WO2009130797A1 - Abo式血液型を判定するためのプローブセット - Google Patents

Abo式血液型を判定するためのプローブセット Download PDF

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WO2009130797A1
WO2009130797A1 PCT/JP2008/058234 JP2008058234W WO2009130797A1 WO 2009130797 A1 WO2009130797 A1 WO 2009130797A1 JP 2008058234 W JP2008058234 W JP 2008058234W WO 2009130797 A1 WO2009130797 A1 WO 2009130797A1
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seq
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PCT/JP2008/058234
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Inventor
平山幸一
池谷博
櫻田宏一
Original Assignee
東洋鋼鈑株式会社
警察庁科学警察研究所長が代表する日本国
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a probe set for determining an AB0 blood group, and a method for determining an AB0 blood group using the probe set.
  • AB0 blood grouping is the oldest serology performed by forensic scientists. Karl Landsteiner discovered the ABO blood system in 1901 and developed a blood classification method. The basis of this method is antibody reactivity with A, B and H antigens found in erythrocytes and other tissues.
  • an aggregation assay using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against A-type and B-type antigens is used. In this way, the AA phenotype is not distinguished from the AO phenotype, and the BB phenotype is not distinguished from the B0 phenotype.
  • Antigens A and B are derived from H antigen (H oligosaccharide) by the action of two glycosyltransferases. Individuals with blood group A express transferase activity that transports N-acetyl galactosamine to the H antigen to form the A antigen. Individuals with blood group 0 have a long history of functional glycosyltransferases and as a result, express only unmodified H antigens on the cell surface.
  • Yamamoto et al., 1990, Nature 345 (17): 229-233 reported a sequence analysis of cDNA isolated from a known AB0 individual for the polymorphism of the AB0 glycosinotransferase gene. ing.
  • the cDNA encoding A and B transferases is 1062 base pairs long and encodes a protein of 353 amino acids.
  • the A and B allelic sequences differ from each other by 7 nucleotides and encode different proteins at 4 amino acids, which explains the different specificities of A and B transferases. It is.
  • the 0 allele encodes a protein lacking the functional domain of the transferase due to base pair deletion.
  • PCR is performed by amplifying a region containing a single nucleotide polymorphism by PCR, cleaving with a restriction enzyme, and then determining the single nucleotide polymorphism by gel electrophoresis.
  • -RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
  • An object of the present invention is to provide a simple and efficient means for determining AB0 blood group by detecting polymorphism of AB0 glycosyltransferase gene.
  • the present inventors have succeeded in designing a probe capable of efficiently discriminating single nucleotide polymorphisms existing in exon 6 and exon 7 in the AB0 glycosyltransferase gene on the genome, thereby completing the present invention. It came to.
  • the present invention includes the following.
  • a probe set for determining AB0 blood type including a type 0 determination probe pair and a type B determination probe pair,
  • Type 0 probe pair consists of the following probe 0-1 and probe 0-2: Probe 0-1: Base sequence of 22 bases or less including the 20136-20155 bases of SEQ ID NO: 1 or complementary to it Probe consisting of a simple base sequence,
  • Probe 0-2 Probe consisting of a base sequence of 22 or fewer consecutive base sequences including the 20136-20156 base in the base sequence from which the 20146th G was deleted in SEQ ID NO: 1, or a complementary base sequence thereof
  • Type B probe pair consists of the following probe B-1 and probe B-2 pairs: Probe B-1: Base sequence of 22 bases or less including the 21857th to 21886th bases of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence Probe consisting of a typical base sequence,
  • Probe B-2 Consists of a base sequence of 22 bases or less including the bases 21857 to 21876 in the base sequence in which the 21867th G is replaced with A in SEQ ID NO: 1, or a complementary base sequence thereto Probe
  • A2-type probe pair consists of the following probe A2-1 and probe A2-2: Probe A2-1: Sequence of 22 bases or less including the 21394-21409th bases of SEQ ID NO: 1 or complementary to it Probe consisting of a typical base sequence,
  • Probe A2-2 Consists of a base sequence of 22 bases or less including the 21394-21409th base in the base sequence in which 21404th C is substituted with T in SEQ ID NO: 1 or a complementary base sequence thereof Probe
  • A3 type probe pair consists of the following probes A3-1 and probe A3-2: probe A3-1: base sequence of 22 bases or less including the 21798-21817th bases of SEQ ID NO: 1 or complementary to it Probe consisting of a typical base sequence,
  • Probe A3-2 Consists of a base sequence of 22 bases or less, including bases 21798 to 21817 in the base sequence in which 21808th G is substituted with A in SEQ ID NO: 1, or a complementary base sequence thereto Probe
  • B3 type probe pair consists of the following probe B3-1 and probe B3-2: Probe B3-1: 22 or less consecutive bases including the 21981th to 22000th bases of SEQ ID NO: 1 A probe comprising a base sequence of or a base sequence complementary thereto,
  • Probe B3-1 ' A probe consisting of a base sequence in which the 5' end of the 21981 to 22000th base of SEQ ID NO: 1 and the 1 'base at the 3' end or 3 'end are deleted or a base sequence complementary thereto
  • Probe B3-2 ′ a nucleotide sequence in which the 21981st to 22000th bases in the base sequence in which 21991th C is replaced with T in SEQ ID NO: 1 and / or one base at the 3 ′ end deleted Probe consisting of complementary base sequence
  • Extracting genomic DNA from a sample derived from a subject Extracting genomic DNA from a sample derived from a subject
  • (1) or (2) a step of contacting the probe set with the amplified nucleic acid, and a step of measuring the ratio of the nucleic acid hybridized to one probe and the nucleic acid hybridized to the other probe in each probe pair;
  • a kit for determining AB0 blood type comprising the probe set according to (1) or (2), or the microarray according to (3) or (4).
  • Figure 3 shows nucleic acid amplified from genomic DNA from 44 specimens with various blood types. The figure shows the result of hyper-hybridizing the probe pair and type B probe pair and plotting the fluorescence intensity ratio in the type 0 judgment probe on the X axis and the type B probe pair probe fluorescence intensity ratio on the Y axis.
  • Figure 4 shows the results when nucleic acids amplified from A2, A3, B3, AO, and B0 DNA were hybridized to A2, A3, and B3 probe pairs. The ratio of the fluorescence intensity derived from the nucleic acid hybridized to each probe pair is shown.
  • Figure 5 shows the nucleic acid amplified from A2-type, AO-type, and B0-type DNAs when hybridized to A2-type probe pairs consisting of 20-base, 18-base, or 16-base sequences. The ratio of fluorescence intensity derived from soybean nucleic acid is shown.
  • the AB0 daricosyltransferase gene on the genome has a polymorphism and has A, B and 0 counter gene sequences.
  • the A and B alleles encode A and B transferases with different specificities, respectively.
  • the A allele encodes a protein having N-acetyl galactosaminyltransferase activity and the B allele encodes a protein having galactosyltransferase activity.
  • the 0 allele encodes a protein lacking the functional domain of the transferase due to a base pair deletion.
  • AB0 blood types include AA, BB, AO, B0, AB and 00.
  • AA type subtypes include A2 type and A3 type
  • BB type subtypes include B3 type.
  • A2 type, A3 type, and B3 type are blood type subtypes identified in antigen-antibody reaction, but point mutation sites in gene sequences have been reported (IMMUNOHEMATOL0GY, 20 (1) (2004) 3-22 ⁇ ).
  • the sequence of the AB0 glycosyltransferase gene is known and is registered in a public database (GenBank). For example, the sequence of the A allele is registered as A101 (AF134412), the sequence of the B allele is registered as B101 (AF016622, AJ536135), and the sequence of the 0 allele is 001 (AF134415, AF134435, AF134436).
  • the sequence of A2 gene is registered as A201 (AF134421, AF134422), the sequence of A3 gene is registered as A301 (AF134423, AF134424), and the sequence of B3 gene is B30KAF134431, AF134432). It is registered as. Each sequence is available, for example, from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/force.
  • the probe set for determining the AB0 blood group of the present invention includes a type 0 determination probe pair and a type B determination probe pair.
  • the probe set of the present invention includes a probe 0-1 and a probe as a type 0 determination probe pair. Includes probe 0-2 pair, probe or probe 0-1 'and probe 0-2' pair.
  • Probe 0-1 is a probe consisting of a continuous 22-base or less base sequence including the 20136-20155 bases (SEQ ID NO: 2) of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, and preferably A probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Probes 0-2 have a base sequence of 22 bases or less including the 20136 to 20156 bases (SEQ ID NO: 3) in the base sequence from which the 20146th G is deleted in SEQ ID NO: 1, or a complementary sequence thereto. It is a prop consisting of simple sequences.
  • a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is preferred.
  • Probe 0- is a probe consisting of a base sequence in which the 5 'end of the 6th to 6th bases of SEQ ID NO: 1 and the 1st base of Z or 3' end are deleted, or a complementary sequence thereof.
  • Lobe 0-2 ' is the nucleotide sequence in which one of the bases from 20136 to 20156 in the base sequence from which the 20146th G was deleted in SEQ ID NO: 1 and one base at the Z or 3' end has been deleted.
  • the probe 0- and probe 0-2 'pairs it is preferable to use pairs having the same deletion at the 5' end and the 3 'end. For example, when probe 0- has a single base deletion only at the 5 'end, it is preferred that probe 0-2' also has a single base deletion only at the 5 'end.
  • the 0 type determination probe pair preferably includes a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the probe set of the present invention includes a pair of probe B-1 and probe B-2, and a pair of Z or probe ⁇ - and probe B-2 ′ as a B-type determination probe pair.
  • Probe B-1 ′ is a probe consisting of a base sequence in which one base at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the 21857th to 21876th bases of SEQ ID NO: 1 is deleted or a complementary sequence thereto
  • Probe B-2 ' has a deletion of the 5' end of the 21857th to 21876th base and the 1 'base of the 3' end in the base sequence in which the 21867th G is replaced with A in SEQ ID NO: 1.
  • probe B-2 ′ also has a deletion of 1 base only at the 5 ′ end.
  • the B-type determination probe pair preferably includes a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the probe set for determining the AB0 blood group according to the present invention further comprises at least one probe pair selected from the group consisting of an A2 determination probe pair, an A3 determination probe pair, and a B3 determination probe pair. May be included.
  • the probe set of the present invention includes a pair of probe A2-1 and probe A2-2, and a pair of probe A2-1 and probe A2-2 'as a type A2 determination probe pair.
  • Probe A2-1 is an isolated base sequence of 22 bases or less, preferably 17 bases or less including or complementary to the 21394 to 21409th bases of SEQ ID NO: 1 (sequence complementary to SEQ ID NO: 6).
  • a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is preferred.
  • the probe A2-2 is a sequence of 22 bases or less including the 21394th to 21409th bases (sequence complementary to SEQ ID NO: 7) in the base sequence in which 21404th C is substituted with T in SEQ ID NO: 1, preferably 17
  • a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 is preferred.
  • Probe A2- is a probe consisting of a base sequence from which the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the 21394 to 21409th bases of SEQ ID NO: 1 have been deleted or a sequence complementary thereto
  • the probe A2- 2 ′ is a base sequence in which the bases of 21394 to 21409 in the base sequence in which 21404th C is substituted with T in SEQ ID NO: 1 are deleted or complementary to the base sequence in which one base at the 3 ′ end is deleted.
  • It is a probe consisting of a typical sequence.
  • the A2 type determination probe pair preferably includes a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the probe set of the present invention includes a pair of a probe A3-1 and a probe A3-2 and / or a pair of a probe A3-1 ′ and a probe A3-2 ′ as an A3 type determination probe pair.
  • the probe A3-1 is a probe comprising a continuous 22-base or less base sequence including the 21798 to 21817th bases (SEQ ID NO: 8) of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, preferably SEQ ID NO: This probe consists of 8 base sequences.
  • Probe A3-2 is a base sequence of 22 bases or less that includes 21798 to 21817th base (SEQ ID NO: 9) in the base sequence in which 21808th G is substituted with A in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereto
  • This probe consists of A probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9 is preferred.
  • Probe A3-1 ′ is a probe consisting of a base sequence in which one base at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the 21798 to 21817th bases of SEQ ID NO: 1 has been deleted or a complementary sequence thereto.
  • A3-2 ' is the base in which the 5' end of the 21798 to 21817th base and the 1 base of Z or 3 'end are lost in the nucleotide sequence' in which the 21808th G is substituted with A in SEQ ID NO: 1.
