 나타낸다. 1, 단백콩; 2, 태광콩; 3, 푸레운콩; 4, 진품콩; 5, PI 96188; 6, 장엽콩; 7, nts382; 8, nts1116.

본 발명은 뿌리혹 형성 표현형에 대한 단일뉴클레오타이드 다형성 유전적 마커, 이를 이용한 뿌리혹 형성 변이체의 동정방법 및 이를 구현하기 위한 키트에 관한 것이다.

대두에서의 뿌리혹 형성 (nodulation)은 지하 생태계에서의 질소 공급의 주요한 공급원이다. 뿌리에서의 혹 형성은 라이좀비움 (Rhizobium) 박테리아의 침 입에 의해 촉발되며, 숙주의 내적 인자 또는 외적 인자에 의해 조절된다. 자가조절이라고 통칭되는 연속적인 과정에서의 특정 기전은 뿌리혹 형성 정도를 전신적으로 조절하는 것으로 알려져 있다 (Carroll et al., 1985; Pierce & Bauer, 1983).

현재까지, 뿌리혹 형성의 유전적 조절을 규명하기 위하여, 에틸메탄 설포네이트 (EMS)를 이용한 화학적 변이생성 (Carroll et al., 1985a; Carroll et al, 1985b; Akao & Kouchi, 1992) 및 고속 중성자 변이생성 (Men et al., 2002)을 통하여, 대두에서 자가조절이 흠결된 수개의 변이체가 동정되었다. Lee et al. (1997)은 30 mM EMS을 이용하여 변이유발된 신팔달콩 2호 (Sinpaldalkong 2)의 M₂ 패밀리로부터, 초다뿌리혹 형성 (supernodulating) 변이체 SS2-2를 분리하였고, 상기 변이체는 외래의 질산염이 존재하는 경우에도 뿌리혹 형성이 억제되지 않았다 (Lee et al., 1997; Lee et al., 1998). SS2-2 및 질산염-내성 공생 (nts) 변이체 사이의 혼성화 (Carroll et al., 1985a; Carroll et al, 1985b) 그리고 초다뿌리혹 형성을 위한 군집 분리에서의 유전적 맵핑은, SS2-2에서의 다뿌리혹 (hypernodulation) 특성이 nts 변이체에서의 초다뿌리혹 형성을 조절하는 유전자좌와 동일한 유전자좌에 의해 조절됨을 보여 주었다 (Ha and Lee, 2001).

초다뿌리혹 형성 유전자좌는 LG H에서의 Satt353로부터 18.9 cM 정도 떨어져 있고 (Ha and Lee, 2001), nts 유전자에 밀접하게 연결된 RFLP 마커 pUTG-132 근처에 있다 (Landau-Ellis et al., 1991, Kolchinsky et al., 1997). 최근에, 측면 마커 pUTG-132 및 LG H에서의 UQC-IS1는 nts 변이체에서의 초다-/다뿌리혹 형성과 관련된 유전자를 분리하는 데 이용되었다 (Searle et al., 2003). nts1116 및 nts382 변이체에서 뿌리혹 자가조절 수용체-유사 단백질 키나아제 전구체 (nodule autoregulation receptor-like protein kinase precursor (NARK)) 유전자의 점돌연변이는 초다-/다뿌리혹 형성 표현형을 초래한다는 것이 규명되었다 (Searle et al., 2003). 따라서, SS2-2에서의 초다뿌리혹 형성은 대두의 동일한 NARK 유전자좌에 의해 조절될 것으로 제안되었다 (Ha and Lee, 2001).

