KR20040105744A - 게놈 변이의 신속한 분석법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단일 또는 다수의 염색체 상의 다수의 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 데에 유용한 방법을 제공한다. 본 방법에서는 제한 효소의 인식 부위를 포함하여 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 생성하는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 이용된다. 5' 오버행은 탐지될 수 있는 뉴클레오티드의 혼입을 위한 주형으로 사용된다. 본 방법에 의해 특히 하나의 핵산 샘플로부터의 단일 뉴클레오티드 다형성과 같은 다수의 서열이 분석될 수 있다.

Description

게놈 변이의 신속한 분석법{RAPID ANALYSIS OF VARIATIONS IN A GENOME}
개체간의 서열 변이는 해로운 질환 돌연변이로부터 중성의 다형성까지의 연속을 포함한다. 듀센형(Duchenne) 근이영양증, 알츠하이머병, 낭성 섬유증, 및 헌팅턴병을 포함하여 최근에 공지된 3천가지보다 많은 유전 질환이 존재한다 (D. N. Cooper and M. Krawczak,"Human Genome Mutations, "BIOS Scientific Publishers,Oxford (1993)). 또한 특정 DNA 서열은 개체가 비만, 동맥경화증, 및 유방암, 전립선암, 및 결장암을 포함하는 여러 유형의 암과 같은 다양한 질환에 걸리기 쉽게 한다. 또한 다운 증후군을 생성하는 삼염색체 21, 에드워드 증후군을 생성하는 삼염색체 18, 파타우 증후군을 생성하는 삼염색체 13, 터너 증후군을 생성하는 일염색체 X, 및 기타 성 염색체 이수성과 같은 염색체 이상은 정상 출산 인간에 있어서 상당한 부분의 유전적 결함을 차지한다. 유전자 돌연변이, 염색체 이상, 및 유전자 서열에서의 변이, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)에 대한 지식은 질환의 이해, 진단, 예방 및 치료에 도움이 될 것이다.
가장 빈번하게는, 서열 변이는 반복 서열 요소, 예를 들어 미니부수체 및 마이크로부수체, 작은 삽입 또는 결실과, 개개의 염기의 치환의 길이가 다른 것으로 생각된다. 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)은 가장 일반적인 유형의 서열 변이를 대표하며; 5%보다 큰 집단 빈도를 가지는 3백만의 일반적인 SNP가 인간 게놈에서 존재하는 것으로 추정되었다. 일반적으로 프레임시프트 (frameshift) 돌연변이를 야기하는 작은 결실 또는 삽입이 평균 매 12 킬로베이스의 게놈 DNA에서 1회 발생한다 (Wang, D. G. et al., Science 280: 1077-1082 (1998)). 이러한 다형성을 안내자로 사용한 유전자 지도가 개발되고 있다 (http://research.marshfieldclinic. org/genetics/ ; 2002년 1월 10일자의 인터넷 주소).
인간 게놈의 핵산 서열은 2001년 2월에 공개되었으며, 수백 수천의 SNP 마커 및 인간 질환에 대한 잠재적인 풍부한 정보를 포함하는 전례가 없는 해상도의 유전자 지도를 제공한다 (Venter et al., Science 291: 1304-1351 (2001);International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409: 860-921 (2001)). 그러나, 인간 염색체 내에 포함된 DNA의 길이는 총 30억 염기쌍보다 커서 모든 개인의 게놈의 서열을 결정하는 것은 실행될 수 없다. 따라서 질환 표현형에 걸리기 쉽게 하거나 질환 표현형을 야기하는 SNP 및 점 돌연변이의 대립유전자 변이체의 존재를 신속하게 결정하는 높은 처리량의 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 개체의 생리학적 특성, 심리학적 특성, 청각 과학적 특성, 안과학적 특성, 신경학적 특성, 약물에 대한 응답, 약물 대사, 및 약물 상호 작용에 영향을 주는 기능적 다형성을 특징화하는 효율적인 방법도 필요하다.
여러 기술, 예를 들어 DNA 서열 결정, 제한 효소 단편 길이 다형성 (restriction fragment length polymorphism, RFLP), DNA 마이크로어레이 및 펩티드 핵산 분석을 포함하는 DNA 혼성화 분석, 및 단백질 절단 시험 (Protein Truncation Test, PTT)이 유전자 변이의 분석 및 탐지에 광범위하게 사용되는데, 이들 모두에는 제한성이 있다. DNA 서열 결정법이 가장 명확한 방법이지만, 이 방법은 또한 가장 시간을 많이 소비하며 값이 비싸다. 심지어 단지 코딩 서열의 작은 분획이 목적하는 것일지라도 종종 유전자의 전체 코딩 서열이 분석된다. 대부분의 경우에 임의의 특정 유전자의 제한된 수의 돌연변이가 대부분의 질환 표현형을 차지한다.
예를 들어 낭성 섬유증 막통과 컨덕턴스 조절 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 유전자는 250,000 염기쌍에 걸쳐서 존재하는 24개의 엑손으로 구성되어 있다 (Rommens et al. , Science 245: 1059-1065 (1989); Riordan et al., Science 245: 1066-73 (1989)). 일반적으로 낭성 섬유증의 질환 상태와 관련된 CFTR 유전자에 대략 200개의 돌연변이가 존재한다. 따라서 CTFR 유전자의 판독 프레임의 단지 매우 작은 퍼센트가 분석될 필요가 있다. 또한 총 10개의 돌연변이가 모든 공지된 질환의 사례의 75.1%를 구성한다. 단일 페닐알라닌 잔기가 결실된 F508은 백인에 있어서의 모든 낭성 섬유증의 66%를 차지한다.
서던 블롯, 슬롯 블롯, 도트 블롯 및 DNA 마이크로어레이를 비롯한 혼성화 기술이 유전자 변이의 탐지에 일반적으로 사용된다 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Third Edition (2001)). 전형적인 혼성화 분석법에 있어서, 미공지 뉴클레오티드 서열 ("표적")은 공지된 뉴클레오티드 서열 ("프로브")을 포함하는 다른 단편에 대한 그의 친화성에 기초하여 분석된다. 두 단편이 "엄격한 조건" 하에서 혼성화된다면 이 서열은 상보성인 것으로 생각되며 표적 단편의 서열은 "프로브" 서열로부터 추정될 수 있다.
그러나 전형적인 혼성화 분석으로부터의 결과는 종종 해석이 어렵다. 혼성화 시그널의 부재 또는 존재는 "엄격한 조건"의 정의에 따라 달라진다. 임의의 갯수의 변수를 사용하여 염 농도, 경쟁 뉴클레오티드 단편의 존재 또는 부재, 비특이적 결합의 제거를 위하여 수행되는 세척의 횟수 및 혼성화가 수행되는 시간 및 온도와 같은 엄격도 조건을 상승시키거나 저하시킬 수 있다. 일반적으로 혼성화 조건은 각각의 "표적" 뉴클레오티드 단편에 대하여 최적화되어야 하는데, 이는 시간이 많이 소비되며 고 처리 방법과 부합되지 않는다. 고도의 변이성과, 고 비율의 허위 양성이 혼성화 분석법에서 종종 보여진다. 일반적으로 혼성화 분석법은 유망한 후보에 있어서의 스크린으로 기능그러나, 양성 확인은 DNA 서열 결정 분석을 필요로 한다.
여러 돌연변이 탐지 기술이 혼성화 분석법의 원리에 기초하여 개발되었다. 예를 들어 프라이머 연장 분석법에 있어서, 목적 뉴클레오티드에 걸쳐서 존재하는 DNA 영역이 PCR 또는 임의의 기타 적합한 증폭 기술로 증폭된다. 증폭 후, 프라이머는 표적 핵산 서열에 혼성화되며, 여기서 프라이머의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드는 분석될 표적 서열 상의 뉴클레오티드 위치의 5'에 인접하여 어닐링된다. 어닐링된 프라이머는 표지된 단일 뉴클레오티드 트리포스페이트에 의해 연장된다. 이어서 혼입된 뉴클레오티드가 탐지된다.
프라이머 연장 분석법에 대한 여러 제한성이 존재한다. 첫째, 목적 영역이 프라이머 연장 이전에 증폭되어야 하는데 이는 분석 시간 및 비용을 증가시킨다. 둘째, PCR 프라이머 및 dNTP가 프라이머 연장 전에 완전히 제거되어야 하며, 잔류 오염물은 결과물의 적절한 분석을 간섭할 수 있다. 셋째, 이 분석법의 가장 한정적인 측면으로서, 프라이머가 DNA 주형에 혼성화되어야 하는데, 이는 각각의 프라이머, 및 분석되는 각각의 서열에 있어서 조건의 최적화를 필요로 한다. 혼성화 분석법은 낮은 재현성 정도, 및 높은 비특이성 정도를 가진다.
펩티드 핵산 (Peptide Nucleic Acid, PNA) 친화성 분석법은 전통적인 혼성화 분석법의 파생법이다 (Nielsen et al., Science 254: 1497-1500 (1991) ; Egholmet al. , J. Am. Chem. Soc. 114: 1895-1897 (1992) ; James et al., Protein Science 3: 1347-1350 (1994)). PNA는 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기 접합 규칙을 따르는 구조적 DNA 모방체이며, 표준 DNA 혼성화 분석법에서 사용된다. PNA는 혼성화 분석법에서 더욱 큰 특이성을 나타내는데 이는 PNA/DNA 미스매치가 DNA/DNA 미스매치보다 더욱 불안정하며 상보성 PNA/DNA 가닥이 상보성 DNA/DNA 가닥보다 더욱 강한 결합을 형성하기 때문이다. 그러나 PNA를 사용한 유전자 분석법은 힘든 혼성화 단계를 여전히 필요로 하며, 따라서 비특이성 정도가 높고 재현성이 어렵다.
최근에 DNA 마이크로어레이가 유전자 변이 및 다형성의 탐지를 위하여 개발되었다 (Taton et al., Science 289: 1757-60,2000 ; Lockhart et al. , Nature 405: 827-836 (2000); Gerhold et al., Trends in Biochemical Sciences 24: 168-73 (1999); Wallace, R. W. , Molecular Medicine Today 3: 384-89 (1997); Blanchard and Hood, Nature Biotechnology 149: 1649 (1996)). DNA 마이크로어레이는 고속 로봇 공학에 의해 유리 또는 나일론 기재 상에서 제작되며, 공지된 신원의 DNA 단편 ("프로브")을 포함한다. 마이크로어레이는 전통적인 염기-접합 규칙에 기초하여 공지 및 비공지 DNA 단편 ("표적")의 매칭에 사용된다. DNA 마이크로어레이의 이점은 하나의 DNA 칩이 수천개의 유전자에 대한 정보를 동시에 제공할 수 있다는 것이다. 그러나 DNA 마이크로어레이는 여전히 혼성화의 원리에 기초하며, 따라서 상기에서 논의된 불리한 점을 가진다.
단백질 절단 시험 (PTT)도 유전자 다형성의 탐지에 일반적으로 사용된다(Roest et al. , Human Molecular Genetics 2: 1719-1721, (1993); Van Der Luit et al. , Genomics 20: 1-4 (1994); Hogervorst et al., Nature Genetics 10: 208-212 (1995)). 일반적으로 PTT에 있어서 목적 유전자는 PCR로 증폭되며 시험관내에서 전사/번역되고, 정제되고 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분석된다. PTT는 코딩 서열의 큰 부분의 스크리닝 및 기대되는 단백질의 크기를 유의하게 감소시키는 종결 코돈을 생성하는 돌연변이의 탐지에 유용하다. 그러나 PTT는 단백질의 크기를 유의하게는 변경시키지 않는 돌연변이의 탐지를 위해서 설계된 것은 아니다.
따라서 DNA, 특히 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 돌연변이를 가질 것으로 의심되는 게놈 DNA의 신속한 분석 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 간단한 개요
본 발명은 (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머 (여기서, 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위를 포함하여 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행 (overhang)이 생성됨)를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계; (b) 증폭 DNA를 제2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소를 이용하여 절단하는 단계; (c) 주형으로 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계; 및 (d) (c)의 DNA의 서열의 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 목적 유전자좌의 서열의 결정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머 (여기서, 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위의 일부를 포함하며, 완전한 제한 효소 인식 부위는 주형 DNA의 증폭시 생성되어 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성됨)를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계; (b) 증폭 DNA를 제2 프라이머 및 주형 DNA에 의해 생성되는 완전한 인식 부위를 인식하는 제한 효소를 이용하여 절단하는 단계; (c) 주형으로 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계; 및 (c)의 DNA의 서열의 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 목적 유전자좌의 서열의 결정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머 (여기서, 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위를 생성하는 서열을 포함하여 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성됨)를 사용하여 주형 폴리뉴클레오티드로부터 목적 유전자좌를 포함하는 DNA 영역을 복제하는 단계; (b) 제2 프라이머에 의해 생성되는 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 DNA를 절단하여 DNA 단편을 생성하는 단계; (c) 주형으로 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계; 및 (d) (c)의 DNA의 서열의 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 목적 유전자좌의 서열의 결정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 결정될 목적 유전자좌 및 제한 효소의 인식 부위를 포함하는 DNA 단편에 관한 것인데, 여기서 제한 효소를 이용한 절단에 의해 DNA 단편상에서 5' 오버행이 생성되며, 목적 유전자좌 및 제한 효소 인식 부위는 서로 관련성이 있어 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성된다.
주형 DNA는 합성 핵산을 포함하는 임의의 공급원, 바람직하게는 박테리아, 진균류, 바이러스, 식물, 원생 동물, 동물 또는 인간 공급원으로부터 수득될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서 주형 DNA은 인간 기원으로부터 수득된다. 다른 실시 형태에 있어서 주형 DNA는 세포, 조직, 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 척수액, 림프액, 정액, 질 분비물, 복수, 타액, 점막 분비물, 복막액, 배설물 샘플, 또는 신체 분비물로부터 수득된다.
제1 및/또는 제2 프라이머의 3' 영역은 주형 DNA와의 미스매치를 포함할 수 있다. 미스매치는 3' 말단의 마지막 1, 2 또는 3개의 염기에서 발생할 수 있지만 그에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 제한 효소는 인식 부위에서 DNA를 절단할 수 있다. 제한 효소는 PflF I, Sau96 I, ScrFI, BsaJI, BsskI, DdeI, EcoNI, Fnu4HI, HinfI, 또는 Tthlll I일 수 있으나 그에 한정되는 것은 아니다. 대안적으로는, 본 발명에서 사용되는 제한 효소는 그의 인식 부위에서 떨어져서 DNA를 절단할 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서 제1 프라이머가 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 이 제한 효소 인식 부위는 제2 프라이머 상의 제한 효소 인식 부위와 다르다. 본 발명은 증폭 DNA를 제1 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소를 이용하여 절단하는 것을 포함한다.
바람직하게는 제2 프라이머 상의 인식 부위는 인식 부위와 떨어져서 DNA를 절단하며 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 생성하는 제한 효소의 인식 부위이다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 제2 프라이머 상의 인식 부위는 IIS형 제한 효소의 인식 부위이다. 예를 들어 IIS형 제한 효소는 AlwI, Alw26 I, BbsI, BbvI, BceAI, BmrI, BsaI, Bst71 I, BsmA I, BsmBI, BsmF I, BspM I, EarI, FauI, Fok I, HgaI, PleI, SapI, SSfaN I, 및 Sthi32 I, 더 바람직하게는 BceA I 및 BsmF I으로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 제2 프라이머의 5' 영역은 주형 DNA에 어닐링하지 않으며/않거나 제1 프라이머의 5' 영역은 주형 DNA에 어닐링하지 않는다. 제1 또는 제2 프라이머의 3' 영역의 어닐링 길이는 25-20개, 20-15개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 또는 4개 미만의 염기일 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함할 수 있다. 추가의 실시 형태에 있어서, PCR의 사이클 1의 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제2 프라이머의 3' 영역의 용융 온도일 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서 PCR의 사이클 2의 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도일 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서 나머지 사이클의 어닐링 온도는 대략 제2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도일 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서 제2 프라이머의 3' 말단은 목적 유전자좌에 인접한다.
제1 및/또는 제2 프라이머는 5' 말단에서 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게는 제1 프라이머는 5' 말단에서 태그를 포함한다. 태그는 증폭 DNA를 주형 DNA로부터 분리하는 데에 사용될 수 있다. 태그는 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 DNA를 표지된 뉴클레오티드를 포함하지 않는 증폭 DNA로부터 분리하는 데에 사용될 수 있다. 태그는 방사성 동위 원소, 형광성 리포터 분자, 화학 발광성 리포터 분자, 항체, 항체 단편, 합텐, 바이오틴, 바이오틴의 유도체, 포토바이오틴, 이미노바이오틴, 디곡시게닌, 아비딘, 효소, 아크리디늄, 당, 효소, 아포효소, 동종 중합체성 올리고뉴클레오티드, 호르몬, 강자성 부분, 상자성 부분, 반자성 부분, 인광성 부분, 발광성 부분, 전기 화학 발광성 부분, 염색성 부분, 탐지가능한 전자 스핀 공명, 전기 용량, 유전 상수 또는 전기 전도도를 가지는 부분, 또는 그의 조합일 수 있지만 그에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 태그는 바이오틴이다. 바이오틴 태그는 스트렙타비딘 매트릭스를 사용하여 증폭 DNA를 주형 DNA로부터 분리하는 데에 사용된다. 스트렙타비딘 매트릭스는 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 코팅된다.
본 발명의 방법에 있어서 뉴클레오티드는 대장균 (E. coli) DNA 폴리머라제, 대장균 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 (Klenow) 단편, T5 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, 벤트 (Vent) DNA 폴리머라제, 박테리오파지 29, REDTaqTMGenomic DNA 폴리머라제, 및 시쿼나제 (sequenase)를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 DNA 폴리머라제에 의해 혼입된다.
뉴클레오티드의 혼입은 표지 및 미표지 뉴클레오티드의 혼합물을 사용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 4개의 뉴클레오티드, 5개의 뉴클레오티드, 또는 5개 초과의 뉴클레오티드가 혼입될 수 있다. 표지 및 미표지 뉴클레오티드의 배합물이 혼입될 수 있다. 표지 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트일 수 있지만 그에 한정되는 것은 아니다. 미표지 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트일 수 있지만 그에 한정되는 것은 아니다. 표지 뉴클레오티드는 방사성 분자, 형광성 분자, 항체, 항체 단편, 합텐, 탄수화물, 바이오틴, 및 바이오틴의 유도체, 인광성 부분, 발광성 부분, 전기 화학 발광성 부분, 염색성 부분, 또는 탐지가능한 전자 스핀 공명, 전기 용량, 유전 상수 또는 전기 전도도를 가지는 부분을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 것과 같은 분자로 표지된다. 바람직하게는 표지 뉴클레오티드는 형광성 분자로 표지된다. 형광성 표지 뉴클레오티드의 혼입은 형광성 및 미표지 뉴클레오티드의 혼합물의 사용을 추가로 포함한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 목적 유전자좌의 서열 결정은 혼입된 뉴클레오티드의 탐지를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 이 탐지는 그에 한정되는 것은 아니지만 전기 영동법, 모세 전기 영동법, 마이크로채널 전기 영동법, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법, 형광성 탐지법, 서열 결정법, ELISA, 질량 분광 분석법, 비행 시간형 질량 분광 분석법, 사중극자형 질량 분광 분석법, 자기 구획 질량분광 분석법, 전기 구획 질량 분광 분석법, 형광 측정법, 적외선 분광 측정법, 자외선 분광 측정법, 팔렌티오스터틱 (palentiostatic) 전류 측정법, 혼성화법, 예를 들어 서던 블롯, 또는 마이크로어레이와 같은 방법에 의해 행한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 탐지는 형광성 탐지에 의한 것이다.
바람직한 실시 형태에 있어서 목적 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 돌연변이를 포함할 것으로 의심된다. 본 방법은 다수의 목적 유전자좌의 서열을 동시에 결정하는 데에 사용될 수 있다. 주형 DNA는 단일 염색체 유래의 다수의 유전자좌를 포함할 수 있다. 주형 DNA는 상이한 염색체 유래의 다수의 유전자좌를 포함할 수 있다. 주형 DNA 상의 목적 유전자좌는 하나의 반응에서 증폭될 수 있다. 대안적으로는 주형 DNA 상의 목적 유전자좌 각각은 개별적인 반응에서 증폭될 수 있다. 증폭 DNA는 함께 풀링 (pooled)한 후 증폭 DNA를 절단할 수 있다. 목적 유전자좌를 포함하는 각각의 표지된 DNA는 분리한 후 목적 유전자좌의 서열을 결정할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서 하나 이상의 목적 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 돌연변이를 포함할 것으로 의심된다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은 단일 개체 또는 다수의 개체 유래의 다수의 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 데에 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 다수의 개체 유래의 단일한 목적 유전자좌의 서열의 결정에 사용될 수 있다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2002년 3월 11일에 출원된 미국 특허 출원 제10/093,618호와, 각각 2002년 3월 1일 및 2002년 5월 8일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제60/360,232호 및 동 제60/378,354호를 우선권으로 주장한다. 상기 출원의 내용은 본 명세서에 그의 전체 내용이 참고로 인용된다.
본 발명은 신속한 핵산 서열 결정 방법에 관한 것이다. 본 방법은 유전자형 분석, 및 단일 또는 다수의 염색체 상에서 하나 내지 수십개 내지 수백개 내지 수천개의 단일 뉴클레오티드 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 또는 돌연변이의 탐지, 그리고 염색체의 이상, 예를 들어 절단 (truncation), 염기 변환 (transversion), 삼염색체 (trisomies), 및 일염색체 (monosomies)의 탐지에 특히 유용하다.
도 1A는 이중 가닥 DNA 분자를 도시하는 개략도이다. 프라이머 쌍은 만곡화살표로 도시하였으며 목적 유전자좌의 측면에 위치하며 N14 염기에서 삼각형 기호로 도시하였다. 목적 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성, 점 돌연변이, 삽입, 결실, 전좌 등일 수 있다. 각각의 프라이머는 제1 프라이머에서 영역 "a"로, 그리고 제2 프라이머에서 영역 "d"로 도시된 5' 말단으로부터 약 10 bp의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제한 효소 인식 부위 "a"는 임의의 유형의 제한 효소에 대한 것일 수 있지만, 인식 부위 "d"는 그의 인식 부위로부터 "n" 뉴클레오티드 떨어져서 절단하여 5' 오버행 및 리세싱된 (recessed) 3' 말단을 남기는 제한 효소에 대한 것이다. 이러한 효소의 예로는 BceA I 및 BsmF I을 들 수 있지만 그에 한정되는 것은 아니다. 5' 오버행은 3' 리세싱된 말단 내로의 뉴클레오티드 혼입을 위한 주형으로 기능한다.
제1 프라이머는 정제를 돕기 위하여 5' 말단에서 바이오틴으로 변형된 것으로 예시되어 있다. 제1 프라이머의 3' 말단의 서열은 프라이머가 목적 유전자좌의 상류 및 하류의 요망되는 거리에서 어닐링되도록 하는 것이다. 제2 프라이머는 목적 유전자좌에 근접하여 어닐링하며, 영역 "c"로 도시된 어닐링 부위는 제2 프라이머의 3' 말단이 목적 유전자좌로부터 1개의 염기만큼 떨어져서 어닐링하도록 설계된다. 제2 프라이머는 목적 DNA로부터의 임의의 거리에서 어닐링할 수 있되, 단, 제2 프라이머 상의 영역 "d"를 인식하는 제한 효소를 이용한 절단은 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 생성한다.
영역 "b"로 도시되는 제1 프라이머 어닐링 부위는 약 20개의 염기이다.
도 1B는 PCR에 의한 첫번째 증폭 사이클의 어닐링 및 연장 단계를 도시하는개략도이다. 첫번째 증폭 사이클은 대략 주형 DNA에 어닐링하며 영역 "c"로 도시되며 본 예에 있어서 13 염기쌍인 제2 프라이머의 3' 영역의 용융 온도에서 수행된다. 이 온도에서 제1 및 제2 프라이머 둘 모두는 그의 각각의 상보성 가닥에 어닐링하며 점선으로 도시된 연장을 시작한다. 이러한 첫번째 사이클에 있어서 제2 프라이머는 제1 프라이머가 다음 사이클에서 어닐링할 수 있는 영역 b를 연장시키며 영역 b를 카피 (copy)한다.
도 1C는 PCR의 제2 증폭 사이클에 있어서 변성 이후의 어닐링 및 연장 단계를 도시하는 개략도이다. 제2 증폭 사이클은 대략 영역 "b"로 도시되는 주형 DNA에 어닐링하는 제1 프라이머의 3' 영역의 20 bp의 용융 온도인 더욱 높은 어닐링 온도 (TM2)에서 수행된다. 따라서 TM2에서 영역 b에 상보성인 제1 프라이머는 제1 반응 사이클에서 카피된 DNA에 결합할 수 있다. 그러나 TM2에서 제2 프라이머는 어닐링 온도가 너무 높기 때문에 제1 반응 사이클에서 카피된 DNA 또는 원래의 주형 DNA에 어닐링할 수 없다. 제2 프라이머는 원래의 주형 DNA의 13개의 염기에 어닐링할 수 있지만 TM2는 대략 20개의 염기의 용융 온도에서 계산된다.
도 1D는 제3 증폭 사이클 동안의 변성 후의 어닐링 및 연장 반응을 도시하는 개략도이다. 이 사이클에 있어서 어닐링 온도 TM3은 대략 영역 "c" 및 "d"를 포함하는 전체 제2 프라이머의 용융 온도가다. 영역 "c" + "d"의 길이는 대략 27-33 bp 길이이며 따라서 TM3은 TM1 및 TM2보다 유의하게 더 높다. 이러한 더 높은 TM에서 영역 c 및 d를 포함하는 제2 프라이머는 사이클 2에서 생성되는 카피된 DNA에 어닐링한다.
도 1E는 나머지 증폭 사이클에 있어서의 어닐링 및 연장 반응을 도시하는 개략도이다. 나머지 사이클에 있어서의 어닐링 온도는 대략 전체 제2 프라이머의 용융 온도인 TM3이다. TM3에서 제2 프라이머는 영역 c' 및 d'을 포함하는 주형에 결합하며 제1 프라이머는 영역 a' 및 b를 포함하는 주형에 결합한다. 첫번째의 세 사이클에 있어서 각각의 사이클에서 어닐링 온도를 TM1 내지 TM2 내지 TM3로 연속적으로 상승시킴으로써 비특이적 증폭을 유의하게 감소시킨다.
도 1F는 고형 매트릭스에 결합된 증폭된 목적 유전자좌를 도시하는 개략도이다.
도 1G는 "d"를 인식하는 제한 효소를 이용한 절단 후의 결합된 증폭 DNA를 도시하는 개략도이다. "하류" 말단은 상청액 내로 방출되며 임의의 적합한 완충제로 세척함으로써 제거될 수 있다. 목적 유전자좌를 포함하는 상류 말단은 고형 매트릭스에 여전히 결합되어 있다.
도 1H는 표지된 ddNTP를 이용한 "필링 인 (filling in)" 후 결합된 증폭 DNA를 도시하는 개략도이다. DNA 폴리머라제가 목적 유전자좌 (N14)에 상보성인 염기 (N'14)의 "필 인"에 사용된다. 이러한 예에 있어서 단지 목적 유전자좌 또는 목적 SNP가 필 인되도록 단지 ddNTP만이 이 반응에 존재한다.
도 1I는 제한 효소 "a"를 이용한 절단 후 표지된 결합 DNA를 도시하는 개략도이다. 표지 DNA는 상청액 내로 방출되는데 이는 혼입된 염기의 확인을 위하여 수집될 수 있다.
도 2는 목적 유전자좌의 "N" 수, 및 프라이머가 각각의 목적 유전자좌의 측면에 위치하도록 특이적으로 어닐링하는 x1,y1내지 xn,yn,의 프라이머쌍의 "n" 수를 가지는 이중 가닥 DNA 주형을 도시하는 개략도이다. 제1 프라이머는 ●으로 도시되는, 5' 말단에서 바이오티닐화되며, 임의의 유형의 제한 효소에 의해 인식되는 제한 효소 인식 부위 "a"를 포함한다. 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위 "d"를 포함하는데, "d"는 그의 인식 부위로부터 떨어져서 DNA를 절단하며 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행 및 리세싱된 3' 말단을 생성하는 제한 효소 인식 부위이다. 제2 프라이머는 각각의 목적 유전자좌에 인접하여 어닐링된다. 제2 프라이머 중의 제한 효소 부위 "d"의 정확한 위치는 제한 효소 "d"를 이용한 각각의 목적 유전자좌의 PCR 생성물의 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행 및 3' 리세싱된 말단이 생성되도록 설계된다. 제1 프라이머의 어닐링 부위는 약 20 염기의 길이이며 각각의 연속성의 제1 프라이머가 그의 각각의 제2 프라이머로부터 더 떨어져서 존재하도록 선택된다. 예를 들어 유전자좌 1에서 제1 및 제2 프라이머의 3' 말단이 Z 염기쌍 떨어져 있다면, 유전자좌 2에서는 제1 및 제2 프라이머의 3' 말단이 Z + K 염기쌍 떨어져 있으며, 여기서 K = 1, 2, 3 또는 3개 초과의 염기이다. 유전자좌 N에 있어서의 프라이머는 ZN-1+ K 염기쌍 떨어져 있다. 각각의 연속성 제1 프라이머가 그의 각각의 제2 프라이머로부터 더욱 떨어져 있도록 만드는 목적은 도 1B-1I에서 설명된 증폭, 정제, 절단 및 표지 후 생성되는) "필 인된" 제한 효소 단편이 크기 면에서 다르며 예를 들어 전기 영동에 의해 분리될 수 있어 각각의 개별적인 목적 유전자좌를 탐지하려는 것이다.
도 3은 다수의 어닐링 온도를 사용한 SNP를 포함하는 DNA 단편의 PCR 증폭이다. 36명의 인간 지원자로부터 유래된 게놈 DNA 주형을 포함하는 샘플에 있어서 하기 4가지의 SNP를 분석하였다: 염색체 21에 위치하며 인간 염색체 21 cSNP 데이터베이스 (Human Chromosome 21 cSNP Database)에서 할당된 확인 번호인 SNP HC21S00340 (레인 1); 염색체 1에 위치하는 SNP TSC 0095512 (레인 2); 염색체 1에 위치하는 SNP TSC 0214366 (레인 3); 및 염색체 1에 위치하는 SNP TSC 0087315 (레인 4). SNP를 포함하는 각각의 DNA 단편을, 본 명세서에서 낮은 엄격도의 어닐링 온도; 중간 엄격도의 어닐링 온도; 및 높은 엄격도의 어닐링 온도로 칭해지는 세가지의 상이한 어닐링 온도의 프로토콜을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 어닐링 온도 프로토콜과는 상관 없이, SNP를 포함하는 각각의 DNA 단편을 40 사이클의 PCR로 증폭시켰다. 각각의 PCR 반응에 있어서의 변성 단계는 95℃에서 30초 동안 수행하였다.
도 3A는 낮은 엄격도의 어닐링 온도의 프로토콜을 사용한 상이한 SNP를 포함하는 4개의 DNA 단편의 PCR 증폭을 입증하는 겔의 사진이다.
도 3B는 중간 엄격도의 어닐링 온도의 프로토콜을 사용한 상이한 SNP를 포함하는 4개의 DNA 단편의 PCR 증폭을 증명하는 겔의 사진이다.
도 3C는 높은 엄격도의 어닐링 온도의 프로토콜을 사용한 상이한 SNP를 포함하는 4개의 DNA 단편의 PCR 증폭을 증명하는 겔의 사진이다.
도 4A는 염색체 21에 위치하며 인간 염색체 21 cSNP 데이터베이스에 의해 할당된 SNP HC21S00027 (서열 번호: 27 & 28)의 DNA 서열의 묘사이다. 제1 프라이머 (서열 번호: 17) 및 제2 프라이머 (서열 번호: 18)를 HC21S00027의 서열의 위 및 아래에 각각 나타내었다. 제1 프라이머는 바이오티닐화되며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제2 프라이머는 BsmF I의 제한 효소 인식 부위를 포함하며 상기 DNA 서열에 어닐링하는 13개의 염기를 포함한다. SNP는 R (A/G) 및 r (T/C; R에 상보성임)로 나타내어진다.
도 4B는 염색체 21에 위치하며 인간 염색체 21 cSNP 데이터베이스에 의해 할당된 SNP HC21S00027 (서열 번호: 27 & 28)의 DNA 서열의 묘사이다. 제1 프라이머 (서열 번호: 17) 및 제2 프라이머 (서열 번호: 19)를 HC21S00027의 서열의 위 및 아래에 각각 나타내었다. 제1 프라이머는 바이오티닐화되며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제2 프라이머는 BceA I의 제한 효소 인식 부위를 포함하며 상기 DNA 서열에 어닐링하는 13개의 염기를 포함한다. SNP는 R (A/G) 및 r (T/C; R에 상보성임)로 나타내어진다.
도 4C는 염색체 1로부터 유래된 SNP TSC0095512 (서열 번호: 29 & 30)의 DNA 서열의 묘사이다. 제1 프라이머 (서열 번호: 11) 및 제2 프라이머 (서열 번호: 20)를 TSC0095512의 서열의 위 및 아래에 각각 나타내었다. 제1 프라이머는 바이오티닐화되며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제2 프라이머는 BsmF I의 제한 효소 인식 부위를 포함하며 상기 DNA 서열에 어닐링하는 13개의 염기를 포함한다. SNP는 S (G/C) 및 s (C/G; S에 상보성임)로 나타내어진다.
도 4D는 염색체 1로부터 유래된 SNP TSC0095512 (서열 번호: 29 & 30)의 DNA서열의 묘사이다. 제1 프라이머 (서열 번호: 11) 및 제2 프라이머 (서열 번호: 12)를 TSC0095512의 서열의 위 및 아래에 각각 나타내었다. 제1 프라이머는 바이오티닐화되며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제2 프라이머는 BceA I의 제한 효소 인식 부위를 포함하며 상기 DNA 서열에 어닐링하는 13개의 염기를 포함한다. SNP는 S (G/C) 및 s (C/G; S에 상보성임)로 나타내어진다.
도 5A-5D는 도 4A-4D에 설명된 프라이머를 이용한 증폭 후의 SNP HC21 S00027 (도 5A (서열 번호: 31 & 32) 및 도 5B (서열 번호: 31 & 33)), 및 SNP TSC0095512 (도 5C (서열 번호: 34 & 35) 및 도 5D (서열 번호: 34 & 36))의 뉴클레오티드 서열을 도시하는 개략도이다. 프라이머 서열 중의 제한 효소 부위를 볼드체로 나타내었다.