  • a probe comprising a sequence or a sequence complementary thereto.
  • Probe A3-1 'and probe In the A3-2 ′ pair it is preferable to use a pair having the same deletion at the 5 ′ end and the 3 ′ end. For example, when probe A3-1 'has a 1 base deletion only at the 5' end, it is preferred that probe A3-2 'also has a 1 base deletion only at the 5' end.
  • the A3 type determination probe pair preferably includes a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the probe set of the present invention includes a pair of probe B3-1 and probe B3-2, and a pair of Z or probe B3-1 ′ and probe B3-2 ′ as a B3 type determination probe pair.
  • Probe B3-1 is a probe consisting of a base sequence of 22 bases or less including the 21981 to 22000th salt (SEQ ID NO: 10) of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, preferably the sequence It is a probe consisting of the nucleotide sequence of number 10.
  • Probe B3-2 has a base sequence of 22 bases or less including the 21981 to 22000th base (SEQ ID NO: 1 1) in the base sequence in which 21991-th C is replaced by T in SEQ ID NO: 1, or a sequence thereof. It is a probe consisting of a typical sequence. A probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 11 is preferred.
  • Probe B3-1 ' is a probe consisting of a base sequence from which the 5' end and / or the 3 'end of the 21981th to 22000th bases of SEQ ID NO: 1 have been deleted or a sequence complementary thereto
  • probe B3 -2 ' is a nucleotide sequence in which the 2'th to 22000th bases of the base sequence in which 21991-th C is substituted with T in SEQ ID NO: 1 and / or the 1' base at the 3'-end deleted.
  • probe B3-1 ' has a single base deletion only at the 5' end
  • probe B3-2 ' also has a single base deletion only at the 5' end.
  • the B3 type determination probe pair preferably includes a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 and a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the present invention also relates to a method for determining the AB0 blood type of a subject using the probe set.
  • the hybridized nucleic acid is brought into contact with the amplified nucleic acid obtained by an amplification reaction using genomic DNA derived from a biological sample of a subject (usually a human subject) as a cage.
  • each probe pair is characterized by measuring the ratio of the nucleic acid hybridized to one probe and the nucleic acid hybridized to the other probe (ratio of the amount of nucleic acid).
  • Amplified nuclear acid obtained by amplification reaction using genomic DNA derived from a subject's biological sample as a cocoon is usually AB0 glycosylated using genomic DNA- derived from the subject's biological sample as a cocoon.
  • the primer set for amplifying a region containing exon 6 includes a primer set consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 18 and a primer set consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 19.
  • examples of a primer set for amplifying a region containing exon 7 include a primer set consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 20 and a primer set consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the method for determining the AB0 blood type of the present invention is as follows:
  • Extracting genomic DNA from a sample derived from a subject Extracting genomic DNA from a sample derived from a subject
  • Two probes measuring the ratio of hybridized nucleic acids in each probe pair preferably have the same base length.
  • the ratio of the nucleic acid hybridized to one probe and the nucleic acid hybridized to the other probe is used to determine the genotype of the subject, that is, the AB0 blood type (AA type, AO type, B0 type, AB Type and 00 type, and A2 type, A3 type and B3 type).
  • Type 0 means AO type or B0 type.
  • Type means AA, AB or BB.
  • the value of 0-2 / 0-1 is 00 type>? 0 type>? It becomes a type. Therefore, by setting the threshold value to the value 0-2 / 0-1, 00 type,? Type 0 or? ? You can determine which type it is.
  • 0-2 / 0-1 is 3.0 or more, it is judged as 00 type, and if the value of 0-2 / 0-1 is more than 1.0 and less than 3.0, it is If the value of 0-2 / 0-1 is less than 1.0? Can be determined as a type. The same applies to the value of the nucleic acid hybridized to probe 0-2 ′ / the value of the nucleic acid hybridized to probe 0-1 ′ (0-2 ′ / 0-1 ′).
  • B? Type means AB type or B0 type. ?
  • the type means AA type, AO type or 00 type.
  • the value of B-2 / B-1 is BB type> B? Type>? It becomes a type. Therefore, by setting the threshold value to the value of B-2 / B-1, BB type, B? Type or? ? You can determine which type it is.
  • the ⁇ type, ⁇ type, AO type, B0 type, AB type or 00 type can be determined.
  • the blood type of the subject is A2 You can determine if it is a type. By setting a threshold value to the value of A2-2 / A2-1, it can be determined whether or not it is A2 type. For example, if the value of A2-2 / A2-1 is 1.5 or more, it can be judged as A2 type. The same applies to the value of the nucleic acid hybridized to probe A2-2 '/ the nucleic acid hybridized to probe A2-1' (A2-2 '/ 2-2-).
  • the blood type of the subject is A3 type Can be determined.
  • A3 type Can be determined whether or not it is A3 type. For example, if the value of A3- 2 / A3-1 is 2.0 or more, it can be determined as A3 type.
  • the blood type of the subject is type B3 Can be determined.
  • a threshold value to the value of B3- 2 / B3-1, it can be determined whether it is B3 type or not. For example, if the value of B3-2 / B3-1 is 2.0 or more, it can be determined as B3 type.
  • Nucleic acid hybridized to probe B3-2 '/ hybridized to probe B3-1' The same applies to the value of the nucleic acid (B3-2 '/ B3-1').
  • the threshold varies depending on the experimental conditions and can be appropriately set by those skilled in the art. More specifically, for a subject whose genotype is known, nucleic acid hybridization is performed for each probe pair, statistical processing is performed, and a standard value of the above ratio is obtained for each genotype. The genotype of the subject can be determined by calculating and comparing the ratio of the subject whose genotype is unknown to the standard value.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it contains genomic DNA.
  • blood and blood-related samples derived from it blood, serum, plasma, etc.
  • lymph fluid sweat, tears, saliva, urine, feces, ascites and cerebrospinal fluid
  • cells, tissues or Examples include crushed organ extracts and extracts.
  • a blood-related sample is preferably used.
  • Hybridization reaction between amplified nucleic acid and probe obtained by amplification reaction using genomic DNA as a cage, and measurement of the ratio of nucleic acid hybridized to one probe and nucleic acid hybridized to the other probe in each probe pair can be carried out by methods that are customary in the art. Specifically, it can be implemented as follows.
  • genomic DNA is extracted from a biological sample collected from a subject.
  • the extraction means is not particularly limited, but is preferably a means capable of directly separating the DNA component from the biological sample, purifying it, and collecting it.
  • Specific examples of extraction means include DNA extraction methods using, for example, phenol / chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB, and the like.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed using the obtained genomic DNA as a saddle type to amplify the detection target region.
  • a nucleic acid amplification reaction polymerase chain reaction (PCR), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), etc. can be applied.
  • the detection target region is a region having specificity to such an extent that a polymorphism in exon 6 and Z or exon 7 contained in the AB0 glycosyltransferase gene on the genomic DNA of the subject can be determined.
  • the nucleic acid amplification reaction is preferably performed on the region containing exon 6 and the region containing Z or exon 7.
  • the method for labeling the amplified nucleic acid is not particularly limited.
  • a method in which a primer used in the nucleic acid amplification reaction is labeled in advance may be used, or a labeled nucleotide may be used in the nucleic acid amplification reaction. Any method used as a substrate may be used.
  • the labeling substance is not particularly limited, and radioisotopes, fluorescent dyes, or organic compounds such as digoxigenin (DIG) and piotin can be used.
  • this reaction system consists of a buffer necessary for nucleic acid amplification 'labeling, a heat-resistant DNA polymerase, a detection region-specific primer, a labeled nucleotide triphosphate (specifically, a nucleotide triphosphate added with a fluorescent label, etc.), It is a reaction system containing nucleotide triphosphate and magnesium chloride.
  • the amount of nucleic acid hybridized to each probe can be measured, for example, by detecting a label.
  • the amplified nucleic acid hybridized to the probe can be quantified, for example, by preparing a calibration curve using a sample containing a known amount of DNA.
  • the probe of the present invention may be immobilized on the same carrier or may be immobilized on a different carrier.
  • the material for the carrier in the microarray those known in the art can be used and are not particularly limited.
  • a carrier having a carbon layer and a chemical modification group on the surface is preferably used as the carrier.
  • Carriers having a carbon layer and a chemical modification group on the surface include those having a carbon layer and a chemical modification group on the surface of the substrate, and those having a chemical modification group on the surface of the substrate made of the carbon layer.
  • materials for the substrate those known in the art can be used. There is no particular limitation, and the same carrier materials as described above can be used.
  • the present invention is suitably used for a carrier having a fine flat plate structure.
  • the shape is not limited to a rectangular shape, a square shape, a circular shape, or the like, but usually, a shape of 1 to 75 mm square, preferably 1 to: L0 square, more preferably 3 to 5 square. Since it is easy to produce a carrier having a fine flat plate structure, it is preferable to use a substrate made of a silicon material or a resin material. Particularly, a carrier having a carbon layer and a chemical modification group on the surface of a substrate made of single crystal silicon is more preferable. preferable. Single crystal silicon has crystal axis orientation slightly changed in some parts (sometimes referred to as mosaic crystal), or atomic scale disorder (lattice defects) Are also included.
  • the carbon layer to be formed on the substrate in the present invention is not particularly limited, but synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon, carbon-based material (for example, glue) (Laphite, fullerene, carbon nanotube), a mixture thereof, or a laminate of them is preferably used.
  • carbides such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide may be used.
  • the formation of the strong bond layer can be performed by a known method.
  • microwave plasma CVD Chemical vapor deposit
  • ECRCVD Electro cyclotron resonance chemical vapor deposit
  • ICP Inductive coupled plasma
  • DC sputtering method ECR (Electric cyclotron resonance) sputtering method
  • ionization deposition method Arc type vapor deposition, laser vapor deposition, EB (Electron beam) vapor deposition, resistance heating vapor deposition, and the like.
  • a raw gas (methane) is decomposed by glow discharge generated between electrodes due to high frequency, and a DLC (diamond-like carbon) layer is synthesized on the substrate.
  • the source gas (benzene) is decomposed and ionized using thermionic electrons generated by tungsten filaments, and carbon is applied to the substrate by a bias voltage.
  • the DLC layer may be formed by ionized vapor deposition in a mixed gas consisting of 1 to 99% by volume of hydrogen gas and 99 to 1% by volume of methane gas.
  • a DC voltage is applied between a solid graphite material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode) to cause an arc discharge in a vacuum to generate carbon atom plasma from the cathode.
  • a negative bias voltage is applied to the substrate even more negatively than the evaporation source, the carbon ions in the plasma can be accelerated toward the substrate to form a force layer.
  • a carbon layer is formed by depositing carbon atoms on a glass substrate by irradiating a target plate of a graph eye with Nd: YAG laser (pulse oscillation) light and melting it. it can.
  • the thickness of the carbon layer is usually about a monomolecular layer to about 100 ⁇ . If it is too thin, the surface of the base substrate may be locally exposed. When the thickness is too large, the productivity is deteriorated, so that the thickness is preferably 2 nm to l ⁇ m, more preferably 5 nm to 500 nra.
  • the probe By introducing a chemical modifying group into the surface of the substrate on which the carbon layer is formed, the probe can be firmly immobilized on the carrier.
  • the chemical modification group to be introduced can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited, and examples thereof include an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a formyl group, a hydroxyl group, and an active ester group.
  • the introduction of the amino group can be carried out, for example, by irradiating the carbon layer with ultraviolet light in ammonia gas or by plasma treatment.
  • the carbon layer can be chlorinated by irradiating it with ultraviolet rays in chlorine gas and further irradiating with ultraviolet rays in ammonia gas.
  • it can be carried out by reacting a gas of polyvalent amine such as methylenediamine and ethylenediamine with a chlorinated carbon layer.
  • the introduction of a carboxyl group can be carried out, for example, by reacting an appropriate compound with the carbon layer aminated as described above.
  • Dicarboxylic acid monohalides such as succinic acid monochloride, malonic acid monochloride; acid anhydrides such as phthalic anhydride, succinic anhydride, oxalic anhydride, anhydrous maleic acid, butanetetracarboxylic anhydride It is done.
  • an epoxy group can be carried out, for example, by reacting a suitable polyvalent epoxy compound with the carbon layer aminated as described above. Alternatively, it can be obtained by reacting an organic peracid with the carbon-carbon double bond contained in the striking bon layer.