단일염기다형성 (SNPs)은 최근에 마커로서 활발하게 개발되고 있다. SNPs는 인간 지놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다 (Sachidanandam et al., 2001). SNPs는 매우 안정된 유전적 마커이고, 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형규명 시스템에 매우 적합하다 (Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000). 그러나, 식물에서, 아라비돕시스 (Arabidopsis), 보리, 옥수수 및 감자와 같은 몇 종에서 SNPs에 대한 연구가 실시되었으나 (Cho et al., 1999; Kanazin et al., 2002; Rickert et al., 2002; Tenaillon et al., 2001), SNPs에 대한 활발한 연구는 없다. 최근에, 25개의 서로 다른 대두 유전자형으로부터 얻은 76 kb 서열에서 총 280개의 SNPs가 발견되었다 (Zhu et al., 2003).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 초다뿌리혹 형성 변이체를 가능한 초기 발달 단계에서 유전자 차원에서 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 초다뿌리혹 형성 표현형에 대한 단일뉴클레오타이드 다형성 (single nucleotide polymorphism: SNP)이 있음을 발견하고, 이 SNP를 이용하는 경우에는 용이하게 초다뿌리혹 형성 변이체를 동정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 초다뿌리혹 형성에 대한 SNP를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 초다뿌리혹 형성에 대한 SNP를 이용하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하며, 정상 뿌리혹 형성 특성을 갖는 식물체에서 상기 959번째 뉴클레오타이드의 w는 A이고 초다뿌리혹 형성 (supernodulating) 변이체에서 상기 959번째 뉴클레오타이드의 w는 T인 것을 특징으로 하는, 뿌리혹 형성 식물체에서 초다뿌리혹 형성 (supernodulating) 변이체를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커 또는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명자들은 초다뿌리혹 형성 변이체를 유전자 수준에서 용이하게 동정할 수 있는 방법을 개발하고자 심도있는 연구를 수행하였고, 그 결과 GmNARK (Glycine max nodule autoregulation receptor-like protein kinase) 유전자에서 초다뿌리혹 형성 변이체를 유전자 수준에서 구별해 주는 단일뉴클레오타이드 다형성 (single nucleotide polymorphism: SNP) 현상을 발견하였다.

본 발명의 SNP는 뿌리혹 형성 식물체에 적용되며, 가장 바람직하게는 대두 (Glycine max)에 적용된다.

본 발명의 SNP에 따르면, 정상 뿌리혹 형성 특성을 갖는 식물체는 서열목록 제 1 서열의 GmNARK 뉴클레오타이드 서열에서 959번째 뉴클레오타이드가 "A"이고, 초다뿌리혹 형성 변이체에서는 "T"이다. 이러한 SNP에 의해 라이신 (AAG) 코딩 서열이 정지 코돈 (TAG)으로 변화되어, 트랜스레이션이 조기에 종결되는 결과를 초래한다.

본 명세서에서 용어, "정상 뿌리혹 형성 특성을 갖는 식물체"는 일반적으로 재배되는 콩의 뿌리혹 형성정도를 가지는 콩을 의미하며, "초다뿌리혹 형성 변이 체"는 정상 뿌리혹 형성 특성을 갖는 콩보다 7-10배 이상의 뿌리혹을 형성하는 변이체를 의미한다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

한편, 본 발명은 상술한 바와 같이, 서열목록 제 1 서열의 GmNARK 뉴클레오타이드 서열에서 959번째 뉴클레오타이드가 "T"인 초다뿌리혹 형성 변이체에 대한 대립형에 관한 것이나, 이러한 대립형 뉴클레오타이드가 이중가닥의 gDNA (genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 즉, 상보적인 뉴클레오타이드 서열에서 초다뿌리혹 형성 변이체를 나타내는 SNP인 "T"는 "A"가 된다.