도 6A-6D는 적당한 IIS형 제한 효소를 이용한 절단 후의 SNP를 포함하는 각각의 증폭 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 도시하는 개략도이다. 도 6A (서열 번호: 31 & 32) 및 도 6B (서열 번호: 31 & 33)는 각각 IIS형 제한 효소인 BsmF I 및 BceA I으로 절단한 SNP HC21500027을 포함하는 DNA 서열의 단편을 도시한다. 도 6C (서열 번호: 34 & 35) 및 도 6D (서열 번호: 34 & 36)는 각각 IIS형 제한 효소인 BsmF I 및 BceA I으로 절단한 SNP TSC0095512를 포함하는 DNA 서열의 단편을 도시한다.
도 7A-7D는 3' 리세싱된 말단의 "필 인"을 위하여 주형으로 절단 SNP 부위의 5' 오버행을 사용한 형광성 표지 뉴클레오티드의 혼입을 도시하는 개략도이다. 도 7A (서열 번호: 31,37 & 41) 및 도 7B (서열 번호: 31,37 & 39)는 표지된 ddNTP(*R-dd= 형광성 디데옥시 뉴클레오티드)가 혼입된 절단 SNP HC21S00027 유전자좌를 도시한다. 도 7C (서열 번호: 34 & 38) 및 도 7D (서열 번호: 34)는 표지 ddNTP (*S-dd= 형광성 디데옥시 뉴클레오티드)가 혼입된 절단 SNP TSC0095512 유전자좌를 도시한다. ddNTP의 사용은 3' 리세싱된 말단이 5' 오버행에 존재하는 목적 뉴클레오티드 또는 SNP 부위에 상보성인 하나의 뉴클레오티드에 의해 연장되는 것을 보증한다.
도 7E는 SNP 부위를 포함하는 5' 오버행 내로의 dNTP 및 ddNTP의 혼입을 도시하는 개략도이다. SNP HC21S00007을 포함하는 DNA 단편을 BsmF I으로 절단하였는데 이는 4개의 염기의 5' 오버행을 생성한다. dNTP 및 ddNTP의 혼합물의 사용에 의해 3' 리세싱된 말단이 1개의 뉴클레오티드 (1개의 ddNTP가 첫번째로 혼입됨) (서열 번호: 31, 37 & 41) ; 2개의 뉴클레오티드 (1개의 dNTP, 이어서 1개의 ddNTP가 혼입됨) (서열 번호: 31,39 & 41) ; 3개의 뉴클레오티드 (2개의 dNTP, 이어서 1개의 ddNTP가 혼입됨) (서열 번호: 31,40 & 41) ; 또는 4개의 뉴클레오티드 (3개의 dNTP, 이어서 1개의 ddNTP가 혼입됨) (서열 번호: 31 & 41)가 연장되게 된다. 모든 네가지 생성물은 크기에 의해 분리될 수 있으며 혼입된 뉴클레오티드가 탐지될 수 있다 (*R-dd= 형광성 디데옥시 뉴클레오티드). SNP 또는 유전자좌 부위에 해당하는 첫번째 뉴클레오티드, 및 다음의 3개의 뉴클레오티드의 탐지에 의해 추가의 수준의 품질 보증이 제공된다. SNP는 R (A/G) 및 r (T/C) (R에 상보성임)로 나타내어진다.
도 8A-8D는 고형 지지체 매트릭스, 즉, 스트렙타비딘 코팅 웰로부터의 "필 인된" SNP의 방출이다. SNP HC21S00027을 도 8A (서열 번호: 31,37 & 41) 및 도 8B (서열 번호: 31,37 & 39)에 도시하였으며, 반면 SNP TSC0095512는 도 8C (서열 번호: 34 & 38) 및 도 8D (서열 번호: 34)에 도시하였다. "필링 인" SNP는 용액 중에서 자유로우며 탐지될 수 있다.
도 9A는 BceAI로 절단된 SNP HC21S00027을 포함하는 DNA 단편의 서열 분석이다. 네가지의 "필 인" 반응이 도시되며, 각각의 반응물은 하나의 형광성 표지 뉴클레오티드 ddGTP, ddATP, ddTTP, 또는 ddCTP와, 미표지 ddNTP를 포함하였다. BceAI을 이용한 절단에 의해 생성되는 5' 오버행 및 기대되는 상기 SNP 부위에서의 뉴클레오티드가 나타내어져 있다.
도 9B는 SNP TSC0095512의 서열 분석이다. SNP TSC0095512는 BceA I의 인식 부위를 포함하는 제2 프라이머를 이용하여 증폭시켰으며, 개별적인 반응에 있어서 BsmF 1의 인식 부위를 포함하는 제2 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 네가지의 필 인 반응을 각각의 PCR 생성물에 대하여 도시하였는데, 각각의 반응물은 하나의 형광성 표지 뉴클레오티드, ddGTP, ddATP, ddTTP, 또는 ddCTP와, 미표지 ddNTP를 포함하였다. BceA I 및 BsmF I을 이용한 절단에 의해 생성되는 5' 오버행 및 기대되는 뉴클레오티드가 나타내어져 있다.
도 9C는 BsmFI의 인식 부위를 포함하는 제2 프라이머를 이용한 증폭 후의 SNP TSC0264580의 서열 분석이다. 네가지의 필 인 반응을 각각의 PCR 생성물에 대하여 도시하였는데, 각각의 반응물은 ddGTP, ddATP, ddTTP, 또는 ddCTP인 하나의하나의 형광성 표지 뉴클레오티드와, 미표지 ddNTP를 포함하였다. 2개의 상이한 5' 오버행이 도시되어 있는데 하나는 센스 가닥 상에서 11개 뉴클레오티드 떨어져서, 그리고 안티센스 가닥 상에서 15 뉴클레오티드 떨어져서 절단된 DNA 분자를 나타내며, 다른 하나는 센스 가닥 상에서 10 뉴클레오티드 떨어져서, 그리고 안티센스 가닥 상에서 14 뉴클레오티드 떨어져서 절단된 DNA 분자를 나타낸다. 기대되는 뉴클레오티드도 나타내어져 있다.
도 9D는 BsmF I의 인식 부위를 포함하는 제2 프라이머를 이용하여 증폭시킨 SNPHC21 S00027의 서열 분석이다. 표지 ddNTP 및 미표지 dNTP의 혼합물을 사용하여 BsmF I을 이용한 절단에 의해 생성되는 5' 오버행을 필 인시켰다. 2개의 상이한 5' 오버행이 도시되어 있는데 하나는 센스 가닥 상에서 11 뉴클레오티드 떨어져서, 그리고 안티센스 가닥 상에서 15 뉴클레오티드 떨어져서 절단된 DNA 분자를 나타내며, 다른 하나는 센스 가닥에서 10 뉴클레오티드 떨어져서, 그리고 안티센스 가닥 상에서 14 뉴클레오티드 떨어져서 절단된 DNA 분자를 나타낸다. SNP의 상류의 뉴클레오티드, SNP 부위에서의 뉴클레오티드 (샘플은 36명의 개인으로부터 유래된 DNA 주형을 포함하며; 뉴클레오티드 둘 모두 샘플에서 나타날 것으로 기대됨), 및 SNP의 하류의 3개의 뉴클레오티드가 나타내어져 있다.
도 10은 다수의 SNP의 서열 분석이다. 염색체 21 상에 위치하는 다수의 SNP, SNP HC21S00131, 및 HC21S00027와, 염색체 1 상에 존재하는 SNPs TSC0087315, SNP TSC0214366, SNP TSC0413944, 및 SNP TSC0095512를 BsmF I의 인식 부위를 포함하는 제2 프라이머를 이용하여 개별적인 PCR 반응에서 증폭시켰다. 프라이머는 각각의 목적하는 증폭 유전자좌가 상이한 크기의 것이 되도록 설계하였다. 증폭 후 반응물을 단일 샘플 내로 풀링하였으며 본 방법의 모든 후속 단계는 (도 1F-1I에 있어서 기술된 바와 같이) 이 샘플 상에서 수행하였다. 각각의 SNP 및 각각의 SNP에서 발견된 뉴클레오티드가 나타내어져 있다.
도 11은 하나의 형광성 표지 뉴클레오티드를 사용한 SNP TSC0837969, TSC0034767, TSC1130902, TSC0597888, TSC0195492, TSC0607185의 두 대립 유전자의 서열 결정이다. 표지 ddGTP를 미표지 dATP, dCTP, dTTP의 존재 하에 사용하여 BsmF I을 이용한 절단에 의해 생성되는 오버행을 필 인시켰다. 필링 인된 가닥 상의 가변성 부위의 선행 뉴클레오티드는 구아닌이 아니며, 필 인된 가닥 상의 가변성 부위 이후의 뉴클레오티드는 구아닌이 아니었다. 필 인된 가닥 상의 가변성 부위 이후의 뉴클레오티드인 2개의 염기는 구아닌이었다. 가변성 부위에서 구아닌을 포함하는 대립유전자는 표지 ddGTP로 필 인시킨다. 구아닌을 포함하지 않는 대립유전자는 미표지 dATP, dCTP, 또는 dTTP로 필 인시키며, 폴리머라제는 표지 ddGTP가 오버행에 상보성인 3 위치에서 필 인될 때까지 뉴클레오티드를 계속하여 혼입시킨다.
본 발명은 DNA의 서열, 특히 목적 유전자좌 또는 다수의 목적 유전자좌의 서열을 신속하게 결정하는 신규한 방법을 제공한다. 임의의 주형 DNA 또는 핵산 샘플 중의 임의의 갯수의 DNA 표적의 서열, 하나 내지 수백 또는 수천 또는 그보다 많은 목적 유전자좌의 서열을 효율적으로, 정확하게, 그리고 경제적으로 결정할 수있다. 본 방법은 단일 염색체 또는 다수의 염색체 상의 하나 내지 수만 또는 그 이상의 유전자, 유전자 영역, 유전자 단편, 단일 뉴클레오티드 다형성 및 돌연변이를 신속하게 서열 결정하는 데에 특히 유용하다.
본 발명은 (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머 (여기서, 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위를 포함하여 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성됨)를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계; (b) 증폭 DNA를 제2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계; (c) 주형으로 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계; 및 (d) (c)의 DNA의 서열의 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 목적 유전자좌의 서열의 결정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머 (여기서, 제1 및/또는 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위의 일부를 포함하며, 완전한 제한 효소 인식 부위는 주형 DNA의 증폭시 생성되어 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성됨)를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계; (b) 증폭 DNA를 제2 프라이머 및 주형 DNA에 의해 생성되는 완전한 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계; (c) 주형으로 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계; 및 (c)의 DNA의 서열의 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 목적 유전자좌의 서열의 결정 방법에 관한 것이다.
DNA 주형
"목적 유전자좌"는 더욱 큰 핵산 영역 이내의 선택된 핵산 영역을 의도한다. 목적 유전자좌는 1-100, 1-50, 1-20, 또는 1-10 뉴클레오티드, 바람직하게는 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 또는 1 뉴클레오티드(들)을 포함할 수 있지만 그에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "대립 유전자"는 염색체 상에서 동일한 위치를 점유하는 여러 택일적 형태의 유전자 중 하나 또는 비코딩 영역의 DNA이다. 대립 유전자라는 용어는 박테리아, 바이러스, 진균류, 원생 동물, 사상균, 효모, 식물, 인간, 비인간, 동물, 및 고세균류류를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 유기체로부터 유래된 DNA의 기술에 사용될 수 있다.
개체와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "돌연변이 대립 유전자"는 질환과 관련된 변이성 대립 유전자를 나타낸다. 예를 들어 박테리아는 일반적으로 하나의 큰 DNA 가닥을 가진다. 박테리아 DNA와 관련한 대립 유전자라는 용어는 동일한 종의 상이한 박테리아 세포에서 동일한 유전자형과 비교하여 하나의 세포에서 발견되는 유전자형을 나타낸다.
대립 유전자는 동일한 서열을 가질 수 있거나 단일 뉴클레오티드 또는 하나 초과의 뉴클레오티드가 다를 수 있다. 각각의 염색체의 2개의 카피 (copy)를 가지는 유기체와 관련하여, 두 염색체 모두가 동일한 대립 유전자를 가진다면 이 상태는 동종성 (homozygous)으로 칭해진다. 두 염색체에서의 대립 유전자가 상이하다면 이 상태는 이종성 (heterozygous)으로 칭해진다. 예를 들어 목적 유전자좌가염색체 1 상의 SNP X이며 모계 염색체가 SNP X에서 아데닌을 포함하며 (A 대립 유전자) 부계 염색체가 SNP X에서 구아닌을 포함한다면 (G 대립 유전자), 이 개체는 SNP X에서 이종성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "서열"은 폴리뉴클레오티드 중 하나의 뉴클레오티드 또는 하나 초과의 연속성 뉴클레오티드의 신원을 의미하거나 이 신원을 결정하는 것을 의미한다 (각각 명사로 사용되는지 동사로 사용되는지에 따라 달라짐). 단일 뉴클레오티드, 예를 들어 하나의 SNP의 경우에는 "서열"은 본 명세서에서 "신원"과 서로 바꾸어 질 수 있는 명사로 사용되며, "서열 결정"은 본 명세서에서 동사로서 "확인"과 서로 바꾸어서 사용된다.
"주형"이라는 용어는 본 발명에서 증폭에 사용될 수 있는 임의의 핵산 분자를 나타낸다. 자연적으로는 이중 가닥이 아닌 RNA 또는 DNA는 주형 DNA로 사용되도록 이중 가닥 DNA로 만들어질 수 있다. 다수의 상이한 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 제제 또는 임의의 이중 가닥 DNA를 주형 DNA로 사용하여 주형 DNA에 포함된 목적 유전자좌(들)를 증폭시킬 수 있다.
주형 DNA를 수득하기 위한 핵산원은 당 업계에에서 잘 확립된 프로토콜을 사용하여 임의의 유기체, 예를 들어 인간 또는 비인간, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 효모, 진균류, 식물, 원생 동물, 동물, 핵산을 포함하는 조직 샘플, 체액 (예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 정액, 질 분비물, 림프액, 뇌척수액 또는 점막 분비물), 배설물, 동일한 핵산을 포함하는 공급원의 개개의 세포 또는 추출물, 및 미토콘드리아 또는 엽록체와 같은 서브세포 구조체로부터 유래된 핵산을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 적당한 공급원으로부터 유래한 것일 수 있다. 핵산은 또한 핵산이 기탁되거나 추출된 법의학적 샘플, 식품 샘플, 고고학적 샘플 또는 무기 샘플로부터 수득될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 핵산은 의학적 병 또는 질환을 진단하거나 대상이 상기 병 또는 질환에 걸리기 쉽게 할 수 있는 하나 이상의 유전자 서열의 존재에 대하여 스크리닝될 인간 또는 동물로부터 수득되었다.
분석될 핵산은 임의의 핵산, 예를 들어 게놈, 플라스미드, 코스미드, 효모 인공 염색체, 유일무이한 DNA 서열을 포함하는 인공 또는 합성 DNA와, RNA 샘플로부터 역전사된 DNA, 예를 들어 cDNA일 수 있다. 주형 DNA로 사용되는 이중 가닥 DNA 형태로 만들어질 수 있다면 RNA의 서열이 본 발명에 따라 결정될 수 있다.
"프라이머" 및 "올리고뉴클레오티드 프라이머"라는 용어는 주형에 어닐링하며 상기 주형의 카피의 합성의 프라이밍에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 논의에 사용시 서로 바꾸어질 수 있다.
"증폭" DNA는 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 1회 또는 다회 "카피된" DNA이다. 다량의 DNA가 분석에 이용가능하여 충분한 갯수의 목적 유전자좌 카피가 분석될 샘플 중에 이미 존재할 경우 목적 유전자좌의 DNA를 훨신 더 많은 갯수의 복제 카피로 "증폭"시킬 필요가 없을 수 있다. 오히려 적당한 프라이머를 사용하여, 일단 제한 효소 부위가 이중 가닥이 되게 하는 헤어핀 구조를 포함하는 것과 같은 주형 DNA를 단순히 "카피"하는 것이 충분할 수 있다.
"카피된 DNA"에서와 같은 "카피"는 1회 카피된 DNA 또는 하나 초과의 카피로증폭된 DNA를 나타낸다.
하나의 실시 형태에 있어서 핵산은 핵산원을 포함하는 원래의 샘플에서 직접 증폭된다. 핵산의 추출, 정제 또는 단리가 필수적인 것은 아니며, 단지 증폭될 수 있는 형태로 제공되는 것이 필요하다. 증폭 이전에 프라이머를 이용한 핵산의 혼성화 단계는 필요하지 않다. 예를 들어 증폭은 당 업계에 잘 알려진 표준 프로토콜을 사용하여 세포 또는 샘플 용해물 (lysate)에서 수행될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 고형 지지체 상에서 존재하며 고형 지지체 또는 고정화 제제 또는 조성물 중 비-DNA 물질로부터 먼저 추출됨이 없이 증폭될 수 있는 고정된 생물학적 제제, 또는 그렇지 않을 경우 비-DNA 물질을 포함하는 조성물 중 DNA는, 이 DNA가 적당한 프라이머와 어닐링되며 카피되며, 특히 증폭되며, 카피 또는 증폭 생성물이 회수 및 이용될 수 있기만 하다면 추가의 정제 없이 직접 사용될 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서 핵산은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 증폭 이전에 원래의 샘플 중에 존재하는 비-핵산 물질로부터 추출, 정제, 또는 단리된다.
다른 실시 형태에 있어서, 핵산은 핵산원을 포함하는 원래의 샘플로부터 추출, 정제 또는 단리되며 증폭 이전에 핵산은 효소 절단, 수동 전단, 및 초음파 처리를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 당 업계에 잘 알려진 임의의 수의 방법을 사용하여 단편화된다. 예를 들어 DNA는 목적 유전자좌에는 존재하지 않는 인식 부위, 특히 8 또는 6 염기쌍의 인식 부위를 가지는 하나 이상의 제한 효소로 절단될 수 있다. 일반적으로 DNA는 50, 100, 250, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000 및100,000 염기쌍의 길이를 포함하는 임의의 원하는 길이로 단편화할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서 DNA는 약 1000 내지 2000 염기쌍의 평균 길이로 단편화된다. 그러나 DNA를 반드시 단편화할 필요는 없다.
목적 유전자좌를 포함하는 DNA 단편은 증폭 전에 목적 유전자좌를 포함하지 않는 DNA의 단편으로부터 정제될 수 있다. 정제는 목적 유전자좌에 어닐링하는 프라이머의 능력에 기초하여 목적 유전자좌를 포함하는 단편을 되찾는 훅 (hook)으로서 증폭에서 사용되는 프라이머 (이하의 "프라이머 설계" 단락 참조)를 사용함으로써 행해질 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 태그-변형 프라이머, 예를 들어 바이오티닐화 프라이머가 사용된다. 추가의 태그에 있어서는 "증폭 DNA의 정제" 단락을 또한 참조한다.
목적 유전자좌를 포함하는 DNA 단편의 정제에 의해 증폭 반응의 특이성을 개선할 수 있다. 이는 주형 DNA의 비특이적 영역의 증폭을 최소화한다. DNA 단편의 정제에 의해 특이성이 개선된 다수의 목적 유전자좌의 복합 PCR (폴리머라제 연쇄 반응) 또는 증폭도 할 수 있게 된다.
하나의 실시 형태에 있어서 핵산 샘플은 본 발명의 방법을 사용하여 소정의 유전자좌 또는 목적 유전자좌의 서열의 결정과 같은 염두에 둔 염두에 둔 원하는 목적으로 수득된다. 예를 들어 핵산은 대상이 걸리기 쉬울 수 있거나 대상이 치료가 필요하거나 특정의 단일 뉴클레오티드 다형성이 존재하는 하나 이상의 병 또는 질환을 확인하기 위하여 수득된다. 대안적인 실시 형태에 있어서 샘플은 하나 이상의 DNA 서열 마커의 존재 또는 부재의 스크리닝을 위하여 수득되는데, 서열 마커의 존재는이 DNA가 특정 박테리아 또는 진균류 미생물 또는 개체로부터 유래한 것임을 확인하는 것이다.
서열 결정될 목적 유전자좌는 서열에만 기초하여 선택될 수 있다. 인간에 있어서 142만개보다 많은 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이 기술되었다 (Nature 409: 928-933 (2001); The SNP Consortium LTD). 평균 매 1.9 kb의 인간 게놈 당 1개의 SNP가 존재한다. 그러나 목적 유전자좌들 사이의 거리를 본 발명에 따라 서열 결정할 목적 유전자좌의 선택시 고려할 필요는 없다. 하나보다 많은 게놈 DNA 상의 목적 유전자좌를 분석할 경우 선택된 목적 유전자좌는 동일 염색체 또는 상이한 염색체 상에 존재할 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서 증폭되는 서열의 길이는 바람직하게는 목적 유전자좌 각각에 있어서 상이하여 목적 유전자좌는 크기에 의해 분리될 수 있다.
실제 본 발명의 이점은 전체 유전자 서열을 카피하는 프라이머가 이용될 필요는 없다는 것이다. 오히려 카피되는 목적 유전자좌는 바람직하게는 단지 총 유전자의 작은 일부이다. 전체 유전자를 서열 결정하는 것이 이점이 전혀 없는데, 이는 상기가 비용을 증가시키고 결과를 지연시킬 수 있기 때문이다. 단지 유전자 내의 원하는 염기 또는 목적 유전자좌를 서열 결정하는 것은 본 방법의 전체 효율을 최대화하는데 이는 상기에 의해 가장 빠른 시간 내에, 그리고 최소의 비용으로 최대의 갯수의 목적 유전자좌의 서열 결정이 가능하기 때문이다.
본 발명의 방법은 특히 다수의 서열을 함께 분석할 수 있기 때문에 다수의 개개의 샘플을 대규모로 스크리닝할 수 있다.
임의의 갯수의 목적 유전자좌를 본 발명의 방법을 사용하여, 특히 동시에 분석 및 프로세싱할 수 있다. 샘플(들)을 분석하여 하나의 목적 유전자좌 또는 다수의 목적 유전자좌의 서열을 동시에 결정할 수 있다. 예를 들어 질환 관련 유전자에서 가장 빈번하게 발생하는 10 또는 20개의 돌연변이 부위는 대부분의 질환 캐리어 (carrier)의 탐지를 위하여 서열 결정될 수 있다.
대안적으로는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-1,000, 1,000-2,000, 2,000-3,000, 3,000-5,000, 5,000-10,000, 10,000-50,000 또는 50,000개 초과의 목적 유전자좌를, 광범위한 유전자 스크리닝이 요망될 경우 동시에 분석할 수 있다. 이러한 광범위한 유전자 스크리닝은 본 발명의 방법을 사용하여 특정 미생물 또는 개체의 확인 또는 SNP 유전자형 분석을 위한 유전자 핑거프린트 (fingerprint)를 제공할 경우 요망될 수 있다.
다수의 목적 유전자좌는 상이한 유기체로부터 유래된 표적일 수 있다. 예를 들어 치료가 필요한 식물, 동물 또는 인간 대상에서는 하나 이상의 병원체에 의한 감염 증상이 있을 수 있다. 이러한 식물, 동물 또는 인간 대상으로부터 취해진 핵산 샘플에 있어서 존재할 경우 그 병원체에 대하여 진단되는 목적 유전자좌의 서열을 결정함으로써 의심되거나 가능한 다수의 병원체의 존재를 동시에 분석할 수 있다. 대상에 있어서 이러한 진단상의 서열의 발견은 병의 원인을 신속하게 정확히 나타낼 뿐만 아니라 탐지되지 않는 다른 병원체를 배제하기도 한다. 이러한 스크리닝은 병원체가 유기체 또는 환경 전반에 만연된 정도의 평가에 사용될 수 있다.유사한 방식으로 유전자 이상의 결과인 질환이 있을 것으로 의심되는 개체로부터 유래된 핵산에 있어서 질환으로 이어지는 공지된 돌연변이의 일부 또는 모두, 또는 더욱 일반적인 하나 이상의 돌연변이를 분석할 수 있다.
본 발명의 방법은 유기체의 유전적 성질의 보전성의 모니터링에 사용될 수 있다. 예를 들어 효모 샘플은 양조 공정에 있어서 다양한 시간대에서 다양한 배치로부터 취해질 수 있으며 그의 존재 또는 신원이 본 명세서에 제공된 그의 게놈 서열의 신속한 분석에 의해 원하는 균주의 존재 또는 신원과 비교될 수 있다.
카피될 목적 유전자좌는 코딩 서열 이내 또는 코딩 서열 외부에 존재할 수 있다. 바람직하게는 카피될 하나 이상의 목적 유전자좌는 유전자 내에 존재한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 카피되는 주형 DNA는 인트론 또는 엑손의 게놈 코딩 서열 내에 존재하는 목적 유전자좌(들)이다. 고도로 바람직한 실시 형태에 있어서 엑손 DNA 서열이 카피된다. 목적 유전자좌는 돌연변이가 질환을 야기하거나 질환에 걸리기 쉽게 하는 것으로 알려진 부위일 수 있다. 목적 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성 부위일 수 있다. 대안적으로는 카피될 목적 유전자좌는 코딩 서열의 외부, 예를 들어 전사 조절 영역, 특히 프로모터, 인핸서, 또는 리프레서 서열 중에 존재할 수 있다.
프라이머 설계
콘센서스 (consensus) 서열을 포함하는 공개 서열을 사용하여 주형 DNA의 증폭에 사용하기 위한 프라이머를 설계 또는 선택할 수 있다. 목적 유전자좌의 측면에 위치하는 프라이머의 제작에 사용될 서열은 목적 유전자좌 또는 그에 인접한 유전자좌의 서열의 조사에 의해 선택할 수 있다. 최근에 공개된 인간 게놈 서열은 목적하는 원하는 인간 유전자좌의 측면에 위치하는 프라이머가 설계되는 유용한 콘센서스 서열 정보원을 제공한다.
목적 유전자좌의 "측면에 위치하는"이라는 것은 프라이머 서열이 하나의 프라이머의 3' 영역의 적어도 일부가 주형 DNA의 안티센스 가닥에 상보성이며 목적 유전자좌의 상류이고 (정방향 프라이머), 다른 하나의 프라이머의 3' 영역의 적어도 일부는 주형 DNA의 센스 가닥에 상보성이며 목적 유전자좌의 하류 (역방향향 프라이머)라는 것을 의미한다. "프라이머쌍"은 정방향 및 역방향향 프라이머의 쌍을 특정하려는 것이다. 프라이머쌍의 두 프라이머 모두는 프라이머를 연장시는 방식으로 어닐링되어 이 연장에 의해 목적 유전자좌 영역의 주형 DNA가 증폭된다.
프라이머는 당 업계에 잘 알려진 방법의 사용에 의한 적당한 서열의 클로닝 및 직접적인 화학적 합성법을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다양한 방법으로 제조할 수 있다 (Narang et al., Methods Enzymol. 68: 90 (1979); Brown et al., Methods Enzymol. 68: 109 (1979)). 프라이머는 Operon Technologies, Amersham Pharmacia Biotech, Sigma, 및 Life Technologies와 같은 구매원으로부터 획득될 수도 있다. 프라이머쌍의 프라이머는 동일한 길이를 가질 수 있다. 대안적으로는 프라이머쌍의 프라이머 중 하나는 프라이머쌍의 다른 프라이머보다 더 길 수 있다. 프라이머는 동일한 용융 온도를 가질 수 있다. 프라이머의 길이는 5' 말단 또는 3' 말단에서 연장 또는 단축시켜 원하는 용융 온도를 가지는 프라이머를 생성할 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 프라이머쌍 내에서의 프라이머의 3' 어닐링길이는 상이하다. 또한 각각의 프라이머쌍의 어닐링 위치는 프라이머쌍의 서열 및 길이가 원하는 용융 온도를 생성하도록 설계될 수 있다. 25 염기쌍보다 작은 프라이머의 용융 온도의 가장 간단한 결정 방정식은 왈리스 규칙 (Wallace Rule) (Td = 2 (A+T) + 4 (G+C))이다. Array Designer Software (Arrayit Inc.), Oligonucleotide Probe Sequence Design Software for Genetic Analysis (Olympus Optical Co.), NetPrimer, 및 Hitachi Software Engineering제의 DNAsis를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 컴퓨터 프로그램도 사용될 수 있다. 각각의 프라이머의 TM (용융 또는 어닐링 온도)은 Net Primer (http://premierbiosoft. com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch. html (2002년 2월 13일자의 인터넷 주소)의 무료 웹 기반의 프로그램)와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된다.
다른 실시 형태에 있어서 프라이머의 어닐링 온도는 사이클 1, 2, 3, 4, 5, 사이클 6-10, 사이클 10-15, 사이클 15-20, 사이클 20-25, 사이클 25-30, 사이클 30-35, 또는 사이클 35-40을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 증폭 사이클 후에 재계산 및 증가될 수 있다. 처음의 증폭 사이클 후 프라이머의 5'의 절반은 각각의 목적 유전자좌로부터의 생성물 내로 혼입되며, 따라서 TM은 각각의 프라이머의 5'의 절반 및 3'의 절반의 서열 둘 모두에 기초하여 재계산될 수 있다.
예를 들어 도 1B에 있어서 첫번째 증폭 사이클은 대략 13개의 염기인 주형 DNA에 어닐링하는 제2 프라이머의 3' 영역 (영역 "c")의 용융 온도에서 수행한다. 첫번째 사이클 후 어닐링 온도는 TM2로 상승시킬 수 있는데, TM2는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제1 프라이머의 3' 영역 (영역 "b")의 용융 온도이다. 제2 프라이머는 원래의 주형 DNA에 결합할 수 없는데, 이는 제2 프라이머가 단지 원래의 DNA 주형 중 13개의 염기에만 어닐링하며, TM2는 대략 제1 프라이머의 3' 어닐링 영역인 대략 20개의 염기의 용융 온도이기 때문이다 (도 1C). 그러나 제1 프라이머는 제1 반응 사이클에서 카피된 DNA에 결합할 수 있다. 세번째 사이클에 있어서 어닐링 온도는 TM3으로 상승되는데, TM3은 대략 제2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도이다 ("c" 및 "d"). 제2 PCR 사이클로부터 생성되는 주형 DNA는 영역 c' 및 d' 둘 모두를 포함하며, 따라서 제2 프라이머는 TM3에서 어닐링 및 연장할 수 있다 (도 1D). 나머지 사이클은 TM3에서 수행된다. 제1 프라이머의 전체 서열 (a + b')은 세번째 PCR 사이클로부터의 주형에 어닐링할 수 있으며 연장될 수 있다 (도 1E). 어닐링 온도의 증가는 비특이적 결합을 감소시며 반응 특이성을 증가시키는데, 이는 3 x 109의 염기쌍을 포함하는 인간 게놈 DNA로부터 유래된 목적 유전자좌의 증폭의 경우 특히 유용하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 어닐링 온도와 관련한 "대략"이라는 용어는 언급된 온도의 10℃ 이내의 온도를 포함하기 위하여 사용된다.
하나의 실시 형태에 있어서 하나의 프라이머쌍이 각각의 목적 유전자좌에 대하여 사용된다. 그러나 다수의 프라이머쌍이 각각의 목적 유전자좌에 대하여 사용될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서 프라이머는 프라이머쌍 중 하나 또는 둘 모두의 프라이머가 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)를 위한 5' 영역의 서열을 포함하도록 설계된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 제한 효소가 DNA를 절단하는 위치와 관련하여 "센스" 가닥은 제한 효소가 절단하는 방향에 있어서 5'에서 3'으로 판독되는 가닥이다. 예를 들어 BsmF I은 하기 서열을 인식한다:
따라서 센스 가닥은 제한 효소가 절단하는 방향으로 5'에서 3'으로 판독되는 "GGGAC" 서열을 포함하는 가닥이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 제한 효소가 DNA를 절단하는 위치와 관련하여 "안티센스" 가닥은 제한 효소가 절단하는 방향으로 3'에서 5'으로 판독되는 가닥이다. 따라서 안티센스 가닥은 3'에서 5'으로 판독되는 "ccctg" 서열을 포함하는 가닥이다.
본 발명에 있어서 프라이머쌍의 프라이머 중 하나는 제한 효소의 제한 효소 인식 부위를 포함하여 제한 효소를 이용한 절단에 의해 리세싱된 3' 말단 및 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 생성하도록 설계될 수 있다 (본 명세서에서 "제2 프라이머로 칭해짐). 예를 들어 프라이머쌍의 제2 프라이머는 인식 부위에서는 DNA를 절단하지 않지만 인식 부위로부터 "n" 뉴클레오티드 떨어져서 절단하는 제한 효소의 인식 부위를 포함할 수 있다. "N"은 제한 효소에 의한 인식 부위에서 절단 부위까지의 거리이다. 인식 서열이 제한 효소 BceAI에 대한 것이면 이 효소는 센스 가닥 상의 인식 부위로부터 십 (10) 뉴클레오티드 떨어져서 절단하며 안티센스 가닥 상의 인식 부위로부터 십이 (12) 뉴클레오티드 떨어져서 절단한다.
프라이머의 3' 영역, 바람직하게는 3'의 절반은 목적 유전자좌의 측면에 위치하는 서열에 어닐링하도록 설계된다 (도 1A). 제2 프라이머는 목적 유전자좌로부터의 임의의 거리에서 어닐링될 수 있되, 단, 이 프라이머 상의 제한 효소 인식 부위를 인식하는 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성된다. 5' 오버행은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 8 초과의 염기를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 크기의 것일 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서는 제2 프라이머의 3' 말단은 목적 유전자좌로부터, 또는 목적 유전자좌에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 14개 초과의 염기에 어닐링할 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서 제2 프라이머는 프라이머쌍의 다른 프라이머보다 목적 유전자좌에 더욱 근접하여 어닐링되도록 설계된다 (본 명세서에서 다른 프라이머는 "제1 프라이머"로 칭해짐). 각각 제2 프라이머는 정방향 또는 역방향향 프라이머일 수 있으며 제1 프라이머는 역방향향 또는 정방향 프라이머일 수 있다. 제1 또는 제2 프라이머가 정방향 또는 역방향향 프라이머이어야 하는지는 어느 설계이 더욱 우수한 서열 결정 결과를 제공하는지에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어 목적 유전자좌에 더욱 근접하여 어닐링되는 프라이머는, 센스 가닥 상의 인식 부위로부터 십 (10) 뉴클레오티드, 그리고 안티센스 가닥 상의 인식 부위로부터 십사 (14) 뉴클레오티드를 절단하는 제한 효소 BsmF I의 인식 부위를포함할 수 있다. 이러한 경우, 프라이머는 제한 효소 인식 부위가 목적 유전자좌로부터 13 염기, 12 염기, 10 염기 또는 11 염기가 되도록 설계될 수 있다. 인식 부위가 목적 유전자좌로부터 13 염기일 경우 BsmF I을 이용한 절단에 의해 5' 오버행 (RXXX)이 생성되는데, 여기서 목적 유전자좌 (R)는 오버행에서 첫번째 뉴클레오티드이며 (3'에서 5'으로 판독), X는 임의의 뉴클레오티드이다. 인식 부위가 목적 유전자좌로부터 12 염기일 경우 BsmF I을 이용한 절단에 의해 5' 오버행 (XRXX)이 생성되는데, 여기서 목적 유전자좌 (R)는 오버행에서 두번째 뉴클레오티드이다 (3'에서 5'으로 판독). 인식 부위가 목적 유전자좌로부터 11 염기일 경우 BsmF I을 이용한 절단에 의해 5' 오버행 (XXRX)이 생성되는데, 여기서 목적 유전자좌 (R)는 오버행에서 세번째 뉴클레오티드이다 (3'에서 5'으로 판독). 제한 효소 인식 부위와 목적 유전자좌 사이의 거리는 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성되도록 설계되어야 한다. 인식 부위와 목적 유전자좌 사이의 효과적인 거리는 제한 효소의 선택에 따라 달라진다.