  • organic peracids include peracetic acid, perbenzoic acid, diperoxyphthalic acid, performic acid, and trifluoroperacetic acid.
  • the introduction of the formyl group can be carried out, for example, by reacting glutaraldehyde with the carbon layer aminated as described above.
  • Introduction of a hydroxyl group can be carried out, for example, by reacting water with the carbon layer chlorinated as described above.
  • the active ester group means an ester group having an electron-withdrawing group having high acidity on the alcohol side of the ester group and activating a nucleophilic reaction, that is, an ester group having high reaction activity.
  • This ester group has an electron-withdrawing group on the alcohol side of the ester group and is more activated than an alkyl ester.
  • the active ester group has reactivity with groups such as amino group, thiol group, and hydroxyl group. More specifically, phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, cyanomethyl esters, and heterocyclic hydroxy compound esters have much higher activity than alkyl esters. Known as active ester groups.
  • active ester groups include, for example, p-nitrotropenyl group, N-hydroxysuccinimide group, succinic acid imide group, phthalic acid imide group, 5-norbornene-2,3-di- Examples thereof include a carboximide group, and an N-hydroxysuccinimide group is particularly preferably used.
  • the introduction of the active ester group can be achieved by, for example, dehydrating condensation agents such as cyanamide carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide) introduced as described above. And active esterification with a compound such as N-hydroxysuccinimide.
  • dehydrating condensation agents such as cyanamide carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide) introduced as described above.
  • active esterification with a compound such as N-hydroxysuccinimide By this treatment, a group in which an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide group is bonded to the end of the hydrocarbon group via an amide bond can be formed (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-139532).
  • the present invention also relates to a kit for determining AB0 blood type, comprising the probe set of the present invention.
  • the kit in the kit of the present invention may be provided in the form of a microarray immobilized on a carrier.
  • the kit of the present invention further comprises a buffer necessary for labeling nucleic acid amplification, a heat-resistant DNA polymerase, a detection region specific primer, a labeled nucleotide triphosphate (specifically, a nucleotide to which a fluorescent label or the like is added. (Triphosphate), nucleotide triphosphate, magnesium chloride and the like.
  • the detection region-specific primer is preferably a primer for amplifying a region containing exon 6 of the AB0 glycosyltransferase gene and a primer for amplifying a region containing exon 7.
  • Two DLC layers were deposited on a 3rara square silicon substrate using the ionization deposition method under the following conditions.
  • SEQ ID NO: 1 Based on the base sequence of exon 6 in the genomic sequence of the AB0 glycosyltransferase gene (SEQ ID NO: 1), it consists of a base sequence of 17, 20, 23, or 25 bases, and the 5 'end was modified with an amino group. S type probes were synthesized. The base sequence of each probe is shown in Table 1 below. Probes 0-1-17 and 0-2-17, probes 0-1-20 and 0-2-20, probes 0-1-23 and 0-2-23, and probes 0-1-25 and 0-2 -25 corresponds to type 0 probe pair. table 1
  • Oral cells inside the vagina of a subject whose blood type was known to be type 0 were scraped with a cotton swab and suspended in PBS of IniL. The cells were collected by centrifugation at 5000 rpm for 1 minute. 180 ⁇ L of PBS was added. A lysate was prepared using Quick Gene DNA tissue kit S manufactured by Fujifilm, and genomic DNA was extracted using Quick Gene-800 manufactured by Fujifilm.
  • the DNA and ⁇ DNA, region (SEQ ID NO: 1 198 8 0-2 0410 th base, 528 bp) containing Ekison 6 of AB0 glycosyltransferase gene in a genomic region (SEQ ID NO containing ⁇ Pye ROCEPHIN 7
  • a PCR reaction solution was prepared with the composition shown in Table 2 so as to amplify the 21299th to 22084th bases of 1 (78 Gbp).
  • the sequences of primers 1 to 4 are shown in Table 3. Table 2
  • Primer sequence (5 ' ⁇ 3') Amplification length
  • Primer 1 AGCTCAGCTTGCTGTGTGTT (SEQ ID NO: 1 8)
  • 528 bp primer 2 AGATGCTGCATGAATGACC (SEQ ID NO: 1 9)
  • Primer 4 CAGAGTTTACCCGTTCTGCT (SEQ ID NO: 2)
  • the PCR reaction mixture prepared was subjected to a PCR reaction at the following temperature cycle using GeneArap PCR system 9700 (ABI). Cy5-dCTP was incorporated during PCR reaction, and amplified DM was Fluorescently labeled.
  • the test was performed in the same manner as in Example 2. Based on the base sequence of exon 6 and exon 7 in the genomic sequence of the AB0 daricosyltransferase gene (SEQ ID NO: 1), it consists of 20 bases consisting of 4 bases modified with an amino group at the 5 'end. That is, a type 0 determination probe pair (probe 0-1 and probe 0-2) and a type B determination probe pair (probe B-1 and probe B-2) were synthesized. The sequence of each probe is shown in Table 4 below. Table 4
  • the four types of probes shown in Table 4 were dissolved in a spot solution (Sol. 6) to 10 ⁇ ⁇ , and the carrier prepared in Example 1 using the spotter SPBI0 (manufactured by Hitachi Soft) was used. Spotted. After 1 hour baking at 80 ° C, 15 minutes with 2 X SSC / 0.2% SDS solution (room temperature) After washing, a microarray 2 in which four types of probes were immobilized on a carrier was obtained.
  • Example 2 using the oral cells inside the vagina of six subjects whose blood types are known to be AA type, AO type, B0 type, AB type and 00 type, respectively. Genomic DNA was extracted and PCR was performed using primers 1 to 4.
  • the PCR product and 3 X SSC / 0.3% SDS were mixed, dropped onto the microarray 2, and covered with a force bar. Placed in a watered tapper and incubated at 45 ° C for 1 hour. Washing was performed twice with 2X SSCZ 0.2% SDS and twice with 2X SSC at room temperature. The excess cleaning solution around microarray 2 was wiped off and covered with a cover glass. Subsequently, scanning with FLA 8000 (Fujifilm) was performed, and the fluorescence intensity of each probe spot was digitized from the fluorescence image using Array Gauge (Fujifilm). For each probe pair, the fluorescence intensity ratio was calculated from the fluorescence intensity.
  • Figure 2 shows the results of the measured fluorescence intensity and the fluorescence intensity ratio (fluorescence intensity at probe 0-2 / fluorescence intensity at probe 0-1 and fluorescence intensity at probe B-2 / fluorescence intensity at probe B-1). Shown in From the results of FIG. 2, using the 0 type determination probe pair (probe 0-1 and probe 0-2) and the B type determination probe pair (probe B-1 and probe B-2) of the present invention, It was shown that AA type, AO type, B0 type, AB type and 00 type can be judged.
  • Example 2 Based on the base sequence of exon 7 in the genomic sequence of the AB0 glycosyltransferase gene (SEQ ID NO: 1), 4 types of probes consisting of 20 bases and the 5 'end modified with an amino group, ie, A2 type determination probe Pair (probe A2-1 and probe A2-2), A3 type probe pair (probe A3-1 and probe A3-2), and B3 type probe pair (probe B3-1 and probe B3- 2) was synthesized. The sequence of each probe is shown in Table 5 below. Table 5
  • A2 type, A3 type, B3 type, AO type and the region containing exon 7 of AB0 glycosyltransferase gene (corresponding to the 21299 to 22084th base of sequence number 1, 786 bp) incorporating a DNA comprising the nucleotide sequence corresponding to Pi B0 type to synthetic plasmid P UC PCR was performed using primers 3 and 4 in the same manner as in Example 2 except that the plasmid was squared as a vertical DNA.
  • the fluorescence intensity ratio (A2-1 / A2-2) was small compared to other specimens even in the A2 type probe pair, and the A2 type could not be clearly determined.
  • the fluorescence intensity ratio (A3-1 / A3-2) in the A3 type determination probe pair is about 6.3 for the A3 type sample, while it is about 1.0 for the other type samples. there were.
  • the fluorescence intensity ratio (B3-1 / B3-2) in the B3 type probe pair is approximately 2.7, compared to approximately 1.0 for the other samples. It was possible to judge.
  • the region containing exon 7 of the AB0 daricosyltransferase gene (corresponding to nucleotides 21299 to 22084 in SEQ ID NO: 1, 786 bp) consists of nucleotide sequences corresponding to A2, AO and B0 types.
  • PCR was performed using primers 3 and 4 in the same manner as in Example 2 using the plasmid synthesized and synthesized in the plasmid pUC as the vertical DNA.
  • the fluorescence intensity ratio (A2-2-* / A2-1- *) of the A2-type specimen was slightly different compared to the AO-type and B0-type specimens.
  • the fluorescence intensity ratio (A2-2-16 / A2-1-16) is about 1.7 for the A2 type, about 0.3 for the AO type, and about 0.0 for the B0 type. The difference has grown. From the above, it was shown that a 16-base probe pair is preferable for A2 type determination.

