WO2021039958A1 - 骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キット - Google Patents

骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キット Download PDF

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WO2021039958A1
WO2021039958A1 PCT/JP2020/032584 JP2020032584W WO2021039958A1 WO 2021039958 A1 WO2021039958 A1 WO 2021039958A1 JP 2020032584 W JP2020032584 W JP 2020032584W WO 2021039958 A1 WO2021039958 A1 WO 2021039958A1
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exon
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恵美 高光
翠 吉村
大場　光芳
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東洋鋼鈑株式会社
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a probe set capable of evaluating a gene mutation useful as a diagnostic item for myeloproliferative neoplasm, and a microarray including the probe set.
  • MPN Myeloproliferative neoplasms
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • CNL chronic neutrophilic leukemia
  • PV polycythemia vera
  • PMF primary myelofibrosis
  • EEF essential thrombocythemia
  • CEL chronic eosinophilic leukemia
  • HES hypereosinophilic syndrome
  • HES obesity cytosis
  • MPN unclassifiable myeloproliferative neoplasms
  • MPN bone marrow morphology and gene mutation data are used as indicators.
  • MPN excluding CML can be diagnosed by diagnosing these in combination.
  • gene mutation data specifically, mutation information on three genes: JAK2, CALR and MPL, and additionally, mutation information on ASXL1, EZH2, TET2, IDH1 / IDH2, SRSF2 and SF3B1 are used.
  • JAK2, CALR and MPL are considered to be the molecular basis for the onset of MPN, the presence or absence of mutations in the gene group is an important factor in the definitive diagnosis of MPN.
  • JAK2V617F mutation (mutation in which valine at position 617 is replaced with phenylalanine) is frequently found in PV, ET and PMF for JAK2, and in a small number of PVs, in addition to the above mutation, to exon 12 It is disclosed that there are insertion / missing mutations in.
  • JAK2 (Janus activating kinase 2) is a gene that encodes a protein that controls the signal of the erythropoietin receptor.
  • Non-Patent Document 3 states that the mutation present in exon 12 with respect to JAK2 is associated with polycythemia vera (PV) and idiopathic erythrocytosis (IE). It is disclosed.
  • Patent Document 5 discloses that a c2035t mutation (T514M mutation) among the mutations existing in exon 12 of the JAK2 gene is detected as a mutation indicating a myeloproliferative disorder.
  • Non-Patent Document 2 further discloses that MPLW515L / K mutant PMF was found in PMF and ET with respect to MPL.
  • MPL is a gene that encodes the thrombopoietin receptor.
  • Non-Patent Document 2 further discloses that 52-base-deficient type 1 and 5-base-inserted type 2 mutations are the most frequent with respect to CALR, and these mutations are found in ET and PMF. Type 1 mutations are more common in PMF and have been disclosed to be associated with conversion to myelofibrosis in ET.
  • CALR is a gene encoding calreticulin, one of the endoplasmic reticulum molecular chaperones.
  • Patent Document 1 discloses a fluorescently labeled probe specific to the JAK2V617F site as a method for analyzing mutations in the JAK2 gene.
  • Patent Document 2 discloses a technique for detecting a mutation different from the JAK2V617F mutation found in a patient who is negative for the JAK2V617F mutation and shows a myeloproliferative neoplasm.
  • Patent Document 3 discloses a probe set for detecting W515K mutation and W515L mutation in MPL as a probe for detecting MPL gene polymorphism.
  • Patent Document 4 discloses a technique for identifying mutations in CALR.
  • Patent Document 5 discloses mutation detection in JAK2 nucleic acid, and discloses a gene mutation existing in exon 12 in JAK2.
  • Patent Document 6 discloses that, in view of the above-mentioned circumstances, primers and probes were designed for each gene mutation as a means for simultaneously and easily detecting a plurality of gene mutations related to myeloid proliferative tumors.
  • V617F mutation in JAK2, type 1 mutation and type 2 mutation in CALR, W515L mutation and W515K mutation in MPL are disclosed as gene mutations to be detected (5 gene mutations in 3 genes).
  • the probe As a method for designing a probe for detecting a target gene mutation, the probe is designed based on the base sequence of the peripheral region containing the gene mutation. At this time, the probe is designed as a sequence that completely matches the base sequence of the peripheral region containing the gene mutation, or a base sequence containing one or several unnatural nucleotides, as disclosed in Patent Document 7.
  • a probe containing one or several unnatural nucleotides does not hybridize with the peripheral region containing the gene mutation at the location of the unnatural nucleotide (mismatch). According to Patent Document 7, it is described that this mismatch can detect with high accuracy whether or not the target nucleic acid in the sample has a gene mutation.