다른 실시 형태에 있어서 제1 프라이머에 비하여 목적 유전자좌에 더욱 근접하여 어닐링될 수 있는 제2 프라이머는 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 생성하는 제한 효소가 목적 유전자좌의 뉴클레오티드와는 상관 없이 절단 부위에서 동일한 서열을 인식하도록 설계될 수 있다. 예를 들어 목적 유전자좌에 더욱 근접하여 어닐링되는 프라이머가 제한 효소 BsmF I의 인식 부위 (5'GGGAC 3')가 목적 유전자좌로부터 13 염기가 되도록 설계될 경우, 이 제한 효소는 목적 유전자좌의 1 염기 상류의 안티센스 가닥을 절단한다. 목적 유전자좌의 뉴클레오티드는 절단 부위에 인접하며 DNA 분자에 따라 다를 수 있다. 절단 부위에 인접한 뉴클레오티드가 동일할 것이 요망될 경우, 프라이머는 BsmF I의 제한 효소 인식 부위가 목적 유전자좌로부터 12 염기 떨어져서 존재하도록 설계될 수 있다. BsmF I을 이용한 절단에 의해 5' 오버행이 생성되는데, 여기서 목적 유전자좌는 오버행의 두번째 위치 (3'에서 5'으로 판독)에 존재하며 더 이상 절단 부위에 인접하여 존재하지 않는다. 제한 효소 인식 부위가 목적 유전자좌로부터 십이 (12) 염기가 되도록 프라이머를 설계하면 절단 부위에 인접하는 뉴클레오티드는 목적 유전자좌의 뉴클레오티드와는 상관 없이 동일해진다. 또한 제한 효소 인식 부위가 목적 유전자좌로부터 십일 (11) 또는 십 (10) 염기가 되도록 설계된 프라이머에 의해 절단 부위에 인접한 뉴클레오티드는 목적 유전자좌의 뉴클레오티드와는 상관 없이 동일해진다.
(정방향 또는 역방향향의) 제1 프라이머의 3' 말단은 목적 유전자좌로부터의 선택된 거리에서 어닐링되도록 설계될 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 상기 거리는 목적 유전자좌로부터 10-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000 및 1000 초과의 염기만큼 떨어져 있다. 제1 프라이머의 어닐링 부위는 각각의 연속성 상류 프라이머가 그의 각각의 하류 프라이머로부터 점점 더 멀리 떨어져서 존재하도록 선택된다.
예를 들어 목적 유전자좌 1에서 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3' 말단이 Z 염기만큼 떨어져 있다면, 목적 유전자좌 2에서 상류 및 하류 프라이머의 3' 말단은 Z + K 염기만큼 떨어져 있으며, 여기서 K = 1, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1000, 또는 1000 초과의 염기이다 (도 2). 각각의 하류 프라이머로부터 점점 더 떨어져 있는 상류 프라이머를 제조하는 목적은 모든 목적 유전자좌의 PCR 생성물이 크기 면에서 상이하여 예를 들어 서열 결정용 겔 상에서 분리될 수 있도록 하려는 것이다. 이는 더욱 나중의 단계에서 PCR 생성물을 풀링함으로써 다중식으로 되게 한다.
하나의 실시 형태에 있어서 제1 프라이머의 5' 영역은 임의의 유형의 제한 효소의 인식 부위를 가질 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서 제1 프라이머는 제2 프라이머에서의 제한 효소 인식 부위와는 다른 하나 이상의 제한 효소 인식 부위를 가진다. 다른 바람직한 실시 형태에 있어서 제1 프라이머는 제2 프라이머보다 목적 유전자좌로부터 더 떨어져서 어닐링된다.
바람직한 실시 형태에 있어서 제2 프라이머는 각각 2 염기 5' 오버행 및 4 염기 5' 오버행을 생성하는 BceA I 및 BsmF I을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 IIS형 제한 효소의 제한 효소 인식 서열을 포함한다. IIS형인 제한 효소가 바람직한데 이는 상기 효소가 비대칭성 염기 서열을 인식하기 때문이다 (정통적인 II형 효소와 같은 회문식 (palindromic)이 아님). IIS형 제한 효소는 인식 부위의 외부에 존재하는 특정 위치에서, 일반적으로 인식 부위 외부의 20 염기쌍 이하의 DNA를 절단한다. 이러한 특징에 의해 IIS형 제한 효소 및 그의 인식 부위는 본 발명의 방법에서 특히 유용해진다. 바람직하게는 본 방법에서 사용되는 IIS형 제한 효소는 5' 오버행 및 리세싱된 3' 말단을 남긴다.
매우 다양한 IIS형 제한 효소가 공지되어 있으며 이러한 효소가 박테리아, 파지, 고세균류류, 및 진핵 조류 (algae)의 바이러스로부터 단리되었으며 구매가능하다 (Promega, Madison WI; New England Biolabs, Beverly, MA; Szybalski W. et al., Gene 100: 13-16, (1991)). 본 발명의 방법에서 유용한 IIS형 제한 효소의 예로는 표 I에 열거된 것과 같은 효소를 들 수 있지만 그에 한정되는 것은 아니다.
하나의 실시 형태에 있어서 프라이머쌍은 프라이머 각각의 5' 영역에서 하나의 제한 효소의 유일무이한 제한 효소 인식 부위를 제공하는 서열을 가진다.
다른 실시 형태에 있어서 프라이머쌍은 프라이머 각각의 5' 영역에서 하나보다 많은 제한 효소에 의해 인식되는, 특히 하나보다 많은 IIS형 제한 효소의 제한 효소 부위를 제공하는 서열을 가진다. 예를 들어 특정의 콘센서스 서열은 하나보다 많은 효소에 의해 인식될 수 있다. 예를 들어 BsgI, Eco57I 및 BpmI 모두는 콘센서스 5' (G/C) TgnAG 3'을 인식하며 안티센스 가닥 상에서 16 bp 떨어져서, 그리고 센스 가닥 상에서 14 bp 떨어져서 절단한다. 이러한 콘센서스 서열을 제공하는 프라이머는 제한 효소 BsgI, Eco57I 및 BpmI 중 임의의 것에 의해 인식될 수 있는 부위를 가지는 생성물로 이어진다.
인식 부위로부터 떨어져서 DNA를 절단하여 리세싱된 3' 말단 및 5' 오버행을 생성하는 다른 제한 효소는 III형 제한 효소를 포함한다. 예를 들어 제한 효소 EcoP15I는 서열 5' CAGCAG 3'을 인식하며 센스 가닥 상에서 25 염기의 하류, 그리고 안티센스 가닥 상에서 27 염기의 하류를 절단한다. 당 업계의 숙련자라면 새로운 제한 효소가 끊임없이 발견되고 있으며 본 발명에서의 사용을 위하여 손쉽게 채용될 수 있다는 것을 또한 인정할 것이다.
다른 실시 형태에 있어서 제2 프라이머는 제한 효소의 인식 서열의 일부를 포함할 수 있는데, 여기서 이 제한 효소의 완전한 인식 부위는 주형 DNA의 증폭시에 생성되어 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성되게 된다. 예를 들어 BsmF I의 인식 부위는 5' GGGACN10 ↓3'이다. 주형 DNA에 어닐링하는 제2 프라이머의 3' 영역은 주형 DNA와 상보성이지 않아도 되는 뉴클레오티드 "GGG"로 끝날 수 있다. 3' 어닐링 영역이 약 10-20 염기일 경우, 심지어 마지막 3개의 염기가 어닐링하지 않는 경우에도 프라이머는 연장되며 BsmF I 부위를 생성한다.
제2 프라이머는 주형 DNA에 어닐링되도록 설계될 수 있는데, 여기서 주형 DNA의 다음 2개의 염기는 아데노신 및 시토신이 프라이머 내로 혼입되어 BsmFI의 인식 부위인 5' GGGACN1O ↓3'을 형성하도록 티미딘 및 구아닌이다. 제2 프라이머는 BsmFI을 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성되도록 하는 방식으로 어닐링되도록 설계될 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서 제2 프라이머는 전체 또는 완전한 제한 효소 인식 부위 또는 주형 DNA의 증폭시 완전한 인식 부위를 생성하는 인식 부위의 일부를 포함할 수 있어 인식 부위에서 절단하는 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성된다. 예를 들어 제한 효소 BsaJ I은 인식 부위 5' C↓CN1N2GG 3'에 결합한다. 제2 프라이머는 이 프라이머의 3' 영역이 "CC"로 끝나도록 설계될 수 있다. 목적 SNP는 "N1"으로 나타내어지며 SNP의 하류의 주형 서열은 "N2'CC"이다.
BsaJI을 이용한 절단 후에 하기 서열의 5' 오버행이 생성된다:
구아닌 뉴클레오티드가 목적 유전자좌에서 보고되지 않았다면 3' 리세싱된 말단은 오버행의 첫번째 뉴클레오티드에 상보성인 미표지 시토신으로 필 인될 수 있다. 과량의 시토신의 제거 후 표지 ddNTP를 사용하여 다음 뉴클레오티드인 N1'을 필 인할 수 있는데 이는 목적 유전자좌를 나타낸다. 대안적으로는 구아닌이 목적 유전자좌의 잠재적인 뉴클레오티드인 것으로 보고될 경우, 표지 뉴클레오티드를 사용하여 목적 유전자좌의 뉴클레오티드 3'을 탐지할 수 있다. 미표지 dCTP, 이어서 시토신 이외의 표지 뉴클레오티드를 사용하여 "필 인"할 수 있다. 시토신은 시토신이 상보성이지 않은 염기에 도달할 때까지 혼입된다. 목적 유전자좌가 구아닌을 포함할 경우, 목적 유전자좌는 표지 뉴클레오티드가 혼입되게 하는 dCTP로 필 인된다. 그러나 목적 유전자좌가 구아닌을 포함하지 않을 경우 표지 뉴클레오티드는
를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다른 제한 효소가 사용될 수 있다.
주형 DNA에 어닐링되는 제2 프라이머의 3' 영역이 주형 DNA에 100% 상보성일 필요는 없다. 예를 들어 제2 프라이머의 3' 말단의 마지막 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드는 주형 DNA와 미스매치될 수 있다. 주형 DNA에 어닐링되는 프라이머의 영역은 프라이머를 표적으로 하여 프라이머를 연장시킨다. 예를 들어 심지어 마지막 2개의 뉴클레오티드가 주형 DNA에 상보성이 아니더라도 프라이머는 연장되어 제한 효소 인식 부위를 생성한다.
BsaJI을 이용한 절단 후 하기 서열의 5' 오버행이 생성된다:
목적 유전자좌에서 시토신 뉴클레오티드가 보고되어 있지 않을 경우, 5' 오버행은 미표지 시토신으로 필 인될 수 있다. 과량의 시토신은 헹구어서 제거될 수 있으며 표지 ddNTP로 필 인될 수 있다. 혼입되는 제1 뉴클레오티드 (N1)는 목적 유전자좌에 상응한다.
대안적으로는 제1 및 제2 프라이머를 사용하여 완전한 제한 효소 인식 서열을 생성할 수 있다. 임의의 제한 효소의 인식 부위는 인식 부위가 하나 이상의 가변성 뉴클레오티드를 포함하기만 한다면 생성될 수 있다. 하나 이상의 가변성 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 인식하는 제한 효소는
를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 이러한 실시 형태에 있어서 제1 또는 제2 프라이머는 목적 유전자좌에 근접하여 어닐링될 수 있거나 제1 또는 제2 프라이머는 목적 유전자좌로부터 동일한 거리에서 어닐링될 수 있다. 제1 및 제2 프라이머는 3' 영역에서 주형 DNA에 대한 미스매치를 포함하도록 설계될 수 있는데, 이러한 미스매치는 제한 효소 인식 부위를 생성한다. 3' 말단에서 허용될 수 있는 미스매치의 갯수는 프라이머의 길이에 따라 달라지며 1, 2 또는 2개 초과의 미스매치를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 목적 유전자좌가 N1'으로 나타내어질 경우 제1 프라이머는 아래에 영역 "a"로 도시된 주형 DNA에 상보성이 되도록 설계될 수 있다. 제1 프라이머의 3' 영역은 주형 DNA에 상보성을 가지지 않는 "CC"로 끝난다. 제2 프라이머는 아래에 영역 "b"로 도시된 주형 DNA에 상보성이 되도록 설계된다. 제2 프라이머의 3' 영역은 주형 DNA에 상보성을 가지지 않는 "CC"로 끝난다.
1라운드의 증폭 후 하기 생성물이 생성된다:
사이클 2에 있어서 프라이머는 첫번째 PCR 사이클로부터 생성된 주형에 어닐링될 수 있다:
PCR 사이클 2 후에 하기 생성물이 생성된다:
BsaJ I의 제한 효소 인식 부위가 생성되며, BsaJ I을 이용한 절단 후 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 생성된다. 목적 유전자좌는 이하에 상세하게 설명된 바와 같이 탐지될 수 있다. 대안적으로는 제1 및 제2 프라이머의 3' 영역은 1, 2, 3 또는 3개 초과의 미스매치, 이어서 주형 DNA에 상보성인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어 제1 및 제2 프라이머를 사용하여 하기 DNA 서열: 5' CCTNN↓NNNAGG 3'에 결합하는 제한 효소 EcoN I의 인식 부위를 생성할 수 있다. 각각의 프라이머의 마지막 뉴클레오티드는 "CCTNl또는 CCTN1N2"이다. 뉴클레오티드 "CCT"는 주형 DNA에 상보성이거나 상보성이 아닐 수 있지만, N1및 N2는 주형 DNA에상보성인 뉴클레오티드이다. 이는 프라이머가 잠재적 미스매치 후 주형 DNA에 어닐링되게 하는데, 이는 제한 효소 인식 부위의 생성에 사용된다.
다른 실시 형태에 있어서 프라이머쌍은 두가지 이상의 제한 효소에 의해 인식되는 2개 이상의 인식 부위를 제공하는 프라이머 각각의 5' 영역의 서열을 가진다.
가장 바람직한 실시 형태에 있어서 프라이머쌍에는 상이한 제한 효소가 임의의 바람직하지 못한 서열을 절단해 내는데 필요하도록 5' 영역, 특히 5' 말단에 상이한 제한 효소 인식 부위가 있다. 예를 들어 목적 유전자좌 "A"를 위한 제1 프라이머는 임의의 유형의 제한 효소일 수 있는 제한 효소 "X"에 의해 인식되는 서열을 포함할 수 있으며, 목적 유전자좌에 더욱 근접하여 어닐링되는 목적 유전자좌 "A"를 위한 제2 프라이머는 "n" 뉴클레오티드만큼 떨어져서 절단하여 5' 오버행 및 리세싱된 3' 말단을 남기는 IIS형 제한 효소인 제한 효소 "Y"를 위한 서열을 포함할 수 있다. 5' 오버행은 목적 유전자좌를 포함한다. 증폭 DNA의 스트렙타비딘 코팅 웰에의 결합 후 효소 "Y"로 절단하고, 헹구고 이어서 표지 뉴클레오티드로 필 인시키고 헹구고, 이어서 제한 효소 "X"로 절단할 수 있는데, 이는 고형 매트릭스로부터 목적 유전자좌를 포함하는 DNA를 방출시킨다. 목적 유전자좌는 목적 유전자좌, 예를 들어 SNP 부위에서 "필 인된" 표지 류클레오티드의 탐지에 의해 분석될 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서 본 발명에 따라 증폭되는 상이한 목적 유전자좌를 위한 제2 프라이머는 5' 영역에서 동일한 제한 효소를 위한 인식 서열을 포함하며,마찬가지로 모든 제1 프라이머도 제2 프라이머를 인식하는 효소와는 다른 효소인 동일한 제한 효소의 인식 부위를 포함한다. 목적 유전자좌에 더욱 근접하여 어닐링되는 프라이머 (정방향 또는 역방향향 프라이머)는 예를 들어 IIS형 제한 효소의 인식 부위를 포함한다.
다른 실시 형태에 있어서 본 발명에 따라 증폭되는 다수의 목적 유전자좌를 위한 제2 프라이머는 5' 영역에서 상이한 제한 효소를 위한 제한 효소 인식 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에 있어서 본 발명에 따라 증폭되는 다수의 목적 유전자좌를 위한 제1 프라이머는 5' 영역에서 상이한 제한 효소를 위한 제한 효소 인식 서열을 포함한다.
다수의 제한 효소 서열은 풀링된 목적 유전자좌가 고형 지지체로부터 방출되는 순서에 영향을 주는 기회를 제공한다. 예를 들어 50개의 목적 유전자좌가 증폭될 경우 제1 프라이머는 정제를 돕기 위한 5'의 가장 말단의 태그 및 제한 효소 인식 부위를 가질 수 있으며, 제2 프라이머는 IIS형 제한 효소의 인식 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어 여러 제1 프라이머는 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 가질 수 있으며 다른 제1 프라이머는 Pst I의 인식 부위를 가질 수 있으며 또다른 제1 프라이머는 BamH I의 인식 부위를 가질 수 있다. 증폭 후 목적 유전자좌를 제1 프라이머 상의 태그의 도움으로 고형 지지체에 결합시킬 수 있다. 한번에 하나의 제한 효소를 이용하여 제한 효소 절단을 실시함으로써, 증폭된 목적 유전자좌를 연속하여 방출시킬 수 있다. 만일 첫번째 절단을 EcoRI으로 실시하면, EcoRI에 대한 인식 부위를 포함한 제1 프라이머로 증폭된 목적 유전자좌가 방출되어 수집되는 한편, 다른 목적 유전자좌는 고체 지지체에 결합된 채로 남아있게 된다. 증폭된 목적 유전자좌는 한번에 하나의 제한 효소로 절단함으로써 고체 지지체로부터 선택적으로 방출될 수 있다. 제1 프라이머내의 상이한 제한 효소 인식 부위들을 사용함으로써 다수의 목적 유전자좌가 단일 반응 튜브에서 증폭되도록 할 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 각 프라이머의 제한 효소 절단 부위의 5'의 임의의 영역을, 단편화 조작, 처리, 동정, 및/또는 정제를 제공하는 기능성 기로 변형시킬 수 있다. 그러한 기능성 기, 즉 태그의 예는 바이오틴, 바이오틴 유도체, 탄수화물, 합텐, 염료, 방사성 분자, 항체, 및 항체 단편, 펩티드, 및 면역원성 분자를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
다른 실시 형태에 있어서, 주형 DNA는 1회의 복제 사이클 이상으로 증폭되는 일 없이 한번 복제될 수 있다. 이것은 분석에 이용가능한 DNA의 양이 많아 목적 유전자좌의 많은 수의 카피가 이미 샘플내에 존재하며 더 이상의 카피가 필요하지 않을 때 유용하다. 이 실시예에서, 프라이머는 바람직하게는 5' 영역에 "헤어핀(hairpin)" 구조를 포함하도록 설계되며, 따라서 그 서열은 한번 접혀져 상보적인 방식으로 그 자체에 서열 내부에 어닐링된다. 주형 DNA가 단지 한번만 복제될 경우, 인식 부위를 포함한 DNA 서열은 "헤어핀" 구조가 아니면 단일 가닥일 것이다. 그러나, 헤어핀 구조의 존재하에서, 그 영역은 효과적으로 이중 가닥이 되어 제한 효소에 의한 활성을 위한 이중 가닥 기질을 제공한다.
반응 조건이 양립하는 정도까지, DNA의 목적 유전자좌(들)을 분석하기 위한모든 프라이머 쌍을 함께 혼합하여 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 모든 프라이머 쌍들을 단일 반응 용기에서 주형 DNA와 혼합한다. 그러한 반응 용기는 예를 들어, 반응 튜브, 또는 마이크로타이터 플레이트의 웰일 수 있다.
대안적으로는, 뉴클레오티드에 대한 경쟁을 피하고 프라이머 이량체와 프라이머를 위한 어닐링 온도에 있어서의 어려움을 최소화하기 위하여, 각 목적 유전자좌 또는 목적 유전자좌들의 작은 군들을 별도의 반응 튜브 또는 웰에서 증폭시킬 수 있으며, 원하면 생성물을 나중에 모을 수 있다. 예를 들어, 별도의 반응물을, 목적 유전자좌 또는 SNP 부위를 포함하는 5' 오버행 및 3' 리세싱된 말단을 생성하는 제한 효소로 절단하기 전에, 단일 반응 용기내에 합할 수 있다. 바람직하게는, 각 프라이머쌍의 프라이머들은 동몰량으로 제공된다. 또한, 특히 바람직하게는, 상이한 프라이머 쌍들의 각각은 사용되는 다른 쌍들에 대하여 동몰량으로 제공된다.
다른 실시 형태에 있어서, 그들의 각각의 목적 유전자좌의 효과적인 증폭을 허용하는 프라이머쌍들의 조합을 이용할 수 있다 (예를 들어 도 2를 참고). 그러한 조합은 본 발명의 방법에 사용하기 전에 결정할 수 있다. 다중-웰 플레이트와 PCR 기계를 이용하여 서로 효율적으로 작용하는 프라이머쌍들을 선택할 수 있다. 예를 들어, Eppendorf Mastercycler® 구배 PCR 기계와 같은 구배 PCR 기계를 이용하여 각 프라이머쌍을 위한 적절한 어닐링 온도를 선택할 수 있다. 유사한 특성을 갖는 프라이머쌍들을 단일 반응 튜브에서 함께 이용할 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 96-웰 또는 그 이상의 플레이트를 포함하며 이에 한정되지 않는 다중-샘플 용기를 이용하여, 목적 유전자좌를 위한 적절한 PCR 조건으로 다수의 주형 DNA 샘플로부터 동일한 프라이머쌍을 이용하여 하나의 목적 유전자좌를 증폭시킬 수 있다. 대안적으로는, 각각의 목적 유전자좌의 증폭을 위하여 별도의 다중-샘플 용기를 이용하고 각 주형 DNA 샘플을 위한 생성물을 나중에 모을 수 있다. 예를 들어, 96개의 다른 DNA 샘플로부터의 유전자 A를 마이크로타이터 플레이트 1에서 증폭시키고, 96개의 다른 DNA 샘플로부터의 유전자 B를 마이크로타이터 플레이트 2에서 증폭시키고, 등등, 그리고 이어서 증폭 생성물들을 합할 수 있다.
다수의 목적 유전자좌들을 증폭시킨 결과는 각 목적 유전자좌의 서열을 갖는 대표적인 PCR 생성물들을 포함하는 제조물이다. 예를 들어, 만일 단지 하나의 개체로부터의 DNA를 주형 DNA로 이용하고 그리고 만일 수백개의 질환 관련 목적 유전자좌들을 그 주형 DNA로부터 증폭시키면, 증폭된 DNA는 목적 유전자좌들 각각으로부터 나온 작은 PCR 생성물들의 혼합물일 것이다. 그러한 제조물을 그때 추가로 분석하여 각 목적 유전자좌에서의 서열 또는 목적 유전자좌들의 단지 일부에서의 서열을 결정할 수 있다. 추가로, DNA를 보존하는 방식으로 그 제조물을 보존하고 나중에 분석할 수도 있다. 증폭된 DNA에 포함된 정보는 형광성 탐지법, 서열 결정법, 겔 전기 영동벙, 및 질량 분광 분석법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적절한 방법에 의해 밝힐 수 있다 (하기의 "혼입된 뉴클레오티드의 검출"을 참고).
목적 유전자좌의 증폭
PCR(폴리머라제 연쇄 반응), 3SR(자체-지지된 서열 반응), LCR(리가제 연쇄 반응), RACE-PCR(cDNA 말단의 신속한 증폭), PLCR(폴리머라제 연쇄 반응과 리가제 연쇄 반응의 조합), Q-베타 파아지 증폭(Shah et al., J.Medical Micro. 33:1435-41(1995)), SDA(가닥 대체 증폭), SOE-PCR(스플라이스 중복 연장 PCR), 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 본 기술 분야에서 알려진 임의의 적절한 방법을 이용하여 주형 DNA를 증폭시킬 수 있다. 이들 방법을 이용하여 본 출원에서 명백하게 개시된 방출성 프라이머 매개 사이클릭 증폭 반응의 변형을 설계할 수 있다. 가장 바람직한 실시 형태에서는, PCR을 이용하여 주형 DNA를 증폭시킨다. (PCR: A Practical Approach, M.J.McPherson, et al., IRL Press (1991); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et al., Academic Press(1990): 및 PCR Technology: Principals and Applications of DNA Amplification, H.A.Erlich, Stockton Press (1989)). PCR은 또한 미국 특허 제 4,683,195호, 4,683,202호, 4,800,159호, 4,965,188호, 4,889,818호, 5,075,216호, 5,079,352호, 5,104,792호, 5,023,171호, 5,091,310호 및 5,066,584호를 비롯한 많은 미국 특허에 개시된다.
전형적인 PCR 반응의 성분들은 주형 DNA, 프라이머, 반응 완충액(폴리머라제의 선택에 의존함), dNTPs(dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP) 및 DNA 폴리머라제를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 적합한 PCR 프라이머는 전술한 대로 설계하고 제조할 수 있다(상기의 "프라이머 설계" 단락 참고). 요약하면, 반응물을 2분간 95℃로 가열하여 주형 DNA의 가닥을 분리시키고, 반응물을 적절한 온도(설계된 프라이머의어닐링 온도를 계산하여 결정함)로 냉각하여 프라이머가 주형 DNA에 어닐링되도록 하고, 72℃로 2분간 가열하여 연장이 일어나도록 한다.
바람직한 실시예에서, 어닐링 온도를 증폭의 첫번째 세 사이클의 각각에서 증가시켜 비특이적인 증폭을 감소시킨다. 또한 하기의 실시예 1을 참고한다. PCR의 첫번째 사이클의 TM1은 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제2 프라이머의 3' 영역의 용융 온도이다. 어닐링 온도를 사이클 2-10, 바람직하게는 사이클 2에서 대략 제1 프라이머의 3' 영역이 주형 DNA에 어닐링하는 용융 온도인 TM2로 상승시킬 수 있다. 만일 어닐링 온도를 사이클 2에서 상승시키면, 어닐링 온도는 어닐링 온도의 다음 증가때까지 대략 동일하게 유지된다. 마지막으로, 어닐링 온도를 TM2로 증가시킨 사이클에 이어지는 임의의 사이클, 바람직하게는 사이클 3에서는, 어닐링 온도를 대략 전체 제2 프라이머의 용융 온도인 TM3으로 상승시킨다. 세번째 사이클 후, 나머지 사이클을 위한 어닐링 온도는 약 TM3이거나 또는 더 증가될 수도 있다. 이 예에서, 어닐링 온도는 사이클 2와 3에서 증가된다. 그러나, 온도의 추가 상승없이 어닐링 온도를 사이클 1에서의 낮은 어닐링 온도로부터 사이클 2에서의 높은 어닐링 온도로 증가시킬 수 있으며, 또는 어닐링 온도를 임의의 수의 증가 단계로 낮은 어닐링 온도로부터 높은 어닐링 온도로 점진적으로 변화시킬 수도 있다. 예를 들어, 어닐링 온도를 사이클 2,3,4,5,6 등에서 변화시킬 수 있다.
어닐링 후, 각 사이클의 온도를 "연장" 온도로 증가시켜 프라이머가 "연장"되도록 하고 이어서 연장 후 각 사이클의 온도를 변성 온도로 증가시킨다. 500 염기쌍 미만의 크기의 PCR 생성물을 위해서는, 각 사이클에서 연장 단계를 제거하고변성 및 어닐링 단계만을 가질 수 있다. 전형적인 PCR 반응은 변성, 어닐링 및 연장의 25-45 사이클로 이루어진다. 그러나, 전술한 대로, 단지 한번의 증폭 사이클(한 카피)만으로도 본 발명을 실시하는 데 충분할 수도 있다.
대장균 DNA 폴리머라제, 대장균 DNA 폴리머라제 I의 클리나우(Klenow) 단편, T7 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, 박테리오파아지 29, 및 REDTaqTM게놈 DNA 폴리머라제, 또는 시쿼나제(sequenase)를 포함하며 이에 한정되지 않는, 프라이머 연장을 촉매하는 임의의 DNA 폴리머라제를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 열안정성 DNA 폴리머라제를 이용한다. "고온 출발 (hotstart)" PCR을 또한 실시할 수 있으며, 여기서는 폴리머라제의 첨가에 앞서 반응물을 2분간 95℃로 가열하거나 또는 사이클 1에서 첫번째 가열 단계까지 폴리머라제를 불활성으로 유지할 수 있다. "고온 출발" PCR을 이용하여 비특이적인 증폭을 최소화시킬 수 있다. 2,5,10,15,20,25,30,35,40, 또는 45 사이클을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 수의 PCR 사이클을 이용하여 DNA를 증폭시킬 수 있다. 가장 바람직한 실시 형태에 있어서, 실시되는 PCR 사이클의 수는 동몰량의 각 목적 유전자좌들이 생성되는 수이다.
증폭된 DNA의 정제
증폭된 DNA의 정제는 본 발명의 실시에 필요하지 않다. 그러나, 한 실시 형태에 있어서, 만일 정제가 바람직하면, 프라이머(제1 또는 제2 프라이머)의 5' 말단을, PCR 생성물의 정제를 촉진하는 태그로 변형시킬 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 제1 프라이머를 PCR 생성물의 정제를 촉진하는 태그로 변형시킨다. 변형은 바람직하게는 모든 프라이머에 대해 동일하지만, 만일 PCR 생성물들을 다른 그룹들로 분리하는 것이 필요하면 다른 변형들을 이용할 수 있다.
태그는 방사성동위원소, 형광성 리포터 분자, 화학 발광성 리포터 분자, 항체, 항체 단편, 합텐, 바이오틴, 바이오틴의 유도체, 포토바이오틴, 이미노바이오틴, 디곡시게닌, 아비딘, 효소, 아크리디늄, 당, 효소, 아포효소, 동종중합성 올리고뉴클레오티드, 호르몬, 강자성 부분, 상자성 부분, 반자성 부분, 인광성 부분, 발광성 부분, 전기 화학 발광성 부분, 염색성 부분, 검출가능한 전자 스핀 공명, 전기 용량, 유전 상수 또는 전기 전도도를 포함하는 부분 또는 그의 조합일 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 프라이머의 5' 말단은 바이오틴화될 수 있다((Kandpal et al., Nucleic Acids Res. 18: 1789-1795 (1990); Kaneoka et al. , Biotechniques 10: 30-34 (1991) ; Green et al., Nucleic Acids Res. 18: 6163- 6164 (1990) ). 바이오틴은 게놈 DNA로부터의 복제된 DNA 또는 관심없는 임의의 다른 DNA 분자를 정제하기 위해 이용될 수 있는 친화성 태그를 제공한다. 바이오티닐화 분자는 로쉐 몰엘큘러 바이오케미컬스 (Roche Molecular Biochemicals)에서 구입할 수 있는 스트렙타웰(Streptawell), 투명한, 고-결합(High- Bind) 플레이트(카탈로그 번호 1 645 692, Roche Molecular Biochemicals, 2001 Biochemicals Catalog에 기재됨)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 도 1F에 나타난 바 대로 스트렙타비딘 코팅된 매트릭스를 이용하여 정제할 수 있다.
각 목적 유전자좌의 PCR 생성물을 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 별도의 웰에 놓는다. 대안적으로는, 목적 유전자좌의 PCR 생성물을 모아서 로쉐 몰엘큘러 바이오케미컬스에서 구입할 수 있는 스트렙타웰(Streptawell), 투명한, 고-결합(High- Bind) 플레이트(카탈로그 번호 1 645 692, Roche Molecular Biochemicals, 2001 Biochemicals Catalog에 기재됨)를 포함하며 이에 한정되지 않는 스트렙타비딘 코팅된 매트릭스내에 놓을 수도 있다.
증폭된 DNA는 또한 예를 들어 표준 방법을 이용한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은, 본 기술 분야에서 공지된 비친화성 방법을 이용하여 주형 DNA로부터 분리될 수 있다.
증폭된 DNA의 절단
증폭된 DNA를, 본 기술 분야에서 공지된 표준 프로토콜을 이용하여 제1 또는 제2 프라이머상에 제공되었던 서열을 인식하는 제한 효소로 절단시킬 수 있다(도 6A-6D). 이용되는 효소는 제1 또는 제2 프라이머로 생성된 제한 인식 부위에 의존한다. 프라이머 상에 형성된 제한 인식 부위에 대한 상세한 사항을 위해서는 상기의 "프라이머 설계" 단락을 참고한다.
IIS형 제한 효소는 그들이 인식 부위의 바깥쪽의 약 10-20 염기쌍을 절단한다는 점에서 매우 유용하다. 바람직하게는, 이용된 IIS형 제한 효소는 5' 오버행과 리세싱된 3' 말단을 생성하는 것들이며 BceA I 와 BsmF I를 포함하며 이에 한정되지 않는다(예를 들어 표 I 참고).
가장 바람직한 실시예에서, 목적 유전자좌에 근접하여 어닐링하는 제2 프라이머(정방향 또는 역방향)는 BceA I 또는 BsmF I에 대한 제한 효소 인식 서열을 포함한다. IIS형 제한 효소 BsmF I은 GGGAC의 핵산 서열을 인식하며, 안티센스 가닥상의 인식 부위로부터 14 뉴클레오티드와 센스 가닥상의 인식 부위로부터 10 뉴클레오티드를 절단한다. BsmF I을 이용한 절단은 4 염기의 5' 오버행을 생성한다.