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Abstract

ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の多型を検出することによりABO式血液型を判定するための簡便かつ効率的な手段を提供することを目的とする。本発明は、ABO式血液型を判定するための、O型判定プローブペア及びB型判定プローブペアを含むプローブセットに関する。

Description

AB0式血液型を判定するためのプローブセット 技術分野
本発明は、 AB0式血液型を判定するためのプローブセット、 及び該プロープセット を用いて AB0式血液型を判定する方法に関する。 背景技術 明
AB0 式血液型分類は法医学者により実施される最も古い血清学である。 Karl Landsteinerは、 1901年に ABO式血液システムを発見し、 血液分類方法を開発した。 この方法の基礎は、赤血球及ぴ他の組織に見出書される A、 B及び H抗原との抗体反応性 である。 当該方法では、 A、 B、 0及び AB表現型を区別するために、 A型-及ぴ B型-抗 原に対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を利用した凝集ァッセィ が用いられる。 この方法では、 AA表現型は AO表現型から区別されず、そして BB表現 型は B0表現型から区別されない。
抗原 A及ぴ Bは、 2種のグリコシルトランスフェラーゼの作用により H抗原（Hオリ ゴ糖） から誘導される。 血液型 Aを有する個人は、 N-ァセチルガラクトサミンを H抗 原に輸送して A抗原を形成するトランスフ ラーゼ活性を発現する。 血液型 0を有す る個人は、 機能的グリコシルトランスフェラーゼを久いており、 その結果、 細胞表面 上に変性されていない H抗原のみを発現する。
AB0グリコシノレトランスフェラ一ゼ遺伝子の多型について、 Yamamoto et al. , 1990, Nature 345 (17) : 229 - 233では、 既知の AB0型の個人から単離された cDNAの配列分析 が報告されている。 A及ぴ B トランスフェラーゼをコ一ドする cDNAは、 1062個の長さ の塩基対であり、 そして 353個のアミノ酸のタンパク質をコードしている。 A及ぴ B 対立遺伝子配列は、 7個のヌクレオチドで互いに異なっており、 4個のアミノ酸にお いて異なるタンパク質をコードしており、 これは A及ぴ B トランスフェラーゼの異な つた特異性を説明するものである。 0対立遺伝子は塩基対欠失により、 トランスフエ ラーゼの機能的ドメインを欠いた蛋白質をコードしている。
核酸を用いた AB0 グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子型の検出も行われており、 例えば、 一塩基多型を含む領域を PCRで増幅し、制限酵素で切断後、ゲル電気泳動で一 塩基多型を判定する PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 法や、 ゲノム DMにおける AB0グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の全塩基配列を決定し て比較するシークェンス法などが報告されている。
しかし、 従来の抗原抗体反応を利用して血球の凝集を目視で観察する判定方法や吸 光度を測定する特殊な方法は、 専門的な技術や経験が必要であり、 また最近市販の抗 体の性質上、 微量な試料から判定する場合に誤判定を生じる可能性があるなど、 多く の問題があった。 また、 PCR- RFLP法やシークェンス法などを用いた判定方法は、 コス トゃ時間がかかる上、 少量の試料での検査が困難であった。 発明の開示
本発明は、 AB0 グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の多型を検出することにより AB0式血液型を判定するための簡便かつ効率的な手段を提供することを目的とする。 本発明者らは、 ゲノム上の AB0グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるェキ ソン 6及ぴェキソン 7に存在する一塩基多型を効率的に識別できるプローブを設計す ることに成功し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下を包含する。
( 1 ) AB0式血液型を判定するためのプローブセットであって、 0型判定プローブペア 及び B型判定プローブペアを含み、
0型判定プローブペアが、 以下のプローブ 0-1及びプローブ 0-2のペア： プローブ 0-1：配列番号 1の 20136〜20155番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ 0-2：配列番号 1において 20146番目の Gが欠失した塩基配列における 20136〜20156番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相捕的 な塩基配列からなるプローブ
、 及び Z又は以下のプローブ 0-1'及ぴプローブ 0-2'のペア：
プローブ 0- ：配列番号 1の 20136〜20155番目の塩基の 5'末端及び /"又は 3'末端 の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、 プロープ 0-2' ：配列番号 1において 20146番目の Gが欠失した塩基配列における 20136〜20156番目の塩基の 5'末端及ぴ 又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基配列ま たはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含み、
B型判定プローブペアが、 以下のプローブ B- 1及ぴプローブ B-2のペア： プローブ B- 1：配列番号 1の 21857〜21876番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ B- 2：配列番号 1において 21867番目の Gが Aに置換された塩基配列にお ける 21857〜21876番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相 補的な塩基配列からなるプローブ
、 及び/又は以下のプローブ B-1'及ぴプローブ B- 2'のペア：
プローブ B- 1，：配列番号 1の 21857〜21876番目の塩基の 5'末端及ぴ 又は 3'末端 の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、 プロ一プ B- 2' ：配列番号 1において 21867番目の Gが Aに置換された塩基配列にお ける 21857〜21876番目の塩基の 5'末端及ぴ Z又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基配 列またはそれに相捕的な塩基配列からなるプロ一プ
を含む、 前記プローブセット。
( 2 ) A2型判定プロ一プペア、 A3型判定プローブペア及ぴ B3型判定プロ一ブペアか らなる群から選択される少なくとも 1のプローブペアをさらに含み、
A2型判定プローブペアが、 以下のプローブ A2- 1及ぴプローブ A2- 2のペア： プローブ A2- 1：配列番号 1の 21394〜21409番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ A2- 2：配列番号 1において 21404番目の Cが Tに置換された塩基配列にお ける 21394〜21409番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相 補的な塩基配列からなるプローブ
、 及び/又は以下のプローブ Α2- 及びプローブ A2- 2'のペア：
プローブ A2-1' ：配列番号 1の 21394〜21409番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末 端の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、 プローブ A2 - 2' ：配列番号 1において 21404番目の Cが Tに置換された塩基配列に おける 21394〜21409番目の塩基の 5'末端及び Z又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基 配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ，
を含み、
A3型判定プローブペアが、 以下のプローブ A3- 1及ぴプロープ A3- 2のペア： プロープ A3- 1：配列番号 1の 21798〜21817番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ A3- 2：配列番号 1において 21808番目の Gが Aに置換された塩基配列にお ける 21798〜21817番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相 補的な塩基配列からなるプローブ
、 及び Z又は以下のプローブ A3- 1'及びプロ一プ A3- 2'のペア：
プローブ A3- 1' ：配列番号 1の 21798〜21817番 gの塩基の 5'末端及び/又は 3'末 端の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩墓配列からなるプローブ、 プローブ A3- 2' ：配列番号 1において 21808番目の Gが Aに置換された塩基配列に おける 21798〜21817番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基 配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含み、
B3型判定プローブペアが、 以下のプロープ B3- 1及ぴプロープ B3- 2のペア： プローブ B3- 1：配列番号 1の 21981~22000番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ B3- 2：配列番号 1において 21991番目の Cが Tに置換された塩基配列にお ける 21981〜22000番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相 補的な塩基配列からなるプローブ
、 及び/又は以下のプロープ Β3- 及ぴプローブ B3- 2'のペア：
プローブ B3- 1' ：配列番号 1の 21981〜22000番目の塩基の 5'末端及びノ又は 3'末 端の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプ口一ブ、 プローブ B3- 2' ：配列番号 1において 21991番目の Cが Tに置換された塩基配列に おける 21981〜22000番目の塩基の 5'末端及び 又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基 配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
含む、 （1 ) 記載のプローブセット。
( 3 ) ( 1 ) 又は （2 ) 記載のプロ一プセットが担体上に固定化されてなる、 AB0式血 液型を判定するためのマイクロアレイ。
( 4 ) 担体が、 表面にカーボン層と化学修飾基とを有するものである、 （3 )記載のマ イクロアレイ。
( 5 ) 被検者の AB0式血液型を判定する方法であって、
被検者由来の試料からゲノム DNAを抽出する工程と、
抽出したゲノム DNAを錡型とし、 AB0グリコシルトランスフエラーゼ遺伝子におけ るェキソン 6を含む領域及ぴ Z又はェキソン 7を含む領域を増幅する工程と、
( 1 ) 又は （2 ) 記載のプローブセットと増幅核酸を接触させる工程と、 各プロープペアにおいて、 一方のプローブにハイプリダイズした核酸と他方のプロ ーブにハイブリダィズした核酸の比を測定する工程と
を含む、 前記方法。
( 6 ) ( 1 ) 若しくは （2 ) 記載のプローブセット、 又は （3 ) 若しくは （4 ) 記載の マイクロアレイを含む、 AB0式血液型を判定するためのキット。 図面の籣単な説明
図 1は、 0型の血液型を有する検体由来のゲノム DNAから増幅した核酸を 17塩基、 20塩基、 23塩基又は 25塩基の塩基配列からなる 0型判定プローブペアにハイブリダ ィズさせたときの、 各プローブペアにハイプリダイズした核酸に由来する蛍光強度及 びその比を示す。
図 2は、 各種血液型を有する検体由来のゲノム DNAから増幅した核酸を 0型判定プ ローブペア及ぴ B型判定プローブペアにハイブリダィズさせたときの、 各プローブぺ ァにハイプリダイズした核酸に由来する蛍光強度の比を示す。
図 3は、各種血液型を有する 44検体由来のゲノム DNAから増幅した核酸を 0型判定 プローブペア及ぴ B型判定プローブペアにハイプリダイズさせ、 0型判定プロ一ブぺ ァにおける蛍光強度比を X軸に、 B型判定プローブペアプローブ蛍光強度比 Y軸にプ ロットした結果を示す。
図 4は、 A2型、 A3型、 B3型、 AO型及ぴ B0型の DNAから増幅した核酸を A2型判定 プローブペア、 A3型判定プローブペア及ぴ B3型判定プローブペアにハイブリダィズ させたときの、 各プローブペアにハイブリダィズした核酸に由来する蛍光強度の比を 示す。
図 5は、 A2型、 AO型及び B0型の DNAから増幅した核酸を 20塩基、 18塩基又は 16 塩基の塩基配列からなる A2型判定プローブペアにハイブリダイズさせたときの、各プ ーブペアにハイプリダイズした核酸に由来する蛍光強度の比を示す。 発明を実施するための最良の形態
ゲノム上の AB0ダリコシルトランスフヱラーゼ遺伝子は多型を有し、 A、 B及び 0対 立遺伝子配列を有する。 A及び B対立遺伝子は、 異なる特異性を有する A及び B トラ ンスフェラーゼをそれぞれコードする。 A対立遺伝子は、 N-ァセチルガラクトサミニ ルトランスフェラ一ゼ活性を有するタンパク質をコードし、 B対立遺伝子は、 ガラク トシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。 0対立遺伝子は塩 基対欠失により、 トランスフェラーゼの機能的ドメインを欠いている蛋白質をコード する。 これらの対立遺伝子の組み合わせにより、 AB0式血液型には、 AA型、 BB型、 AO 型、 B0型、 AB型及ぴ 00型が存在する。 さらに、 AA型及ぴ BB型には亜型も存在し、 AA型の亜型としては、 A2型、 A3型が存在し、 BB型の亜型としては B3型が存在する。
A2型、 A3型おょぴ、 B3型はそもそも抗原抗体反応において識別される血液型の亜 型であるが、 現在では遺伝子配列における点変異の部位が報告されているものである (IMMUNOHEMATOL0GY, 20 (1) (2004) 3-22· )。
AB0 グリコシルトランスフェラ一ゼ遺伝子の配列は公知であり、 公開されたデータ ベース （GenBank)に登録されている。例えば、 A対立遺伝子の配列は、 A101 (AF134412) として登録されており、 B対立遺伝子の配列は、 B101 (AF016622， AJ536135)として登 録されており、 0対立遺伝子の配列は、 001 (AF134415， AF134435, AF134436)として登 録されている。 また、 A2遺伝子の配列は、 A201 (AF134421, AF134422)として登録され ており、 A3遺伝子の配列は、 A301 (AF134423, AF134424)として登録されており、 B3遺 伝子の配列は、 B30KAF134431, AF134432)として登録されている。各配列は、例えば、 http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/力 ら入手できる。