이러한 측면에서, 본 명세서의 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, gDNA에서 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 뿌리혹 형성 식물체로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및 (b) 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드에 해당하는 초다뿌리혹 형성-관련 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 염기 "T"의 존재 유무를 상기 분리된 핵산 분자에서 확인하는 단계를 포함하며, 상기 SNP 위치가 "T"인 경우에는 초다뿌리혹 형성 변이체로 판정하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹 형성 식물체에서 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정방법을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산분자는 식물체의 다양한 기관으로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 잎, 뿌리, 줄기 및 종자로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 잎으로부터 얻는다. 핵산분자의 공급원 (source)로서의 식물체는 어떠한 발달 단계에 있는 것이든 모두 공급원으로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명의 방법은 초기 발달 단계에 있는 식물체로부터 핵산 분자를 얻어 그 식물체가 초다뿌리혹 형성 형질을 갖는 지를 초기에 판정할 수 있다.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성 된다. 상기 총 RNA는 식물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 초다뿌리혹 형성 변이체 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

가장 바람직하게는, 본 발명 방법의 단계 (b)는 대립형-특이 유전자 증폭 방법에 의해 실시된다. 이와 같이, 본 발명의 SNP가 유전자 증폭 방법에 적용되는 경우, 특히 SNAP (single nucleotide amplified polymophism)라 통칭된다.

이러한 유전자 증폭은 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 기본적으로 이용한다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭 (참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페 어 체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다.

증폭 기술이 적용되는 경우에는, 프라이머의 디자인이 중요하다. 바람직하게는, 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머는 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드에 해당하는 초다뿌리혹 형성-관련 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 염기에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 전방향 프라이머의 3'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 전방향 프라이머의 3'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖으며, 바로 인접한 서열은 타깃 서열에 매칭되지 않는 비상보적인 염기를 갖는다. 본 발명의 프라이머의 일 실시예를 보여주는 표 2를 참조하면, T 대립형-특이 전방향 프라이머의 3'-말단은 "TT"을 서열을 갖는 데, 가장 말단 부분에 있는 T는 "T" SNP에 매칭 되지만, 그 옆에 있는 "T"는 타깃 서열에 미스매칭 된다. 이러한 프라이머 디자인 전략은 하나의 뉴클레오타이드만으로는 대립형 특이적인 지노타이핑 PCR이 어렵기 때문에, 다른 또 하나의 미스매칭 되는 뉴클레오타이드를 삽입한 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 초다뿌리혹 형성 변이체를 스크리닝하는 데 이용되며 3'-말단에 "T"를 갖는 프라이머는 T-대립형(또는 특이) 프라이머라 하고, 정상 뿌리혹 특성을 갖는 식물체를 스크리닝하는 데 이용되며 3'-말단에 "A"를 갖는 프라이머는 A-대립형(또는 특이) 프라이머라 한다. 그러나, 안티센스 가닥을 기 준으로 하면, 3'-말단에 "A"를 갖는 프라이머가 초다뿌리혹 형성 변이체를 스크리닝하는 데 이용되는 것이며, 3'-말단에 "T"를 갖는 프라이머가 정상 뿌리혹 특성을 갖는 식물체를 스크리닝하는 데 이용되는 것이다.

본 발명의 방법은, SNP에 해당하는 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드를 기준으로 하여, 그 다운스트림에 위치한 서열을 증폭하는 경우와 업스트림에 위치한 서열을 증폭하는 경우로 대별할 수 있다.

우선, 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 다운스트림에 위치한 서열을 증폭하는 경우, 바람직하게는, 이용되는 전방향 프라이머는 3'-말단에 "T" 염기를 갖으며, 나머지 부분은 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드의 업스트림에 위치한 서열과 실질적으로 대응되는 서열을 갖는다.

본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, "실질적으로 대응되는 서열"은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

이러한 전방향 프라이머는 다음 일반식 I로 표현된다:

X_p-dT (I)

상기 일반식에서, X는 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 업스트림에 인접한 연속적인 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 대응되는 서열이고, p는 8-30의 정수이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 전방향 프라이머는 다음 일반식 Ⅱ로 표현된다:

X_p-Y_q-dT (Ⅱ)

상기 일반식에서, X는 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 업스트림에 인접한 연속적인 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 대응되는 서열이고, Y는 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 5'-방향쪽에 바로 인접한 뉴클레오타이드와 다른 서열이며, p는 8-30의 정수이고, q는 1-2의 정수이다.