예를 들어, 만일 제2 프라이머가, 증폭 후 제한 효소 인식 부위가 목적 유전자좌로부터 13 염기이도록 설계되면, 절단 후, 목적 유전자좌는 5' 오버행에서 첫번째 염기(3' 에서 5'으로 판독)이고 리세싱된 3' 말단은 목적 유전자좌의 1염기 상류이다. 3' 리세싱된 말단은 목적 유전자좌에 상보성인 뉴클레오티드로 필 인될 수 있다. 오버행의 1 염기는 디데옥시뉴클레오티드를 이용하여 필 인할수 있다. 그러나, 오버행의 1,2,3 또는 모든 4 염기는 데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시뉴클레오티드와 데옥시뉴클레오티드의 혼합물을 이용하여 필 인할수 있다.
제한 효소 BsmF I는 센스 가닥상의 인식 부위로부터 10 뉴클레오티드와 안티센스 가닥상의 인식 부위로부터 14 뉴클레오티드에서 DNA를 절단한다. 그러나, 서열 의존 방식으로, 제한 효소 BsmF I는 또한 센스 가닥 상의 인식 부위로부터 11 뉴클레오티드와 안티센스 가닥상의 인식 부위로부터 15 뉴클레오티드를 절단한다. 따라서, 절단 후, DNA 분자의 두 집단이 존재한다: 10/14에서 절단된 DNA 분자와 11/15에서 절단된 DNA 분자. 만일 BsmF I를 위한 인식 부위가 증폭된 생성물에서 목적 유전자좌로부터 13염기이면, 11/15 위치에서 절단된 DNA 분자가 오버행의 두번째 위치에서 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 생성할 것이다 (3' 에서 5'으로 판독). DNA 분자의 3' 리세싱된 말단은 표지된 뉴클레오티드로 필 인할수 있다. 예를 들어, 만일 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 이용하면, 11/15에서 절단된 분자의 3' 리세싱된 말단은 목적 유전자좌의 1 염기 상류에 해당하는 1 염기로 필 인되며 10/14에서 절단된 분자의 3' 리세싱된 말단은 목적 유전자좌에 해당하는 1 염기로 필 인된다. 10/14 위치에서 절단된 DNA 분자와 11/15 위치에서 절단된 DNA 분자는 크기에 의해 분리될 수 있으며, 혼입된 뉴클레오티드에 의해 검출될 수 있다. 이것은 목적 유전자좌 이전의 뉴클레오티드의 검출, 목적 유전자좌의 검출, 및 가능하게는 목적 유전자좌 뒤의 3 염기쌍의 검출을 허용한다.
대안적으로는, 만일 목적 유전자좌의 상류의 염기와 목적 유전자좌가 상이한 뉴클레오티드이면, 11/15에서 절단된 분자의 3' 리세싱된 말단은 그 상류 염기에 상보적인 데옥시뉴클레오티드로 필 인할수 있다. 나머지 데옥시뉴클레오티드는 세척되며, 목적 유전자좌 부위는 표지된 데옥시뉴클레오티드, 미표지된 데옥시뉴클레오티드, 표지된 디데옥시뉴클레오티드, 또는 미표지된 디데옥시뉴클레오티드로 필 인할수 있다. 반응에서 필 인한 후, 뉴클레오티드를 임의의 적절한 방법으로 탐지할 수 있다. 따라서, dNTP를 이용하여 반응에서 첫번째 필 인 후, 10/14 및 11/15에서 절단된 분자들의 3' 리세싱된 말단은 목적 유전자좌의 상류이다. 3' 리세싱된 말단은 이제 1 염기로 채울 수 있으며, 이 염기는 목적 유전자좌, 2 염기, 3 염기 또는 4 염기에 해당한다.
대안적으로는, 만일 목적 유전자좌의 상류 염기와 목적 유전자좌의 하류 염기가 동일한 것으로 보고되면, 11/15에서 절단된 분자의 3' 리세싱된 말단은 미표지된 데옥시뉴클레오티드로 필 인 후 표지된 디데옥시뉴클레오티드로 필 인할수 있다. 예를 들어, 만일 목적 유전자좌의 상류의 뉴클레오티드가 시토신이며, 시토신은 목적 유전자좌의 가능한 뉴클레오티드이며, 아데노신은 목적 유전자좌의 3'의 첫번째 뉴클레오티드이면, "필 인" 반응은 미표지 데옥시구아닌 트리포스페이트(dGTP) 및 이어지는 표지된 디데옥시티미딘 트리포스페이트를 이용한 필 인으로 실시될 수 있다. 만일 목적 유전자좌가 시토신을 포함하면, ddTTP가 혼입되어 검출될 것이다. 그러나, 만일 목적 유전자좌가 시토신을 포함하지 않으면, dGTP가 혼입되지 않으며, 이는 ddTTP의 혼입을 막는다.
제한 효소 BceA I는 핵산 서열 ACGGC를 인식하며 센스 가닥 상의 인식 부위로부터 12 뉴클레오티드와 안티센스 가닥 상의 인식 부위로부터 14 뉴클레오티드를 절단한다. 만일 제2 프라이머상의 BceA I를 위한 인식 부위로부터의 거리가 목적 유전자좌로부터 13 염기이도록 설계되면 (도 4A-4D 참고), BceA I를 이용한 절단은 목적 유전자좌를 포함한 2염기의 5' 오버행 및 목적 유전자좌의 상류인 리세싱된 3' 말단을 생성할 것이다. 목적 유전자좌는 5' 오버행에서 첫번째 뉴클레오티드이다(3'에서 5'으로 판독).
BsmF I에서 보여지는 것보다 훨씬 낮은 빈도이긴 하지만, 제한 효소 BceA I에서 다른 절단이 또한 나타난다. 제한 효소 BceA I는 센스 가닥상의 인식 부위로부터 13 뉴클레오티드와 안티센스 가닥 상의 인식 부위로부터 15 뉴클레오티드를 절단할 수 있다. 따라서, 두 가지의 DNA 분자 집단이 존재한다: 12/14에서 절단된 DNA 분자와 13/15에서 절단된 DNA 분자. 만일 제한 효소 인식 부위가 증폭된 생성물에서 목적 유전자좌로부터 13 염기이면, 13/15 위치에서 절단된 DNA 분자는 5'오버행을 생성하며, 이는 오버행의 두번째 위치에서 목적 유전자좌를 포함한다 (3'에서 5'으로 판독). 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 이용하여 DNA 분자의 3' 리세싱된 말단을 필 인할수 있다. 13/15에서 절단된 DNA 분자는 필 인된 목적 유전자좌의 상류 염기를 가질 것이며, 12/14에서 절단된 DNA 분자는 필 인된 목적 유전자좌 부위를 가질 것이다. 13/15에서 절단된 DNA 분자와 12/14에서 절단된 DNA 분자는 크기에 의해 분리될 수 있으며, 혼입된 뉴클레오티드가 검출될 수 있다. 따라서, 대안적인 절단을 이용하여 추가의 서열 정보를 얻을 수 있다.
대안적으로는, 만일 5' 오버행의 2 염기가 상이하면, 13/15에서 절단된 DNA 분자의 3' 리세싱된 말단은 오버행의 첫번째 염기에 상보적인 데옥시뉴클레오티드로 채울 수 있으며, 과다한 데옥시뉴클레오티드는 세척한다. 필 인 후, 12/14에서 절단된 DNA 분자와 13/15에서 절단된 DNA 분자의 3' 리세싱된 말단은 목적 유전자좌의 상류이다. 3' 리세싱된 말단은 표지된 디데옥시뉴클레오티드, 미표지된 디데옥시뉴클레오티드, 표지된 데옥시뉴클레오티드, 또는 미표지된 데옥시뉴클레오티드로 필 인할수 있다.
만일 프라이머가 복제된 목적 유전자좌의 일부를 위해 다른 제한 부위를 제공하면, 모든 필요한 제한 효소를 함께 추가하여 복제된 DNA를 동시에 절단할 수 있다. 대안적으로는, 다른 제한 효소 절단을, 예를 들어 한번에 하나의 제한 효소를 이용하여, 순서대로 실시하여, 그 제한 효소에 특이적인 생성물만이 절단되도록 할 수 있다.
표지된 뉴클레오티드의 혼입
제2 프라이머상의 서열을 인식하는 제한 효소를 이용한 절단은 리세싱된 3' 말단과 목적 유전자좌를 포함한 5' 오버행을 생성한다 (도 1G). 리세싱된 3' 말단은 미표지 또는 표지 뉴클레오티드의 존재하에서 또는 미표지 및 표지 뉴클레오티드의 조합 존재하에서 주형으로서 5' 오버행을 이용하여 필 인할수 있다. 뉴클레오티드는 방사성 분자, 형광 분자, 항체, 항체 단편, 합텐, 탄수화물, 바이오틴, 바이오틴의 유도체, 인광성 부분, 발광성 부분, 전기 화학 발광성 부분, 염색성 부분, 검출가능한 전자 스핀 공명, 전기 용량, 유전 상수 또는 전기 전도도를 포함하는 부분을 포함하지만 그에 한정되지는 않는, 검출을 허용하는 임의의 유형의 화학기 또는 부분으로 표지시킬 수 있다. 뉴클레오티드는 하나 이상의 유형의 화학기 또는 부분으로 표지시킬 수 있다. 각 뉴클레오티드는 동일한 화학기 또는 부분으로 표지시킬 수 있다. 대안적으로는, 각각 다른 뉴클레오티드를 다른 화학기 또는 부분으로 표지시킬 수 있다. 표지된 뉴클레오티드는 dNTP, ddNTP, 또는 dNTP와 ddNTP 둘다의 혼합물일 수 있다. 미표지된 뉴클레오티드는 dNTP, ddNTP 또는 dNTP와 ddNTP 둘다의 혼합물일 수 있다.
뉴클레오티드의 임의의 조합을 이용하여, 미표지된 데옥시뉴클레오티드, 표지된 데옥시뉴크레오티드, 미표지된 디데옥시뉴클레오티드, 표지된 디데옥시뉴클레오티드, 표지 및 미표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 표지 및 미표지 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 표지된 데옥시뉴클레오티드와 표지된 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 표지된 데옥시뉴클레오티드와 미표지된 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 미표지된 데옥시뉴클레오티드와 미표지된 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 미표지된 데옥시뉴클레오티드와 표지된 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 디데옥시뉴클레오티드 유사체, 데옥시뉴클레오티드 유사체, 디데옥시뉴클레오티드 유사체와 데옥시뉴클레오티드 유사체의 혼합물, 인산화된 뉴클레오시드 유사체, 2-데옥시뉴클레오시드-5'-트리포스페이트 및 변형된 2'-데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 뉴클레오티드를 혼입하기 위해 이용할 수 있다.
예를 들어, 도 1H에서 나타난 바와 같이, 폴리머라제의 존재하에, 3' 리세싱된 말단은 5' 오버행을 주형으로 이용하여 형광 ddNTP로 필 인할수 있다. 혼입된 ddNTP는 형광성 탐지법을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
모든 네 가지 뉴클레오티드를 다른 형광 기로 표지할 수 있으며, 이로 인해 모든 네 가지의 표지된 뉴클레오티드의 존재하에서 한 반응이 실시될 수 있다. 대안적으로는, 다섯 개의 별도의 "필 인" 반응을 각 목적 유전자좌를 위해 실시할 수 있으며; 네 개의 반응 각각은 다른 표지된 뉴클레오티드(예, ddATP*, ddTTP*, ddUTP*, ddGTP*, 또는 ddCTP*, 여기서 *는 표지된 뉴클레오티드를 나타냄)를 포함할 것이다. 각 뉴클레오티드는 다른 화학기 또는 동일한 화학기로 표지될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드일 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 플루오르세인, 피렌, 7-메톡시쿠마린, 캐스케이드 블루(Cascade Blue)TM, 알렉사 플루르(Alexa Flur) 350, 알렉사 플루르 430, 알렉사 플루르 488, 알렉사 플루르 532, 알렉사 플루르 546, 알렉사 플루르 568, 알렉사플루르 594, 알렉사 플루르 633, 알렉사 플루르 647, 알렉사 플루르 660, 알렉사 플루르 680, AMCA-X, 디알킬아미노쿠마린, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 마리나 블루(Marina Blue), BODIPY 493/503, BODIPY Fl-X, DTAF, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 댄실-X, 6-FAM, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 514, 로다민 그린-X, 로돌 그린, 칼세인, 에오신, 에티듐 브로마이드, NBD, TET, 2', 4', 5', 7' 테트라브로모설폰플루오르신, BODIPY-R6G, BODIPY-Fl BR2, BODIPY 530/550, HEX, BODIPY 558/568, BODIPY-TMR-X., PyMPO, BODIPY 564/570, TAMRA, BODIPY 576/589, Cy3, 로다민 레드-x, BODIPY 581/591, 카르복시X로다민, 텍사스 레드-X, BODIPY-TR-X., Cy5, 스펙트럼아쿠아, 스펙트럼그린 #1, 스펙트럼그린 #2, 스펙트럼오렌지, 스펙트럼레드, 또는 나프토플루오르세인을 포함하며 이에 한정되지 않는 형광 염료로 뉴클레오티드를 표지시킬 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, "필 인" 반응은 뉴클레오티드가 다른 형광기로 표지된 형광성 표지 dNTP로 실시될 수 있다. 혼입된 뉴클레오티드는 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 적절한 방법으로 검출할 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 표지된 ddNTP와 미표지 dNTP 둘다의 혼합물을 이용하여, SNP 또는 목적 유전자좌를 포함한 DNA 서열의 리세싱된 3' 말단을 필 인할수 있다. 바람직하게는, 5' 오버행은 2,3,4,5,6, 또는 6보다 많은 염기를 포함하며 이에 한정되지 않는 하나보다 많은 염기로 이루어진다. 예를 들어, 만일 5' 오버행이 서열 "XGAA"로 이루어지면(이때 X는 목적 유전자좌, 예를 들어 SNP임), 표지된 ddNTP와 미표지된 dNTP의 혼합물을 이용한 채우기는 몇 가지 다른 DNA 단편들을 생성할 것이다. 만일 표지된 ddNTP가 위치 "X"에서 혼입되면, 반응은 종결되며 하나의 표지된 염기가 혼입될 것이다. 그러나, 만일 미표지된 dNTP가 혼입되면, 폴리머라제는 표지된 ddNTP가 혼입될 때까지 계속 다른 염기를 혼입할 것이다. 만일 혼입된 첫번째 두 뉴클레오티드가 dNTP이고 세번째가 ddNTP이면, 3' 리세싱된 말단은 3 염기만큼 연장될 것이다. 이 DNA 단편은 1,2, 또는 4 염기 크기만큼 연장된 다른 DNA 단편들로부터 분리될 수 있다. 표지된 ddNTP와 미표지된 dNTP의 혼합물은 오버행의 모든 염기가 채워지게 할 것이며, 목적 유전자좌, 예를 들어 SNP에 대한 추가의 서열 정보를 제공한다 (도 7E와 9D 참고).
표지된 뉴클레오티드의 혼입 후, 증폭된 DNA를 제1 프라이머에 의해 제공된 서열을 인식하는 제한 효소로 절단할 수 있다. 예를 들어, 도 1I에서, 증폭된 DNA는 영역 "a"에 결합하는 제한 효소로 절단되며, 그 결과 스트렙타비딘 매트릭스로부터 혼입된 뉴클레오티드를 포함한 DNA 단편을 방출한다.
대안적으로는, 각 목적 유전자좌를 위한 각 프라이머 쌍의 한 프라이머를, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 포함하며 이에 한정되지 않는 고체 지지체 매트릭스에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트를, 하나의 프라이머가 바이오틴화된 프라이머쌍을 이용한 증폭 반응에 이용할 수 있다. 먼저, 바이오티닐화된 프라이머를 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트에 결합시킨다. 이어서, 플레이트를 목적 유전자좌의 PCR 증폭을 위한 반응 용기로 이용한다. 증폭 반응이 완결된 후, 과다한 프라이머, 염 및 주형 DNA를세척에 의해 제거한다. 증폭된 DNA는 마이크로타이터 플레이트에 부착된 채로 남아 있는다. 증폭된 DNA는 제2 프라이머상의 서열을 인식하는 제한 효소로 절단될 수 있으며, 목적 유전자좌를 포함한 5' 오버행을 생성한다. 절단된 단편은 세척에 의해 제거할 수 있다. 절단 후, SNP 부위 또는 목적 유전자좌는 5' 오버행에서 노출된다. 리세싱된 3' 말단은 폴리머라제 존재하에서 형광 ddNTP를 포함하며 이에 한정되지 않는 표지된 뉴클레오티드로 필 인할수 있다. 제1 프라이머의 5' 영역의 서열을 인식하는 제한 효소로 절단함으로써, 표지된 DNA를 마이크로타이터 플레이트내의 상청액내로 방출시킬 수 있다.
목적 유전자좌의 분석
형광성 탐지법, DNA 서열 결정 겔, 자동화 DNA 서열 결정 기계 상에서의 모세 전기 영동법, 마이크로채널 전기 영동법 및 기타 서열 결정 방법, 질량 분광 분석법, 비행 시간형 질량 분광 분석법, 사중극자형 질량 분광 분석법, 자기 구획 질량 분광 분석법, 전기 구획 질량 분광 분석법, 적외선 분광 측정법, 자외선 분광 측정법, 팔렌티오스터틱 전류 측정법을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다양한 방법, 또는 서던 블롯, 슬롯 블롯, 도트 블롯 및 DNA 마이크로어레이를 포함하는 DNA 혼성화 기술 (여기서, DNA 단편은 "프로브" 및 "표적" 둘 모두로서 유용함), ELISA, 형광 분석법, 및 형광 공명에너지 전이법 (FRET)에 의해 표지된 목적 유전자좌를 분석할 수 있다.
겔 전기 영동 및 이어지는 혼입된 뉴클레오티드의 형광 검출을 이용하여 목적 유전자좌를 분석할 수 있다. 목적 유전자좌를 분석하거나 판독하는 다른 방법은 96-웰 스트렙타비딘 코팅된 플레이트상에서 직접 형광 플레이트 판독기 또는 형광분석기를 이용하는 것이다. 플레이트를 형광 플레이트 판독기 또는 스캐너상에 놓아 파마시아 9200 타이푼이 각 목적 유전자좌를 판독하도록 할 수 있다.
대안적으로는, 목적 유전자좌의 PCR 생성물을 모을 수 있으며, "필 인" 후(도 10), 적절한 임의의 방법을 이용하여 생성물을 크기에 의해 분리하고, 형광성 탐지법, DNA 서열 결정 겔, 자동화 DNA 서열 결정 기계 상에서의 모세 전기 영동법, 마이크로채널 전기 영동법 및 기타 서열 결정 방법, 서던 블롯, 슬롯 블롯, 도트 블롯 및 DNA 마이크로어레이를 포함하는 DNA 혼성화 기법, 질량 분광 분석법, 비행 시간형 질량 분광 분석법, 사중극자형 질량 분광 분석법, 자기 구획 질량 분광 분석법, 전기 구획 질량 분광 분석법, 적외선 분광 측정법, 자외선 분광 측정법, 팔렌티오스터틱 전류 측정법을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다양한 방법을 이용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 DNA를 크기에 의해 분리할 수 있으며 겔을 스캐닝하여 각 밴드에서 형광의 색을 결정할 수 있다(예를 들어 ABI 377 DNA 서열 결정 기계 또는 파마시아 타이푼 9200을 이용함).
다른 실시 형태에 있어서, 한 뉴클레오티드를 이용하여 유전자의 다수의 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다. 연장 반응을 종결시키는 뉴클레오티드를 이용하여 유전자의 다수의 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다. 한 대립유전자에서, 종결 뉴클레오티드는 상기 대립유전자의 5' 오버행내의 목적 유전자좌에 상보적이다. 이 뉴클레오티드는 혼입되어 반응을 종결시킨다. 다른 대립유전자에서, 이 종결 뉴클레오티드는 목적 유전자좌에 상보적이 아니며, 비종결 뉴클레오티드가 다른 대립유전자의 목적 유전자좌에 혼입되도록 한다. 그러나, 종결 뉴클레오티드는 상기 다른 대립유전자의 5' 오버행내의 목적 유전자좌로부터 하류의 뉴클레오티드에 상보적이다. 종결 뉴클레오티드의 혼입 패턴을 분석하여 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다. 종결 뉴클레오티드를 표지 또는 미표지할 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 종결 뉴클레오티드는, 디데옥시뉴클레오티드, 디데옥시뉴클레오티드 유도체, 디데옥시뉴클레오티드 유사체, 디데옥시뉴클레오티드 상동체, 황 화학기를 가진 디데옥시뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드 유도체, 데옥시뉴클레오티드 상동체, 데옥시뉴클레오티드 유사체, 및 황 화학기를 가진 데옥시뉴클레오티드, 아라비노시드 트리포스페이트, 아라비노시드 트리포스페이트 유사체, 아라비노시드 트리포스페이트 상동체, 또는 아라비노시드 유도체를 포함하며 이에 한정되지 않는, 연장 반응을 종결시키거나 방해하는 뉴클레오티드이다.
다른 실시 형태에 있어서, 형광 염료를 포함하며 이에 한정되지 않는 하나의 시그널 생성 부분 태그로 표지된 종결 뉴클레오티드를 이용하여 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다. 하나의 시그널 생성 부분 태그로 표지된 단일 뉴클레오티드의 이용은 다른 형광 부들을 이용할 때 발생할 수 있는 어려움을 제거한다. 더욱이, 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하기 위하여 하나의 시그널 생성 부분 태그로 표지된 하나의 뉴클레오티드를 이용함으로써 반응의 수를 감소시키고, 피펫팅 에러를 제거한다.
예를 들어, 만일 제2 프라이머가 BsmFI을 위한 제한 효소 인식 부위를 포함하면, 절단은 4 염기의 5' 오버행을 생성할 것이다. 제2 프라이머는 목적 유전자좌가 오버행의 첫번째 위치에 위치하도록 설계될 수 있다. 대표적인 오버행이 하기에 개시되며, 여기서 R은 목적 유전자좌를 나타낸다:
하나의 시그널 생성 부분의 태그를 가지는 하나의 뉴클레오티드가 가변성 부위가 동종성인지 또는 이종성인지의 결정에 사용될 수 있다. 예를 들어 아데닌 또는 구아닌이 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열의 결정에 사용될 수 있되, 단, 가변성 부위가 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)이면, 2, 3 또는 4 위치에서 오버행에 아데닌 또는 구아닌이 존재한다.
예를 들어 오버행의 2 위치의 뉴클레오티드가 아데닌에 상보성인 티미딘이라면, 표지 ddATP, 미표지 dCTP, dGTP, 및 dTTP를 사용하여 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다. ddATP는 형광성 염료를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 시그널 생성 부분으로 표지될 수 있다. 주형 DNA가 아데닌에 대하여 동종성이면, 표지 ddATP*가 대립 유전자의 오버행에 상보성인 1 위치에서 혼입되며, 오버행에 상보성인 2, 3 또는 4 위치에서는 뉴클레오티드 혼입이 전혀 보여지지 않는다.
오버행에 상보성인 1 위치에서 표지 ddATP의 혼입에 상응하는 하나의 시그널이 보여지는데, 이는 개체가 이 위치에서 아데닌에 대하여 동종성임을 나타낸다. 이러한 표지 방법은 양자 계수가 다른 상이한 염료의 사용에 의해 발생될 수 있는 모든 어려움을 제거한다.
동종성 구아닌:
주형 DNA가 구아닌에 대하여 동종성이면, ddATP는 오버행에 상보성인 1 위치에서 전혀 혼입되지 않지만, ddATP는 첫번째의 이용가능한 위치에서 혼입되는데, 이경우 상기 위치는 오버행에 상보성인 2 위치이다. 예를 들어 오버행 중 두번째 위치가 티미딘에 상응한다면, 하기와 같다:
오버행에 상보성인 2 위치에서 ddATP의 혼입에 상응하는 하나의 시그널이 보여지는데, 이는 개체가 구아닌에 대하여 동종성임을 나타낸다. 오버행에 상보성인2 위치에서 필 인되는 분자는 오버행에 상보성인 1 위치에서 필 인되는 분자보다 상이한 분자량을 가진다.
이종성 상태:
2개의 시그널이 보여지는데, 첫번째 시그널은 오버행에 상보성인 1 위치에서 필 인되는 ddATP에 상응하며 두번째 시그널은 오버행에 상보성인 2 위치에서 필 인되는 ddATP에 상응한다. 2개의 시그널은 분자량에 기초하여 분리될 수 있으며, 대립유전자 1 및 대립유전자 2는 단일 염기쌍에 의해 분리되는데 이는 시그널의 탐지 및 정량화를 용이하게 한다. 1 위치에서 필 인되는 분자는 겔 전기 영동법, 모세관 겔 전기 영동법, DNA 서열 결정법 및 질량 분광 분석법을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 분자량에 기초하여 구별하는 임의의 방법을 사용하여 2 위치에서 필 인되는 분자와 구별될 수 있다. 뉴클레오티드를 화학적 부분으로 표지하는 것이 필요한 것은 아니며 상이한 대립유전자에 상응하는 DNA 분자는 분자량에 기초하여 분리될 수 있다.
오버행의 2 위치가 아데닌에 상보성이지 않을 경우 3 또는 4 위치가 아데닌에 상보성일 수 있음이 가능하다. 예를 들어 오버행의 3 위치는 아데닌 뉴클레오티드에 상보성일 수 있으며 이 경우 표지 ddATP가 두 대립유전자의 서열 결정에 사용될 수 있다.
아데닌에 대하여 동종성:
구아닌에 대하여 동종성:
이종성:
2개의 시그널이 보여지는데, 첫번째 시그널은 오버행에 상보성인 1 위치에서 필 인되는 ddATP에 상응하며 두번째 시그널은 오버행에 상보성인 3 위치에서 필 인되는 ddATP에 상응한다. 2개의 시그널은 분자량에 기초하여 분리될 수 있으며, 대립유전자 1 및 대립유전자 2는 2개의 염기에 의해 분리되는데, 이는 분자량에 기초하여 식별하는 임의의 방법을 사용하여 탐지할 수 있다.
대안적으로는 2 및 3 위치가 아데닌에 상보성이지 않으며 (즉, 오버행의 2 및 3 위치가 구아닌, 시토신 또는 아데닌에 상응함) 위치 4가 아데닌에 상보성일 경우 표지 ddATP가 두 대립유전자의 서열 결정에 사용될 수 있다.
아데닌에 대하여 동종성:
오버행에 상보성인 1 위치에서 ddATP로 필 인된 분자의 분자량에 상응하는 하나의 시그널이 보여지는데 이는 개체가 가변성 부위에서 아데닌에 대하여 동종성이라는 것을 나타낸다.
구아닌에 대하여 동종성:
오버행에 상보성인 위치 4에서 필 인되는 분자의 분자량에 상응하는 하나의 시그널이 보여지는데 이는 개체가 구아닌에 대하여 동종성이라는 것을 나타낸다.
이종성:
2개의 시그널이 보여지는데, 첫번째 시그널은 오버행에 상보성인 1 위치에서 필 인되는 ddATP에 상응하며 두번째 시그널은 오버행에 상동성인 4 위치에서 필 인되는 ddATP에 상응한다. 2개의 시그널은 분자량에 기초하여 분리될 수 있으며, 대립유전자 1 및 대립유전자 2는 3개의 염기에 의해 분리되는데 이에 의해 시그널이 탐지 및 정량화된다. 1 위치에서 필 인되는 분자 및 4 위치에서 필 인되는 분자는 분자량에 기초하여 구별될 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이 가변성 부위가 아데닌 또는 구아닌을 포함할 경우 표지 아데닌 또는 표지 구아닌을 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다. 오버행의 2, 3 또는 4 위치가 아데닌에 상보성이지는 않지만 이 위치 중 하나가 구아닌에 상보성이면, 표지 ddGTP를 사용하여 주형 DNA가 아데닌 또는 구아닌에 대하여 동종성인지 이종성인지를 결정할 수 있다. 예를 들어 오버행 중 3 위치가 시토신에 상응하면 하기 시그널이 주형 DNA가 구아닌에 대하여 동종성인지, 아데닌에 대하여 동종성인지 또는 이종성인지를 예측하게 된다:
구아닌에 대하여 동종성:
오버행에 상보성인 1 위치에서 ddGTP로 필 인되는 분자의 분자량에 상응하는 하나의 시그널이 보여지는데 이는 개체가 구아닌에 대하여 동종성이라는 것을 나타낸다.
아데닌에 대하여 동종성:
오버행에 상보성인 3 위치에서 필 인되는 분자의 분자량에 상응하는 하나의 시그널이 보여지는데 이는 개체가 가변성 부위에서 아데닌에 대하여 동종성이라는 것을 나타낸다.
이종성:
2개의 시그널이 보여지는데, 첫번째 시그널은 오버행에 상보성인 1 위치에서 필 인되는 ddGTP에 상응하며 두번재 시그널은 오버행에 상보성인 3 위치에서 필 인되는 ddGTP에 상응한다. 2개의 시그널은 분자량에 기초하여 분리될 수 있으며, 대립유전자 1 및 대립유전자 2는 2개의 염기에 의해 분리되는데, 이에 의해 시그널이 용이하게 탐지 및 정량화된다.
일부 IIS형 제한 효소도 상기에서 논의된 바와 같이 대안적인 절단을 나타낸다. 예를 들어 BsmFI은 인식 부위로부터 10/14 및 11/15에서 절단한다. 그러나 절단 패턴은 상호 배타적이지는 않으며, 만일 11/15 절단 패턴이 특정 서열에서 보여지면 10/14 절단도 보여진다. 제한 효소 BsmF I이 인식 부위로부터 10/14를 절단하면 5' 오버행은 X1X2X3X4가 된다. BsmF I이 인식 부위로부터 11/15를 절단하면, 5' 오버행은 X0X1X2X3이 된다. 오버행의 X0위치가 표지 뉴클레오티드에 상보성이면 표지 뉴클레오티드는 X0위치에서 혼입되어 추가의 품질 보증 수준을 제공한다. 이는 추가의 서열 정보를 제공한다.
예를 들어 가변성 부위가 아데닌 또는 구아닌이며 오버행 중 3 위치가 아데닌에 상보성일 경우, 표지 ddATP를 사용하여 가변성 부위에서 유전자형을 결정할 수 있다. 11/15 오버행의 0 위치가 아데닌에 상보성인 뉴클레오티드를 포함할 경우, ddATP가 필 인되며 추가의 시그널이 보여진다.
이종성:
3개의 시그널이 보여지는데, 하나는 오버행에 상보성인 0 위치에서 혼입된 ddATP에 상응하며, 하나는 오버행에 상보성인 1 위치에서 혼입된 ddATP에 상응하며, 하나는 오버행에 상보성인 3 위치에서 혼입된 ddATP에 상응한다. 오버행에 상보성인 0, 1 및 3 위치에서 필 인된 분자는 분자량이 다르며 겔 전기 영동법 및 질량 분광 분석법을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 분자량에 기초하여 구별하는 임의의 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
하나의 대립유전자 대 다른 대립유전자의 비의 정량화에 있어서, 또는 야생형 DNA 서열의 존재 하에 돌연변이 DNA 서열의 상대적인 양을 결정할 경우 정확하며 고도로 민감한 탐지 방법이 사용되어야 한다. IIS형 제한 효소에 의해 나타내어지는 택일적인 절단은 하나의 대립유전자 대 다른 대립유전자의 비의 결정의 어려움을 증가시킬 수 있는데 이는 제한 효소가 2개의 대립 유전자 상에서 동일하게 택일적인 절단 (11/15) 패턴을 나타낼 수는 없기 때문이다. 예를 들어 대립유전자1은 시간의 80% 동안 10/14에서, 그리고 시간의 20% 동안 11/15에서 절단될 수 있다. 그러나 2개의 대립유전자는 서열이 다를 수 있기 때문에 대립유전자 2는 시간의 90% 동안 10/14에서, 그리고 시간의 20% 동안 11/15에서 절단될 수 있다.
정량화하기 위해서는 택일적 절단 문제점은 오버행의 0 위치의 뉴클레오티드가 표지 뉴클레오티드에 상보성이지 않을 경우 제거될 수 있다. 예를 들어 가변성 부위가 아데닌 또는 구아닌에 상응하며 오버행의 3 위치가 아데닌에 상보성일 경우 (즉, 티미딘이 오버행의 3 위치에 위치할 경우) 표지 ddATP를 사용하여 가변성 부위의 유전자형을 결정할 수 있다. 11/15 절단 특성에 의해 생성되는 오버행의 0 위치가 아데닌에 상보성이 아닐 경우 (즉, 오버행의 0 위치가 구아닌, 시토신 또는 아데닌에 상응할 경우) 인식 부위로부터 11/15에서 절단된 단편으로부터는 추가의 시그널이 전혀 보이지 않는다. 오버행에 상보성인 0 위치는 미표지 뉴클레오티드로 채워질 수 있어 제한 효소의 택일적 절단 패턴으로부터 보여지는 모든 복잡성이 제거된다. 본 방법은 돌연변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 가변성 부위의 비를 정량화하는 고도로 정확한 방법을 제공한다.
예를 들어 SNP X가 아데닌 또는 구아닌일 경우 이러한 표지 방법에 의해 제한 효소가 택일적 절단 패턴과 관련하여 대립유전자 사이에서 임의의 상이성을 나타내는지를 결정하지 않고도 아데닌에 상응하는 대립유전자 및 구아닌에 상응하는 대립유전자가 정량화된다.
이종성:
BsmF I의 택일적 절단 특성에 의해 생성되는 오버행이 하기에 도시되어 있다:
표지 ddATP 및 미표지 dGTP, dCTP, dTTP를 이용한 필 인 후, 하기 분자가 생성된다:
2개의 시그널이 보여지는데, 하나는 오버행에 상보성인 1 위치에서 ddATP로 필 인된 분자에 상응하며 하나는 오버행에 상보성인 3 위치에서 ddATP로 필 인된분자에 상응한다. 11/15 오버행의 0 위치는 미표지 뉴클레오티드로 필 인되는데, 이는 대립유전자 1 상의 가변성 부위의 뉴클레오티드 및 대립유전자 2 상의 가변성 부위의 뉴클레오티드의 비의 정량화의 모든 어려움을 제거한다.