本発明の AB0式血液型を判定するためのプローブセットは、 0型判定プローブペア、 及び B型判定プローブペアを含む。
本発明のプローブセットは、 0型判定プローブペアとして、 プローブ 0-1及びプロ ーブ 0-2のペア、 及ぴノ又はプローブ 0-1'及ぴプローブ 0-2'のペアを含む。
プローブ 0-1は、配列番号 1の 20136〜20155番目の塩基（配列番号 2 ) を含む連続 した 22塩基以下の塩基配列又はそれに相捕的な配列からなるプロ一ブであり、好まし くは配列番号 2の塩基配列からなるプローブである。 プローブ 0 - 2は、 配列番号 1に おいて 20146番目の Gが欠失した塩基配列における 20136〜20156番目の塩基（配列番 号 3 )を含む連続した 22塩基以下の塩基配列又はそれに相捕的な配列からなるプロ一 プである。 好ましくは配列番号 3の塩基配列からなるプローブである。
プローブ 0- は、配列番号 1の 20136〜20155番目の塩基の 5'末端及ぴ Z又は 3'末 端の 1塩基が欠失した塩基配列又はそれに相捕的な配列からなるプローブであり、 プ ローブ 0 - 2'は、配列番号 1において 20146番目の Gが欠失した塩基配列における 20136 〜20156番目の塩基の 5'末端及ぴ Z又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基配列又はそれ に相補的な配列からなるプロープである。プローブ 0 - とプローブ 0 - 2'のペアにおい ては、 5'末端及ぴ 3'末端において同じ欠失を有するペアを用いるのが好ましい。 例え ば、 プローブ 0- が 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有する場合、 プローブ 0-2' も 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有することが好ましい。
0型判定プローブペアとして、 配列番号 2の塩基配列からなるプローブと配列番号 3の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明のプローブセットは、 B型判定プローブペアとして、 プローブ B- 1及びプロ ーブ B- 2のペア、 及び Z又はプローブ Β- 及ぴプローブ B- 2'のペアを含む。
プローブ B- 1は、配列番号 1の 21857〜21876番目の塩基（配列番号 4 ) を含む連続 した 22塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、好まし くは配列番号 4の塩基配列からなるプローブである。 プローブ B-2は、 配列番号 1に おいて 21867番目の Gが Aに置換された塩基配列における 21857〜21876番目の塩基（配 列番号 5 )を含む連続した 22塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプ ローブである。 好ましくは配列番号 5の塩基配列からなるプローブである。
プローブ B- 1'は、配列番号 1の 21857〜21876番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末 端の 1塩基が欠失した塩基配列又はそれに相捕的な配列からなるプローブであり、 プ ローブ B- 2'は、配列番号 1において 21867番目の Gが Aに置換された塩基配列におけ る 21857〜21876番目の塩基の 5'末端及ぴ 又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基配列 又はそれに相補的な配列からなるプローブである。プローブ B - 1'とプローブ B - 2'のぺ ァにおいては、 5'末端及ぴ 3'末端において同じ欠失を有するペアを用いるのが好まし い。例えば、プローブ B-1'が 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有する場合、 プロ一 プ B-2'も 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有することが好ましい。
B型判定プローブペアとして、 配列番号 4の塩基配列からなるプローブと配列番号 5の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。 本発明の AB0式血液型を判定するためのプローブセットは、 A2型判定プローブペア、 A3型判定プローブペア、 及び B3型判定プローブペアからなる群から選択される少な くとも 1のプローブペアをさらに含んでいてもよい。
本発明のプローブセットは、 A2型判定プロ一ブペアとして、 プローブ A2-1及ぴプ ローブ A2- 2のペア、 及ぴノ又はプローブ A2- 1'及ぴプローブ A2-2'のペアを含む。 プローブ A2- 1は、 配列番号 1の 21394~21409番目の塩基 （配列番号 6に相補的な 配列） を含む違続した 22塩基以下、 好ましくは 17塩基以下の塩基配列又はそれに相 補的な配列からなるプローブであり、 好ましくは配列番号 6の塩基配列からなるプロ ーブである。プローブ A2 - 2は、配列番号 1において 21404番目の Cが Tに置換された 塩基配列における 21394〜21409番目の塩基（配列番号 7に相補的な配列）を含む連続 した 22塩基以下、 好ましくは 17塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からな るプローブである。 好ましくは配列番号 7の塩基配列からなるプローブである。
プローブ A2- は、 配列番号 1の 21394~21409番目の塩基の 5'末端及び 又は 3' 末端の 1塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、 プロ一プ A2- 2'は、 配列番号 1において 21404番目の Cが Tに置換された塩基配列に おける 21394〜21409番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基 配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。 プローブ A2- とプロープ A2 - 2'のペアにおいては、 5'末端及び 3'末端において同じ欠失を有するペアを用いる のが好ましい。 例えば、 プローブ A2 - 1'が 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有する 場合、 プローブ A2 - 2'も 5'未端においてのみ 1塩基の欠失を有することが好ましい。
A2型判定プローブペアとして、配列番号 6の塩基配列からなるプローブと配列番号 7の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明のプローブセットは、 A3型判定プローブペアとして、 プローブ A3-1及びプ ローブ A3-2のペア、 及び/又はプローブ A3- 1'及びプローブ A3- 2'のペアを含む。 プローブ A3- 1は、 配列番号 1の 21798〜21817番目の塩基 （配列番号 8 ) を含む連 続した 22塩基以下の塩基配列又はそれに相捕的な配列からなるプローブであり、好ま しくは配列番号 8の塩基配列からなるプローブである。プローブ A3-2は、配列番号 1 において 21808番目の Gが Aに置換された塩基配列における 21798〜21817番目の塩基 (配列番号 9 )を含む連続した 22塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からな るプローブである。 好ましくは配列番号 9の塩基配列からなるプローブである。
プローブ A3- 1'は、 配列番号 1の 21798〜21817番目の塩基の 5'末端及び/又は 3' 末端の 1塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、 プロ一ブ A3- 2'は、 配列番号 1において 21808番目の Gが Aに置換された塩基配列'に おける 21798〜21817番目の塩基の 5'末端及び Z又は 3'末端の 1塩基が久失した塩基 配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。 プロ一ブ A3 - 1'とプローブ A3-2'のペアにおいては、 5'末端及び 3'末端において同じ欠失を有するペアを用いる のが好ましい。 例えば、 プローブ A3- 1'が 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有する 場合、 プローブ A3 - 2'も 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有することが好ましい。
A3型判定プローブペアとして、配列番号 8の塩基配列からなるプロ一ブと配列番号 9の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明のプローブセットは、 B3型判定プローブペアとして、 プローブ B3- 1及ぴプ ロープ B3-2のペア、 及び Z又はプローブ B3- 1'及ぴプローブ B3- 2'のペアを含む。 プローブ B3- 1は、 配列番号 1の 21981〜22000番目の塩 ¾ (配列番号 1 0 ) を含む 連続した 22塩基以下の塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、好 ましくは配列番号 1 0の塩基配列からなるプローブである。プローブ B3-2は、配列番 号 1において 21991番目の Cが Tに置換された塩基配列における 21981〜22000番目の 塩基（配列番号 1 1 )を含む連続した 22塩基以下の塩基配列又はそれに相捕的な配列 からなるプローブである。 好ましくは配列番号 1 1の塩基配列からなるプローブであ る。
プローブ B3- 1'は、 配列番号 1の 21981〜22000番目の塩基の 5'末端及ぴ 又は 3' 末端の 1塩基が欠失した塩基配列又はそれに相補的な配列からなるプローブであり、 プローブ B3- 2'は、 配列番号 1において 21991番目の Cが Tに置換された塩基配列に おける 21981〜22000番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基 配列又はそれに相補的な配列からなるプローブである。 プローブ B3- 1'とプローブ B3 - 2'のペアにおいては、 5'末端及び 3'末端において同じ欠失を有するペアを用いる のが好ましい。 例えば、 プローブ B3 - 1'が 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有する 場合、 プローブ B3- 2'も 5'末端においてのみ 1塩基の欠失を有することが好ましい。
B3型判定プローブペアとして、配列番号 1 0の塩基配列からなるプロ一ブと配列番 号 1 1の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。
本発明はまた、 上記プローブセットを用いて被検者の AB0式血液型を判定する方法 に関する。 本発明の方法では、 被検者 （通常、 ヒト被検者をさす） の生体試料由来の ゲノム DNAを錄型とする増幅反応によって得られた増幅核酸と上記プロ一ブセットを 接触させるハイブリダィゼーシヨン法において、 各プロープペアにおいて一方のプロ —プにハイプリダイズした核酸と他方のプローブにハイブリダイズした核酸の比 (核 酸の量の比） を測定することを特徴とする。
本発明において核酸には、 DNAおよび RNAが包含され、 DNAには一本鎖 DNAおよぴニ 本鎖 DNAが包含される。 プローブは通常核酸をさし、 好ましくは DNAである。 增幅核 酸は、 好ましくは DNAである。
被検者の生体試料由来のゲノム DNAを鎳型とする増幅反応によって得られた増幅核 酸とは、 通常、 被検者の生体試料由来のゲノム DNA-を铸型として、 AB0グリコシルト ランスフェラーゼ遺伝子におけるェキソン 6を含む領域及ぴ Z又はェキソン 7を含む 領域を増幅することによって得られる増幅核酸をさす。 0型判定プローブペア及ぴ B 型判定プローブペアの双方についてハイブリダイズした核酸の比を測定する場合は、 • ェキソン 6を含む領域及びェキソン 7を含む領域の双方を増幅する。 A2型判定プロ一 ブペア、 A3型判定プローブペア又は B3型判定プローブペアについてのみハイブリダ ィズした核酸の比を測定する場合は、 ェキソン 7を含む領域のみを増幅すれば足りる 力 双方の領域を増幅してもよい。
ェキソン 6を含む領域を增幅するためのプライマー及ぴェキソン 7を含む領域を増 幅するためのプライマ一は、 当業者であれば適宜設計できる。 例えば、 ェキソン 6を 含む領域を増幅するためのプライマーセットとしては、 配列番号 1 8の塩基配列から なるプライマーと配列番号 1 9の塩基配列からなるプライマーのセットが挙げられる。 ェキソン 7を含む領域を増幅するためのプライマーセットとしては、 配列番号 2 0の 塩基配列からなるプライマーと配列番号 2 1の塩基配列からなるプライマーのセット が挙げられる。
従って、 より具体的には、 本発明の AB0式血液型を判定する方法は、
被検者由来の試料からゲノム DNAを抽出する工程と、
抽出したゲノム DNAを鍀型とし、 AB0グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子におけ るェキソン 6を含む領域及び Z又はェキソン 7を含む領域を増幅する工程と、
本発明のプロ一ブセットと增幅核酸を接触させる工程と、
各プローブペアにおいて、 一方のプロ一ブにハイブリダィズした核酸と他方のプロ ーブにハイプリダイズした核酸の比を測定する工程と
を含む。
各プローブペアにおいてハイブリダィズした核酸の比を測定する 2つのプローブは 同じ塩基長のものを用いるのが好ましい。
プローブは、 例えば、 核酸合成装置によって化学的に合成することで取得すること ができる。 核酸合成装置としては、 DNAシンセサイザー、 全自動核酸合成装置、 核酸 自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
各プローブペアにおいて、 一方のプローブにハイプリダイズした核酸と他方のプロ ーブにハイブリダィズした核酸の比から、 被検者の遺伝子型、 すなわち AB0式血液型 (AA型、 AO型、 B0型、 AB型及び 00型、 並びに A2型、 A3型及ぴ B3型） を判定する ことができる。
より具体的には、 以下のように判定することができる。
0型判定プローブペアにおいて、プローブ 0-2にハイプリダイズした核酸/プローブ 0-1にハイブリダィズした核酸の値（0-2/0-1) に基づき、被検者の血液型が 00型、？0 型又は？？型（？ = A又は B)であるかを判定できる。？0型は、 AO型又は B0型を意味し、？? 型は AA型、 AB型又は BB型を意味する。 0-2/0 - 1の値は、 00型 > ?0型 >？?型となる。 従って、 0-2/0-1の値に閾値を設定することにより、 00型、 ？0型又は？？型のいずれで あるかを判定できる。例えば、 0-2/0- 1の値が 3. 0以上であれば 00型と判定し、 0-2/0-1 の値が 1. 0以上 3. 0未満であれば? 0型と判定し、 0-2/0-1の値が 1. 0未満であれば?？ 型と判定できる。 プローブ 0-2'にハイブリダィズした核酸/プローブ 0-1'にハイブリ ダイズした核酸の値 （0- 2' /0- 1' ) についても同様である。