상기 일반식에서, p는 바람직하게는 15-25이며, q는 바람직하게는 1이다.

이 경우, 역방향 프라이머는 상술한 전방향 프라이머와 쌍을 이루어 약 50-1000 bp의 증폭물, 바람직하게는 50-500 bp, 보다 바람직하게는 80-400 bp, 가장 바람직하게는 약 200-400 bp의 증폭물을 형성할 수 있도록 서열목록 제 1 서열의 상보적 서열에 혼성화할 수 있는 프라이머이다.

하기 실시예의 표 2에는 본 발명에 이용 가능한 프라이머 서열의 구체적인 예가 기재되어 있다. 표 2의 T-특이 프라이머쌍 중 첫 번째 프라이머쌍이, 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 다운스트림에 위치한 서열을 증폭할 때 이용되는 것이다.

두 번째로, 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 업스트림에 위치한 서열을 증폭하는 경우, 바람직하게는, 이용되는 역방향 프라이머는 3'-말단에 "A" 염기를 갖으며, 나머지 부분은 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이 드의 다운스트림에 위치한 서열과 실질적으로 상보적인 서열을 갖는다.

본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, "실질적으로 상보적인 서열"은 완전히 상보적인 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 상보적이지 않는 서열도 포함되는 의미이다.

이러한 역방향 프라이머는 다음 일반식 I'로 표현된다:

X'_p-dT (I')

상기 일반식에서, X'는 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 다운스트림에 인접한 연속적인 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 서열이고, p는 8-30의 정수이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 역방향 프라이머는 다음 일반식 Ⅱ'로 표현된다:

X'_p-Y'_q-dT (Ⅱ')

상기 일반식에서, X는 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 다운스트림에 인접한 연속적인 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 서열이고, Y'는 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 3'-방향쪽에 바로 인접한 뉴클레오타이드의 상보적인 서열과 다른 서열이며, p는 8-30의 정수이고, q는 1-2의 정수이다.

상기 일반식에서, p는 바람직하게는 15-25이며, q는 바람직하게는 1이다.

이 경우, 전방향 프라이머는 상술한 역방향 프라이머와 쌍을 이루어 약 50-1000 bp의 증폭물, 바람직하게는 50-500 bp, 보다 바람직하게는 80-400 bp, 가장 바람직하게는 약 200-400 bp의 증폭물을 형성할 수 있도록 서열목록 제 1 서열의 상보적 서열에 혼성화할 수 있는 프라이머이다.

하기 실시예의 표 2에는 본 발명에 이용 가능한 프라이머 서열의 구체적인 예가 기재되어 있다. 표 2의 T-특이 프라이머쌍 중 두 번째 프라이머쌍이, 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드의 업스트림에 위치한 서열을 증폭할 때 이용되는 것이다.

PCR 방법의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 이용할 수 있다. 한편, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, PCR 단계에서 어닐링 단계는 일반적인 온도보다 높은 온도에서 실시하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 55-68℃, 보다 바람직하게는 60-654℃, 가장 바람직하게는 약 62-65℃에서 어닐링하여, 대립형-특이 PCR을 실시한다.

한편, 대립형-특이 PCR에 의해 증폭된 산물은 아가로스-겔 전기영동과 같은 통상적인 전기영동 방법으로 확인된다. 즉, PCR 증폭 반응물을 아가로스-겔에 로딩하여, 밴드가 출현하는 지 여부를 관찰하여 초다뿌리혹 변이체 여부를 판정한다.