아데닌, 아데닌 유도체, 아데닌 유사체, 구아닌, 구아닌 유도체, 구아닌 유사체, 시토신, 시토신 유도체, 시토신 유사체, 티미딘, 티미딘 유도체 또는 티미딘 유사체, 또는 아데닌, 아데닌 유도체, 아데닌 유사체, 구아닌, 구아닌 유도체, 구아닌 유사체, 시토신, 시토신 유도체, 시토신 유사체, 티미딘, 티미딘 유도체 또는 티미딘 유사체,의 임의의 배합물을 포함하는 임의의 뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
뉴클레오티드는 방사성 분자, 형광성 분자, 항체, 항체 단편, 합텐, 탄수화물, 바이오틴, 바이오틴 유도체, 인광성 부분, 발광성 부분, 전기 화학 발광성 부분, 염색성 부분, 또는 탐지가능한 전자 스핀 공명, 전기 용량, 유전 상수 또는 전기 전도도를 가지는 부분을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아닌 임의의 화학적 기 또는 부분으로 표지될 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서 표지 및 미표지 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 표지 디데옥시뉴클레오티드 및 표지 데옥시뉴클레오티드; 표지 디데옥시뉴클레오티드 및 미표지 데옥시뉴클레오티드; 미표지 디데옥시뉴클레오티드 및 미표지 데옥시뉴클레오티드와; 미표지 디데옥시뉴클레오티드 및 표지 데옥시뉴클레오티드를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 데옥시뉴클레오티드 및 디데옥시뉴클레오티드의 임의의 배합물이 사용될 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서 화학적 부분으로 표지된 뉴클레오티드가 PCR 반응에서 사용될 수 있다. 이어서 제한 효소를 이용한 절단 후 생성되는 5' 오버행을 미표지 뉴클레오티드를 사용하여 필 인시킨다. 미표지 종결 뉴클레오티드를 미표지 뉴클레오티드의 존재 하에 사용하여 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다.
예를 들어 표지 dTTP가 PCR 반응에 사용될 경우 하기의 5' 오버행이 BsmF I을 이용한 절단 후에 생성된다:
미표지 ddATP, 미표지 dCTP, 미표지 dGTP, 및 미표지 dTTP를 사용하여 5' 오버행을 필 인할수 있다. 2개의 시그널이 생성되는데, 하나의 시그널은 오버행에 상보성인 1 위치에서 필 인된 DNA 분자에 상응하며, 두번째 시그널은 오버행에 상보성인 3 위치에서 필 인된 DNA 분자에 상응한다. DNA 분자는 분자량에 기초하여 분리될 수 있으며 PCR 반응 동안 혼입된 dTTP의 형광성에 의해 탐지될 수 있다.
목적하는 부위의 표지 DNA의 유전자좌는 형광성 탐지법, DNA 서열 결정 겔, 자동화 DNA 서열 결정 기계 상에서의 모세 전기 영동법, 마이크로채널 전기 영동법 및 기타 서열 결정 방법, 질량 분광 분석법, 비행 시간형 질량 분광 분석법, 사중극자형 질량 분광 분석법, 자기 구획 질량 분광 분석법, 전기 구획 질량 분광 분석법, 적외선 분광 측정법, 자외선 분광 측정법, 팔렌티오스터틱 전류 측정법을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다양한 방법, 또는 서던 블롯, 슬롯 블롯, 도트 블롯 및 DNA 마이크로어레이를 포함하는 DNA 혼성화 기술에 의해 분석될 수 있는데, 여기서 DNA 단편은 "프로브" 및 "표적" 둘 모두로서, ELISA, 형광 분석법, 및 '형광 공명에너지 전이법 (FRET)으로 유용하다.
이러한 표지 방법은 극도로 민감하며 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6-1:10, 1:11-1:20, 1:21-1:30, 1:31-1:40, 1:41-1:50, 1:51-1:60, 1:61-1:70, 1:71-1:80, 1:81-1:90, 1:91-1:100, 1:101-1:200, 1:250, 1:251-1:300, 1:301-1:400, 1:401-1:500, 1: 501-1:600, 1:601-1:700, 1:701-1:800, 1:801-1:900, 1:901-1:1000, 1:1001-1:2000, 1:2001-1:3000, 1:3001-1:4000, 1:4001-1:5000, 1:5001-1:6000, 1:6001-1:7000, 1:7001-1:8000, 1:8001-1:9000, 1:9001-1:10,000, 1:10,001-1:20,000, 1:20,001-1:30,000, 1:30,001-1:40,000, 1:40,001-1:50,000, 및 1:50,000보다 큰 것을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다양한 비로 존재하는 목적 유전자좌의 대립유전자가 탐지되게 한다.
예를 들어 이러한 표지 방법에 의해 하나의 시그널 생성 부분으로 표지된 하나의 뉴클레오티드를 사용하여 SNP 유전자좌에서 대립유전자의 서열을 결정하거나 정상 대립유전자 집단 사이에서 돌연변이 대립유전자를 탐지하거나 항생제 민감성 박테리아로부터 유래된 대립유전자 중에서 박테리아 세포로부터 유래되는 항생제 내성을 코딩하는 대립유전자를 탐지하거나, 약물 민감성 바이러스로부터 유래된 대립유전자 중에서 약물 내성 바이러스로부터 유래되는 대립유전자를 탐지하거나, 병원체성 박테리아 균주로부터 유래된 비병원체성 박테리아 균쥬로부터 유래된 대립유전자를 탐지한다.
상기에 나타낸 바와 같이 단일 뉴클레오티드를 사용하여 특정의 목적 유전자좌에서 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다. 본 방법은 개체가 특정 돌연변이에 대하여 동종성인지 이종성인지를 결정하는 데에 있어서, 또는 특정 SNP 부위에서 대립유전자의 서열을 결정하는 데에 있어서 특히 유용하다. 본 표지 방법에 의해 다양한 염료의 양자 계수에 의해 야기되는 모든 에러가 제거된다. 이는 또한 마이크로타이터 플레이트의 웰 또는 단일 에펜도르프 튜브를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 단일 반응 용기에서 반응이 진행되게 한다.
이 표지 방법은 동일한 샘플내의 다수의 유전자 시그널의 검출에 특히 유용하다. 예를 들어, 이 방법은 임산부의 DNA와 태아 DNA 둘다를 포함한, 임신한 여성의 혈액, 혈청, 또는 혈장에서 태아 DNA를 검출하는 데 유용하다. 임산부 DNA와 태아 DNA는 97:3과 같은 비율로 혈액, 혈청 또는 혈장에 존재할 수 있으나; 전술한 방법을 이용하여 태아 DNA를 검출할 수 있다. 이 표지 방법은 동일한 집단내의 2, 3, 또는 4개의 다른 유전자 시그널을 검출하기 위해 이용될 수 있다.
이 표지 방법은 야생형 대립유전자의 큰 집단중에 있는 돌연변이 대립유전자를 검출하는 데 특히 유용하다. 더욱이, 이 표지 방법은 야생형 세포의 큰 집단중의 하나의 돌연변이 세포를 검출할 수 있도록 한다. 예를 들어, 이 표지 방법을 이용하여 큰 정상 세포 집단중의 하나의 암 세포를 검출할 수 있다. 일반적으로 암 세포는 DNA 서열에서 돌연변이를 갖는다. 돌연변이 DNA 서열은 야생형 DNA 서열의 큰 배경이 있다하더라도 동정될 수 있다. 이 표지 방법을 이용하여 결장암, 신장암, 유방암, 방광암, 간암, 콩팥암, 뇌암, 폐암, 전립선암, 및 백혈병을 포함한 혈액의 암을 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 암 유형을 스크리닝, 검출, 또는 진단할 수 있다.
이 표지 방법은 또한 박테리아, 진균, 바이러스, 원생동물, 및 마이코박테리아를 포함하며 이에 한정되지 않는 병원성 유기체를 검출하는 데 이용할 수 있다. 이 방법은 또한 박테리아, 진균, 바이러스, 원생 동물 및 마이코박테리아를 포함하며 이에 한정되지 않는 미생물의 병원성 균주와 비병원성 균주를 구별하는 데 이용할 수 있다.
예를 들어, 여러 균주의 대장균(E.coli)가 있으며, 대부분은 비병원성이다. 그러나, 대장균 O157과 같은 몇몇 균주는 병원성이다. 비병원성 대장균 균주와 병원성 대장균들 간에는 유전적인 차이가 있다. 전술한 표지 방법을 이용하여, 때때로 개체의 정상 박테리아 무리와 연합되어 있는 비병원성 유기체의 큰 집단중의 병원성 미생물을 검출할 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 목적 유전자좌에 대하여 3'인 뉴클레오티드의 혼입을 검출함으로써 목적 유전자좌의 서열을 결정할 수 있으며, 이때 상기 뉴클레오티드는 목적 유전자좌에서의 가능한 뉴클레오티드와 다른 뉴클레오티드이다. 이 실시 형태는 SNP의 서열 결정 및 검출에 특히 유용하다. DNA 폴리머라제가 뉴클레오티드를 혼입하는 효율 및 속도는 각 뉴클레오티드에 따라 달라진다.
인간 게놈 프로젝트로부터의 데이터에 따르면, 모든 SNP의 99%가 이중성이다. 인간 게놈의 서열을 이용하여 목적 SNP에 대하여 3'인 뉴클레오티드를 결정할 수 있다. SNP 부위에 대해 3'인 뉴클레오티드가 SNP 부위에서의 가능한 뉴클레오티드와 상이할 경우, SNP에 3'인 하나 이상의 염기인 뉴클레오티드를 이용하여 SNP의 신원을 결정할 수 있다.
예를 들어, 염색체 13에 있는 SNP X의 신원을 결정한다고 가정해 보자. 인간 게놈의 서열은 SNP X가 아데노신 또는 구아닌일 수 있으며 목적 유전자좌에 3'인 뉴클레오티드가 티미딘임을 나타낸다. BsmF I을 위한 제한 효소 인식 부위를 포함하며 증폭 후 목적 유전자좌로부터 13 염기이도록 설계된 프라이머를 이용하여 SNP X를 포함한 DNA 단편을 증폭시킨다. 제한 효소 BsmF I을 이용한 절단은 아데노신 또는 구아닌일 수 있는 목적 유전자좌를 포함한 5' 오버행을 생성한다. 절단 생성물은 두 개의 "필 인" 반응으로 나눠질 수 있다: 하나는 dTTP를 포함하고, 다른 반응은 dCTP를 포함함. 만일 목적 유전자좌가 구아닌에 대해 동종성이면, dCTP와 혼합된 DNA 분자만이 필 인된다. 만일 목적 유전자좌가 아데노신에 대해 동종성이면, dTTP와 혼합된 DNA 분자만이 필 인된다. 만일 목적 유전자좌가 이종성이면, dCTP와 혼합된 DNA 분자가 필 인되며 또한 dTTP와 혼합된 DNA 분자도 필 인된다. 과다한 dNTP를 제거하기 위한 세척 후, 샘플을, 목적 유전자좌에 대해 3'인 뉴클레오티드(티미딘)에 상보적인 표지된 ddATP로 필 인시킨다. 이전 반응에 의해 필 인된 DNA 분자는 표지된 ddATP로 필 인된다. 만일 개체가 아데노신에 대해 동종성이면, dTTP와 혼합된 DNA 분자가 이어서 표지된 ddATP로 필 인된다. 그러나, dCTP와 혼합된 DNA 분자는 그 뉴클레오티드를 혼입하지 않았을 것이며, 따라서 ddATP를 혼입할 수 없다. dTTP와 혼합된 분자내에서 표지된 ddATP만의 검출은 염색체 13상의 SNP X에서 뉴클레오티드의 신원이 아데노신임을 나타낸다.
다른 실시 형태에 있어서, 단일 뉴클레오티드 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 대규모 스크리닝을 실시할 수 있다. 단일 염색체상의 또는 다수의 염색체상의 1~10 에서 100~1000의 목적 유전자좌를 상기의 "프라이머 설계" 단락에서 설명한 바와 같은 프라이머로 증폭시킬 수 있다. 프라이머들을 각각의 증폭된 목적 유전자좌가 다른 크기가 되도록 설계할 수 있다 (도 2). 공개된 야생형 서열에 기초하여 목적 유전자좌에서 동일한 뉴클레오티드를 가질 것으로 예측된 증폭된 목적 유전자좌를, 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트의 웰을 비롯한 고체 지지체에 결합된 채로 모으고, 제2 프라이머상의 인식 부위에 결합할 제한 효소로 절단시킬 수 있다. 절단 후, 3' 리세싱된 말단을 표지된 ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP의 혼합물로 채울 수 있으며, 이때 각 뉴클레오티드는 다른 기로 표지된다. 과다한 뉴클레오티드를 제거하기 위한 세척 후, 스트렙타비딘 코팅된 플레이트상에서 직접 플레이트 판독기 또는 형광분석기를 이용하여 형광 스펙트럼을 검출할 수 있다. 만일 모든 50개의 목적 유전자좌가 야생형 뉴클레오티드를 포함하면, 단지 하나의 형광 스펙트럼만이 나타날 것이다. 그러나, 50개의 목적 유전자좌 중 하나 이상이 돌연변이를 포함하면, 다른 뉴클레오티드가 혼입될 것이며 다른 형광 패턴이 나타날 것이다. 뉴클레오티드는 고체 매트릭스로부터 방출되어, 서열 결정 겔상에서 분석되어 돌연변이를 포함한 목적 유전자좌를 결정할 수 있다. 50개의 목적 유전자좌의 각각이 다른 크기이므로, 이들은 서열 결정 겔에서 분리될 것이다.
다수의 목적 유전자좌는, 단일 염색체상의 다수의 목적 유전자좌, 다수 염색체, 다수 유전자, 단일 유전자, 또는 임의의 그 조합을 대표하는, 한 개체로부터의 DNA 샘플일 수 있다. 다수의 목적 유전자좌는 또한 다수의 개체로부터의 동일한 목적 유전자좌를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 50명의 다른 개체로부터의 50개의 DNA 샘플을 모으고 분석하여 유전자 "X"에서 특정의 목적 뉴클레오티드를 결정할 수 있다.
사람 데이터를 분석중일 때, 공지 서열은 한 개체로부터(예를 들어 현재 분석중인 DNA가 유래한 개체를 포함) 결정된 특정 서열일 수 있으며, 또는 인간 게놈의 일부로서 공개된 것과 같은 콘센서스 서열일 수 있다.
키트
본 발명의 방법은 키트 형태로 본 방법에 이용되는 시약을 제공함으로써 편리하게 실시된다. 키트는 바람직하게는 다음 성분들 중 하나 이상을 포함한다: 키트 지시, 적절한 완충액, 염, DNA 추출 세제, 프라이머, 뉴클레오티드, 표지된 뉴클레오티드, 5' 말단 변형 물질, 및 필요하다면, 별도의 용기 또는 패키지에 들어 있는 적절한 순도의 물, 이러한 성분들은 키트 사용자가 적절한 핵산 샘플을 추출하고 이를 본 발명 방법에 따라 분석하도록 한다. 키트에 제공되는 프라이머는 키트의 목적 및 키트를 이용하여 시험하고자 하는 원하는 DNA에 따라 다를 것이다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 키트는 제한 효소를 위한 인식 부위가 생성되도록 하는 프라이머를 포함하여 그 효소를 이용한 절단에 의해, 서열 결정 방법동안 생성된 DNA 단편에서 목적 유전자좌를 포함한 5' 오버행이 생성되도록 한다.
키트는 또한 원하는 또는 다양한 단일 뉴클레오티드 다형성, 특히 원치 않는 상태 또는 질환과 관련된 것들을 검출하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 한 키트는 다른 성분들 중에서, 유방암과 관련된 하나 이상의 목적 유전자좌를 증폭시키기 위한 프라이머 세트 또는 세트들을 포함할 수 있다. 다른 키트는 다른 성분들 중에서, 타입 I 또는 타입 II 당뇨병을 발생시키는 소인과 관련된 유전자를 위한 프라이머 세트 또는 세트들을 포함할 수 있다. 또한, 다른 키트는 다른 성분들 중에서, 심장 질환을 발생시키는 소인과 관련된 유전자를 위한 프라이머 세트 또는 세트들을 포함할 수 있다. 그러한 키트의 유용성에 대한 상세한 사항은 하기의 "유용성" 단락에서 제공된다.
유용성
본 발명의 방법은 어떤 핵산, 그 내부의 목적 유전자좌 또는 목적 유전자좌들의 서열을 알고자 할 때 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 특히 게놈 DNA에 적용할 때 유용하다. 유기체-특이적인 또는 종-특이적인 목적 유전자좌 또는 좌들로부터의 DNA가 증폭될 때, 그 DNA의 공급원을 동정하기 위한 유전자형결정에 본 발명의 방법을 이용할 수 있으며, 따라서 그 DNA 샘플이 유래된 유기체 또는 종의 신원을 확인하거나 제공한다. 유기체는 임의의 핵산 포함 유기체, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 효모, 식물, 동물 또는 사람일 수 있다.
임의의 유기체 집단내에서, 본 발명의 방법은 샘플 핵산의 서열과 공지 핵산의 서열간의 차이를 동정하는 데 유용하다. 그러한 차이는 예를 들어 대립유전자 변이, 돌연변이, 다형성 및 특히 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함할 수 있다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은 단일 뉴클레오티드 다형성의 확인을 위한 방법을 제공한다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법은 질환, 특히 게놈 서열의 존재의 결과로서 발생하는 유전 질환의 존재의 확인, 또는 다른 생물학적 상태를 아는 것이 필요한 개체에서 동정할 필요가 있는 그 생물학적 상태의 확인을 위한 방법을 제공한다. 그러한 게놈 서열의 존재에 기초하여 개체에서 그러한 서열을 동정하는 것은 예를 들어, 그 개체가 보균자인지를 결정하기 위하여 또는 그 개체가 어떤 유전적 형질, 상태 또는 질환을 발생시킬 소인이 있는지를 평가하기 위하여 이용할 수 있다. 본 발명의 방법은 특히 부모와 아이의 출생전 유전자 시험에 유용하다. 본 발명에 의해 진단될 수 있는 일부 질환의 예가 표 IIa 내지 IIc에 열거되어 있다.
본 발명의 방법은 유전적 특성 또는 유전자 질환과 관련된 수십, 수백 또는 심지어 수천개의 목적 유전자좌와 같은 다수의 목적 유전자좌에서 이러한 특성 또는 질환과 관련된 목적 유전자좌, 특히 이러한 특성 또는 병과 가장 빈번하게 관련된 유전자좌를 서열 결정함으로써 개체를 스크리닝하는 데에 유용하다. 본 발명은 심장 질환, 암, 내분비 장애, 면역 장애, 신경계 장애, 근골격계 장애, 안과학적장애, 유전자 이상, 삼염색체, 일염색체, 염기 변환, 전좌, 피부 장애, 및 가족성 질환을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 특정 질환 세트의 분석에 유용하다.
본 발명의 방법은 물질, 예를 들어 식품 물질에 있어서 특정 미생물의 존재를 신속하게 확인하도록 미생물의 유전자형을 분석하는 데에 사용될 수 있다. 이와 관련하여 본 발명의 방법은 바람직하지 못한 생물학적 오염물, 예를 들어 미생물, 진균류 또는 동물 배설물의 존재에 대하여 식품, 액체 또는 공기 샘플을 신속하게 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명은 박테리아, 바이러스, 진균류, 원생 동물, 사상균, 효모, 식물, 동물 및 고세균류를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다양한 유기체의 탐지에 유용하다. 본 발명은 물, 공기, 호텔, 회의실, 수영장, 욕실, 항공기, 우주선, 기차, 버스, 자동차, 사무실, 가정, 상점, 교회, 공원, 해변, 운동 시설, 놀이 공원, 극장, 및 대중의 만남의 장소인 임의의 기타 시설을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다양한 공급원으로부터 수집되는 유기체의 탐지에 유용하다.
본 발명의 방법은 인간 또는 동물 혈액 샘플로부터 유래된 혈액 배양물에 있어서 다수의 유형의 박테리아 또는 바이러스의 존재의 시험에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 발효 산물, 예를 들어 와인, 맥주 및 기타 알코올에 있어서 바람직하거나 바람직하지 못한 효모 균주, 또는 그의 특정한 특성의 존재를 확증 또는 확인하거나 그의 부재를 확인하는 데에도 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 예를 들어 범죄학, 법의학, 모계 또는 부계 시험, 고고학적 분석 등에 있어서의 사용에 있어서의 미공지 서열의 DNA와 공지된 기원 또는 서열의 DNA의 관련성을 확증 또는 확인하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 밀, 보리, 옥수수, 담배, 알팔파, 사과, 살구, 바나나, 오렌지, 배, 승도 복숭아, 무화과, 대추야자, 건포도, 서양자두, 복숭아, 살구, 블루베리, 딸기, 크랜베리, 베리, 체리, 키위, 라임, 레몬, 메론, 파인애플, 플랜태인(plantain), 구아바, 말린 자두, 시계풀 열매, 탕헤르 오렌지, 그레이프 프룻, 포도, 수박, 칸타루프, 감로메론, 석류, 감, 견과, 아티초크, 콩나물, 사탕무, 카르둔, 차이오트, 꽃상추, 부추, 오크라, 골파, 봄양파, 샬롯, 파스닙, 고구마, 참마, 아스파라거스, 아보카도, 구경양배추, 순무, 가지, 호박, 순무뿌리, 호박, 토마토, 감자, 오이, 당근, 양배추, 셀러리, 브로콜라이, 컬리플라워, 무, 후추, 시금치, 버섯, 서양 호박, 양파, 완두콩, 콩 및 기타 콩류를 포함하며 이에 한정되지 않는, 열매를 생산하는 식물, 나무 및 관목 및 야채 및 기타 농작물을 비롯한 식물, 나무 및 관목, 그리고 하이브리드 식물, 나무 및 관목의 유전자형을 결정하는 데 이용할 수 있다.
특히, 본 발명의 방법은 많은 다른 목적 유전자좌를 포함하는 핵산 샘플들의 혼합물 및/또는 목적 유전자좌에 대해 분석될 다른 공급원들로부터의 핵산 샘플들의 혼합물을 스크리닝하는 데 유용하다. 대규모 스크리닝의 예는 농장 동물 무리, 또는 예를 들어 옥수수 또는 밀과 같은 식용 식물의 농작물로부터 핵산 샘플을 취하고, 이를 모으고, 이어서 나중에 원치않는 유전적 마커의 존재에 대해 모아진 샘플을 분석하는 것을 포함하며, 이때 모아진 샘플이 그러한 원치않는 유전적 서열의 존재를 나타내면 개개의 샘플만을 나중에 분석한다. 원치않는 유전적 서열의 예는농장 동물로부터 취한 핵산 샘플내에서 바이러스 또는 박테리아성 핵산 서열의 검출일 것이며, 그 예는 마이코박테리아 또는 수족구병 바이러스 서열 또는 식물의 진균 또는 박테리아 병원균이다.
핵산 풀(pool)을 이용할 수 있는 다른 예는 살았거나 죽은 동물 또는 사람 대상, 특히 병원균 또는 돌연변이가 검출되면 치료를 필요로 할 수 있는 대상으로부터의 하나 이상의 조직에서 얻은 샘플들에서 병원균 또는 유전자 돌연변이의 존재를 시험하는 것이다. 예를 들어, 병원균 또는 그렇지 않으면 원치않는 유전자 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝할 동물 또는 사람 대상으로부터 많은 샘플을 취할 수 있으며, 각 생물 샘플로부터 목적 유전자좌를 개별적으로 증폭시키고, 이어서 증폭된 DNA 샘플을 제한 효소 절단, "필 인" 및 검출을 위해 합할 수 있다. 이것은 병원균 또는 돌연변이의 존재를 진단할, 핵산 서열의 존재 또는 부재의 분석을 위한 초기 스크리닝으로 유용할 것이다. 이어서, 만일 병원균 또는 돌연변이의 원치 않는 핵산 서열이 검출되면, 개별 샘플을 별도로 분석하여 원치않는 서열의 분포를 결정할 수 있다. 그러한 분석은 특히 분석될 샘플의 수가 많을 때 비용면에서 효과적이다. 병원균의 샘플은 마이코박테리아, 특히 결핵 또는 파라결핵을 야기하는 것들, 박테리아, 특히 바실러스 안트라시스를 비롯한 생물학전에서 사용되는 박테리아 병원균, 및 식중독을 야기할 수 있는 전염성 박테리아, 바이러스, 특히 인플루엔자 및 AIDS 바이러스, 및 악성 세포와 관련된 것으로 알려진 돌연변이를 포함한다. 그러한 분석은 또한 병원성 박테리아에 대한 음식물의 대규모 스크리닝에 유익할 것이다.
역으로, 합쳐진 샘플을 스크리닝하고, 이어서 필요에 따라 개별 샘플을 스크리닝함으로써, 식물, 동물 또는 사람 대상에서, 또는 대상의 집단에서 다양한 위치에서의 원하는 유전자 서열의 존재 및 분포를 검출하는 데에 본 발명의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은 약물 대사, 약물 상호작용, 및 약물에 대한 또는 다수 약물에 대한 반응성에 영향을 미치는 개체의 유전적 변이를 분석하는 데에 유용하다. 본 발명의 방법은 특히 약리게놈학에 유용하다.
이제 본 발명을 일반적으로 설명하였으므로, 단지 예시의 목적으로만 여기에 포함되며 달리 특정되지 않으면 제한의 의도가 아닌 구체적 예들을 참고함으로써 본 발명을 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다.
하기 실시예는 단지 예시적인 것이며 청구의 범위에 의해 정의된 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
DNA 서열을 PCR에 의해 증폭시켰으며, 이때 사이클 1에서 어닐링 단계를 특정 온도에서 실시하고, 이어서 사이클 2에서 증폭시키고, 이어서 비특이적인 증폭을 감소시키기 위하여 사이클 3에서 더욱 증폭시켰다. PCR의 사이클 1의 TM1은 제2 프라이머의, 주형 DNA에 어닐링하는 3' 영역의 용융 온도를 계산하여 결정하였다. 예를 들어, 도 1B에서, TM1은 대략 영역 "c"의 용융 온도일 수 있다. 어닐링 온도를 사이클 2에서, 대략 제1 프라이머의, 주형 DNA에 어닐링하는 3' 영역의 용융 온도인 TM 2로 증가시켰다. 예를 들어, 도 1C에서, 어닐링 온도는 영역 "b"의 용융 온도에 해당한다. 사이클 3에서, 어닐링 온도를 대략 제2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도인 TM3으로 상승시켰다. 예를 들어, 도 1D에서, 어닐링 온도(TM3)는 영역 "c" + 영역 "d"의 용융 온도에 해당한다. 증폭의 나머지 사이클은 TM3에서 실시하였다.
주형 DNA의 제조
동의한다는 통지 하에 사람 자원자로부터 정맥천자에 의해 얻어진 5ml 혈액 샘플로부터 주형 DNA를 제조하였다. 36명의 자원자로부터 혈액을 수집하였다. QIAGEN에 의해 공급된 QIAamp DNA 혈액 미디 키트(카탈로그 번호 51183)를 이용하여 각 혈액 샘플로부터 주형 DNA를 분리하였다. 분리 후, 36명의 자원자 각각으로부터의 주형 DNA를 추가 분석을 위하여 모았다.
프라이머의 설계
하기의 네개의 단일 뉴클레오티드 다형성을 분석하였다:
SNP HC21S00340, 인간 염색체 21 cSNP 데이터베이스에 의해 부여된 확인 번호, (도 3, 레인 1) 염색체 21상에 위치;
SNP TSC 0095512(도 3, 레인 2) 염색체 1 상에 위치;
SNP TSC 0214366(도 3, 레인 3) 염색체 1 상에 위치; 및
SNP TSC 0087315(도 3, 레인 4) 염색체 1상에 위치.
SNP Consortium Ltd 데이터베이스는 2002년 2월 14일자로 유효한 웹사이트 주소인 http://snp.cshl.org/에서 접근할 수 있다.
SNP HC21S00340을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' TAGAATAGCACTGAATTCAGGAATACAATCATTGTCAC 3' (서열 번호: 9)
제2 프라이머:
5' ATCACGATAAACGGCCAAACTCAGGTTA 3' (서열 번호: 10)
SNP TSC0095512를 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' AAGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG 3' (서열 번호: 11)
제2 프라이머:
5' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG 3' (서열 번호: 12)
SNP TSC0214366을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' ATGACTAGCTATGAATTCGTTCAAGGTAGAAAATGGAA 3' (서열 번호: 13)
제2 프라이머:
5' GAGAATTAGAACGGCCCAAATCCCACTC 3' (서열 번호: 14)
SNP TSC 0087315를 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' TTACAATGCATGAATTCATCTTGGTCTCTCAAAGTGC 3' (서열 번호: 15)
제2 프라이머:
5' TGGACCATAAACGGCCAAAAACTGTAAG 3' (서열 번호: 16)
모든 프라이머는, 3' 영역이 각 목적 유전자좌에 인접한 상류 서열 또는 하류 서열에 상보적이고 5' 영역이 제한 효소 인식 부위를 포함하도록 설계하였다.
제1 프라이머는 5' 말단에서 바이오틴 태그와 제한 효소 EcoRI을 위한 인식 부위를 포함하였다. 제2 프라이머는 제한 효소 BceA I를 위한 인식 부위를 포함하였다.
PCR 반응
PCR(미국 특허 제 4,683,195호 및 4,683,202호)을 이용하여 모든 네 개의 목적 유전자좌를 주형 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. PCR 반응의 성분은 다음과 같다: 40ng의 주형 DNA, 5μM의 제1 프라이머, 5μM의 제2 프라이머, 퀴아젠에서 구입한 1X HotStarTaq 마스터 믹스(Master Mix)(카탈로그 번호 203443). HotStarTaq 마스터 믹스는 DNA 폴리머라제, PCR 완충액, 200μM의 각 dNTP, 및 1.5mM MgCl2를 포함하였다.
목적 SNP를 포함한 각 주형 DNA의 증폭은, 여기서 낮은 엄격도 어닐링 온도, 중간 엄격도 어닐링 온도, 및 높은 엄격도 어닐링 온도로 불리는, 세 가지의 다른 어닐링 온도 시리즈를 이용하여 실시하였다. 어닐링 온도 프로토콜에 상관없이, 각 PCR 반응은 40 사이클의 증폭으로 이루어졌다. PCR 반응은 퀴아젠에서 구입한 1X HotStarTaq 마스터 믹스를 이용하여 실시하였다. 제조자에 의해 지시되는 바와 같이, 반응물을 첫번째 PCR 사이클에 앞서 15분간 95℃에서 항온처리하였다. 각 연장 단계 후의 변성 단계는 30초동안 95℃에서 실시하였다. 어닐링 반응은 어떤온도 증가도 없이 효율적인 연장을 허용하는 온도에서 실시하였다.
낮은 엄격도 어닐링 반응은 처음 세 사이클의 각각에서 세 가지의 다른 어닐링 온도를 포함하였다. 첫번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 37℃였으며; 두번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 57℃였으며; 세번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 64℃였다. 어닐링은 완결때까지 후속 사이클에서는 64℃에서 실시하였다.
겔의 사진에서 나타난 것처럼(도 3A), SNP TSC 0087315를 포함한 DNA 주형의 증폭후에는 다수의 밴드가 관찰되었다(레인 4). SNP HC21S00340(레인 1), SNP TSC 0095512(레인 2), 및 SNP TSC 0214366(레인 3)을 포함한 DNA 주형들의 증폭은 높은 강도의 단일 밴드와 보다 높은 분자량의 희미한 강도의 하나의 밴드를 생성하였다. 낮은 어닐링 온도 조건을 사용한 경우, 정확한 크기의 생성물이 얻어졌으며, 이것이 각 반응에서 주요 생성물이었다.
중간 엄격도 어닐링 반응은 처음 세 사이클의 각각에서 세 가지의 다른 어닐링 온도를 포함하였다. 첫번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 40℃였으며; 두번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 60℃였으며; 세번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 67℃였다. 어닐링은 완결때까지 후속 사이클에서는 64℃에서 실시하였다. 낮은 엄격도 어닐링 조건하에서 관찰된 것과 유사하게, SNP TSC0087315를 포함한 DNA 주형의 증폭(도 3B, 레인 4)은 중간 엄격도의 조건하에서 다수의 밴드를 생성하였다. SNP를 포함한 다른 세 개의 DNA 단편의 증폭(레인 1-3)은 단일 밴드를 생성하였다. 이들 결과는 다양한 어닐링 온도를 이용하여 13 염기의 어닐링 길이를 가진 프라이머를 이용하여 게놈 DNA로부터의 목적 유전자좌를 명확하게 증폭시킬 수 있음을 입증한다.
높은 엄격도 어닐링 반응은 첫번째 세 사이클의 각각에서 세 개의 다른 어닐링 온도로 구성되었다. 첫번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 46℃였으며; 두번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 65℃였으며; 세번째 사이클의 어닐링 온도는 30초동안 72℃였다. 어닐링은 완결때까지 후속 사이클에서는 72℃에서 실시하였다. 젤의 사진에서 나타나는 것처럼(도 3C), 높은 엄격도 어닐링 온도를 이용한 SNP TSC0087315 포함 DNA 주형의 증폭(레인 4)은 정확한 분자량의 단일 밴드를 생성하였다. 첫번째 세 사이클의 각각을 위한 어닐링 온도를 상승시킴으로써, 비특이적인 증폭을 제거하였다.
SNP TSC0095512를 포함하는 DNA 단편의 증폭 (레인 2)에 의해 단일 밴드가 생성되었다. SNP HC21S00340 (레인 1), 및 TSC0214366 (레인 3)을 포함하는 DNA 단편은 높은 엄격도의 어닐링 온도에서 증폭되지 않았지만 중간 정도의 엄격도의 어닐링 온도에서는 상기 SNP 포함 DNA 단편은 단일 밴드로 증폭되었다. 이러한 결과는 SNP TSC0087315를 포함하는 DNA 단편에 있어서 입증된 바와 같이 가변적인 어닐링 온도를 사용하여 비특이적 PCR 생성물을 감소시킬 수 있음을 입증한다 (도 3, 레인 4).
실시예 2
염색체 1 (TSC0095512), 13 (TSC0264580), 및 21 (HC21S00027) 상의 SNP를 분석하였다. 두가지 상이한 프라이머 세트를 사용하여 SNPTSC0095512를 분석하고두가지 유형의 뉴클레오티드 혼입 반응을 사용하여 SNP HC21S00027을 분석하였다.
주형 DNA의 제조
동의한다는 통지 하에 정맥 천자에 의해 인간 지원자로부터 수득한 5 ml의 혈액 샘플로부터 주형 DNA를 제조하였다. QIAGEN에 의해 공급되는 QIAmp DNA Blood Midi Kit (카탈로그 번호: 51183)를 사용하여 주형 DNA를 단리하였다. 주형 DNA를 상기 키트에 포함된 지시에 따라 단리하였다. 단리 후 36명의 인간 지원자로부터 유래된 주형 DNA를 함께 풀링하고 제한 효소 EcoRI으로 절단하였다. 제한 효소 절단은 제조자의 지시에 따라 수행하였다.