B型判定プローブペアにおいて、プローブ B- 2にハイブリダイズした核酸/プローブ B-1にハイプリダイズした核酸の値 （B- 2/B- 1) に基づき、 被検者の血液型が BB型、 B?型又は？？型 （？ = A又は 0) であるかを判定できる。 B?型は、 AB型又は B0型を意味 し、 ？？型は AA型、 AO型又は 00型を意味する。 B- 2/B- 1の値は、 BB型 >B?型 >？?型と なる。 従って、 B - 2/B-1の値に閾値を設定することにより、 BB型、 B?型又は？？型のい ずれであるかを判定できる。例えば、 B - 2/B - 1の値が 3. 0以上であれば BB型と判定し、 B-2/B-1の値が 1. 0以上 3. 0未満であれば B?型と判定し、 B- 2/B- 1の値が 1. 0未満で あれば？？型と判定できる。 プローブ B - 2'にハイプリダイズした核酸/プローブ B - に ハイプリダイズした核酸の値 （B- 2' /Β- ) についても同様である。
上記 0-2/0-1の値及ぴ Β- 2/B-1の値から得られる判定結果を組み合わせることによ り、 ΑΑ型、 ΒΒ型、 AO型、 B0型、 AB型又は 00型のいずれであるかを判定することが できる。 ·
A2型判定プローブペアにおいて、プローブ A2- 2にハイブリダイズした核酸/プロ一 ブ A2-1にハイプリダイズした核酸の値 （A2-2/A2-1) に基づき、 被検者の血液型が A2 型であるかどうかを判定できる。 A2-2/A2-1の値に閾値を設定することにより、 A2型 であるかどうかを判定できる。 例えば、 A2-2/A2- 1の値が 1. 5以上であれば A2型と判 定できる。 プローブ A2- 2'にハイブリダィズした核酸/プローブ A2-1'にハイプリダイ ズした核酸の値 （A2- 2' /Α2- ) についても同様である。
A3型判定プローブペアにおいて、プローブ A3- 2にハイブリダィズした核酸/プロ一 ブ A3- 1にハイプリダイズした核酸の値 （A3- 2/A3-1) に基づき、 被検者の血液型が A3 型であるかどうかを判定できる。 A3- 2/A3- 1の値に閾値を設定することにより、 A3型 であるかどうかを判定できる。 例えば、 A3- 2/A3- 1の値が 2. 0以上であれば A3型と判 定できる。 プローブ A3-2'にハイブリダイズした核酸/プローブ A3- 1'にハイブリダイ ズした核酸の値 （A3- 2' /A3-1' ) についても同様である。
B3型判定プローブペアにおいて、プローブ B3- 2にハイプリダイズした核酸/プロ一 ブ B3-1にハイブリダィズした核酸の値 （B3- 2/B3- 1) に基づき、 被検者の血液型が B3 型であるかどうかを判定できる。 B3- 2/B3- 1の値に閾値を設定することにより、 B3型 であるかどうかを判定できる。 例えば、 B3-2/B3- 1の値が 2. 0以上であれば B3型と判 定できる。 プローブ B3- 2'にハイブリダイズした核酸/プローブ B3- 1'にハイブリダイ ズした核酸の値 （B3-2' /B3- 1' ) についても同様である。
閾値は、 実験条件により異なり当業者であれば適宜設定できる。 より詳しくは、 そ の遺伝子型が既知である被検者ついて、 プローブペアごとに核酸ハイブリダィゼーシ ョンを実施し、 統計的処理を行ってそれぞれの遺伝子型について上記比の標準値を算 出し、 遺伝子型が未知の被検者における比と当該標準値とを比較することにより、 被 検者の遺伝子型を判定することができる。
生体試料は、 ゲノム DNAを含むものであれば特に制限されない。 例えば、 血液およ ぴこれに由来する血液関連試料 （血液、 血清おょぴ血漿など）、 リンパ液、 汗、 涙、 唾 液、 尿、 糞便、 腹水および髄液等の体液、 ならびに細胞、 組織または臓器の破砕物お ょぴ抽出液などが挙げられる。 本発明においては、 好ましくは、 血液関連試料を用い る。
ゲノム DNAを鍚型とした増幅反応により得られる増幅核酸とプロ一ブとのハイブリ ダイゼーション反応、 並びに各プローブペアにおいて一方のプローブにハイプリダイ ズした核酸と他方のプローブにハイブリダィズした核酸の比の測定は、 当技術分野で 憒用の方法により実施することができる。 具体的には、 以下のように実施することが できる。
まず、被検者から採取した生体試料からゲノム DNAを抽出する。抽出手段としては、 特に限定されないが、 前記生体試料から直接的に DNA成分を分離し、 精製して回収で きる手段であることが好ましい。 抽出手段の具体例としては、 例えばフエノール/ク ロロホルム、 エタノール、 水酸化ナトリウム、 CTABなどを用いた DNA抽出法が挙げら れる。
次に、 得られたゲノム DNAを錄型として用いて核酸増幅反応を行い、 検出対象領域 を増幅させる。 核酸増幅反応としては、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR)、 LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) 等を適用することができる。 ここで、 検出対象領域とは、 被検者のゲノム DNA上の AB0グリコシルトランスフヱラーゼ遺伝 子に含まれるェキソン 6及び Z又はェキソン 7における遺伝子多型を判定できる程度 に特異性を有する領域である。 本発明においては、 好ましくはェキソン 6を含む領域 及び Z又はェキソン 7を含む領域に対し核酸増幅反応を実施する。
また、 検出対象領域を増幅させる際には、 増幅後の領域を識別できるように標識を 付加することが望ましい。 このとき、 増幅された核酸を標識する方法としては、 特に 限定されないが、 例えば核酸増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識してお く方法を使用してもよいし、 核酸増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する 方法を使用してもよい。 標識物質としては、 特に限定されないが、 放射性同位元素や 蛍光色素、 あるいはジゴキシゲニン（DIG)やピオチンなどの有機化合物などを使用す ることができる。 またこの反応系は、 核酸増幅 '標識に必要な緩衝剤、 耐熱性 DNAポリメラーゼ、 検 出対象領域特異的プライマー、 標識ヌクレオチド三燐酸 （具体的には蛍光標識等を付 加したヌクレオチド三燐酸）、ヌクレオチド三燐酸および塩化マグネシウム等を含む反 応系である。
上記のようにして得られた增幅核酸と本発明のプロープとのハイブリダィゼーショ ン反応を行い、 各プロープにハイブリダィズした核酸の量を、 例えば標識を検出する ことにより測定できる。 プローブにハイブリダィズした增幅核酸は、 例えば、 既知量 の DNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、 定量することができる。 上記ハイブリダイゼーシヨン反応においては、 本発明のプローブが担体上に固定化 されたマイクロアレイを用い、 該マイクロアレイに増幅核酸を適用することが好まし レ、。 その場合、 本発明のプロープは、 同一の担体に固定化されていてもよいし、 異な る担体に固定化されていてもよい。 少なくともプローブペア同士は同一の担体に固定 化されていることが好ましく、 0型判定プローブペアと B型判定プローブペアも同一 の担体に固定化されていることが好ましい。 各プローブとしては、 それぞれの条件を 満たす限り、 複数種のものが担体上に固定化されていてもよい。
マイクロアレイにおける担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、 特に制限されない。 例えば、 白金、 白金黒、 金、 パラジウム、 ロジウム、 銀、 水銀、 タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、 およびグラフアイト、 力一ボンフ アイバーに代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、 アモルファスシリコ ン、 炭化ケィ素、 酸化ケィ素、 窒化ケィ素などに代表されるシリコン材料、 S0I (シリ コン .オン 'ィンシュレータ) などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガ ラス、 石英ガラス、 アルミナ、 サファイア、 セラミクス、 フォルステライ ト、 感光性 ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、 エチレン、 ポリプロピレン、 環状ポリオレフ イン、 ポリイソブチレン、 ポリエチレンテレフタレート、 不飽和ポリエステル、 含フ ッ素榭脂、 ポリ塩化ビュル、 ポリ塩化ビニリデン、 ポリ酢酸ビエル、 ポリビニルアル コール、 ポリビュルァセタール、 アクリル樹脂、 ポリアクリロニトリル、 ポリスチレ ン、ァセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、 フエノール樹脂、ユリア樹脂、 エポキシ樹脂、 メラミン樹脂、 スチレン .アクリロニトリル共重合体、 アタリロニト リル.ブタジエンスチレン共重合体、 ポリフエ二レンォキサイドおよびポリスルホン などの有機材料等が挙げられる。 担体の形状も特に制限されないが、 好ましくは平板 状である。
本発明においては、 担体として、 好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有 する担体を用いる。 表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、 基板の表面 にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、 およびカーボン層からなる基板の表面に 化学修飾基を有するものが包含される。 基板の材料としては、 当技術分野で公知のも のを使用でき、 特に制限されず、 上述の担体材料と同様のものを使用できる。
本発明は、 微細な平板状の構造を有する担体に対し好適に用いられる。 形状は、 長 方形、 正方形および円形など限定されないが、 通常、 l〜75mm 四方のもの、 好ましく は 1〜： L0腿四方のもの、 より好ましくは 3〜5膽四方のものを用いる。微細な平板状の 構造の担体を製造しやすいことから、 シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いる のが好ましく、 特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾 基を有する担体がより好ましい。 単結晶シリコンには、 部分部分でごくわずかに結晶 軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度で の乱れ（格子欠陥）が含まれているものも包含される。
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、 特に制限されないが、 合 成ダイヤモンド、 高圧合成ダイヤモンド、 天然ダイヤモンド、 軟ダイヤモンド （例え ば、 ダイヤモンドライクカーボン）、 アモルファスカーボン、 炭素系物質 （例えば、 グ ラファイト、 フラーレン、 カーボンナノチューブ） のいずれか、 それらの混合物、 ま たはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。 また、 炭化ハフニウム、 炭化 ニオブ、 炭化珪素、 炭化タンタル、 炭化トリウム、 炭化チタン、 炭化ウラン、 炭化タ ングステン、 炭化ジルコニウム、 炭化モリブデン、 炭化クロム、 炭化バナジウム等の 炭化物を用いてもよい。 ここで、 軟ダイヤモンドとは、 いわゆるダイヤモンドライク カーボン （DLC： Diamond Like Carbon) 等の、 ダイヤモンドとカーボンとの混合体で ある不完全ダイヤモンド構造体を総称し、 その混合割合は、 特に限定されない。 カー ボン層は、 化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との 結合における反応に耐えることができる点、 分析対象物質と静電結合によって結合す るためその結合が柔軟性を持っている点、 UV吸収がないため検出系 UVに対して透明 性である点、 およびエレクトロブロッテイングの際に通電可能な点において有利であ る。 また、 分析対象物質との結合反応において、 非特異的吸着が少ない点においても 有利である。 前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。 本発明において力一ボン層の形成は公知の方法で行うことができる。 例えば、 マイ クロ波プラズマ CVD (Chemical vapor deposit ) 法、 ECRCVD (Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit) 法、 I CP (Inductive coupled plasma) 法、 直流 スパッタリング法、 ECR (Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、 イオン化 蒸着法、 アーク式蒸着法、 レ一ザ蒸着法、 EB (Electron beam)蒸着法、 抵抗加熱蒸着法 などが挙げられる。
高周波プラズマ CVD法では、 高周波によって電極間に生じるグロ一放電により原料 ガス （メタン） を分解し、 基板上に DLC (ダイヤモンドライクカーボン） 層を合成す る。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、 原料ガス （ベンゼン） を分解'イオン化し、 バイアス電圧によって基板上にカーボン 層を形成する。 水素ガス 1〜99体積％と残りメタンガス 99〜1体積％からなる混合ガ ス中で、 イオン化蒸着法により DLC層を形成してもよい。
アーク式蒸着法では、 固体のグラフアイト材料 （陰極蒸発源） と真空容器 （陽極） の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原 子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加すること により基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速し力一ボン層を形成することが できる。
レーザ蒸着法では、例えば Nd :YAGレーザ（パルス発振） 光をグラフアイ卜のターゲ ット板に照射して溶融させ、 ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボ ン層を形成することができる。
基板の表面にカーボン層を形成する場合、 カーボン層の厚さは、 通常、 単分子層〜 100 μ ηι程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、 逆 に厚くなると生産性が悪くなるので、 好ましくは 2nm〜l μ m、 より好ましくは 5nm〜 500nraである。
カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、 プローブ を担体に強固に固定化できる。 導入する化学修飾基は、 当業者であれば適宜選択する ことができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、 ホルミル基、 ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