대립형-특히 PCR에 따라 본 발명의 방법을 실시하는 경우, 바람직하게는 본 발명의 방법은 다음의 단계를 포함한다;

(ⅰ) 뿌리혹 형성 식물체로부터 핵산 분자를 분리하는 단계;

(ⅱ) 상기 일반식 I 또는 Ⅱ로 표시되는 전방향 프라이머 또는 상기 일반식 Ⅰ' 또는 Ⅱ'로 표시되는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR를 실시하는 단계; 및

(ⅲ) PCR 반응결과물을 전기영동하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열의 폴리뉴클레오타이드에 어닐링할 수 있으며, 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 포함하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정용 키트를 포함한다.

바람직하게는, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머는 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드에 해당하는 초다뿌리혹 형성-관련 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 염기에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 프라이머의 3'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다.

본 발명의 키트는 상술한 프라이머를 필수 구성요소로 하는 바, 프라이머에 대한 상세한 설명은 본 발명의 키트에 이용되는 프라이머에도 적용된다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에 따르면, 복잡한 데이터 수집을 요구하는 뿌리혹 형성의 표현형 결정 (phenotyping) 및 접종 과정 없이, 식물체의 초기 성장 단계에서 초다뿌리혹 형성 변이체를 신속하게 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 마커는 다른 유전자형 결정 (genotyping) 방법보다 신속하고, 재현성이 우수하며 저가의 유전자형 결정 방법을 제공하는 것을 가능하게 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

식물재료

2개의 다른 대두 유전자형, 즉 정상적 뿌리혹 형성 특성을 갖는 신팔달콩 2호와 그의 초다뿌리혹 형성 변이체 SS2-2를 GmNARK (Glycine max nodule autoregulation receptor-like protein kinase) 유전자에서의 SNP를 동정하기 위하여 사용하였다. GmNARK에 대한 SNAP 마커의 개발 및 평가를 위하여, SS2-2를 신팔달콩 2호와 교잡시켜 40개 종자의 F₂ 자손을 얻었다. 또한, 6개의 정상적-뿌리혹 형성 재배종 및 2개의 초다-/다뿌리혹 형성 변이체를 이용하였다 (참조: 표 1).

실험에 이용된 대두 재배종에서의 뿌리혹 형성 표현형

타입	뿌리혹 형성 특성	재배종
야생형	정상	신팔달콩 2, 단백콩, 태광콩, 푸레운콩, 진품콩 2, PI 96188, 장엽콩
변이형	초다뿌리혹 형성	SS2-2, nts382
	다뿌리혹 형성	nts1116

서열결정과 SNP 발견 및 동정

Rogers & Bendich (1994)에 개시된 방법에 따라 건강한 엽으로부터 지놈 DNA를 분리하였다. 훼스트 다이-기초 프로토콜에 따라 형광 스펙트로포토미터를 이용하여 DNA 농도를 측정하였다 (모델 F-4500, Hitachi Ltd., Ibaragi, 일본). Tris-EDTA 완충액 (pH 8.0)으로 DNA 용액을 실험 농도까지 희석하고 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.

GmNARK 유전자에 상응하는 PCR 생성물을 얻기 위하여, NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)로부터 얻을 수 있는 GmNARK 유전자 서열 (GenBank Acc. No. AY166655)을 기초로 하여 프라이머를 제작하였다. Gene Runner V. 3.05 (Hastings software Inc., Hastings on Hudson, NY, 미국)를 이용하여 프라이머 서열을 분석하고 선택하였다. 가능한 한 예상되는 길이의 단일 앰플리콘 (amplicon)을 얻기 위하여, 증폭 조건을 최적화하였다. 증폭반응물은 지놈 DNA 50 ng, 전방향 및 역방향 프라이머 각각 3.2 pmol, 각각의 dNTP 200 μM, 1.5 mM MgCl₂, 1 x 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl) 및 AmpliTaq Gold DNA 중합효소 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 1 U를 포함하며, 총 50 ㎕이었다. 반응 혼합물을 94℃에서 4분동안 변성한 다음, 94℃ 30초, 50-65℃ 30초 어닐링 및 72℃ 1분으로 총 30사이클을 증폭하였다. PCR 생성물을 1.0% 에티늄 브로마이드-염색 아가로스 젤에서 전기영동 하였다.