프라이머의 설계
SNPHC21 S00027을 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' ATAACCGTATGCGAATTCTATAATTTTCCTGATAAAGG 3' (서열 번호: 17)
제2 프라이머:
5' CTTAAATCAGGGGACTAGGTAAACTTCA 3' (서열 번호: 18)
제1 프라이머는 5'의 가장 말단에 바이오틴 태그, 및 제한 효소 EcoRI을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 프라이머는 제한 효소 BsmF I을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (도 4A).
또한 SNP HC21S00027은 동일한 제1 프라이머 및 하기 서열을 가지는 상이한 제2 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다:
제2 프라이머:
5' CTTAAATCAGACGGCTAGGTAAACTTCA 3' (서열 번호: 19)
상기 제2 프라이머는 제한 효소 BceA I을 위한 인식 부위를 포함한다 (도 4B).
SNP TSC0095512를 하기 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' AAGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG 3' (서열 번호: 11)
제2 프라이머:
5' TCTCCAACTAGGGACTCATCGAGTAAAG 3' (서열 번호: 20)
제1 프라이머는 5' 말단에서 바이오틴 태그를 가지며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제2 프라이머는 BsmF I의 제한 효소 인식 부위를 포함한다 (도 4C).
또한 SNP TSC0095512를 동일한 제1 프라이머 및 하기 서열을 가지는 상이한 제2 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제2 프라이머:
5' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG 3' (서열 번호: 12)
상기 제2 프라이머는 제한 효소 BceA I의 인식 부위를 포함한다 (도 4D).
염색체 13에 위치하는 SNP TSC0264580을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' AACGCCGGGCGAGAATTCAGTTTTTCAACTTGCAAGG 3' (서열 번호: 21)
제2 프라이머:
5' CTACACATATCTGGGACGTTGGCCATCC 3' (서열 번호: 22)
제1 프라이머는 5'의 가장 말단에 바이오틴 태그를 포함하며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 가진다. 제2 프라이머는 BsmF I의 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
PCR 반응
모든 목적 유전자좌를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR, 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제4,683,195호 및 동 제4,683, 202호)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 본 실시예에 있어서, 목적 유전자좌는 개별적인 반응 튜브에서 증폭시키지만 단일 PCR 반응에서 함께 증폭시킬 수도 있다. 특이성 증가를 위하여 "고온-시작 (hot-start)" PCR을 사용하였다. QIAGEN에 의해 공급되는 HotStarTaq Master Mix Kit (카탈로그 번호: 203443)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 반응 당 주형 DNA 및 프라이머의 양은 각각의 목적 유전자좌에 있어서 최적화할 수 있지만, 본 실시예에 있어서 40 ng의 주형 인간 게놈 DNA 및 5 μM의 각각의 프라이머를 사용하였다. 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 하기의 PCR 조건을 사용하였다:
(1)95℃에서 15분 15초;
(2)37℃에서 30초;
(3)95℃에서 30초;
(4)57℃에서 30초;
(5)95℃에서 30초;
(6)64℃에서 30초;
(7)95℃에서 30초;
(8) 단계 6 및 7을 삼십구 (39)회 반복;
(9)72℃에서 5분.
첫번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 37℃인 대략 제2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도였다. 두번째 PCR 사이클에서의 어닐링 온도는 57℃인 대략 주형 DNA에 어닐링되는 제1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도였다. 세번째 PCR 사이클의 어닐링 온도는 64℃인 대략 제2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도였다. 나머지 사이클을 위한 어닐링 온도는 64℃였다. PCR의 첫번째 세 사이클에서 TM1에서 TM2로 TM3로 어닐링 온도를 상승시키는 것은 특이성을 크게 개선한다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것이며, 당업자는 각 사이클을 위한 어닐링 온도가 이용되는 특정 프라이머에 의존함을 이해할 것이다.
변성, 어닐링, 및 연장을 위한 온도 및 시간은, 다양한 세팅을 시도해보고 최상의 결과를 낳는 파라미터를 이용함으로써 최적화될 수 있다. SNP HC21S00027과 SNP TSC095512를 위한 PCR 생성물의 도식이 도 5A-5D에 나타난다.
목적 유전자좌를 포함한 단편의 정제
PCR 생성물을 게놈 주형 DNA로부터 분리하였다. 각 PCR 생성물을 로쉐 다이아그노스틱 게엠베하(Roche Diagnostic GmbH)로부터의 스트렙타웰, 투명, 고결합 플레이트(카탈로그 번호 1 645 692, Roche Molecular Biochemicals, 2001Biochemicals Catalog에 열거됨)의 네 개의 별도의 반응 웰들로 나누었다. 제1 프라이머는 5' 바이오틴 태그를 포함하여 PCR 생성물은 스트렙타비딘 코팅된 웰에 결합하는 한편 게놈 주형 DNA는 그렇지 않았다. 스트렙타비딘 결합 반응은 37℃에서 20분동안 1000 rpm에서 써모믹서(에펜돌프)를 이용하여 실시하였다. 각 웰을 흡인하여 미결합 물질을 제거하고, 온화하게 혼합하면서 1X PBS로 세번씩 세척하였다(Kandpal et al., Nucl.Acids Res. 18:1789-1795(1990); Kaneoka et al., Biotechniques 10:30-34(1991);Green et al., Nucl.Acids Res.18:6163-6164(1990)).
목적 유전자좌를 포함한 분리된 단편의 제한 효소 절단
정제된 PCR 생성물을 제2 프라이머로부터 PCR 생성물내로 혼입된 인식 부위에 결합한 제한 효소로 절단하였다. SNP HC21S00027(도 6A와 6B) 및 SNP TSC0095512(도 6C와 6D)를 포함한 DNA 주형을 두 개의 다른 제2 프라이머를 이용하여 별도의 반응으로 증폭시켰다. 도 6A(SNP HC21S00027)와 도 6C(SNP TSC0095512)는 제한 효소 BsmF I(New England Biolabs 카탈로그 번호 R0572S)로 절단 후 PCR 생성물을 보여준다. 도 6B(SNP HC21S00027)와 도 6D(SNP TSC0095512)는 제한 효소 BceA I(New England Biolabs 카탈로그 번호 R0623S)로 절단 후 PCR 생성물을 보여준다. 절단은 제한 효소와 함께 공급된 설명서에 따라 스트렙타웰에서 실시하였다. SNP TSC0264580을 포함한 DNA 단편을 BsmF I로 절단하였다. 적절한 제한 효소로 절단 후, 웰을 PBS로 세번 세척하여 절단된 단편들을 제거하였다.
표지된 뉴클레오티드의 혼입
전술한 제한 효소 절단은 SNP 부위 또는 목적 유전자좌를 포함한 5' 오버행과 3' 리세싱된 말단을 가진 DNA 단편을 생성하였다. 5' 오버행은 주형으로 작용하여 DNA 폴리머라제 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들이 혼입되도록 하였다.
각 SNP를 위하여, 네 개의 별도의 필 인 반응을 실시하였다; 네 반응의 각각은 상이한 형광성 표지 ddNTP(ddATP, ddTTP, ddGTP, 또는 ddCTP)를 포함하였다. 다음 성분들을 각 필 인 반응에 첨가하였다: 1㎕의 형광성 표지 ddNTP, 0.5㎕의 미표지된 ddNTP(40μM)(형광성 표지 뉴클레오티드를 제외한 모든 뉴클레오티드를 포함함), 2㎕의 10X 시쿼나제 완충액, 0.25㎕의 시쿼나제, 및 20㎕ 반응물을 위해 필요한 만큼의 물. 모든 필 인 반응을 40℃에서 10분간 실시하였다. 비형광성 표지 ddNTP를 퍼멘타스 인크(Fermentas Inc.)(Hanover, MD)에서 구입하였다. 모든 다른 표지 시약은 아머샴(Amersham)(Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565)으로부터 구입하였다. 형광성 표지 ddNTP의 존재하에서, 3' 리세싱된 말단을 1 염기만큼 연장시켰으며, 이 염기는 SNP 또는 목적 유전자좌에 해당한다(도 7A-7D).
표지된 ddNTP와 미표지된 dNTP의 혼합물을 또한 SNP HC21S00027을 위한 "필 인" 반응을 위해 이용하였다. "필 인" 조건은 40 μM 미표지된 dNTPs, 1㎕의 형광성 표지 ddATP, 1㎕의 형광성 표지 ddTTP, 1㎕의 형광성 표지 ddCTP, 및 1㎕의 ddGTP를 포함한 혼합물을 이용한 것을 제외하고는 전술한 대로였다. 형광 ddNTP는 아머샴(Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565;아머샴은 형광 뉴클레오티드의 농도를 공개하지 않았음)으로부터 구입하였다. SNP HC21S00027을 포함한 DNA 단편을 제한 효소 BsmF I로 절단하였으며, 이는 4 염기의 5' 오버행을 생성하였다. 도 7E에서 나타난 대로, 만일 혼입된 첫번째 뉴클레오티드가 표지된 ddNTP이면, 3' 리세싱된 말단은 1 염기만큼 필 인되며 SNP 또는 목적 유전자좌가 검출되도록 한다. 그러나, 만일 혼입된 첫번째 뉴클레오티드가 dNTP이면, 폴리머라제는 ddNTP가 필 인될 때까지 계속 뉴클레오티드를 혼입한다. 예를 들어, 처음 두 뉴클레오티드는 dNTP로 필 인되고 세번째 뉴클레오티드는 ddNTP로 채워져 오버행에서 세번째 뉴클레오티드가 검출되도록 할 수도 있다. 따라서, 전체 5' 오버행의 서열이 결정될 수 있으며 이는 각 SNP 또는 목적 유전자좌로부터 얻어지는 정보를 증가시킨다.
표지 후, 각 스트렙타웰을 1X PBS(100㎕)로 3회 헹구었다. 이어서 효소와 함께 공급된 제조자의 설명서에 따라 제한 효소 EcoRI으로 절단하여, "필 인된" DNA 단편을 스트렙타웰로부터 방출시켰다(도 8A-8D). 절단은 120rpm으로 흔들면서 37℃에서 1시간동안 실시하였다.
목적 유전자좌의 검출
스트렙타비딘 매트릭스로부터 방출 후, 10㎕ 샘플의 2-3㎕ 를 48웰 멤브레인 트레이에 로딩하였다(The Gel Company, 카탈로그 번호 TAM48-01). 트레이내의 샘플을 48 플로우 멤브레인 콤(The Gel Company, 카탈로그 번호 AM48)으로 흡수시키고, 36cm 5% 아크릴아미드 (우레아)젤(Bio Whittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)내로 삽입시켰다.
샘플을 3분동안 3000볼트에서 겔 내로 전기영동시켰다. 멤브레인 콤을 제거하고, ABI 377 자동화된 서열결정 기계상에서 3시간동안 겔을 진행시켰다. 혼입된 표지된 뉴클레오티드를 형광으로 검출하였다.
도 9A에서 나타난 바대로, 36 개체의 샘플로부터, 두 뉴클레오티드, 아데노신 또는 구아닌 중의 하나가 SNP HC21S00027에서 검출되었다. 이들은 SNP HC21S00027에서 존재하는 것으로 보고된 두 뉴클레오티드였다(www.snp.schl.org/snpsearch.shtml). 두 뉴클레오티드 구아닌 또는 시토신 중의 하나가 SNP TSC0095512에서 검출되었다(도 9B). 목적 유전자좌를 BceA I 을 위한 인식 부위를 포함한 제2 프라이머 또는 BsmF I을 위한 인식 부위를 포함한 제2 프라이머로 증폭시킬 때도 동일한 결과를 얻었다.
도 9C에서 나타난 대로, 두 뉴클레오티드 아데노신 또는 시토신 중의 하나가 SNP TSC0264580에서 검출되었다. 이들은 이 SNP 부위를 위해 보고된 두 뉴클레오티드이다(www.snp.schl.org/snpsearch.shtml). 또한, 티미딘이 목적 유전자좌의 1 염기 상류에서 검출되었다. 서열 의존 방식으로, BsmF I은 10/14 위치에서 일부 DNA 분자를 절단하고 동일한 서열을 갖는 다른 DNA 분자를 11/15 위치에서 절단한다. 제한 효소 BsmF I이 센스 가닥상에서 11 뉴클레오티드 떨어져 그리고 안티센스가닥상에서 15 뉴클레오티드 떨어져 절단할 때, 3' 리세싱된 말단은 SNP 부위의 1 염기 상류이다. SNP TSC0264580의 서열은 SNP 부위를 바로 앞서는 염기가 티미딘임을 나타냈다. 이 위치에 표지된 ddNTP가 혼입되면 10/14 위치에서 절단된 단편보다 1 염기 작은 단편을 생성하였다. 따라서, 11/15 위치에서 절단된 DNA 분자는SNP 부위를 바로 앞서는 염기에 대한 신원 정보를 제공하였으며, 10/14 위치에서 절단된 DNA 분자는 SNP 부위에 대한 신원성 정보를 제공하였다.
SNP HC21S00027은 BsmF I을 위한 인식 부위를 포함한 제2 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 표지된 ddNTP와 미표지된 dNTP의 혼합물을 이용하여 BsmF I을 이용한 절단에 의해 생성된 5' 오버행을 필 인하였다. 만일 dNTP가 혼입되면, 폴리머라제는 ddNTP가 혼입될 때까지 뉴클레오티드를 혼입시켰다. 각각 1 염기가 다른 DNA 단편들의 집단이 생성되었으며, 이는 오버행의 전체 서열이 결정되도록 하였다.
도 9D에서 보는 바와 같이, SNP 또는 목적 유전자좌를 바로 앞서는 뉴클레오티드(티미딘)에 상보적인 아데노신이 검출되었다. 이 뉴클레오티드는 상기에서 상세히 설명한 BsmF I의 11/15 절단 특성때문에 검출되었다. 구아닌과 아데노신이 SNP 부위에서 검출되었으며, 이들은 이 SNP 부위를 위해 보고된 두 뉴클레오티드이다(도 9A). 두 뉴클레오티드는, 염료의 분자량이 상이하여 두 뉴클레오티드의 분리를 허용하였기 대문에 SNP 부위에서 검출되었다. 검출된 다음 뉴클레오티드는 티미딘이었으며, 이는 SNP 부위의 바로 하류의 뉴클레오티드에 상보적이다. 검출된 다음 뉴클레오티드는 구아닌이었으며, 이는 SNP 부위의 2 염기 하류의 뉴클레오티드에 상보적이었다. 마지막으로, 아데노신이 검출되었으며, 이는 SNP 부위의 하류의 세번째 뉴클레오티드에 상보적이었다. 서열 정보는 SNP 부위뿐만 아니라 SNP 부위를 바로 앞서는 뉴클레오티드 및 다음 세 뉴클레오티드에 대해 얻어졌다.
목적 유전자좌의 어느 것도 돌연변이를 포함하지 않았다. 그러나, 목적 유전자좌들 중 하나가 점 돌연변이, 삽입, 결실, 전이, 또는 상기 돌연변이들의 임의 조합을 포함하며 이에 한정되지 않는 돌연변이를 보유하면, 콘센서스 서열 또는 공개된 서열과의 비교에 의해 동정될 수 있다. 목적 유전자좌 각각에 부여된 서열을 각 목적 유전자좌에서의 유전자의 원래의 질환과 관련되지 않은 서열과 비교함으로써 그 서열에서 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정한다. 그 서열에서 돌연변이의 발견은 이어서 표시된 질환의 존재, 또는 적절하다면 그 개인에서 그 질환을 발생시킬 소인의 존재로서 해석된다. 돌연변이된 서열 대 정상 또는 비돌연변이된 서열의 상대적인 양을 평가하여 대상이 돌연변이된 서열의 하나 또는 두 대립유전자를 가졌는지를 결정할 수 있으며, 따라서, 그 대상이 보균자인지 여부, 또는 나타내진 돌연변이가 우성 또는 열성 상태로 될지 여부를 결정할 수 있다.
실시예 3
염색체 1로부터의 네 개의 목적 유전자좌와 염색체 21로부터의 두 개의 목적 유전자좌를 별도의 PCR 반응에서 증폭시키고, 함께 모으고, 분석하였다. 각각의 증폭된 목적 유전자좌가 다른 크기이도록 프라이머를 설계하여 목적 유전자좌의 검출을 가능하게 하였다.
주형 DNA의 제조
통지된 동의 하에 정맥 천자에 의해 인간 지원자로부터 수득한 5 ml의 혈액 샘플로부터 주형 DNA를 제조하였다. QIAGEN에 의해 공급되는 QIAmp DNA Blood Midi Kit (카탈로그 번호: 51183)를 사용하여 주형 DNA를 단리하였다. 주형 DNA를 상기 키트에 포함된 지시에 따라 단리하였다. 주형 DNA를 36명의 인간 지원자로부터 단리하고, 이어서 추가의 분석을 위한 단일 샘플로 풀링하였다.
프라이머의 설계
SNP TSC 0087315를 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' TTACAATGCATGAATTCATCTTGGTCTCTCAAAGTGC 3' (서열 번호: 15)
제2 프라이머:
5' TGGACCATAAACGGCCAAAAACTGTAAG 3' (서열 번호: 16)
SNP TSC0214366을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' ATGACTAGCTATGAATTCGTTCAAGGTAGAAAATGGAA 3' (서열 번호: 13)
제2 프라이머:
5' GAGAATTAGAACGGCCCAAATCCCACTC 3' (서열 번호: 14)
SNP TSC 0413944를 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' TACCTTTTGATCGAATTCAAGGCCAAAAATATTAAGTT 3' (서열 번호: 23)
제2 프라이머:
5' TCGAACTTTAACGGCCTTAGAGTAGAGA 3' (서열 번호: 24)
SNP TSC0095512를 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' AAGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG 3' (서열 번호:11)
제2 프라이머:
5' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG 3' (서열 번호: 12)
SNP HC21S00131을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' CGATTTCGATAAGAATTCAAAAGCAGTTCTTAGTTCAG 3' (서열 번호: 25)
제2 프라이머:
5' TGCGAATCTTACGGCTGCATCACATTCA 3' (서열 번호: 26)
SNP HC21S00027을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' ATAACCGTATGCGAATTCTATAATTTTCCTGATAAAGG 3' (서열 번호: 17)
제2 프라이머:
5' CTTAAATCAGACGGCTAGGTAAACTTCA 3' (서열 번호: 19)
각각의 SNP에 있어서, 제1 프라이머는 제한 효소 EcoRI의 인식 부위를 포함하며 5'의 가장 말단에 바이오틴 태그를 가진다. 각각의 SNP의 증폭에 사용되는 제2 프라이머는 제한 효소 BceAI의 인식 부위를 포함한다.
PCR 반응
PCR 반응을 하기의 어닐링 온도를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2에 기술한 바와 같이 수행하였다: 첫번째 PCR 사이클의 어닐링 온도는 37℃에서 30초 동안이었으며, 두번째 PCR 사이클의 어닐링 온도는 57℃에서 30초 동안이었으며 세번째 PCR 사이클의 어닐링 온도는 64℃에서 30초 동안이었다. 모든 후속 사이클의 어닐링 온도는 64℃에서 30초 동안이었다. 삼십칠 (37)회의 PCR 사이클을 수행하였다. PCR 후 1/4의 부피를 각각의 반응물로부터 옮기고 단일 튜브로 합하였다.
목적 유전자좌를 포함하는 단편의 정제
PCR 생성물 (이제 하나의 샘플로 합하며, "샘플"로 칭해짐)을, 샘플을 Streptawell 마이크로타이터 플레이트의 단일 웰에 결합시킨 것을 제외하고는 실시예 2에 기술한 바와 같이 게놈 주형 DNA로부터 분리하였다.
목적 유전자좌를 포함하는 단리한 단편의 제한 효소 절단
샘플을 제2 프라이머의 인식 부위에 결합되는 제한 효소 BceAI으로 절단하였다. 제한 효소 절단은 효소를 이용하여 공급되는 지시에 따라 수행하였다. 제한 효소 절단 후 웰을 1X PBS로 3회 세척하였다.
뉴클레오티드의 혼입
상기한 제한 효소 절단에 의해 SNP 부위 또는 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행 및 3' 리세싱된 말단을 가지는 DNA 분자를 생성하였다. 5' 오버행은 주형으로 기능하여 DNA 폴리머라제의 존재 하에 뉴클레오티드가 혼입되게 한다.
하기 성분을 필 인 반응에 사용하였다: 1 ㎕의 형광성 표지 ddATP; 1 ㎕의 형광성 표지 ddTTP; 1 ㎕의 형광성 표지 ddGTP; 1 ㎕의 형광성 표지 ddCTP; 2 ㎕의 10X 시쿼나제 완충제, 0.25 ㎕의 시쿼나제, 및 20 ㎕의 반응에 필요한 물. 필 인 반응을 40℃에서 10분 동안 수행하였다. 모든 표지 시약은 Amersham (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit (US 79565); 키트에 제공된 ddNTP의 농도는 특허권이 있는 것이며 Amersham이 공개하지 않음)으로부터 획득하였다. 형광성 표지 ddNTP의 존재 하에 3' 리세싱된 말단을 SNP 또는 목적 유전자좌에 상응하는 하나의 염기로 필 인시켰다.
뉴클레오티드의 혼입 후 Streptawell을 1X PBS (100 ㎕)로 3회 헹구었다. 이어서 "필 인" DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 제한 효소 EcoRI으로 절단하여 Streptawell로부터 방출시켰다. 절단은 120 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 수행하였다.
목적 유전자좌의 탐지
스트렙타비딘 매트릭스로부터의 방출 후 10 ㎕의 샘플 중 2-3 ㎕를 48웰 막 트레이에 로딩하였다 (The Gel Company, 카탈로그 번호: TAM48-01). 트레이의 샘플을 48 Flow Membrane Comb (The Gel Company, 카탈로그 번호: AM48)에 흡수시키고, 36 cm의 5% 아크릴아미드 (우레아) 겔 (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호: 50691) 내로 삽입하였다.
샘플을 3000 볼트에서 3분 동안 겔 내로 전기 영동시켰다. 상기 막 콤 (comb)을 제거하고, 겔을 ABI 377 자동화 서열 결정 기계 상에서 3시간 동안 진행시켰다. 혼입된 뉴클레오티드를 형광성으로 탐지하였다.
프라이머는 각각의 증폭된 목적 유전자좌가 크기 면에서 다르도록 설계하였다. 도 10에 도시된 바와 같이 각각의 증폭된 목적 유전자좌는 약 5-10 뉴클레오티드가 달랐는데, 이에 의해 목적 유전자좌는 겔 전기 영동으로 서로 분리된다. 2개의 뉴클레오티드를 SNP TCS0087315에 있어서 탐지하였는데 이들은 구아닌 및 시토신이다. 이들은 SNP TCS0087315에서 존재하는 것으로 보고되어 있다(www.snp.schl.org/snpsearch.shtml). 샘플은 36명의 개체로부터 유래된 주형 DNA를 포함하며, 구아닌이 혼입된 DNA 분자는 시토신이 혼입된 DNA 분자와는 분자량 면에서 다르기 때문에 독특한 밴드가 각각의 뉴클레오티드에 있어서 보여졌다.
2개의 뉴클레오티드가 SNP HC21S00027에서 탐지되었는데 이들은 구아닌 및 아데노신이었다 (도 10). 상기 SNP에서 보고된 2개의 뉴클레오티드는 구아닌 및 아데노신이다 (www.snp.schl.org/snpsearch.shtml). 상기에서 논의된 바와 같이 샘플은 36명의 개체로부터 유래된 주형 DNA를 포함하며 뉴클레오티드 둘 모두가 샘플에서 나타날 것으로 기대된다. 구아닌이 혼입된 DNA 단편의 분자량은 아데노신이 혼입된 DNA 단편과는 다른데 이에 의해 뉴클레오티드 둘 모두가 탐지되게 된다.
시토신 뉴클레오티드를 SNP TSC0214366에서 탐지하였다 (도 10). 상기 SNP 위치에서 존재하는 것으로 보고된 2개의 뉴클레오티드는 티미딘 및 시토신이다.
구아닌 뉴클레오티드를 SNP TSC0413944에서 탐지하였다 (도 10). 상기 SNP에서 보고된 2개의 뉴클레오티드는 구아닌 및 시토신이다 (http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml).
시토신 뉴클레오티드를 SNP TSC0095512에서 탐지하였다 (도 10). 상기 SNP 부위에서 보고된 2개의 뉴클레오티드는 구아닌 및 시토신이다 (www.snp.schl.org/snpsearch.shtml).
SNP HC21S00131에서 검출된 뉴클레오티드는 구아닌이었다. 상기 SNP 부위에서 보고된 2개의 뉴클레오티드는 구아닌 및 아데노신이다 (www.snp.schl.org/snpsearch.shtml).
상기에서 논의된 바와 같이 샘플은 36명의 개체로부터 유래된 DNA 주형으로 이루어지며 SNP 부위에서 두 뉴클레오티드 모두가 나타날 것으로 기대된다. SNP TSC0413944, TSC0095512, TSC0214366 및 HC21500131에 있어서 2개의 뉴클레오티드 중 하나가 탐지되었다. 상기 SNP 부위에 있어서 보고된 두 뉴클레오티드가 샘플에 존재할 것 같지만 하나의 형광성 염료가 다른 것을 압도한다. 하나의 뉴클레오티드가 혼입된 DNA 분자의 분자량은 다른 뉴클레오티드가 혼입된 DNA 분자가 효율적으로 분리되게 하지 않는다. 그러나 SNP는 서로 손쉽게 분리되었으며 각각의 SNP에 있어서 적절한 뉴클레오티드를 혼입시켰다. 다수의 염색체로부터 유래된, PCR 후 단일 샘플로 처리되는 다수의 목적 유전자좌의 서열을 결정하였다.
형광성 표지된 ddNTP를 포함하는 단일 반응을 다수의 목적 유전자좌를 포함하는 샘플을 이용하여 수행하였다. 대안적으로는, 각각의 반응물이 형광성으로 표지된 하나의 뉴클레오티드 (ddATP, ddTTP, ddGTP, 또는 ddCTP) 및 미표지 ddNTP를 포함하는 4가지의 개별적인 필 인 반응을 수행하였다 (실시예 2, 도 7A-7D 및 도 9A-C 참조). 4가지의 개별적인 "필 인" 반응에 의해 목적 유전자좌에 존재하는 임의의 뉴클레오티드를 탐지한다. 예를 들어 단일 개체로부터 유래된 다수의 목적 유전자좌를 포함하는 샘플을 분석할 경우, 그리고 상기 개체가 하나 이상의 목적 유전자좌에서 이종성일 경우, 4가지의 개별적인 "필 인" 반응을 사용하여 이종성의 목적 유전자좌의 뉴클레오티드를 결정할 수 있다.
또한 다수의 개체로부터 유래된 주형을 포함하는 샘플을 분석할 경우 4가지의 개별적인 "필 인" 반응에 의해 뉴클레오티드가 목적 유전자좌에서 얼마나 빈번하게 발견되는지와는 상관 없이 샘플에 존재하는 뉴클레오티드를 탐지한다. 에를 들어 샘플이 50명의 개체로부터 유래된 DNA 주형을 포함하며 개체 중 49명이 목적 유전자좌에서 티미딘을 가지며 한명의 개체가 구아닌을 가질 경우 4가지의 개별적인 "필 인" 반응의 수행에 의해 구아닌을 탐지하게 되는데, 여기서 각각의 "필 인" 반응물은 도 9A-9C에서와 같이 겔의 개별적인 레인에서 진행된다. 다수의 DNA 주형으로 이루어진 샘플을 분석할 경우 다수의 "필 인" 반응은 질량 차이에 의해 단일 목적 부위에서 다수의 뉴클레오티드를 구별해야 하는 필요성을 경감시킨다.
본 실시예에 있어서 다수의 단일 뉴클레오티드 다형성을 분석하였다. 또한 다수의 목적 유전자좌로부터의 점 돌연변이, 염기 전위, 염기 변환, 전좌, 삽입 및 결실을 포함하는 돌연변이의 존재또는 부재를 결정할 수 있다. 다수의 목적 유전자좌는 단일 유전자 또는 다수의 유전자로부터 유래될 수 있다.
질환 표현형을 야기하거나 질환 표현형에 걸리기 쉬운 다수의 목적 유전자좌의 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어 암 또는 기타 다른 질환에 연루된 하나 내지 수십개 내지 수백개 내지 수천개의 유전자를 증폭시킬 수 있다. 프라이머는 각각의 증폭된 목적 유전자좌가 크기 면에서 다르도록 설계할 수 있다. PCR 후 증폭된 목적 유전자좌를 합하고 단일 샘플로 취급할 수 있다. 대안적으로는 다수의 목적 유전자좌를 하나의 PCR 반응에서 증폭시킬 수 있거나 총 갯수의 목적 유전자좌, 예를 들어 100개의 유전자좌를 샘플로, 예를 들어 PCR 반응 당 10개의 목적 유전자좌로 나눌 수 있으며 이어서 나중에 풀링할 수 있다. 본 발명에서 입증된 바와 같이 다수의 목적 유전자좌의 서열을 결정할 수 있다. 이와 같이 하나의 반응에서 질환 표현형의 소인이 되거나 질환 표현형을 야기하는 하나 내지 수십개 내지 수백개 내지 수천개의 유전자의 서열을 결정할 수 있다.
실시예 4
동의한다는 통지를 수득한 하에 4명의 개인으로부터 게놈 DNA를 수득하였다. 염색체 13 상의 6개의 SNP (TSC0837969, TSC0034767, TSC1130902, TSC0597888, TSC0195492, TSC0607185)를 주형 DNA를 사용하여 분석하였다. 이러한 SNP와 관련한 정보는 하기 웹사이트에서 찾을 수 있다 (2003년 2월 11자의 유효 웹사이트인 www.snp.schl.org/snpsearch.shtml).
하나의 형광성 염료로 표지된 단일 뉴클레오티드를 사용하여 6개의 선택된 SNP 부위에서 개인의 유전자형을 분석하였다. 프라이머는 6개의 SNP가 단일 반응에서 분석되도록 설계하였다.
주형 DNA의 제조
동의한다는 통지 하에 정맥 천자에 의해 인간 지원자로부터 수득한 9 ml의 혈액 샘플로부터 주형 DNA를 제조하였다. QIAGEN에 의해 공급되는 QIAmp DNA Blood Midi Kit (카탈로그 번호: 51183)를 사용하여 주형 DNA를 단리하였다. 주형 DNA를 상기 키트에 포함된 지시에 따라 단리하였다.
프라이머의 설계
SNP TSC0837969를 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' GGGCTAGTCTCCGAATTCCACCTATCCTACCAAATGTC 3'
제2 프라이머:
5' TAGCTGTAGTTAGGGACTGTTCTGAGCAC 3'
제1 프라이머는 5' 말단에 바이오틴 태그를 가지며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 44 염기에 어닐링하도록 설계하였다. 제2 프라이머는 BsmFI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC0034767를 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' CGAATGCAAGGCGAATTCGTTAGTAATAACACAGTGCA 3'
제2 프라이머:
5' AAGACTGGATCCGGGACCATGTAGAATAC 3'
제1 프라이머는 5' 말단에 바이오틴 태그를 가지며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 50 염기에 어닐링하도록 설계하였다. 제2 프라이머는 BsmFI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC1130902를 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' TCTAACCATTGCGAATTCAGGGCAAGGGGGGTGAGATC 3'
제2 프라이머:
5' TGACTTGGATCCGGGACAACGACTCATCC 3'
제1 프라이머는 5' 말단에 바이오틴 태그를 가지며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 60 염기에 어닐링하도록설계하였다. 제2 프라이머는 BsmFI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC0597888을 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' ACCCAGGCGCCAGAATTCTTTAGATAAAGCTGAAGGGA 3'
제2 프라이머:
5' GTTACGGGATCCGGGACTCCATATTGATC 3'
제1 프라이머는 5' 말단에 바이오틴 태그를 가지며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 70 염기에 어닐링하도록 설계하였다. 제2 프라이머는 BsmFI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC0195492를 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' CGTTGGCTTGAGGAATTCGACCAAAAGAGCCAAGAGAA
제2 프라이머:
5' AAAAAGGGATCCGGGACCTTGACTAGGAC 3'
제1 프라이머는 5' 말단에 바이오틴 태그를 가지며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 80 염기에 어닐링하도록 설계하였다. 제2 프라이머는 BsmFI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC0607185를 하기 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다:
제1 프라이머:
5' ACTTGATTCCGTGAATTCGTTATCAATAAATCTTACAT 3'
제2 프라이머:
5' CAAGTTGGATCCGGGACCCAGGGCTAACC 3'
제1 프라이머는 5' 말단에 바이오틴 태그를 가지며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 90 염기에 어닐링하도록 설계하였다. 제2 프라이머는 BsmFI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
모든 목적 유전자좌를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR, 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제4,683,195호 및 동 제4,683, 202호)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 본 실시예에 있어서, 목적 유전자좌는 개별적인 반응 튜브에서 증폭시키지만 단일 PCR 반응에서 함께 증폭시킬 수도 있다. 특이성 증가를 위하여 "고온-시작 (hot-start)" PCR을 사용하였다. QIAGEN에 의해 공급되는 HotStarTaq Master Mix Kit (카탈로그 번호: 203443)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 반응 당 주형 DNA 및 프라이머의 양은 각각의 목적 유전자좌에 있어서 최적화할 수 있지만, 본 실시예에 있어서 40 ng의 주형 인간 게놈 DNA 및 5 μM의 각각의 프라이머를 사용하였다. 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 하기의 PCR 조건을 사용하였다:
(1)95℃에서 15분 15초;
(2)37℃에서 30초;
(3)95℃에서 30초;
(4)57℃에서 30초;
(5)95℃에서 30초;
(6)64℃에서 30초;
(7)95℃에서 30초;
(8) 단계 6 및 7을 삼십구 (39)회 반복;
(9)72℃에서 5분.
첫번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 37℃인 대략 제2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도였다. 두번째 PCR 사이클에서의 어닐링 온도는 57℃인 대략 주형 DNA에 어닐링되는 제1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도였다. 세번째 PCR 사이클의 어닐링 온도는 64℃인 대략 제2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도였다. 나머지 사이클의 어닐링 온도는 64℃였다. 첫번째 세 PCR 사이클에 있어서 어닐링 온도를 TM1에서 TM2 내지 TM3으로 단계적으로 상승시키는 것은 특이성을 크게 개선시킨다. 이러한 어닐링 온도는 대표적인 것이며 숙련자라면 각각의 사이클에 있어서의 어닐링 온도가 사용되는 특정 프라이머에 따라 달라진다는 것을 알 것이다.