  • the present invention can accurately determine the presence or absence of a plurality of types of gene mutations existing in CARL among the gene mutations related to myeloproliferative tumors, and can more accurately determine the presence or absence of myeloproliferative tumors. It is possible to provide an evaluation kit, simultaneously determine the presence or absence of multiple gene mutations existing in JAK2 among the gene mutations related to myeloproliferative tumors, and determine the presence or absence of myeloproliferative neoplasms with higher accuracy. The purpose is to make a gene mutation evaluation kit that can be used.
  • the present invention includes the following. (1) A 52-base-deficient type 1 mutation in CALR that is a gene mutation related to myeloid proliferative tumor and lacks 52 bases 506 to 557 in the base sequence of the wild-type CARL gene shown in SEQ ID NO: 10.
  • Type 3 mutation with 46 bases missing from 509th to 554th bases in the same base sequence Type 4 mutation with 34 bases missing with 34th bases 516th to 549th missing in the same base sequence, and same base sequence Evaluation of gene mutations associated with myeloid proliferative tumors, including CALR mutant probes corresponding to at least one gene mutation selected from the group consisting of 52 base-deficient type 5 mutations lacking 52 bases 505 to 556 in The CALR mutant probe is a kit for evaluating gene mutations, which is characterized by having a mismatch due to an artificial defect.
  • the CALR mutant probe for the type 1 mutation has a base sequence lacking one or more bases selected from the range of 558th to 564th in SEQ ID NO: 10 or a complementary base sequence thereof.
  • the CALR mutant probe for the type 3 mutation has a base sequence lacking one or more bases selected from the range of positions 555 to 559 in SEQ ID NO: 10 or a complementary base sequence thereof.
  • the CALR mutant probe for the type 4 mutation has a base sequence lacking one or more bases selected from the range of positions 550 to 558 in SEQ ID NO: 10 or a complementary base sequence thereof.
  • the CALR mutant probe for the type 5 mutation is characterized by having a base sequence lacking one or more bases selected from the range of positions 558 to 564 in SEQ ID NO: 10 or a complementary base sequence thereof (1).
  • the CALR mutant probe for the type 1 mutation contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 95 or its complementary base sequence
  • the CALR mutant probe for the type 3 mutation has the base sequence shown in SEQ ID NO: 53.
  • the CALR mutant probe for the type 4 mutation containing the base sequence thereof or the complementary base sequence thereof contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 54 or the complementary base sequence thereof
  • the CALR mutant probe for the type 5 mutation has the SEQ ID NO:
  • the kit for evaluating gene mutation according to (1) which comprises the nucleotide sequence shown in 55 or a complementary nucleotide sequence thereof.
  • a data analysis method for the diagnosis of myeloproliferative neoplasms that identifies at least one gene mutation selected from the group consisting of 5 mutations.
  • a kit for evaluating gene mutations related to myeloproliferative tumors which comprises a JAK2 mutant probe corresponding to a gene mutation related to myeloproliferative tumors in JAK2 and a primer set for amplifying a region containing the gene mutation.
  • the JAK2 mutant probe includes a V617F mutant probe corresponding to the V617F mutation and an exon 12 mutant probe corresponding to the gene mutation existing in exon 12 of the JAK2 gene.
  • the primer set includes a primer set for V617F mutation that amplifies a region containing a V617F mutation, and a primer set for exon 12 that amplifies a region containing a gene mutation existing in exon 12 of the JAK2 gene.
  • Exxon 12 mutant probe is N542_E543del mutant probe corresponding to the defective mutation of N542-E543 in JAK2, E543_D544del mutant probe corresponding to the defective mutation of E543-D544 in JAK2, and R541-E543 in JAK2 is lysine.
  • the kit for evaluating gene mutation according to (7) which comprises at least one mutant probe selected from the group consisting of K539L (CT) mutant probes corresponding to the K539L (CT) mutation in JAK2.
  • CT K539L
  • CT K539L
  • the concentration ratio of the labeled primer in the V617F mutation primer set to the labeled primer in the exon 12 primer set [concentration of exon 12 primer] / [concentration of V617F mutation primer] is 1.0 to 5.5.
  • the exon 12 primer set is a continuous forward primer for exon 12 having a length of 10 consecutive bases or more selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a continuous primer set selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the gene mutation evaluation kit according to (7) which comprises a reverse primer for exon 12 having a length of 10 bases or more.
  • the exon 12 forward primer is an exon 12 forward primer F1 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, an exon 12 forward primer F3 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the kit for evaluating gene mutation according to (12) which is one primer selected from the group consisting of the forward primer F4 for exon 12 and the forward primer F5 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. ..
  • the reverse primer for exon 12 is the reverse primer R1 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, the reverse primer R2 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the gene mutation evaluation kit according to (12) which is one primer selected from the group consisting of the reverse primer R3 for exon 12 consisting of.