ァミノ基の導入は、 例えば、 カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射すること によりまたはプラズマ処理することにより実施できる。 または、 カーボン層を塩素ガ ス中で紫外線を照射して塩素化し、 さらにアンモニアガス中で紫外線照射することに より実施できる。 または、 メチレンジァミン、 エチレンジァミンで等の多価アミン類 ガス中を、 塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。 カルボキシル基の導入は、 例えば、 前記のようにァミノ化したカーボン層に適当な 化合物を反応させることにより実施できる。 カルボキシル基を導入するために用いら れる化合物としては、 例えば、 式： X- R,- C00H (式中、 Xはハロゲン原子、 は炭素数 10〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばク口口酢酸、 フルォロ酢酸、 ブロモ酢酸、 ョード酢酸、 2-クロ口プロピオン酸、 3-クロ口プロピオ ン酸、 3 -クロロアクリル酸、 4-クロロ安息香酸；式： H00C-R2-C00H (式中、 は単結 合または炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えば シユウ酸、マロン酸、 コハク酸、マレイン酸、 フマル酸、 フタル酸；ポリアクリル酸、 ポリメタクリノレ酸、 トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸； 式： R3- CO- R4- C00H (式中、 R3は水素原子または炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基、 R4 は炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸またはアルデヒ ド酸； 式： X- 0C- Rs- C00H (式中、 Xはハロゲン原子、 R5は単結合または炭素数 1〜12の 2価 の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハラィド、例えばコハク酸モノ クロリ ド、 マロン酸モノクロリ ド；無水フタル酸、 無水コハク酸、 無水シユウ酸、 無 水マレイン酸、 無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
エポキシ基の導入は、 例えば、 前記のようにァミノ化したカーボン層に適当な多価 エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。 あるいは、 力一ボン層が含有 する炭素-炭素 2重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。 有機 過酸としては、 過酢酸、 過安息香酸、 ジペルォキシフタル酸、 過ギ酸、 トリフルォロ 過酢酸などが挙げられる。
ホルミル基の導入は、 例えば、 前記のようにァミノ化したカーボン層に、 グルタル アルデヒドを反応させることにより実施できる。
ヒドロキシル基の導入は、 例えば、 前記のように塩素化したカーボン層に、 水を反 応させることにより実施できる。
活性エステル基は、 エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有し て求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。 エステル基のアルコール側に、 電子求引性の基を有し、 アルキルエステルよりも活性 化されたエステル基である。 活性エステル基は、 アミノ基、 チオール基、 水酸基等の 基に対する反応性を有する。 さらに具体的には、 フエノールエステル類、 チオフエノ ールエステル類、 N-ヒ ドロキシァミンエステル類、 シァノメチルエステル、 複素環ヒ ドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有 する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、 たとえば p -二トロフエニル基、 N-ヒドロキシスクシンィミド基、 コハク酸ィミ ド基、 フタル酸イミ ド基、 5-ノルポルネン -2， 3 -ジカルボキシイミド基等が挙げられ、 特に、 N -ヒ ドロキシスクシンィミ ド基が好ましく用いられる。
活性エステル基の導入は、 例えば、 前記のように導入したカルボキシル基を、 シァ ナミ ドゃカルボジィミ ド（例えば、 1- [3- (ジメチルァミノ）プロピル] -3-ェチルカルボ ジイミ ド）などの脱水縮合剤と N-ヒドロキシスクシンイミ ドなどの化合物で活性エス テル化することにより実施できる。 この処理により、 アミド結合を介して炭化水素基 の末端に、 N-ヒ ドロキシスクシンイミ ド基等の活性エステル基が結合した基を形成す ることができる （特開 2001- 139532)。
本発明のプローブを、 スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶 液を調製し、これを 96穴もしくは 384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶 液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、 プローブが 担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。 または、 スポッティン グ溶液をマイク口ピぺッターにて手動でスポッティングしてもよい。
スポッティング後、 プローブが担体に結合する反応を進行させるため、 インキュべ —ションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常一 20〜100°C、好ましく は 0〜90°Cの温度で、 通常 0. 5〜16時間、 好ましくは 1〜2時間にわたって行う。 イン キュベーシヨンは、 高湿度の雰囲気下、 例えば、 湿度 50〜90%の条件で行うのが望ま しい。 インキュベーションに続き、 担体に結合していない核酸を除去するため、 洗浄 液 （例えば、 50mM TBS/0. 05% Tween20) を用いて洗浄を行うことが好ましい。
本発明はまた、 本発明のプロープセットを含む、 AB0式血液型を判定するためのキ ットに関する。 本発明のキットにおいてプ ープは、 担体上に固定化されたマイクロ アレイの形態で提供されてもよい。 本発明のキッ 'トは、 さらに、 核酸増幅 '標識に必 要な緩衝剤、 耐熱性 DNAポリメラーゼ、 検出対象領域特異的プライマー、 標識ヌクレ ォチド三燐酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三燐酸）、ヌクレオチド 三燐酸および塩化マグネシウム等を含んでいてもよい。 検出対象領域特異的プライマ 一は、 好ましくは AB0グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のェキソン 6を含む領域 を増幅するためのプライマー及びェキソン 7を含む領域を増幅するためのプライマー である。 実施例
実施例 1 担体の作製
3rara角のシリコン基板にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で 2層の DLC層の製膜 を行った。
1層目 2層目
原料ガス CH4 4. 75 47. 5 i.sscm)
¾ 0. 25 2. 5 ossein)
作動圧力 3. 0 8. 0 (Pa)
基板バイアス 直流電圧 500 500 (V)
高周波出力 100 ― (W)
アノード電圧 50 50 (V)
フィラメント 電圧 7 7 (V)
電流 22 22 (A)
得られた表面に DLC層を有するシリコン基板上に、 下記の条件でアンモニアプラズ マを用いて、 アミノ基を導入した。 原料ガス ΝΗ3 30 ^sscm)
作動圧 Λ 8. 0 sscm)
基板バイアス 直流電圧 500 (Pa)
高周波出力 ― (w)
アノード電圧 50 (V)
フィラメント 電圧 7 (V)
22 (A)
140m 無水コハク酸及び 0. 1Mホウ酸ナトリゥムを含む 1 -メチル -2 -ピロリ ドン溶 液に 30 分間浸漬し、カルボキシル基を導入した。 0. 1M リン酸カリウムバッファー、 0. 1M 1- [3 -（ジメチルァミノ）プロピル] - 3 -ェチルカルポジィミ ド、 20mM N-ヒ ドロキシ スクシイミ ドを含む溶液に 30分間浸漬し、活性化を行い、 シリコン基板表面に DLC層 及ぴ化学修飾基としての N -ヒドロキシスクシィミド基を有する担体を得た。
実施例 2 プローブ長の比較
AB0 グリコシルトランスフェラ一ゼ遺伝子のゲノム配列 （配列番号 1 ) におけるェ キソン 6の塩基配列に基づき、 17塩基、 20塩基、 23塩基又は 25塩基の塩基配列から なり 5'末端をァミノ基で修飾した S種のプローブを合成した。各プローブの塩基配列 を下記表 1に示す。プローブ 0-1-17と 0-2-17、プローブ 0-1-20と 0-2-20、 プロープ 0-1-23と 0-2 - 23、及びプローブ 0-1-25と 0-2-25がそれぞれ 0型判定プローブペアに 相当する。 表 1
Figure imgf000019_0001
20塩基 0-1-20 TCCTCGTGGTGACCCCTTGG 2 配列番号 1 の 20136〜
20155番目の塩基
0-2-20 TCCTCGTGGTACCCCTTGGC 3 配列番号 1において 20146 の Gが欠失した塩基配列に おける 20136〜20156 番目 の塩基
23塩基 0-1-23 TGTCCTCGTGGTGACCCCTTGGC 14 配列番号 1 の 20134〜
20156番目の塩基
0-2-23 TGTCCTCGTGGTACCCCTTGGCT 15 配列番号 1において 20146 の Gが欠失した塩基配列に おける 20134〜20157番目 の塩基
0-1-25 ATGTCCTCGTGGTGACCCCTTGGCT 16 配列番号 1 の 20133〜
20157番目の塩基
0-2-25 ATGTCCTCGTGGTACCCCTTGGCTG 17 酉己列番号 1において 20146 の Gが欠失した塩基配列に おける 20133〜20158番目 の塩基 表 1に示した 8種のプローブを 10 ； u Mとなるようにスポットソリユーション（Sol. 6) に溶解し、スポッター SPBI0 (日立ソフト社製） を用いて実施例 1で作製した担体上 にスポットした。 80°Cで 1時間べ一キング後、 2 X SSC/0. 2% SDS溶液 （室温） で 15分 間洗浄し、 8種のプローブが担体上に固定化されたマイクロアレイ 1を得た。
血液型が 0型であることがわかっている被検者の頰内側の口腔内細胞を綿棒でかき とり、 IniLの PBSに懸濁した。 5000rpmで 1分遠心し、細胞を回収した。 PBSを 180 μ L 加えた。 フジフィルム社製 Quick Gene DNA tissue kit Sを用いてライセートを作成 し、 さらにフジフィルム社製 Quick Gene- 800を用いてゲノム DNAを抽出した。
この DNAを鍚型 DNAとし、 ゲノムにおける AB0グリコシルトランスフェラーゼ遺伝 子のェキソン 6を含む領域 （配列番号 1の 19880〜20410番目の塩基、 528 bp) 及ぴェ キソン 7を含む領域 （配列番号 1の 21299〜22084番目の塩基、 78G bp) を增幅するよ う表 2に示した組成で PCR反応液を作製した。プライマ一 1〜4の配列を表 3に示す。 表 2
10/ M プライマー 1 0.5^L
ΙΟβΜ プライマー 2 0· 5μί
ΙΟμΜ プライマー 3 ' 0.5 Ι
lOjuM プライマー 4 0.5μΙ
1.0 X PCR Buffer 2μΙ
0.5mM dNTP (0.4mM dCTP) 2μΙ
ImM Cy5-dCTP 0.2μΙ
50% グリセ口一ノレ 2μΙ
δΌ/μΙ Ex Taq (Takara社製） Ο. ΙμΙ
錄型 DNA ΙμΙ
¾0 ΙίμΙ
Total 20.3/iL 表 3
プライマ一配列 （5' →3') 増幅長 プライマー 1 AGCTCAGCTTGCTGTGTGTT (配列番号 1 8 )
528bp プライマー 2 AGATGCTGCATGAATGACC (配列番号 1 9)
GCCTGCCTTGCAGATACGTG (配列番号 20 )
プライマー 4 CAGAGTTTACCCGTTCTGCT (配列番号 2 調製した PCR反応液に対し、 GeneArap PCR system 9700 (ABI)を用い、 下記温度サイ クルで PCR反応を行った。 PCR反応中に Cy5- dCTPが取り込まれ、増幅 DMが蛍光標識 される。
95°C 5分
95°C 10秒 '
58。C 10秒
72°C 20秒 」
72°C 1分
95。C 5分
4°C oo 2 AI L PCR産物と Ι μ ί 3 X SSC/0. 3% SDSを混合し、 マイクロアレイ 1に滴下し、 力 バーを被せた。 水を張ったタッパーに入れ、 45°Cで 1時間ィンキュベートした。 室温 で 2 X SSCZ0. 2% SDSで 2回、 2 X SSCで 2回、 洗浄を行った。
マイクロアレイ丄の周りの余分な洗浄液を拭き取り、 カバ一ガラスを被せた。 続い て FLA 8000 (フジフィルム社製） でスキャンを行い、 蛍光画像から Array Gauge (フ ジフィルム社製） を用いて各プローブのスポットの蛍光強度を数値化した。 この蛍光 強度がプローブにハイプリダイズした核酸の量を表す。 各プローブペアについて、 蛍 光強度から蛍光強度比を算出した。 この蛍光強度比がプローブにハイブリダィズした 核酸の量の比を表す。 蛍光強度実測値と蛍光強度比 （プローブ 0-2-*における蛍光強 度/プローブ 0-1-*における蛍光強度） の結果を図 1に示す。 プローブの塩基数が増え るに従って、蛍光強度実測値は増加した。蛍光強度比は 20塩基のプローブを用いた場 合が最も高かった。このことからプローブの塩基長は 20塩基が最適であることがわか つた。
実施例 3 AA型、 AO型、 B0型、 AB型及び 00型の判定
実施例 2と同様に試験を行った。 AB0 ダリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノ ム配列 （配列番号 1 ) におけるェキソン 6及びェキソン 7の塩基配列に基づき、 20塩 基の塩基配列からなり 5'末端をァミノ基で修飾した 4種のプロ一プ、 すなわち、 0型 判定プローブペア （プローブ 0-1及ぴプローブ 0-2) 及ぴ B型判定プローブペア （プ 口ーブ B- 1及びプローブ B- 2) を合成した。各プローブの配列を下記表 4に示す。 表 4
Figure imgf000022_0001
表 4に示した 4種のプローブを 10 μ Μとなるようにスポットソリユーション（Sol . 6) に溶解し、スポッター SPBI0 (日立ソフト社製） を用いて実施例 1で作製した担体上 にスポットした。 80°Cで 1時間べ一キング後、 2 X SSC/0. 2% SDS溶液 （室温） で 15分 間洗浄し、 4種のプローブが担体上に固定化されたマイクロアレイ 2を得た。
検体として、 血液型がそれぞれ AA型、 AO型、 B0型、 AB型及び 00型であることが わかっている 6人の被検者の頰内側の口腔内細胞を用い、実施例 2と同様にゲノム DNA を抽出し、 プライマー 1〜 4を用いて PCRを実施した。
PCR産物と 3 X SSC/0. 3% SDSを混合し、 マイクロアレイ 2に滴下し、 力 バーを被せた。 水を張ったタッパーに入れ、 45°Cで 1時間インキュベートした。 室温 で 2 X SSCZ0. 2% SDSで 2回、 2 X SSCで 2回、 洗浄を行った。 マイクロアレイ 2の周 りの余分な洗浄液を拭き取り、 カバーガラスを被せた。 続いて FLA 8000 (フジフィル ム社製） でスキャンを行い、 蛍光画像から Array Gauge (フジフィルム社製) を用い て各プローブのスポットの蛍光強度を数値化した。 各プローブペアについて、 蛍光強 度から蛍光強度比を算出した。 蛍光強度実測値と蛍光強度比 （プローブ 0-2における 蛍光強度/プローブ 0-1における蛍光強度、 及ぴプローブ B-2における蛍光強度/プロ ーブ B-1における蛍光強度） の結果を図 2に示す。 図 2の結果から、 本発明の 0型判 定プローブペア （プローブ 0-1及びプローブ 0-2) 及ぴ B型判定プローブペア （プロ ーブ B-1及びプローブ B- 2) を用いて、 AA型、 AO型、 B0型、 AB型及ぴ 00型を判定で きることが示された。