변성, 어닐링 및 연장에 있어서의 온도 및 시간은 다양한 설정치의 시도 및 가장 우수한 결과를 생성하는 파라미터의 사용에 의해 최적화할 수 있다. 본 실시예에 있어서, 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 다양한 거리에서 어닐링되도록 설계한다. 숙련자라면 제1 프라이머의 어닐링 위치가 목적 유전자좌로부터 5-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31- 35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-140, 141-160, 161-180, 181-200, 201-220, 221-240, 241-260, 261-280, 281-300, 301- 350, 351-400, 401-450, 451-500, 또는 500초과의 염기일 수 있음을 알 수 있다.
목적 유전자좌를 포함하는 단편의 정제
PCR 생성물을 게놈 주형 DNA로부터 분리하였다. PCR 반응 후 1명의 개인으로부터의 각각의 PCR 반응물의 1/4 부피를 Roche Diagnostics GmbH (Roche Molecular Biochemicals, 2001 Biochemicals Catalog에 열거된 바와 같이 카탈로그 번호 1 645 692)를 투명한 고-결합 플레이트의 Streptawell의 웰에서 함께 혼합시켰다. 제1 프라이머는 5' 바이오틴 태그를 포함하여 PCR 생성물이 스트렙타비딘 코팅 웰에는 결합되는 반면 게놈 주형 DNA는 결합되지 않는다. 스트렙타비딘 결합 반응은 37℃에서 20분 동안 1000 rpm에서 Thermomixer (Eppendorf)를 사용하여 수행하였다. 각각의 웰을 흡인하여 미결합 물질을 제거하고 온화하게 혼합하면서 1X PBS로 3회 세척하였다 (Kandpal et al. , Nucl. Acids Res. 18:1789- 1795 (1990); Kaneoka et al. , Biotechniques 10: 30-34 (1991); Green et al. , Nucl. Acids Res. 18: 6163-6164 (1990)).
목적 유전자좌를 포함하는 단리된 단편의 제한 효소 절단
정제 PCR 생성물을 제한 효소 BsmFI으로 절단하였는데 상기 제한 효소는 제2 프라이머로부터의 PCR 생성물 내로 혼입된 인식 부위에 결합한다. 절단은 제한 효소와 함께 공급된 지시에 따라 스트렙타웰에서 수행하였다. 절단 후 웰을 PBS로 3회 세척하여 절단 단편을 제거하였다.
표지 뉴클레오티드의 혼입
BsmF I을 이용한 제한 효소 절단에 의해 SNP 부위 또는 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행 및 3' 리세싱된 말단을 가지는 DNA 단편을 생성하였다. 5' 오버행은 DNA 폴리머라제의 존재 하에 뉴클레오티드(들)가 혼입되게 하는 주형으로 기능ㅎ㎕다.
이하에 SNP TSC0837969에 있어서의 5' 오버행의 개략도를 도시하였다. 전체 DNA 서열은 재현되어 있지 않으며 단지 일부가 오버행을 입증하기 위하여 재현되어 있다 (여기서 R은 가변성 부위를 나타냄).
TSC0837969에 있어서 5' 센스 가닥 (여기에서는 상부 가닥으로 도시됨) 상에서 관찰된 뉴클레오티드는 아데닌 및 구아닌이다. 안티센스 가닥 상의 오버행에서의 세번째 위치는 구아닌에 상보성인 시토신에 상응한다. 이 가변성 부위는 아데닌 또는 구아닌일 수 있기 때문에 미표지 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재 하에 형광성 표지 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정하였다. 구아닌에 대하여 동종성, 아데닌에 대하여 동종성 또는 이종성인 개체에 있어서의 필-인 반응을 이하에 도시한다.
TSC 0837969에서 구아닌에 대하여 동종성:
표지 ddGTP를 오버행의 첫번째 위치에 혼입시킨다. 단지 하나의 시그널이 보여지는데 이는 오버행의 첫번째 위치에서 표지 ddGTP로 필 인된 분자에 상응한다.
TSC 0837969에서 아데닌에 대하여 동종성:
미표지 dATP를 오버행의 1 위치에 혼입시키고 미표지 dTTP를 오버행의 2 위치에 혼입시킨다. 표지 ddGTP를 오버행의 3 위치에 혼입시킨다. 단지 하나의 시그널이 보여지는데, 3 위치에서 ddGTP로 필 인된 분자는 1 위치에서 필 인된 분자와는 다른 분자량을 가지는데 이에 의해 아데닌 또는 구아닌에 대하여 동종성인 개체를 용이하게 확인하게 된다.
TSC0837969에서 이종성:
2개의 시그널이 보여지는데, 하나의 시그널은 1 위치에서 ddGTP로 필 인된 DNA 분자에 상응하며 두번째 시그널은 오버행의 3 위치에서 필 인된 분자에 상응한다. 2개의 시그널은 겔 진기영동법을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 분자량에기초하여 분리하는 임의의 기술을 사용하여 분리할 수 있다.
이하에 SNP TSC0034767에 있어서의 5' 오버행의 개략도를 도시한다. 전체 DNA 서열은 재현되어 있지 않으며 단지 일부가 오버행을 입증하기 위하여 재현되어 있다 (여기서 R은 가변성 부위를 나타냄).
TSC0034767에 있어서 5' 센스 가닥 (여기에서는 상부 가닥으로 도시됨) 상에서 관찰된 뉴클레오티드는 시토신 및 구아닌이다. 오버행에서의 두번째 위치는 티미딘에 상보성인 아데닌에 상응한다. 오버행에서의 세번째 위치는 구아닌에 상보성인 시토신에 상응한다. 미표지 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재 하에 형광성 표지 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정하였다.
이 경우에 있어서 제2 프라이머는 목적 유전자좌의 상류에 어닐링되며 따라서 필-인 반응은 안티센스 가닥 상에서 일어난다 (여기에서 하부 가닥으로 도시함). 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 IIS형 제한 효소의 인식 부위를 포함하는 제2 프라이머가 목적 유전자좌의 상류에 어닐링하는지 하류에 어닐링하는지에 따라 필 인될 수 있다.
이하에 SNP TSC1130902에 있어서의 5' 오버행의 개략도를 도시한다. 전체 DNA 서열은 재현되어 있지 않으며 단지 일부가 오버행을 입증하기 위하여 재현되어있다 (여기서 R은 가변성 부위를 나타냄).
TSC1130902에 있어서 5' 센스 가닥 상에서 관찰된 뉴클레오티드는 아데닌 및 구아닌이다. 오버행에서의 두번째 위치는 티미딘에 상응하며 오버행에서의 세번째 위치는 구아닌에 상보성인 시토신에 상응한다.
미표지 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재 하에 형광성 표지 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정하였다.
이하에 SNP TSC0597888에 있어서의 5' 오버행의 개략도를 도시한다. 전체 DNA 서열은 재현되어 있지 않으며 단지 일부가 오버행을 입증하기 위하여 재현되어 있다 (여기서 R은 가변성 부위를 나타냄).
TSC0597888에 있어서 5' 센스 가닥 (여기서 상부 가닥으로 도시함) 상에서 관찰된 뉴클레오티드는 시토신 및 구아닌이다. 오버행에서의 세번째 위치는 구아닌에 상보성인 시토신에 상응한다. 미표지 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재 하에 형광성 표지 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정하였다.
이하에 SNP TSC0607185에 있어서의 5' 오버행의 개략도를 도시한다. 전체 DNA 서열은 재현되어 있지 않으며 단지 일부가 오버행을 입증하기 위하여 재현되어있다 (여기서 R은 가변성 부위를 나타냄).
TSC0607185에 있어서 5' 센스 가닥 (여기서 상부 가닥으로 도시함) 상에서 관찰된 뉴클레오티드는 시토신 및 티미딘이다. 이 경우에 있어서 제2 프라이머는 목적 유전자좌의 상류에 어닐링하는데, 이에 의해 안티센스 가닥이 필 인된다. 안티센스 가닥 (여기서 하부 가닥으로 도시함)은 구아닌 또는 아데닌으로 필 인된다.
오버행에서의 두번째 위치는 아데닌에 상보성인 티미딘이며 오버행에서의 세번째 위치는 구아닌에 상보성인 시토신에 상응한다. 미표지 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재 하에 형광성 표지 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정하였다.
이하에 SNP TSC0195492에 있어서의 5' 오버행의 개략도를 도시한다. 전체 DNA 서열은 재현되어 있지 않으며 단지 일부가 오버행을 입증하기 위하여 재현되어 있다.
이 부위에서 관찰된 뉴클레오티드는 센스 가닥 (여기서 사부 가닥으로 도시함) 상의 시토신 및 구아닌이다. 5' 오버행에서의 두번째 위치는 티미딘에 상보성인 아데닌이며 오버행에서의 세번째 위치는 구아닌에 상보성인 시토신이다. 미표지 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재 하에 형광성 표지 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정하였다.
상기에서 입증된 바와 같이 6개의 SNP의 두 대립유전자의 서열은 미표지 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재 하에 ddGTP로 표지함으로써 결정하였다. 하기 성분을 필 인 반응에 사용하였다: 1 ㎕의 형광성 표지 ddGTP, 구아닌을 제외한 모든 뉴클레오티드를 포함하는 0.5 ㎕의 미표지 ddNTP, 2 ㎕의 10X 시쿼나제 완충제, 0.25 ㎕의 시쿼나제, 및 20 ㎕의 반응에 필요한 물. 필 인 반응을 40℃에서 10분 동안 수행하였다. 비-형광성 표지 ddNTP를 Fermentas Inc. (미국 매릴랜드주 하노버 소재)로부터 구매하였다. 모든 표지 시약은 Amersham으로부터 획득하였다 (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit (US 79565)).
표지 후 각각의 Streptawell을 1X PBS (100 ㎕)로 3회 헹구었다. 이어서 "필 인" DNA 단편을 효소와 함께 공급된 제조자의 지시에 따라 제한 효소 EcoRI으로 절단하였다. 절단은 120 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 수행하였다.
목적 유전자좌의 탐지
스트렙타비딘 매트릭스로부터의 방출 후 샘플을 36 cm의 5% 아크릴아미드 (우레아) 겔 (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호: 50691)의 레인 내로 로딩하였다. 샘플을 3000 볼트에서 3분 동안 겔 내로 전기 영동시켰다. 겔을 서열 결정 장치 (Hoefer SQ3 Sequencer) 상에서 3시간 동안 진행시켰다. 겔을 장치로부터 옮기고 Typhoon 9400 Variable Mode Imager 상에서 스캐닝하였다. 혼입된 표지 뉴클레오티드를 형광성으로 탐지하였다.
도 11에 도시된 바와 같이 SNP TSC0837969에 있어서 레인 1 및 2의 주형 DNA는 아데닌에 대하여 동종성이다. 하기 필 인 반응은 개체가 아데닌에 대하여 동종성일 경우 일어날 것으로 기대하였다:
TSC 0837969에서 아데닌에 대하여 동종성:
미표지 dATP는 오버행에 상보성인 첫번째 위치에서 혼입되었다. 미표지 dTTP는 오버행에 상보성인 두번째 위치에서 혼입되었다. 표지 ddGTP는 오버행에 상보성인 세번째 위치에서 혼입되었다. 단지 하나의 밴드가 보여지는데 이는 아크릴아미드 겔의 약 46 위치에서 이동하였다. 이는 아데닌이 1 위치에서 필 인된 뉴클레오티드임을 나타내는 것이다. 구아닌 뉴클레오티드가 필 인되었을 경우 밴드는 44 위치에서 기대된다.
그러나 SNP TSC0837969에 있어서의 레인 3 및 4의 주형 DNA는 이종성이었다. 개체가 이종성일 경우 하기 필 인 반응이 기대되었다:
TSC0837969에서 이종성:
2개의 독특한 밴드가 보여지는데, 하나의 밴드는 오버행에 상보성인 1 위치에서 ddGTP로 필 인된 분자에 상응하며 (G 대립유전자), 두번째 밴드는 오버행에상보성인 3 위치에서 ddGTP로 필 인된 분자에 상응한다 (A 대립유전자). 2개의 밴드는 겔 전기 영동법을 사용하여 분자량에서의 차이에 기초하여 분리하였다. 하나의 형광성 표지 뉴클레오티드 ddGTP를 사용하여 개체가 SNP 부위에서 이종성임을 결정하였다. 이는 2개의 상이한 대립유전자의 존재를 효과적으로 탐지하기 위한 첫번째 단일 뉴클레오티드의 사용이다.
SNP TSC0034767에 있어서 레인 1 및 3의 주형 DNA는 2개의 독특한 밴드로 증명되듯이 시토신 및 구아닌에 대하여 이종성이다. 하부의 밴드는 오버행에 상보성인 1 위치에서 필 인된 ddGTP에 상응한다. 약간 더 높은 분자량의 두번째 밴드는 3 위치에서 필 인된 ddGTP에 상응하는데, 이는 오버행에서의 첫번째 위치가 미표지 dCTP로 필 인되었음을 나타내며, 이에 의해 폴리머라제는 오버행에 상보성인 3 위치에서 ddGTP를 혼입할 때까지 뉴클레오티드의 혼입을 계속하게 된다. 레인 2 및 4의 주형 DNA는 ddGTP가 오버행에 상보성인 첫번째 위치에서 필 인된 경우보다 더 큰 분자량의 단일 밴드에 의해 증명되는 바와 같이 구아닌에 대하여 동종성이다.
SNP TSC1130902에 있어서, 레인 1, 2 및 4의 주형 DNA는 겔 상에서 약 62 위치에서 이동하는 더 큰 분자량의 단일 밴드에 의해 증명되는 바와 같이 가변성 부위에서 아데닌에 대하여 동종성이다. 레인 3의 주형 DNA는 2개의 독특한 밴드의 존재에 의해 나타내어지는 바와 같이 가변성 부위에서 이종성이다. 하부의 밴드는 오버행에 상보성인 1 위치에서 ddGTP로 필 인된 분자에 상응한다 (구아닌 대립유전자). 더욱 큰 분자량의 밴드는 오버행에 상보성인 3 위치에서 ddGTP로 필 인된 분자에 상응한다 (아데닌 대립유전자).
SNP TSC0597888에 있어서 레인 1 및 4의 주형 DNA는 가변성 부위에서 시토신에 대하여 동종성이며, 레인 2의 주형 DNA는 가변성 부위에서 이종성이며, 레인 3의 주형 DNA는 구아닌에 대하여 동종성이다. 기대되는 필 인 반응을 이하에 도시한다:
시토신에 대하여 동종성:
구아닌에 대하여 동종성:
구아닌/시토신에 대하여 이종성:
가변성 부위에서 구아닌에 대하여 동종성인 주형 DNA는 단일 밴드를 나타내는데, 이는 오버행에 상보성인 1 위치에서 ddGTP로 필 인된 DNA 분자에 상응한다. 이러한 DNA 분자는 오버행의 3 위치에서 ddGTP로 필 인된 DNA 분자에 비하여 분자량이 더 작다 (SNP TSC0597888에 있어서 레인 3 참조). DNA 분자는 분자량에 있어서 2개의 염기만큼 상이하였다.
가변성 부위에서 시토신에 대하여 동종성인 주형 DNA는 단일 밴드를 나타내는데, 이는 오버행에 상보성인 3 위치에서 ddGTP로 필 인된 DNA 분자에 상응한다. 이러한 DNA 분자는 1 위치에서 ddGTP로 필 인된 DNA 분자보다 더 큰 분자량에서 이동하였다 (SNP TSC0597888에 있어서 레인 1 및 4 참조).
가변성 부위에서 이종성인 주형 DNA는 2개의 밴드를 나타내었는데, 하나의 밴드는 오버행에 상보성인 1 위치에서 ddGTP로 필 인된 DNA 분자에 상응하며 분자량이 더 작았고, 두번째 밴드는 오버행에 상보성인 3 위치에서 ddGTP로 필 인된 DNA 분자에 상응하며 분자량이 더 컸다 (SNP TSC0597888에 있어서 레인 3 참조).
SNP TSCO195492에 있어서 레인 1 및 3의 주형 DNA는 가변성 부위에서 이종성이었는데, 이는 2개의 독특한 밴드의 존재에 의해 입증되었다. 레인 2의 주형 DNA는 가변성 부위에서 구아닌에 대하여 동종성이었다. 레인 4의 주형 DNA는 시토신에 대하여 동종성이었다. 단지 1개의 밴드가 상기 SNP에 있어서 레인 4에서 보여졌으며, 이 밴드는 오버행에 상보성인 1 위치에서 ddGTP로 필 인된 DNA 분자보다 더 큰 분자량을 가진다 (레인 2, 3 및 4 비교).
관찰된 SNP TSC0607185의 대립유전자는 시토신 또는 티미딘인 것으로 보고된다. 일관성을 위하여, SNP 컨소시움은 센스 가닥에 나타나는 관찰된 대립유전자를의미한다 (www.snp.schl.org/snpsearch.shtml; 2003년 2월 11자의 유효 웹사이트). 이러한 SNP에 있어서, 제2 프라이머는 목적 유전자좌의 상류에 어닐링되는데, 이에 의해 BsmF I을 이용한 절단 후 필 인 반응이 안티센스 가닥 상에서 일어난다.
레인 1 및 3의 주형 DNA는 이종성이며, 레인 2의 주형 DNA는 티미딘에 대하여 동종성이며, 레인 4의 주형 DNA는 시토신에 대하여 동종성이다. 안티센스 가닥은 ddGTP로 필 인시키며, 따라서 센스 가닥 상의 뉴클레오티드는 시토신에 상응한다.
분자량 마커를 사용하여 기대되는 밴드의 위치를 확인할 수 있다. 대안적으로는 분석되는 각각의 SNP에 있어서, 공지된 이종성 샘플을 사용할 수 있는데, 이는 2개의 기대되는 밴드의 위치를 정확하게 확인하여 준다.
도 11에서 입증되는 바와 같이 하나의 형광성 염료로 표지된 하나의 뉴클레오티드를 사용하여 SNP 및 단일 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 가변성 부위의 신원을 결정할 수 있다. 일반적으로 개체가 SNP 부위에서 동종성인지 이종성인지를 결정하기 위해서는 하나의 염료로 표지된 하나의 뉴클레오티드 및 제2 염료로 표지된 제2 뉴클레오티드를 사용하여 다수의 반응을 수행한다. 그러나 이는 두 염료가 상이한 양자 계수를 가지기 때문에 결과의 비교에 있어서 문제점을 창출한다. 심지어 상이한 뉴클레오티드를 동일한 염료로 표지하는 경우에도 양자 계수는 상이하다. 하나의 염료로 표지한 단일 뉴클레오티드를 사용하면 상이한 염료의 양자 계수로부터의 모든 에러가 제거된다.
본 실시예에 있어서 형광성 표지 ddGTP를 사용하였다. 그러나 본 방법은 방사성 동위 원소, 형광성 분자, 항체, 항체 단편, 합텐, 탄수화물, 바이오틴, 바이오틴의 유도체, 인광성 부분, 발광성 부분, 전기 화학 발광성 부분, 염색성 부분, 및 탐지가능한 전자 스핀 공명, 전기 용량, 유전 상수 또는 전기 전도도를 가지는 부분을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 시그널 생성 부분으로 태그된 뉴클레오티드에 있어서 적용가능하다. 또한, 표지된 ddATP, ddTTP, 또는 ddCTP를 사용할 수 있다.
상기 실시예에서는 두번째 대립유전자의 지시체로서 오버행에 상보성인 세번째 위치를 이용하였다. 그러나 오버행의 두번째 또는 네번째 위치도 사용할 수 있다 (뉴클레오티드의 혼입에 대한 단락 참조). 또한, 오버행을 IIS형 효소인 BsmF I을 이용하여 생성하였지만, 하기 표 I에 열거된 효소를 포함하지만 그에 한정되지는 않는, 결합 부위로부터 떨어진 DNA를 절단하는 임의의 효소가 사용될 수 있다.
또한 상기 실시예에 있어서 SNP 부위에 인접하여 선행하는 뉴클레오티드는 필 인된 가닥 상의 구아닌이 아니었다. 이는 제거될 IIS형 제한 효소의 대안적인 절단 특성의 모든 영향을 제거한다. 예를 들어 SNP TSC0837969에서 센스 가닥 상의 SNP 부위의 상류의 뉴클레오티드는 아데닌이었다. BsmF I이 택일적 절단 특성을 나타낼 경우 하기의 오버행이 아데닌 대립유전자 및 구아닌 대립유전자에 있어서 생성된다:
구아닌 대립유전자에 있어서, 오버행의 첫번째 위치는 dATP로 필 인되는데, 이는 폴리머라제가 오버행에 상보성인 2 위치에서 ddGTP를 혼입하도록 한다. 10/14 위치에서 절단되는 분자 또는 11/15 위치에서 절단되는 분자 사이에는 탐지가능한 차이가 전혀 존재하지 않는다.
아데닌 대립유전자에 있어서, 오버행에 상보성인 첫번째 위치는 dATP로 필 인되며, 두번째 위치는 dATP로 필 인되며, 세번째 위치는 dTTP로 필 인되며, 네번째 위치는 ddGTP로 필 인된다. 10/14 위치에서 절단되는 분자 또는 11/15 위치에서 절단되는 분자 사이에는 탐지가능한 차이가 전혀 존재하지 않는다.유일한 차이는 DNA 분자가 가변성 부위에서 아데닌을 포함하거나 가변성 부위에서 구아닌을 포함하는지에 상응한다.
도 11에서 알 수 있듯이, 제1 프라이머의 어닐링 영역의 위치화에 의해 다수의 SNP를 겔의 단일 레인에서 분석한다. 또한, 동일한 염료를 가지는 동일한 뉴클레오티드를 사용함으로써 단일 필 인 반응을 수행할 수 있다. 본 실시예에 있어서 6개의 SNP를 하나의 레인에서 분석하였다. 그러나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-100, 101-120, 121-140, 141-160, 161-180, 181-200, 및 200개 초과의 SNP를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 갯수의 SNP를 단일 반응에서 분석할 수 있다.
또한 두 대립유전자의 탐지에 사용되는 하나의 표지 뉴클레오티드를 상이한 SNP 세트의 탐지에 사용되는 제2 표지 뉴클레오티드와 혼합할 수 있되, 단, 표지되는 뉴클레오티드 중 어느 것도 가변성 부위 (11/15 절단물의 0 위치에서 뉴클레오티드에 상보성임)의 바로 앞에 나타나지는 않는다. 예를 들어 SNP X가 가변성 부위에서 구아닌 또는 티미딘일 수 있으며 BsmF I을 이용한 절단 후 생성되는 하기5' 오버행을 가진다는 것을 가정:
표지 ddGTP, 미표지 dATP, dCTP, 및dTTP를 이용한 필 인 반응 후 하기 분자가 생성된다:
이제 SNP Y가 아데닌 또는 티미딘일 수 있으며 BsmF I을 이용한 절단 후 생성되는 하기의 5' 오버행을 가진다고 가정:
표지 ddATP 및 미표지 dCTP, dGTP, 및 dTTP를 이용한 필 인 후, 하기의 분자가 생성된다:
본 실시예에 있어서 표지 ddGTP 및 미표지 ddATP를 사용하여 각각 SNP X 및SNP Y의 두 대립유전자의 신원을 결정한다. 11/15 절단 SNP X로부터 인접하여 선행하는 뉴클레오티드 (오버행의 0 위치에 상보성인 뉴클레오티드)는 필 인된 가닥 상의 구아닌 또는 아데닌이 아니다. 마찬가지로 SNP Y에 인접하여 선행하는 뉴클레오티드는 필 인된 가닥 상의 구아닌 또는 아데닌이 다니다. 이는 두 SNP에 있어서의 필 인 반응이 표지 ddGTP, 표지 ddATP와, 미표지 dCTP 및 dTTP를 이용한 단일 반응에서 일어나도록 한다. 이는 수행할 필요가 있는 반응 횟수를 감소시키며 하나의 반응에서 분석될 수 있는 SNP의 갯수를 증가시킨다.
각각의 SNP를 위한 제1 프라이머는 SNP가 겔 상에서 상이한 위치에서 이동하도록 하는 목적 유전자로부터의 상이한 거리에서 어닐링되도록 설계할 수 있다. 예를 들어 SNP X의 증폭에 사용되는 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 30 염기에서 어닐링될 수 있으며 SNP Y의 증폭에 사용되는 제1 프라이머는 목적 유전자좌로부터 35 염기에서 어닐링될 수 있다. 또한 뉴클레오티드는 중복되지 않는 스펙트럼에서 방출되는 형광성 염료로 표지될 수 있다. 겔을 진행시킨 후 겔을 하나의 염료에 특이적인 하나의 파장에서 스캐닝할 수 있다. 이 염료로 표지된 분자만이 시그널을 방출한다. 이어서 겔을 두번째 염료에 있어서의 파장에서 스캐닝할 수 있다. 상기 염료로 표지된 분자만이 시그널을 방출한다. 본 방법에 의해 단일 반응에서 분석될 수 있는 SNP의 갯수가 최대로 압축되게 된다.
본 실시예에 있어서 필 인된 가닥 상의 가변성 부위에 선행하는 뉴클레오티드는 아데닌 또는 구아닌이 아니다. 본 방법은 표지 뉴클레오티드의 임의의 배합물로 행해질 수 있으며, 숙련자라면 어느 표지 반응물이 혼합될 수 있으며 어느 것이 혼합될 수 없는지를 알 수 있다. 에를 들어 하나의 SNP를 티미딘으로 표지하고 두번째 SNP를 시토신으로 표지할 경우, SNP는 각각의 가변성 부위에 인접하여 선행하는 뉴클레오티드가 센스 가닥 상의 티미딘 또는 시토신이 아니며 가변성 부위 바로 뒤의 뉴클레오티드가 센스 가닥 상의 티미딘 또는 시토신이 아니라면 단일 반응에서 표지할 수 있다.
본 방법은 택일적 절단 정도를 결정하는 복잡성이 부가됨이 없이, 또는 염료의 양자 계수를 보정할 필요 없이 하나의 대립유전자로부터의 시그널이 두번째 대립유전자로부터의 시그널에 비교되게 한다. 본 방법은 하나의 대립유전자 대 다른 대립유전자의 비를 정량화하고자 시도할 경우 특히 유용하다. 예를 들어 본 방법은 염색체 이상의 탐지에 유용하다. 이종성 부위에서 대립유전자의 비는 약 1:1 (하나의 A 대립유전자 및 하나의 G 대립유전자)일 것으로 기대된다. 그러나 여분의 염색체가 존재할 경우 이 비는 약 1:2 (하나의 A 대립유전자 및 2개의 G 대립유전자 또는 2개의 A 대립유전자 및 1개의 G 대립유전자)일 것으로 기대된다. 본 방법은 모계 DNA의 존재 하에 태아 DNA를 탐지하고자 시도할 경우 특히 유용하다.
또한 본 방법은 하나의 샘플에서의 2개의 유전자 시그널의 탐지에 유용하다. 예를 들어 본 방법은 야생형 세포의 존재 하에 돌연변이 세포를 탐지할 수 있다 (실시예 5 참조). 돌연변이 세포가 특정 유전자의 DNA의 서열 중의 돌연변이를 포함할 경우, 본 방법을 사용하여 돌연변이 시그널 및 야생형 시그널 둘 모두를 탐지할 수 있다. 본 방법을 사용하여 야생형 DNA 서열의 존재 하에 돌연변이 DNA 서열을 탐지할 수 있다. 돌연변이 DNA 대 야생형 DNA의 비는 하나의 시그널 생성 부분으로 표지된 단일 뉴클레오티드를 사용하기 때문에 정량화할 수 있다.
실시예 5
다양한 유형의 암의 탐지를 위한 비침습성 방법은 질환률 및 이 질환으로부터의 사망률을 감소시키는 잠재력을 가진다. 결장내시경, 바륨 관장술, 및 S상 결장경을 포함하는 결장직장 종양의 조기 탐지를 위한 여러 기술이 개발되었지만 이 기술은 사용에 있어서는 제한되는데, 이는 이 기술이 낮은 환자 응낙 수준을 야기하는 침습적 기술이기 때문이다. 비침습적 유전자 시험이 초기 상태의 결장직장 종양의 확인에 유용할 수 있다.
1991년에 연구자들은 결장직장 종양의 형성에 중요한 역할을 하는 선종성 용종증 (APC)를 확인하였다 (Kinzler et al., Science 253: 661-665, 1991). APC 유전자는 염색체 5q21-22 상에 존재하며 총 15개의 엑손이 8529개의 뉴클레오티드의 RNA 분자를 코딩하는데 이는 300 Kd의 APC 단백질을 생성한다. 이 단백질은 다수의 세포 유형에서 발현되며 세포 유착에 필수적이다.
APC 유전자의 돌연변이가 일반적으로 결장직장 종양 형성을 일으킨다 (Tsao, J. et al., Am, J. Pathol. 145:531-534, 1994). 대략 APC 유전자에서의 돌연변이 중 95%가 넌센스/프레임시프트 돌연변이로 이어진다. 가장 일반적인 돌연변이가 코돈 1061 및 1309에서 나타나는데, 상기 코돈에서의 돌연변이가 모든 생식 세포 돌연변이의 1/3을 차지한다. 체세포 돌연변이와 관련해서는, 60%가 코딩 서열의 약 10%인 코돈 1286-1513 내에서 나타난다. 이 영역은 돌연변이 집단 영역 (mutation Cluster Region, MCR)로 명명되어 있다. 뉴클레오티드 치환 (표 III 참조), 스플라이싱 에러 (표 IV 참조), 적은 결실 (표 V 참조), 적은 삽입 (표 VI 참조), 적은 삽입/결실 (표 VII 참조), 큰 결실 (표 VIII 참조), 큰 삽입 (표 IX 참조) 및 복합적인 재배열 (표 X 참조)을 포함하는 다수의 유형의 돌연변이가 APC 유전자에서 확인되었다.
연구자들은 대변 샘플에서 APC 유전자에서의 돌연변이를 지니는 세포를 확인하려고 하였다 (Traverso, G. et al., New England Journal of Medicine, Vol 346:311-320, 2002). APC 돌연변이는 거의 모든 종양 세포에서 발견되지만 대변 샘플 중의 250개의 세포 중 약 1개의 세포가 APC 유전자에 있어서의 돌연변이를 가지며, 대변 내로 흘려진 대부분의 세포는 정상 세포이다. 또한, 인간 DNA는 대변 샘플에서 발견되는 약 10억개의 총 DNA를 대표하는데, 대부분의 DNA는 박테리아의 것이다. Traverso 등에 의해 이용된 기술은 절단 단백질을 생성하는 돌연변이만을 탐지한다.
상기에서 논의된 바와 같이 APC 유전자에서의 다수의 돌연변이는 결장직장 종양의 형성에 연루되어 있다. 따라서 결장직장 종양의 탐지를 위한 고도로 민감하며 비침습적인 기술에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 이하에 APC 유전자에서의 2개의 돌연변이의 탐지 방법을 설명하였다. 그러나 임의의 갯수의 돌연변이를 본 명세서에 설명한 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
주형 DNA의 제조
대변 샘플을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 결장 세포를 포함하는 샘플로부터 주형 DNA를 정제한다. 주형 DNA를 Ahlquist 등 (Gastroenterology, 119:1219-1227, 2000)에 의해 기술된 절차를 사용하여 정제한다. 대변 샘플이 동결된 것일 경우, 샘플을 실온에서 해동시키고 Exactor 대변 진탕기 (Exact Laboratories, 미국 매사추세츠주 메이나드 소재)로 균질화하였다. 균질화 후 4 그램의 각각의 대변 샘플을 2536 x g에서 5분 동안 원심분리한다. 샘플을 16,500 x g에서 10분 동안 두번째로 원심 분리한다. 상청액을 20 ㎕ 의 RNase (1 밀리리터 당 0.5 mg)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. DNA를 1/10 부피의 3 ml의 아세트산나트륨/리터 및 동일 부피의 이소프로판올로 침전시켰다. DNA를 5 ml의 TRIS-EDTA (0.01 몰의 트리스/리터 (pH 7.4) 및 0.001 몰의 EDTA/리터)에 용해시킨다.
프라이머의 설계
돌연변이가 코돈 1370에서 존재하는지를 결정하기 위하여 하기의 프라이머를 사용한다:
제1 프라이머:
5' GTGCAAAGGCCTGAATTCCCAGGCACAAAGCTGTTGAA 3'
제2 프라이머:
5' TGAAGCGAACTAGGGACTCAGGTGGACTT
제1 프라이머는 5'의 가장 말단에 바이오틴 태그, 및 제한 효소 EcoRI을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제2 프라이머는 제한 효소 BsmFI을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
적은 결실이 코돈 1302에 존재하는지를 결정하기 위하여 하기의 프라이머를사용한다:
제1 프라이머:
5' GATTCCGTAAACGAATTCAGTTCATTATCATCTTTGTC 3'
제2 프라이머:
5' CCATTGTTAAGCGGGACTTCTGCTATTTG 3'
제1 프라이머는 5' 말단에서 바이오틴 태그를 가지며 EcoRI의 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제2 프라이머는 BsmF I의 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
PCR 반응
모든 목적 유전자좌를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR, 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제4,683,195호 및 동 제4,683, 202호)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 본 실시예에 있어서, 목적 유전자좌는 개별적인 반응 튜브에서 증폭시키지만 단일 PCR 반응에서 함께 증폭시킬 수도 있다. 특이성 증가를 위하여 "고온-시작 (hot-start)" PCR을 사용하였다. QIAGEN에 의해 공급되는 HotStarTaq Master Mix Kit (카탈로그 번호: 203443)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 반응 당 주형 DNA 및 프라이머의 양은 각각의 목적 유전자좌에 있어서 최적화할 수 있지만, 본 실시예에 있어서 40 ng의 주형 인간 게놈 DNA 및 5 μM의 각각의 프라이머를 사용하였다. 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 하기의 PCR 조건을 사용하였다:
(1)95℃에서 15분 15초;
(2)37℃에서 30초;
(3)95℃에서 30초;
(4)57℃에서 30초;
(5)95℃에서 30초;
(6)64℃에서 30초;
(7)95℃에서 30초;
(8) 단계 6 및 7을 삼십구 (39)회 반복;
(9)72℃에서 5분.
첫번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 37℃인 대략 제2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도였다. 두번째 PCR 사이클에서의 어닐링 온도는 57℃인 대략 주형 DNA에 어닐링되는 제1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도였다. 세번째 PCR 사이클의 어닐링 온도는 64℃인 대략 제2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도였다. 나머지 사이클의 어닐링 온도는 64℃였다. 첫번째 세 PCR 사이클에 있어서 어닐링 온도를 TM1에서 TM2 내지 TM3으로 단계적으로 상승시키는 것은 특이성을 크게 개선시킨다. 이러한 어닐링 온도는 대표적인 것이며 숙련자라면 각각의 사이클에 있어서의 어닐링 온도가 사용되는 특정 프라이머에 따라 달라진다는 것을 알 것이다.