  • the exon 12 primer set is characterized by comprising an exon 12 forward primer F5 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and an exon 12 reverse primer R2 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the kit for evaluating gene mutation is the reverse primer R1 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, the reverse primer R2 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO
  • CALR mutant probes corresponding to gene mutations associated with myeloproliferative neoplasms in CALR A CALR primer set that amplifies the region containing the gene mutation associated with myeloproliferative neoplasm in CALR, MPL mutant probes for gene mutations associated with myeloproliferative neoplasms in MPL, An MPL primer set that amplifies the region containing the gene mutation associated with myeloproliferative neoplasm in MPL,
  • the gene mutation evaluation kit according to (7) which further comprises.
  • the kit for evaluating gene mutation according to (7), wherein the V617F mutant probe and the exon 12 mutant probe are provided with a microarray immobilized on a carrier.
  • a plurality of gene mutations (type 1 mutation, type 3 mutation to type 5 mutation) particularly present in CARL can be accurately determined. Therefore, according to the present invention, it is possible to improve the diagnostic accuracy of myeloproliferative neoplasm using the information of the above-mentioned gene mutation of the diagnosis subject. Further, according to the present invention, among the gene mutations related to myeloproliferative neoplasms, a plurality of gene mutations particularly present in JAK2 (V617F mutation and gene mutation existing in exon 12) can be determined at the same time. Therefore, according to the present invention, it is possible to improve the diagnostic accuracy of myeloproliferative neoplasm using the information of the above-mentioned gene mutation of the diagnosis subject.
  • FIG. 1 It is a block diagram for demonstrating the defective region in the type 1 gene mutation, the type 3 gene mutation, the type 4 gene mutation and the type 5 gene mutation in CARL. It is a characteristic diagram which shows the result of having measured each mutation sample and the wild type sample using the type3 mutation probe 5, the type4 mutation probe 5 and the type5 mutation probe 4 designed in an Example. It is a block diagram explaining the primer designed to amplify the region containing a plurality of gene mutations contained in exon 12 of JAK2. It is a characteristic diagram which shows the result of having measured the fluorescence intensity derived from four amplification fragments obtained by using the primer set designed in Example 1. FIG. FIG. FIG.
  • FIG. 5 is a characteristic diagram in which the concentration of the labeled primer (forward primer) in the primer set for amplifying the region containing the V617F mutation site is on the horizontal axis, and the fluorescence intensity derived from the four amplified regions is on the vertical axis.
  • FIG. 5 is a characteristic diagram in which the concentration of the labeled primer (forward primer) in the primer set for amplifying the region containing the V617F mutation site is on the horizontal axis, and the fluorescence intensity derived from the four amplified regions is on the vertical axis.
  • the kit for evaluating gene mutations related to myeloid proliferative tumors according to the present invention is a group consisting of so-called type 1 mutations, type 3 mutations, type 4 mutations and type 5 mutations as gene mutations related to myeloid proliferative tumors in CARL. It comprises a CALR mutant probe that identifies at least one gene mutation selected from.
  • the CALR gene mutations are different from 52-base-deficient type 1 mutations, 5-base-inserted type 2 mutations, 46-base-deficient type 3 mutations, 34-base-deficient type 4 mutations, and type 1 mutations 52.
  • Type 5 mutations lacking 52 bases are mainly known. These type 1 to type 5 mutations are located at the C-terminus of the CALR protein. Mutations in either of these are found in patients with primary myelofibrosis (PMF) or essential thrombocythemia (ET) with a frequency of 20-25%.
  • type 2 mutations are associated with essential thrombocythemia (ET)
  • type 1 mutations are associated with primary myelofibrosis (PMF).
  • the CALR gene mutation is also a mutation found in myeloproliferative neoplasms that do not have a gene mutation in JAK2, which will be described in detail later.
  • the nucleotide sequence encoding the wild-type CALR is shown in SEQ ID NO: 10. If it has a type 1 mutation, 52 bases at positions 506 to 557 will be deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. If it has a type 2 mutation, TTGTC will be inserted between the 568th and 569th sequences in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10. If it has a type 3 mutation, 46 bases at positions 509 to 554 will be deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. If it has a type 4 mutation, 34 bases at positions 516 to 549 will be deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. If it has a type 5 mutation, 52 bases at positions 505 to 556 will be deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • type 1 mutations, type 3 mutations, type 4 mutations, and type 5 mutations which are defective gene mutations
  • the regions deleted based on a part of the base sequence encoding wild-type CALR are shown in FIG. Shown schematically.