단일 단편으로 증폭된 PCR 생성물은 서열결정에서 주형으로 이용되었다. PCR 반응물을 NucleoSpin Extract kit (MACHEREY-NAGEL Inc., Easton City, PA, 미국)로 정제하고, BigDye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 서열결정 반응을 실시한 다음, ABI PRISM 3700 DNA sequencer로 최종적으로 서열을 결정하였다. 신팔달콩 2호 및 SS2-2 사이에서의 GmNARK 유전자에서의 SNP를 동정하기 위하여, Seqscape 소프트웨어 V. 1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, 미국)을 이용하여 상기 서열을 정렬하였다.

프라이머 디자인 및 SNAP-PCR

동정된 SNP에 특이적인 프라이머를 얻기 위하여, SNP 위치를 포함하는 GmNARK 서열의 일부분을 웹-접근 SNAPER 프로그램 (http://ausubellab.m호.harvard.edu/)에 입력하였다. SNP에 대한 총 5종의 프라이머쌍을 표준 PCR 증폭을 이용하여 시험하였다 (참조: 표 2). PCR은 주형 DNA 10-100 ng, 전방향 및 역방향 프라이머 각각 5 μM, 각각의 dNTP 100 μM, 1.5 mM MgCl₂, 1 x 반응 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl) 및 Taq DNA 중합효소 (AmpliTaq Gold 중합효소, Applied Biosystems, Foster City, CA, 미국) 1 U를 포함하는 총 20 ㎕의 반응물을 이용하여 실시하였다. 프로그램화 열 조절기 (DNA Engine Tetrad, MJ Research, Watertown, MA, 미국)를 이용하여 주형 DNA를 우선 94℃에서 5분 동안 변성한 다음, 다음의 조건으로 PCR 증폭 28 또는 38 사이클을 실시하였다: 94℃ 30초 변성, 64℃ 1분 어닐링과 변성, 그런 다음 72℃ 10분 최종 연장 반응. 증폭 생성물을 1.5% 아가로스 젤에서 분리하여, 밴드의 유무에 따라 SNP 위치에서의 각각의 대립형 (allele)을 분석하였다.

실험 결과

GmNARK 에서의 SNP 동정

GmNARK 유전자 서열로부터 디자인된 몇 종의 프라이머쌍을 이용하여 신팔달콩 2호와 SS2-2간의 SNP를 동정하였다. 상기 프라이머쌍 중에서, 단지 1종의 프라이머쌍만이 서열변이를 갖는 앰플리콘을 생성하였다. 상기 앰플리콘을 형성한 프라이머쌍의 서열은 다음과 같다: 전방향 프라이머: GACATGAGAAGCTGTGTGTGCTAC, 역방향 프라이머: TCCAAGCTCTTAAACTCCGAG. A/T SNP가 GmNARK 유전자 서열의 959 위치에서 발견되었다 (참조: 서열목록 제 1 서열). 엑손 지역에서의 A로부터 T로의 단일염기 변화는, 4종의 SNP 타입 중에서 퓨린의 피리미딘으로의 트랜스버젼으로 분류되었다. SS2-2에서의 서열 변이는 라이신 (AAG)가 정지 코돈 (TAG)으로 변화되는 것을 초래하고, 결국 유전자의 트랜스레이션을 종료시키는 결과를 유발한다.