변성, 어닐링 및 연장에 있어서의 온도 및 시간은 다양한 설정치의 시도 및 가장 우수한 결과를 생성하는 파라미터의 사용에 의해 최적화한다.
목적 유전자좌를 포함하는 단편의 정제
PCR 생성물을 게놈 주형 DNA로부터 분리하였다. PCR 반응 후 1명의 개인으로부터의 각각의 PCR 반응물의 1/4 부피를 Roche Diagnostics GmbH (RocheMolecular Biochemicals, 2001 Biochemicals Catalog에 열거된 바와 같이 카탈로그 번호 1 645 692)를 투명한 고-결합 플레이트의 Streptawell의 웰에서 함께 혼합시켰다. 제1 프라이머는 5' 바이오틴 태그를 포함하여 PCR 생성물이 스트렙타비딘 코팅 웰에는 결합되는 반면 게놈 주형 DNA는 결합되지 않는다. 스트렙타비딘 결합 반응은 37℃에서 20분 동안 1000 rpm에서 Thermomixer (Eppendorf)를 사용하여 수행하였다. 각각의 웰을 흡인하여 미결합 물질을 제거하고 온화하게 혼합하면서 1X PBS로 3회 세척하였다 (Kandpal et al. , Nucl. Acids Res. 18:1789- 1795 (1990); Kaneoka et al. , Biotechniques 10: 30-34 (1991); Green et al. , Nucl. Acids Res. 18: 6163-6164 (1990)).
대안적으로는 PCR 생성물을 스트렙타비딘 플레이트의 단일 웰에 두어 단일 웰에서 뉴클레오티드 혼입 반응을 수행한다.
목적 유전자좌를 포함하는 단리된 단편의 제한 효소 절단
정제 PCR 생성물을 제한 효소 BsmFI (New England Biolabs 카탈로그 번호: R0572S)으로 절단하였는데 상기 제한 효소는 제2 프라이머로부터의 PCR 생성물 내로 혼입된 인식 부위에 결합한다. 절단은 제한 효소와 함께 공급된 지시에 따라 스트렙타웰에서 수행하였다. 적당한 제한 효소를 이용한 절단 후 웰을 PBS로 3회 세척하여 절단 단편을 제거하였다.
표지 뉴클레오티드의 혼입
상기한 제한 효소 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행 및 3' 리세싱된 말단을 가지는 DNA 단편이 생성된다. 5' 오버행은 DNA 폴리머라제의 존재 하에 뉴클레오티드(들)이 혼입되게 하는 주형으로 기능한다.
각각의 목적 유전자좌에 있어서 4가지의 개별적인 필 인 반응을 수행하는데, 4가지의 반응 각각은 상이한 형광성 표지 ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP, 또는 ddCTP)를 포함한다. 하기의 성분을 각각의 필 인 반응물에 첨가한다: 1 ㎕의 형광성 표지 ddNTP, 형광성으로 표지된 뉴클레오티드를 제외한 모든 뉴클레오티드를 포함하는 0. 5 ㎕의 미표지 ddNTP (40 μM), 2 ㎕의 10 X 시쿼나제 완충제, 0.25 ㎕의 시쿼나제, 및 20 ㎕의 반응물에 필요한 물. 반응물에서 필은 40℃에서 10분 동안 수행한다. 비-형광성 표지 ddNTP를 Fermentas Inc. (미국 매릴랜드주 하노버 소재)로부터 구매하였다. 모든 다른 표지 시약은 Amersham으로부터 획득하였다 (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit (US 79565)). 형광성 표지 ddNTP의 존재 하에 3' 리세싱된 말단을 목적 유전자좌에 상응하는 하나의 염기로 연장시킨다.
표지 ddNTP 및 미표지 dNTP의 혼합물도 필 인 반응에 사용될 수 있다. "필 인" 조건은, 40 μM의 미표지 dNTP, 1 ㎕의 형광성 표지 ddATP, 1 ㎕의 형광성 표지 ddTTP, 1 ㎕의 형광성 표지 ddCTP, 및 1 ㎕의 ddGTP를 포함하는 혼합물을 사용하는 것을 제외하고는 상기한 바와 같다. 형광성 ddNTP는 Amersham으로부터 획득하였다 (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565; Amersham은 형광성 뉴클레오티드의 농도를 공개하지 않음). 목적 유전자좌를 제한 효소 BsmF I으로 절단하였는데 이는 4개의 염기의 5' 오버행을 생성한다. 혼입된 첫번째 뉴클레오티드가 표지 ddNTP일 경우 3' 리세싱된 말단은 하나의 염기에 의해필 인되며 이에 의해 목적 유전자좌를 탐색한다. 그러나 혼입된 첫번째 뉴클레오티드가 dNTP일 경우 폴리머라제는 ddNTP가 필 인될때까지 뉴클레오티드를 계속하여 혼입시킨다. 예를 들어 첫번째의 2개의 뉴클레오티드는 dNTP로 필 인될 수 있으며, 세번째 뉴클레오티드는 ddNTP로 필 인될 수 있는데 이에 의해 오버행에서 세번째 뉴클레오티드를 탐지하게 된다. 따라서 전체 5' 오버행의 서열을 결정하게 되는데, 이는 각각의 SNP 또는 목적 유전자좌로부터 수득되는 정보를 증가시킨다. 이러한 유형의 필 인 반응은 삽입, 결실, 삽입 및 결실, 재배열과, 전좌의 존재를 탐지할 경우 특히 유용하다.
대안적으로는 단일 염료로 표지된 하나의 뉴클레오티드를 사용하여 목적 유전자좌의 서열을 결정한다. 실시예 4 참조. 본 방법은 상이한 양자 계수를 가지는 상이한 염료를 사용할 경우의 모든 잠재적인 에러를 제거한다.
표지 후 각각의 스트렙타웰을 1X PBS (100 ㎕)회 헹군다. "필 인된" DNA 단편을 효소와 함께 공급되는 제조자의 지시에 따라 제한 효소 EcoRI으로 절단함으로써 스트렙타웰로부터 방출시킨다. 절단은 120 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 수행한다.
목적 유전자좌의 탐지
스트렙타비딘 매트릭스로부터의 방출 후 샘플을 36 cm의 5% 아크릴아미드 (우레아) 겔 (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호: 50691)의 레인 내로 로딩하였다. 샘플을 3000 볼트에서 3분 동안 겔 내로 전기 영동시켰다. 겔을 서열 결정 장치 (Hoefer SQ3 Sequencer)를 사용하여 3시간 동안 진행시켰다. 혼입된 표지 뉴클레오티드를 형광성으로 탐지하였다.
개별적인 필 인 반응을 수행할 경우 세포가 APC 유전자의 코돈 1370에서 돌연변이를 포함하는지를 결정하기 위하여 ddATP 및 ddTTP에 있어서의 필 인 반응에 상응하는 겔의 레인을 분석한다. 단지 정상 세포만이 존재할 경우 ddATP와의 필 인 반응에 상응하는 레인은 선명한 시그널이다. 시그널은 ddTTP와의 "필 인" 반응에 있어서는 전혀 탐지되지 않는다. 그러나 환자 샘플이 APC 유전자의 코돈 1370에서 돌연변이를 포함하는 세포를 포함할 경우 ddATP와의 필 인 반응에 상응하는 레인은 선명한 시그널이며, ddTTP와의 필 인 반응에 상응하는 레인으로부터 시그널이 탐지된다. ddTTP와의 필 인 반응에 상응하는 레인으로부터의 시그널의 강도는 샘플 중의 돌연변이 세포의 갯수를 나타내는 것이다.
대안적으로는, 하나의 표지 뉴클레오티드를 사용하여 APC 유전자의 코돈 1370에서 대립유전자의 서열을 결정한다. 코돈 1370에서는 정상 서열이 AAA인데, 이는 리신 아미노산을 코딩한다. 그러나 뉴클레오티드 치환이 코돈 1370에서 확인되었는데, 이는 결장직장 종양과 관련되어 있다. 구체적으로는, A에서 T로의 변화 (AAA-TAA)가 일반적으로 코돈 1370에서 발견되는데, 이는 종결 코돈으로 이어진다. 단일한 필 인 반응을 표지 ddATP와, 미표지 dTTP, dCTP, 및 dGTP를 사용하여 수행한다. 하나의 형광성 염료로 표지된 단일 뉴클레오티드를 사용하여 코돈 1370을 코딩하는 정상 및 돌연변이 DNA 서열 둘 모두의 존재를 결정한다. 관련 DNA 서열을 볼드체의 코돈 1370에 상응하는 서열과 함께 하기에 도시한다:
BsmF I을 이용한 절단 후 하기의 오버행이 생성된다:
환자 샘플에 코돈 1370에서 돌연변이를 지니는 세포가 전혀 없다면 표지 ddATP의 혼입에 상응하는 하나의 시그널이 보여진다.
그러나 환자 샘플에 코돈 1370에서 돌연변이를 지니는 세포가 있다면 코돈 1370의 정상 서열에 상응하는 하나의 시그널이 보여지며, 코돈 1370의 돌연변이 서열에 상응하는 두번째 시그널이 보여진다. 시그널은 이들이 분자량에 있어서 다르기 때문에 명확하게 확인된다.
돌연변이 대립유전자가 존재할 경우 2개의 시그널이 보여진다. 돌연변이 DNA 분자는 야생형 DNA 분자 이후의 하나의 염기로 필 인된다. 분자량에 기초하여 구별하는 임의의 방법을 사용하여 2개의 시그널을 분리한다. 하나의 표지 뉴클레오티드 (ddATP)를 사용하여 야생형 DNA 서열 및 돌연변이 DNA 서열 둘 모두의 존재를 탐지한다. 본 표지 방법은 수행해야 할 필요가 있는 반응의 수를 감소시키며 환자 샘플에서 돌연변이 세포의 갯수를 정확하게 정량화하게 한다. 샘플 중의 돌연변이 세포의 갯수를 사용하여 환자의 예후, 질환의 정도 및 심각성을 결정한다. 본 표지 방법은 독특한 양자 게수를 가지는 상이한 염료의 사용과 관련된 복잡성을 제거한다. 또한 본 표지 방법은 피펫팅 반응과 관련된 에러도 제거한다.
개별적인 필 인 반응을 수행할 경우 세포가 APC 유전자의 코돈 1302에서 돌연변이를 포함하는지를 결정하기 위하여 ddTTP 및 ddCTP에 있어서의 필 인 반응에상응하는 겔의 레인을 분석한다. 정상 DNA 서열을 볼드체의 코돈 1302를 코딩하는 서열과 함께 이하에 도시한다:
정상 서열:
절단 후 하기의 5' 오버행이 생성된다:
필 인 반응 후 표지 ddTTP가 혼입된다.
일반적으로 코돈 1302를 코딩하는 APC 서열의 단일 염기의 결실은 결장직장 종양과 관련되어 있다. 돌연변이 DNA 서열을 볼드체의 관련 서열과 함께 이하에도시한다:
APC 유전자에 돌연변이가 전혀 존재하지 않는다면 시그널은 ddCTP*와의 필 인 반응에 있어서는 탐지되지 않지만 선명한 시그널이 ddTTP*와의 필 인 반응에 있어서 탐지된다.
대안적으로는 단일 필 인 반응을 미표지 dNTP, 형광성 표지 ddATP, 형광성 표지 ddTTP, 형광성 표지 ddCTP, 및 형광성 표지 ddGTP를 포함하는 혼합물을 사용하여 수행한다. 결실이 존재하지 않을 경우 ddTTP가 혼입된다.
그러나 T가 결실될 경우 표지 ddCTP*가 혼입된다.
2개의 시그널이 티미딘 뉴클레오티드의 결실 때문에 분자량에 의해 분리된다. 돌연변이 세포가 존재할 경우 2개의 시그널이 동일 레인에서 생성되며 단일 염기쌍에 의해 분리된다 (이러한 원리는 도 9에서 입증됨). 결실은 DNA 단편의 분자량에서의 변화를 야기하며 이에 의해 단일 필 인 반응을 사용하여 정상 및 돌연변이 세포 둘 모두의 존재를 탐지한다.
상기 실시예에 있어서 뉴클레오티드의 치환 및 적은 결실의 탐지 방법을 설명한다. 그러나 본 방법은 뉴클레오티드 치환 (표 III 참조), 스플라이싱 에러 (표 IV 참조), 적은 결실 (표 V 참조), 적은 삽입 (표 VI 참조), 적은 삽입/결실 (표 VII 참조), 큰 결실 (표 VIII 참조), 큰 삽입 (표 IX 참조) 및 복합적인 재배열 (표 X 참조)을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 유형의 돌연변이의 탐지에 사용한다.
또한, 상기 방법은 표 II에 열거된 것을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 유형의 질환의 탐지에 사용된다. 또한, 표 II에 열거된 질환과 관련된 유전자, BRCA1, BRCA2, MSH6, MSH2, MLH1, RET, PTEN, ATM, H-RAS, p53, ELAC2, CDH1, APC, AR, PMS2, MLH3, CYP1A1, GSTP1, GSTM1, AXIN2, CYP19, MET, NAT1, CDKN2A, NQ01, trc8, RAD51, PMS1, TGFBR2, VHL, MC4R, POMC, NROB2, UCP2, PCSK1, PPARG, ADRB2, UCP3, glurl, cart, SORBS1, LEP, LEPR, SIM1, TNF, IL-6, IL-1, IL-2, IL-3, IL1A, TAP2, THPO, THRB, NBS1, RBM15, LIF, MPL, RUNX1, Her-2, 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체, 갑상선 수용체, p21, p27, K-RAS, N-RAS, 망막아세포종 단백질, 비스코트-알드리히 증후군 (Wiskott-Aldrich, WAS) 유전자, 인자 V 라이덴 (Leiden), 인자 II (프로트롬빈), 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제, 낭성 섬유증, LDL 수용체, HDL 수용체, 수퍼옥시드 디스뮤타제 유전자 및 SHOX 유전자, 산화 질소 조절에 연루된 유전자, 세포 사이클 조절에 연루된 유전자, 종양 억제 유전자, 종양 유전자, 신경 퇴화와 관련된 유전자, 비만과 관련된 유전자를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 유형의 돌연변이 유전자를본 명세서에 설명한 본 발명을 사용하여 탐지한다. 약어는 본 명세서에 참고로 인용된, 2003년 2월 12일자로 유효한 웹사이트인 www.archive.uwcm.ac.uk/uwcm에 열거되어 있는 단백질에 상응한다.
상기 실시예는 배설물 샘플로부터 유래된 돌연변이 세포 및 돌연변이 대립유전자의 탐지를 입증한다. 그러나 본 명세서에 설명된 방법은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 척수액, 림프액, 정액, 질 분비물, 복수, 타액, 점막 분비물, 복막액, 배설물 샘플, 신체 분비물, 유액, 폐 흡인물, 세포, 조직, 동일한 핵산을 포함하는 공급원의 개개의 세포 또는 추출물, 및 미토콘드리아 또는 엽록체와 같은 서브세포 구조체를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 생물학적 샘플로부터 유래된 돌연변이 세포의 탐지에 사용한다. 또한 본 명세서에 설명한 방법은 법의학적 샘플, 식품 샘플, 고고학적 샘플, 농업적 샘플 또는 무기 샘플을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 갯수의 핵산 포함 샘플로부터 유래된 돌연변이 세포 및 돌연변이 DNA의 탐지에 사용된다.
상기 실시예는 APC 유전자에서의 돌연변이의 탐지에 관한 것이다. 그러나 본 명세서에 설명된 본 발명은 질환과 관련되거나 질환의 소인이 되는 임의의 유전자에서의 돌연변이의 탐지에 사용된다 (표 XI 참조).
예를 들어 글루타치온 S-트랜스퍼라제 P1 (GSTP1) 프로모터의 과다 메틸화는 전립선암에 있어서 가장 일반적인 DNA 변경이다. 프로모터의 메틸화 상태를 중아황산나트륨 및 본 명세서에 설명된 방법을 사용하여 결정한다.
중아황산나트륨을 이용한 처리에 의해 비메닐화 시토신 잔기를 우라실로 치환하며 메틸화 시토신은 변화시키지 않은채 남겨둔다. 본 명세서에 설명한 방법을 사용하여, 제1 및 제2 프라이머를 설계하여 종종 메틸화되는 GSTP1 프로모터 영역을 증폭시킨다. 이하에 중아황산나트륨 처리 이전의 GSTP1 프로모터 영역을 도시한다:
중아황산나트륨 처리 전:
이하에 중아황산나트륨 처리, PCR 증폭, 및 IIS형 제한 효소 BsmF I을 이용한 절단 후의 GSTP1 프로모터 영역을 도시한다:
표지 ddddATP, 미표지 dCTP, dGTP, 및 dTTP를 사용하여 5' 오버행을 필 인한다. 하기 분자가 생성된다:
2개의 시그널이 보여지는데, 하나는 오버행에 상보성인 1 위치에서 ddATP로 필 인된 DNA 분자에 상응하며 (비메틸화), 다른 하나는 오버행에 상보성인 4 위치에서 ddATP로 필 인된 DNA 분자에 상응한다 (메틸화). 2개의 시그널을 분자량에 기초하여 분리한다. 대안적으로는 필 인 반응을 하나의 반응에서는 표지 ddGTP를 사용하고 다른 반응에서는 표지 ddATP를 사용하여 개별적인 반응에서 수행한다.
본 명세서에 설명한 방법을 사용하여 전립선암을 스크리닝하고 또한 이 질환의 진행 및 심각성을 모니터링한다. 메틸화 및 비메틸화 서열 둘 모두의 탐지를 위하여 단일 뉴클레오티드를 사용하면 정확한 정량화를 정확하게 할 수 있으며 메틸화 서열에 있어서의 높은 수준의 민감성을 제공하게 되는데, 이는 이 질환의 더욱 초기의 탐지에 있어서의 유용한 도구이다.
표 III-X에 포함된 정보는 Human Gene Mutation Database로부터 획득하였다. 본 명세서에 제공된 정보를 이용하면 당 업자는 임의의 유전자에 있어서 대립유전자의 서열 결정에 본 방법을 어떻게 적용할 것인지를 알 수 있다. 다수의 유전자 및 그와 관련된 돌연변이를 웹사이트 www.archive.uwcm.ac.uk./uwcm에서 찾을 수있다.
볼드체 문자는 코돈을 나타낸다. 소문자는 결실을 나타낸다. 결실이 코딩 영역을 넘어서 연장할 경우 다른 위치상의 정보가 제공된다. 예를 들어 약어 5' UTR은 5'의 미번역 영역을 나타내며 약어 E6I6은 엑손 6/인트론 6의 경계를 나타낸다.
이제 본 발명을 충분히 설명하였기 때문에 당 업계의 숙련자라면 본 발명 또는 그의 임의의 실시 형태의 취지 또는 범주에 영향을 주지 않고서 본 발명을 광범위하며 동등한 범위의 조건, 파라미터 등을 이용하여 수행할 수 있음을 알 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌, 예를 들어 과학적 출판물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개개의 문헌이 구체적으로, 그리고 개별적으로 그의 전체 내용이 참고로 인용되는 것이라 나타내어지는 것과 동일한 정도로 그의 전체 내용이 본 명세서에 참고로 인용된다. 인용된 문헌이 단지 이 문헌의 첫번째 페이지를 제공할 경우 이 문헌의 나머지 페이지를 포함하는 전체 문헌인 것으로 생각된다.

Claims (67)

  1. 목적 유전자좌의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 폴리뉴클레오티드로부터 목적 유전자좌를 포함하는 DNA 영역을 복제하는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위를 발생시키는 서열을 함유함으로써, 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행을 발생시키며;
    (b) 제2 프라이머에 의해 발생된 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 DNA를 절단하여 DNA 단편을 생성하는 단계;
    (c) 주형으로서 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계; 및
    (d) (c)의 DNA의 서열 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 목적 유전자좌의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위를 함유함으로써, 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행을 발생시키며;
    (b) 증폭된 DNA를 제2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) 주형으로서 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계; 및
    (d) (c)의 DNA의 서열 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 주형 DNA를 박테리아, 진균류, 바이러스, 원생 동물, 식물, 동물 및 인간으로 구성된 군으로부터 선택되는 공급원으로부터 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 주형 DNA를 인간 공급원으로부터 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 주형 DNA를 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 척수액, 림프액, 정액, 질 분비물, 복수, 타액, 점막 분비물, 복막액, 배설물, 또는 신체분비물로 구성된 군으로부터 선택되는 샘플로부터 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, (a)에서의 증폭이 폴리머라제 연쇄반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 제한 효소가 인식 부위에서 DNA를 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제2 프라이머의 5' 영역이 주형 DNA에 어닐링하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 제1 프라이머의 5' 영역이 주형 DNA에 어닐링하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 제한 효소가 BsaJ I, BsskI, DdeI, EcoNI, Fnu4HI 및 Hinf I으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제2항에 있어서, 제한 효소가 인식 부위로부터 떨어져서 DNA를 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 제2 프라이머의 5' 영역이 주형 DNA에 어닐링하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 제1 프라이머의 5' 영역이 주형 DNA에 어닐링하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 제2 프라이머의 3' 영역의 어닐링 길이가 25-20, 20-15, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 그리고 4 미만의 염기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제2항에 있어서, PCR 사이클 1의 어닐링 온도가 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제2 프라이머의 3' 영역의 일부의 용융 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, PCR 사이클 2의 어닐링 온도가 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제1 프라이머의 3' 영역의 일부의 용융 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 나머지 PCR 사이클의 어닐링 온도가 대략 전체 제2 프라이머의 용융 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제2항에 있어서, 제2 프라이머의 3' 단부가 목적 유전자좌에 인접하여 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제11항에 있어서, 인식 부위가 IIS형 제한 효소의 인식 부위인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, IIS형 제한 효소가 Alw I, Alw26 I, Bbs I, Bbv I, BceA I, Bmr I, Bsa I, Bst71 I, BsmA I, BsmB I, BsmF I, BspM I, Ear I, Fau I, Fok I, Hga I, Ple I, Sap I, SSfaN I, 및 Sthi32 I로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, IIS형 제한 효소가 BceA I 또는 BsmF I인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제2항에 있어서, 제1 프라이머가 제2 프라이머 상의 제한 효소 인식 부위와는 다른 제한 효소 인식 부위를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제1 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 (c)의 DNA를 절단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제2항에 있어서, 제1 또는 제2 프라이머가 5' 말단에 태그를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제2항에 있어서, 제1 프라이머가 5' 말단에 태그를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제27항에 있어서, 태그를 사용하여 증폭 DNA를 주형 DNA로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 태그를 사용하여 혼입 뉴클레오티드를 포함하는 증폭 DNA를 혼입 뉴클레오티드를 함유하지 않는 증폭 DNA로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 태그가 방사성 동위 원소, 형광성 리포터 분자, 화학 발광성 리포터 분자, 항체, 항체 단편, 합텐, 바이오틴, 바이오틴의 유도체, 포토바이오틴, 이미노바이오틴, 디곡시게닌, 아비딘, 효소, 아크리디늄, 당, 효소, 아포효소, 동종 중합체성 올리고뉴클레오티드, 호르몬, 강자성 부분, 상자성 부분, 반자성 부분, 인광성 부분, 발광성 부분, 전기 화학 발광성 부분, 염색성 부분, 탐지가능한 전자 스핀 공명, 전기 용량, 유전 상수 또는 전기 전도도를 가지는 부분, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제24항에 있어서, 태그가 바이오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 바이오틴 태그를, 스트렙타비딘 매트릭스를 사용하여 증폭 DNA를 주형 DNA로부터 분리하는 데에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 스트렙타비딘 매트릭스가 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코팅된 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제2항에 있어서, (c)에서의 뉴클레오티드의 혼입이 대장균 DNA 폴리머라제, 대장균 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편, T7 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제 및 시쿼나제로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 폴리머라제에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제2항에 있어서, (c)에서의 뉴클레오티드의 혼입이 표지된 뉴클레오티드 혼입을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제2항에 있어서, (c)에서의 뉴클레오티드의 혼입이 표지되지 않은 뉴클레오티드 혼입을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 디데옥시뉴클레오티드 및 데옥시뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제33항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 방사성 분자, 형광성 분자, 항체, 항체 단편, 합텐, 탄수화물, 바이오틴, 바이오틴의 유도체, 인광성 부분, 발광성 부분, 전기 화학 발광성 부분, 염색성 부분, 및 탐지가능한 전자 스핀 공명, 전기용량, 유전 상수 또는 전기 전도도를 가지는 부분으로 구성된 군으로부터 선택되는 분자로 표지된 것임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제33항에 있어서, 표지된 뉴클레오티드가 형광성 분자로 표지된 것임을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 표지되지 않은 뉴클레오티드 혼입을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제2항에 있어서, (d)에서의 목적 유전자좌의 서열 결정 단계가 뉴클레오티드를 탐지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제33항에 있어서, (d)에서의 목적 유전자좌의 서열 결정 단계가 표지된 뉴클레오티드를 탐지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 탐지가 겔 전기 영동법, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법, 형광성 탐지법, 서열 결정법, ELISA, 질량 분광 분석법, 형광 측정법, 혼성화법, 마이크로어레이, 그리고 서던 블롯으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  42. 제40항에 있어서, 탐지 방법이 DNA 서열 결정법인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 탐지 방법이 형광성 탐지법인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제2항에 있어서, 목적 유전자좌가 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 돌연변이를 함유할 것으로 의심되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제2항에 있어서, 상기 방법을 다수의 목적 유전자좌의 서열을 동시에 결정하는 데에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 주형 DNA가 단일 염색체로부터 유래된 다수의 유전자좌를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 주형 DNA가 상이한 염색체로부터 유래된 다수의 유전자좌를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제45항에 있어서, 주형 DNA 상의 목적 유전자좌를 하나의 반응에서 증폭시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제45항에 있어서, 주형 DNA 상의 각각의 목적 유전자좌를 개별적인 반응에서증폭시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 증폭된 DNA를 함께 모은 후에 이 증폭 DNA를 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제45항에 있어서, 목적 유전자좌를 함유하는 (c)에서의 각 표지된 DNA를 (d) 단계 전에 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제45항에 있어서, 목적 유전자좌 중 하나 이상이 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 돌연변이를 함유할 것으로 의심되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 목적 유전자좌의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위의 일부를 함유하고, 주형 DNA의 증폭시에 완전한 제한 효소 인식 부위가 발생되어 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 발생시키며;
    (b) 증폭된 DNA를 제2 프라이머와 주형 DNA에 의해 발생되는 완전한 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) 주형으로서 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계; 및
    (d) (c)의 DNA의 서열 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제52항에 있어서, 제2 프라이머의 3' 영역이 주형 DNA와의 미스매치를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제53항에 있어서, 미스매치가 3' 영역의 마지막 1, 2 또는 3 염기에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 목적 유전자좌의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 인식 부위로부터 떨어져서 DNA를 절단하는 제한 효소의 인식 부위를 포함하고, 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행이 발생되며, 제1 프라이머는 제2 프라이머 상의 제한 효소 인식 부위와는 다른 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 5' 말단에 태그를 포함하며;
    (b) 증폭된 DNA를 제2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) 주형으로서 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단된 DNA 내로 표지 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계;
    (d) (c)의 DNA를 제1 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계; 및
    (e) 표지된 뉴클레오티드를 함유하는 (d)의 절단된 DNA의 서열을 결정함으로써 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 목적 유전자좌의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 인식 부위로부터 떨어져서 DNA를 절단하는 제한 효소의 인식 부위를 포함하고, 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행이 발생되며, 제1 프라이머는 제2 프라이머 상의 제한 효소 인식 부위와는 다른 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 5' 말단에 태그를 함유하며, PCR 사이클 1의 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제2 프라이머의 3' 영역의 일부의 용융 온도이고, PCR 사이클 2의 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제1 프라이머의 3' 영역의 일부의 용융 온도이고, 나머지 사이클의 어닐링 온도는 대략 전체 제2 프라이머의 용융 온도이며;
    (b) 증폭된 DNA를 제2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) 주형으로서 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 사용하여 (b)의 절단된 DNA 내로 표지 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계;
    (d) (c)의 DNA를 제1 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계; 및
    (e) 표지된 뉴클레오티드를 함유하는 (d)의 절단된 DNA의 서열을 결정함으로써 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제56항에 있어서, 태그를 사용하여 증폭 DNA를 주형 DNA로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 방법에서 사용된 프라이머 세트 및 지시사항의 세트를 포함하는 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 키트로서, 여기서 제2 프라이머는 제한 효소의 인식 부위를 발생시키는 서열을 함유함으로써, 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행을 발생시키는 것을 특징으로 하는 키트.
  60. 제한 효소를 이용한 절단에 의해 DNA 단편 상에 5' 오버행이 발생되며, 목적 유전자좌 및 제한 효소 인식 부위는 서로 관련성을 가져 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행이 발생되는, 서열 결정될 목적 유전자좌 및 제한 효소 인식 부위를 함유하는 DNA 단편.
  61. 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위를 함유함으로써, 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행을 발생시키며;
    (b) 증폭된 DNA를 제2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) (b)의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계로, 여기서
    (i) 신장을 종결시키는, 목적 유전자좌의 대립유전자에 상보성인 뉴클레오티드를 상기 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키고,
    (ii) 목적 유전자좌의 상이한 대립유전자에 상보성인 뉴클레오티드를 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키고, 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 중 뉴클레오티드에 상보성인 상기 종결 뉴클레오티드를 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키며; 그리고
    (d) (c)의 DNA의 서열 결정에 의해 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 제한 효소 인식 부위의 일부를 함유하고, 주형 DNA의 증폭시에 완전한 제한 효소 인식 부위가 발생되어 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행을 발생시키며;
    (b) 증폭된 DNA를 제2 프라이머와 주형 DNA에 의해 발생되는 완전한 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) (b)의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계로, 여기서
    (i) 신장을 종결시키는, 목적 유전자좌의 대립 유전자에 상보성인 뉴클레오티드를 상기 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키고,
    (ii) 목적 유전자좌의 상이한 대립유전자에 상보성인 뉴클레오티드를 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키고, 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 중 뉴클레오티드에 상보성인 상기 종결 뉴클레오티드를 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키며; 그리고
    (d) (c)의 DNA의 서열 결정에 의해 목적 유전자좌의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 인식 부위로부터 떨어져서 DNA를 절단하는 제한 효소의 인식 부위를 함유하고, 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 포함하는 5' 오버행이 발생되며, 제1 프라이머는 제2 프라이머 상의제한 효소 인식 부위와는 다른 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 5' 말단에 태그를 함유하며;
    (b) 증폭된 DNA를 제2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) (b)의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계로, 여기서
    (i) 신장을 종결시키는, 목적 유전자좌의 대립 유전자에 상보성인 표지 뉴클레오티드를 상기 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키고,
    (ii) 목적 유전자좌의 상이한 대립유전자에 상보성인 뉴클레오티드를 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키고, 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 중 뉴클레오티드에 상보성인 상기 종결 뉴클레오티드를 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키며;
    (d) (c)의 DNA를 제1 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계; 및
    (e) 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 (d)의 절단된 DNA의 서열 결정에 의해 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열 결정 방법으로서,
    (a) 제1 및 제2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상에서 목적 유전자좌를 증폭시키는 단계로, 여기서 제2 프라이머는 인식 부위로부터 떨어져서 DNA를 절단하는제한 효소의 인식 부위를 함유하고, 제한 효소를 이용한 절단에 의해 목적 유전자좌를 함유하는 5' 오버행이 발생되며, 제1 프라이머는 제2 프라이머 상의 제한 효소 인식 부위와는 다른 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 5' 말단에 태그를 함유하며, PCR 사이클 1의 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제2 프라이머의 3' 영역의 일부의 용융 온도이고, PCR 사이클 2의 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제1 프라이머의 3' 영역의 일부의 용융 온도이고, 나머지 PCR 사이클의 어닐링 온도는 대략 전체 제2 프라이머의 용융 온도이며;
    (b) 증폭된 DNA를 제2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계;
    (c) (b)의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 혼입시키는 단계로, 여기서
    (i) 신장을 종결시키는, 목적 유전자좌의 대립 유전자에 상보성인 뉴클레오티드를 상기 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키고,
    (ii) 목적 유전자좌의 상이한 대립유전자에 상보성인 뉴클레오티드를 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키고, 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 중 뉴클레오티드에 상보성인 상기 종결 뉴클레오티드를 상기 상이한 대립유전자의 5' 오버행 내로 혼입시키며;
    (d) (c)의 DNA를 제1 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계; 및
    (e) 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 (d)의 절단된 DNA의 서열 결정에 의해 목적 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제61항에 있어서, 상기 방법을 정상 대립유전자의 존재 하에 돌연변이 대립유전자의 서열을 결정하는 데에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 돌연변이 대립유전자 및 정상 대립유전자가 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6-1:10, 1:11-1:20, 1:21-1:30, 1:31-1:40, 1:41-1:50, 1:51-1:60, 1:61-1:70, 1:71-1:80, 1:81-1:90, 1:91-1:100, 1:101-1:200, 1:250, 1:251-1:300, 1:301-1:400, 1:401-1:500, 1:501-1:600, 1:601-1:700, 1:701-1:800, 1:801-1:900, 1:901-1:1000, 1:1001-1:2000, 1:2001-1:3000, 1:3001-1:4000, 1:4001-1:5000, 1:5001-1:6000, 1:6001-1:7000, 1:7001-1:8000, 1:8001-1:9000, 1:9001-1:10,000, 1:10,001-1:20,000, 1:20,001-1:30,000, 1:30,001-1:40,000, 1:40,001-1:50,000, 그리고 1: 50,000 이상의 비로 구성된 군으로부터 선택되는 비로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 돌연변이 대립유전자가 BRCA1, BRCA2, MSH6, MSH2, MLH1, RET, PTEN, ATM, H-RAS, p53, ELAC2, CDH1, APC, AR, PMS2, MLH3, CYP1A1, GSTP1, GSTM1, AXIN2, CYP19, MET, NAT1, CDKN2A, NQ01, trc8, RAD51, PMS1, TGFBR2, VHL, MC4R, POMC, NROB2, UCP2, PCSK1, PPARG, ADRB2, UCP3, glurl, cart, SORBS1, LEP, LEPR, SIM1, TNF, IL-6, IL-1, IL-2, IL-3, ILIA, TAP2, THPO, THRB,NBS1, RBM15, LIF, MPL, RUNX1, Her-2, 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체, 갑상선 수용체, p21, p27, K-RAS, N-RAS, 망막아세포종 단백질, 비스코트-알드리히 증후군 (WAS) 유전자, 인자 V 라이덴, 인자 II (프로트롬빈), 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제, 낭성 섬유증, LDL 수용체, HDL 수용체, 수퍼옥시드 디스뮤타제 유전자 및 SHOX 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 돌연변이 대립유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
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