実施例 4 血液型未知の検体の判定
実施例 3で作製したマイクロアレイ 2を用いて、血液型が未知の 44検体を用いて試 験を行った。 検体として、 血液 （生体血、 死体血、 血痕）、 大動脈、 骨、 腎臓、 毛髪を 用い、 実施例 2と同様にゲノム DNAを抽出し、 プライマー 1 〜4を用いて PCRを実施 した。
2 μ ί PCR産物と 1 μ L 3 X SSC/0. 3% SDSを混合し、 マイクロアレイ 2に滴下し、 力 パーを被せた。 水を張ったタッパーに入れ、 45°Cで 1時間インキュベートした。 室温 で 2 X SSO/0. 2% SDSで 2回、 2 X SSCで 2回、 洗浄を行った。 マイクロアレイ 2の周 りの余分な洗浄液を拭き取り、 カバーガラスを被せた。 続いて FLA 8000 (フジフィル ム社製） でスキャンを行い、 蛍光画像から Array Gauge (フジフィルム社製） を用い て各スポットの蛍光強度を数値化した。 各プローブペアについて、 蛍光強度から蛍光 強度比を算出した。
44検体について、プローブ 0-2における蛍光強度ノプローブ 0-1における蛍光強度 を X軸に、 プローブ B-2における蛍光強度 Zプローブ B-1における蛍光強度を Y軸に プロットした（図 3 )。 グラフ上の 5箇所に偏った分布を示し、これに血液型（遺伝型） を当てはめることができた。 以上から、 0型判定プロ一プペア （プローブ 0-1及ぴプ ローブ 0-2)及び B型判定プローブペア （プローブ B- 1及ぴプローブ B- 2) における蛍 光強度比について、 それぞれ閾値を設定することで未知の検体の血液型を判定できる ことが示された。 実施例 5 血液型亜型の判定
実施例 2と同様に試験を行った。 AB0 グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノ ム配列 （配列番号 1 ) におけるェキソン 7の塩基配列に基づき、 20塩基の塩基配列か らなり 5'末端をァミノ基で修飾した 4種のプローブ、すなわち、 A2型判定プローブぺ ァ （プローブ A2-1及びプローブ A2-2)、 A3型判定プローブペア （プローブ A3- 1及ぴ プローブ A3- 2)、 及び B3型判定プローブペア （プロ一ブ B3-1及ぴプローブ B3- 2) を 合成した。各プローブの配列を下記表 5に示す。 表 5
Figure imgf000024_0001
表 5に示した 6種のプローブを 10 μ Μとなるようにスポットソリユーション（Sol . 6) に溶解し、スポッタ一 SPBI0 (日立ソフト社製） を用いて実施例 1で作製した担体上 にスポットした。 80°Cで 1時間べ一キング後、 2 X SSC/0. 2% SDS溶液 （室温） で 15分 間洗浄し、 4種のプローブが担体上に固定化されたマイクロアレイ 3を得た。
検体として、 AB0グリコシルトランスフェラ一ゼ遗伝子のェキソン 7を含む領域（配 列番号 1の 21299~22084番目の塩基に相当、 786 bp) について、 A2型、 A3型、 B3型、 AO型及ぴ B0型に相当する塩基配列からなる DNAを合成しプラスミド PUCに組み込ん だプラスミ ドを鎳型 DNAとして角い、 実施例 2と同様に、 プライマー 3及ぴ 4を用い て PCRを実施した。
2 L PCR産物と 1 L 3 X SSC/0. 3% SDSを混合し、 マイクロアレイ 2に滴下し、 力 バーを被せた。 水を張ったタッパーに入れ、 45°Cで 1時間インキュベートした。 室温 で 2 X SSCZ0. 2% SDSで 2回、 2 X SSCで 2回、 洗浄を行った。 マイクロアレイ 2の周 りの余分な洗浄液を拭き取り、 カバーガラスを被せた。 続いて FLA 8000 (フジフィル ム社製） でスキャンを行い、 蛍光画像から Array Gauge (フジフィルム社製） を用い て各プローブのスポットの蛍光強度を数値化した。 各プローブペアについて、 蛍光強 度から蛍光強度比（プローブ A2 - 2における蛍光強度/プローブ A2- 1における蛍光強度、 プローブ A3- 2における蛍光強度/プローブ A3- 1における蛍光強度、 プローブ B3- 2に おける蛍光強度/プローブ B3-1における蛍光強度） を算出した。 結果を図 4に示す。
A2型の検体は、 A2型判定プローブペアにおいても蛍光強度比 （A2- 1/A2- 2) はその 他の検体と差が小さく、 A2型を明確に判定することはできなかつた。 A3型判定プロ一 ブペアにおける蛍光強度比 （A3 - 1/A3- 2) は、 A3型の検体では約 6. 3であり、 一方そ の他の検体では約 1. 0であり、 判定可能であった。 また検体 B3型についても、 B3型判 定プロープペアにおける蛍光強度比（B3- 1/B3- 2) は、その他の検体の蛍光強度比が約 1. 0であるに対して、約 2. 7となり、判定可能であった。
実施例 6 亜型 A2判定プローブの塩基長の検討
実施例 5で判定できなかった亜型 A2型を判定するために、 20塩基、 18塩基及び 16 塩基の塩基配列からなり 5'末端をァミノ基で修飾した 3種の A2型判定プローブペア を合成した。各プローブの配列を下記表 6に示す。 表 6
Figure imgf000025_0001
A2-1-18 CGCGGCCGGCTGGTCGGT 24 配列番号 1の 21394〜21411番目 に相補的な塩基
A2-2-18 CGCGGCCAGCTGGTCGGT 25 配列番号 1において 21404の が
18塩基
T に置換された塩基配列における 21394〜21411 番目に相補的な塩
A2-1-16 CGGCCGGCTGGTCGGT 6 配列番号 1の 21394〜21409番目 に相補的な塩基
A2-2-16 CGGCCAGCTGGTCGGT 7 配列番号 1において 21404の C力 S
16塩基
T に置換された塩基配列における 21394〜21409 番目に相捕的な塩
検体として、 AB0ダリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のェキソン 7を含む領域（配 列番号 1の 21299〜22084番目の塩基に相当、 786 bp) について、 A2型、 AO型及び B0 型に相当する塩基配列からなる DNAを合成しプラスミ ド pUCに組み込んだプラスミ ド を鎵型 DNAとして用い、 実施例 2と同様に、 プライマー 3及び 4を用いて PCRを実施 した。
2 L PCR産物と l ju L 3 X SSCZ0. 3% SDSを混合し、 マイクロアレイ 2に滴下し、 力 バーを被せた。 水を張ったタッパーに入れ、 45°Cで 1時間インキュベートした。 室温 で 2 X SSC/0. 2% SDSで 2回、 2 X SSCで 2回、 洗浄を行った。 マイクロアレイ 2の周 りの余分な洗浄液を拭き取り、 カバーガラスを被せた。 続いて FLA 8000 (フジフィル ム社製） でスキャンを行い、 蛍光画像から Array Gauge (フジフィルム社製） を用い て各プローブのスポットの蛍光強度を数値化した。 各プローブペアについて、 蛍光強 度から蛍光強度比 （プローブ A2-2- *における蛍光強度/プローブ A2 - 1- *における蛍光 強度） を算出した。 結果を図 5に示す。
20塩基及び 18塩基のプロープペアでは、 A2型の検体の蛍光強度比（A2- 2- */A2- 1 - *) は、 AO型及び B0型の検体と比べてわずかしか差がなかった。 それに対し、 16塩基の プローブペアでは蛍光強度比 (A2-2-16/A2-1-16) は、 A2型が約 1. 7、 AO型が約 0. 3、 B0型が約 0. 0と差が大きくなつた。 以上から、 A2型の判定には、 16塩基のプローブ ペアが好ましいことが示された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本明 細書中にとり入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ABO式血液型を判定するためのプロ一ブセットあって、 0型判定プローブペア及び B型判定プローブペアを含み、
0型判定プローブペアが、 以下のプローブ 0-1及びプローブ 0-2のペア： プロ一ブ 0-1：配列番号 1の 20136〜20155番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ 0-2：配列番号 1において 20146番目の G が欠失した塩基配列における 20136〜20156番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相補的 な塩基配列からなるプローブ
、 及び/又は以下のプローブ 0- 及ぴプローブ 0-2'のペア：
プローブ 0- ：配列番号 1の 20136〜20155番目の塩基の 5'末端及ぴ 又は 3'末端 の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、 プローブ 0 - 2' ：配列番号 1において 20146番目の Gが欠失した塩基配列における 20136〜20156番目の塩基の 5'末端及ぴ Z又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基配列ま たはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含み、
B型判定プローブペアが、 以下のプロープ B- 1及びプローブ B-2のペア： プローブ B- 1：配列番号 1の 21857〜21876番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ B- 2：配列番号 1において 21867番目の Gが Aに置換された塩基配列にお ける 21857〜21876番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相 捕的な塩基配列からなるプロ一ブ
、 及び/又は以下のプローブ B-1'及ぴプローブ B- 2'のペア：
プローブ B - 1' ：配列番号 1の 21857〜21876番目の塩基の 5'末端及ぴ 又は 3'末端 の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、 プローブ B- 2'：配列番号 1において 21867番目の Gが Aに置換された塩基配列にお ける 21857〜21876番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基配 列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含む、 前記プローブセット。
2 . A2型判定プローブペア、 A3型判定プローブペア及び B3型判定プローブペアから なる群から選択される少なくとも 1のプローブペアをさらに含み、
A2型判定プローブペアが、 以下のプロープ A2-1及ぴプローブ A2- 2のペア： プローブ A2- 1：配列番号 1の 21394〜21409番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプロープ、
プローブ A2- 2：配列番号 1において 21404番目の Cが Tに置換された塩基配列にお ける 21394〜21409番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相 捕的な塩基配列からなるプロ一ブ
、 及び Z又は以下のプローブ A2-1'及びプローブ A2- 2'のペア：
プローブ A2-1' ：配列番号 1の 21394〜21409番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末 端の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、 プローブ A2- 2' ：配列番号 1において 21404番目の Cが Tに置換された塩基配列に おける 21394〜21409番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基 配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含み、
A3型判定プローブペアが、 以下のプローブ A3- 1及びプローブ A3-2のペア： プローブ A3- 1：配列番号 1の 21798〜21817番目の塩基を含む違続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ A3- 2：配列番号 1において 21808番目の Gが Aに置換された塩基配列にお ける 21798〜21817番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相 補的な塩基配列からなるプローブ
、 及び Z又は以下のプローブ A3- 及ぴプローブ A3- 2'のペア：
プローブ A3- 1' ：配列番号 1の 21798〜21817番目の塩基の 5'末端及ぴ Z又は 3'末 端の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、 プロ一ブ A3- 2' ：配列番号 1において 21808番目の G力 S Aに置換された塩基配列に おける 21798〜21817番目の塩基の 5'末端及び 又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基 配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ
を含み、
B3型判定プローブペアが、 以下のプローブ B3- 1及ぴプローブ B3- 2のペア： プ口ープ B3- 1：配列番号 1の 21981〜22000番目の塩基を含む連続した 22塩基以下 の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、
プローブ B3- 2：配列番号 1において 21991番目の Cが Tに置換された塩基配列にお ける 21981〜22000番目の塩基を含む連続した 22塩基以下の塩基配列またはそれに相 補的な塩基配列からなるプローブ
、 及び Z又は以下のプローブ B3- 1'及びプロ一ブ B3- 2'のペア：
プロ一プ B3- 1' ：配列番号 1の 21981〜22000番目の塩基の 5'末端及び/又は 3'末 端の 1塩基が欠失した塩基配列またはそれに相捕的な塩基配列からなるプローブ、 プローブ B3 - 2' ：配列番号 1において 21991番目の C力 S Tに置換された塩基配列に おける 21981〜22000番目の塩基の 5'末端及びノ又は 3'末端の 1塩基が欠失した塩基 配列またはそれに相捕的な塩基配列からなるプローブ
含む、 請求の範囲第 1項記載のプローブセット。
3 .請求の範囲第 1項又は第 2項記載のプローブセットが担体上に固定化されてなる、 AB0式血液型を判定するためのマイクロアレイ。
4 . 担体が、 表面にカーボン層と化学修飾基とを有するものである、 請求の範囲第 3 項記載のマイクロアレイ。
5 . 被検者の AB0式血液型を判定する方法であって、
被検者由来の試料からゲノム DNAを抽出する工程と、
抽出したゲノム DNAを鍀型とし、 AB0グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子におけ るェキソン 6を含む領域及ぴノ又はェキソン 7を含む領域を増幅する工程と、
請求の範囲第 1項又は第 2項記載のプローブセットと増幅核酸を接触させる工程と、 各プローブペアにおいて、 一方のプローブにハイプリダイズした核酸と他方のプロ ーブにハイブリダイズした核酸の比を測定する工程と
を含む、 前記方法。
6 . 請求の範囲第 1項若しくは第 2項記載のプローブセット、 又は請求の範囲第 3項 若しくは第 4項記載のマイクロアレイを含む、 AB0式血液型を判定するためのキット。
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