초다뿌리혹 형성에 대한 SNAP 마커 개발

본 발명의 A/T SNP에 대하여, SNAPER 프로그램으로 디자인된 5종의 프라이머쌍은 A 대립형에 대하여 3쌍, T 대립형에 대하여 2쌍으로 이루어져 있다 (참조: 표 2). A 대립형에 대한 1종의 프라이머쌍을 선택하고, DNA 농도 및 증폭 사이클에 따른 각각의 대립형에 대한 PCR 특이성을 조사하였다. 주형 DNA 농도가 높을수록 그리고 사이클수가 많을수록 위양 (false positive) 결과가 나왔다 (참조: 도 2a). 100 μM dNTP 농도 하에서 30 ng 이하의 주형 DNA 및 28 PCR 사이클을 이용한 경우, A 대립형에 대한 증폭산물이 생성되었고, T 대립형에 대해서는 증폭산물이 생성되지 않았다. 5종의 프라이머쌍 중에서 A 대립형에 대한 2종의 프라이머쌍을 제외한 3종의 프라이머쌍이 각각의 대립형에 대한 신뢰성 있는 특이성을 나타내었다 (참조; 도 2b 및 표 2).

SNAP-PCR에 이용된 GmNARK 유전자의 A/T SNP에 특이적인 프라이머쌍의 서열 및 각각의 프라이머쌍에 의해 형성된 PCR 산물의 표현형

대립형	프라이머 서열	PCR 산물 크기 (bp)	표현형
A-특이	F: CAACCTCACCGGCGTACTTCCGA R: CCTCAGCGTCTTCAACTTCGACAAACTC	343	다형
	F: AACAACCTCACCGGCGTACTTCCAA R: CCTCAGCGTCTTCAACTTCGACAAACTC	345	단형
	F: AATCAGAGAGACATGAGAAGCTGTGTGTGCTA R: GTGAGGGCGGCGAGCTCCCT	374	단형
T-특이	F: GAACAACCTCACCGGCGTACTTCCTT R: CCTCAGCGTCTTCAACTTCGACAAACTC	346	다형
	F: AATCAGAGAGACATGAGAAGCTGTGTGTGCTA R: GTGAGGGCGGCGAGCTCCAA	374	다형

초다뿌리혹 형성에 대한 SNAP 마커

초다뿌리혹 형성에 대한 MAS(marker-assisted selection)에서의 SNAP의 유용성을 평가하기 위하여, SS2-2 x 신팔달콩 2호의 40개 F₂ 자손에서의 뿌리혹 형성의 표현형 데이터를 비교하였다 (참조: 도 3). 이 군집에서, 28개 및 12개 자손이, 각각 정상 및 초다뿌리혹 형성 자손으로 판명되었다. 28개의 정상 개체 중, 8개 개체가 A 대립형에 대하여 특이적인 밴드만을 나타내었고, 이는 상기 개체가 동형접합체임을 보이는 것이다. 정상 표현형을 갖는 나머지 개체들은 A/T SNP에 대하여 이형접합체로 규명되었는 바, 이는 양쪽에 모두 특이적인 밴드가 나타났기 때문이다.

12개의 초다뿌리혹 형성 개체는 단지 T 대립형에 대하여 특이적인 밴드를 보였다. 이러한 GmNARK의 대립형 분리 비율은 F₂ 군집에서 단일 열성 유전자의 1:2:1의 기대비율과 부합되는 것이다. 따라서, GmNARK 유전자와 공-분리되는 본 발명의 SNAP 마커 및 SNP 위치에서의 선택적 뉴클레오타이드는, 각각 정상 표현형 및 초다뿌리혹 형성 표현형을 규명한다.

6개의 정상, 1개의 초다뿌리혹 형성 및 1개의 다뿌리혹 형성 유전자형으로 이루어진 8개의 대두 표현형 (참조: 표 1)에 대하여, GmNARK에 대한 SNAP 마커를 평가하였다. 모든 유전자형은 신팔달콩 2호와 동일한 밴드 패턴을 나타내었다 (참조: 도 4). 초다뿌리혹 형성 변이체 nts382는 GmNARK 유전자의 다른 위치에서 SNP를 갖는 것으로 알려져 있다. 상기 결과는, 본 발명의 SNAP 마커가 무작위 PCR 마커와 다르게 특정의 교잡 군집에 대하여 특이성을 갖지 않는다는 것을 나타내며, 뿌리의 표현형 분석 없이 초다뿌리혹 형성 특성을 갖는 개체를 선택할 수 있다는 것을 나타낸다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 초다뿌리혹 형성에 대한 SNP를 제공한다. 또한, 본 발명은 초다뿌리혹 형성에 대한 SNP를 이용하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정방법을 제공한다. 한편, 본 발명은 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정용 키트를 제공한다. 본 발명에 따르면, 복잡한 데이터 수집을 요구하는 뿌리혹 형성의 표현형 결정 및 접종 과정 없이, 식물체의 초기 성장 단계에서 초다뿌리혹 형성 변이체를 신속하게 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 마커는 다른 유전자형 결정 (genotyping) 방법보다 신속하고, 재현성이 우수하며 저가의 유전자형 결정 방법을 제공하는 것을 가능하게 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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cctcctcact ctgctactca 4020 cactcacaac ctaattaatc tctagttaat taagttattt gctcatcgat ccagattcac 4080 ttcttttcaa aataaattaa cacagacgaa aactgtagga ataactttca tctgttgttt 4140 gtccgaagtg aaacaacgaa tcaaatgtga actatgtatc aaatgtaaga taggttttaa 4200 ttaattttgt aatattggtg tcaactgtca actgtcaagt aattcgaagg attttcccca 4260 atcgaattcc ccggccgcca tggcggccg 4289

Claims (11)

1. 서열목록 제 1 서열로 표시되는 DNA에 있어서 959번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 서열로 구성되며, 상기 959번째 뉴클레오타이드 w가 T인 것을 특징으로 하는 DNA 단편으로서, 상기 DNA 단편은 뿌리혹 형성 식물체에서 초다뿌리혹 형성 (supernodulating) 변이체를 동정하는 데 이용되는 유전적 마커로서 유용한 DNA 단편.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 뿌리혹 형성 식물체는 콩인 것을 특징으로 하는 유전적 마커로서 유용한 DNA 단편.
3. (a) 뿌리혹 형성 식물체로부터 핵산 분자를 분리하는 단계; 및 (b) 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드에 해당하는 초다뿌리혹 형성-관련 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 염기 "T"의 존재 유무를 상기 분리된 핵산 분자에서 확인하는 단계를 포함하며, 상기 SNP 위치가 "T"인 경우에는 초다뿌리혹 형성 변이체로 판정하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹 형성 식물체에서 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정방법:
4. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산 분자를 증폭하여 실시하는 것을 특징으로 하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드에 해당하는 초다뿌리혹 형성-관련 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 염기에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머의 3'-말단은 상기 SNP 염기에 매칭되는 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 전방향 프라이머는 3'-말단에 "T" 염기를 갖으며, 나머지 부분은 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드의 업스트림에 위치한 서열과 대응되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 3'-말단에 "A" 염기를 갖으며, 나머지 부분은 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드의 다운스트림에 위치한 서열과 상보적인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정방법.
8. 서열목록 제 1 서열의 959번째 뉴클레오타이드 w가 T인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 포함하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정용 키트.
9. 제 6 항에 있어서, 상기 프라이머쌍 중에서 전방향 프라이머 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드에 해당하는 초다뿌리혹 형성-관련 단일뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 염기에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 전방향 또는 역방향 프라이머의 3'-말단은 상기 SNP 염기에 매칭되는 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정용 키트.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 전방향 프라이머는 3'-말단에 "T" 염기를 갖으며, 나머지 부분은 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드의 업스트림에 위치한 서열과 대응되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정용 키트.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 3'-말단에 "A" 염기를 갖으며, 나머지 부분은 서열목록 제 1 서열에서 959번째 뉴클레오타이드의 다운스트림에 위치한 서열과 상보적인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 초다뿌리혹 형성 변이체의 동정용 키트.

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