  • a type 1 mutation lacking 52 bases of wild-type CALR SEQ ID NO: 57
  • a type 3 mutation lacking 46 bases of wild-type CALR SEQ ID NO: 58
  • 34 bases of wild-type CALR The missing type 4 mutation (SEQ ID NO: 59) and the type 5 mutation lacking 52 bases of wild-type CALR (SEQ ID NO: 60) were very similar before and after the deletion on the 3'side of the deletion position (arrow in the figure).
  • the sequences that match before and after the deletion are underlined.
  • the gene mutation evaluation kit according to the present invention is a CALR mutant probe for detecting a type 1 mutation probe for detecting a type 1 mutation, a type 3 mutation probe for detecting a type 3 mutation, and a type 4 mutation. Includes at least one probe selected from the group consisting of a Type 4 mutant probe and a Type 5 mutant probe for detecting a Type 5 mutation. That is, the gene mutation evaluation kit according to the present invention may include all of the type 1 mutation probe, the type 3 mutation probe, the type 4 mutation probe and the type 5 mutation probe, or the type 3 mutation probe and the type 4 mutation. It may include one of the probes and a type 5 mutant probe or any two probes.
  • the CARL mutant probe has at least one base (one to several bases, for example, one to several bases) with respect to the sequence after the deletion mutation of the type 1 mutation, type 3 mutation, type 4 mutation, and type 5 mutation shown in FIG. It is designed as a complementary strand in which 5 bases, preferably 1 to 3 bases, more preferably 1 base) are deleted (that is, artificially deleted).
  • the base to be artificially deleted as shown in FIG. 1, the sequence after the deletion of each of the type 1 mutation, type 3 mutation, type 4 mutation, and type 5 mutation matches the wild-type sequence. It is preferably selected from the region (underlined portion in FIG. 1).
  • the CALR mutant probe can be designed as a complementary strand to a predetermined base sequence, but may be designed as the same strand as the base sequence.
  • the CALR mutant probe corresponding to these type 1 mutations, type 3 mutations, type 4 mutations, or type 5 mutations is within 10 bases on the 3'end side of the defect position (arrow in FIG. 1), preferably 8 bases. It can be designed as a complementary strand lacking at least one base within, more preferably within 5 bases.
  • the CALR mutant probe corresponding to the type 1 mutation lacks at least one base from the range of 7 bases on the 3'end side (underlined part in FIG. 1) counting from the defect position (arrow in FIG. 1). It can be designed as a mutated complementary strand. Based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, the CALR mutant probe corresponding to the type 1 mutation can be designed as a complementary strand lacking at least one base from the range of 7 bases at positions 558 to 564. ..
  • the CALR mutant probe corresponding to the type 1 mutation is preferably designed as a complementary strand of GACGAGGAGCGGACAAGGAG (SEQ ID NO: 95) lacking the 560th to 562nd AGA in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 (sequence number 95).
  • the base sequence of number 95 may be used).
  • the CALR mutant probe corresponding to the type 3 mutation is designed as a complementary strand in which at least one base is deleted from the range of 5 bases (underlined in FIG. 1) 3'terminal to the deletion position (arrow in FIG. 1). can do.
  • the CALR mutant probe corresponding to the type 3 mutation can be designed as a complementary strand lacking at least one base from the range of 5 bases at positions 555 to 559. ..
  • the CALR mutant probe corresponding to the type 3 mutation is preferably designed as a complementary strand of GAGGAGCAGAGCAGAGGACAA (SEQ ID NO: 53) lacking the 558th G in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 53). It may be a base sequence).
  • the CALR mutant probe corresponding to the type 4 mutation is a complementary strand in which at least one base is deleted from the range of 9 bases on the 3'end side (underlined part in FIG. 1) counting from the deletion position (arrow in FIG. 1). Can be designed. Based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, the CALR mutant probe corresponding to the type 4 mutation can be designed as a complementary strand lacking at least one base from the range of 9 bases at positions 550 to 558. ..
  • the CALR mutant probe corresponding to the type 4 mutation is preferably designed as a complementary strand of CAGAGGCTTAGAGGAGGCAGAG (SEQ ID NO: 54) lacking the 552nd G in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 54). It may be a base sequence).
  • the CALR mutant probe corresponding to the type 5 mutation lacks at least one base from the range of the 2nd to 8th 7 bases on the 3'end side (underlined part in FIG. 1) counting from the defect position (arrow in FIG. 1). It can be designed as a mutated complementary strand. Based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, the CALR mutant probe corresponding to the type 5 mutation can be designed as a complementary strand lacking at least one base from the range of 7 bases at positions 558 to 564. ..
  • CALR mutant probe corresponding to the type 5 mutation is preferably designed as a complementary strand of GACGAGGGGCGGACAAGGAG (SEQ ID NO: 55) lacking AGA at positions 560 to 562 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 55). It may have a base sequence of 55).
  • the kit for evaluating gene mutations related to myeloproliferative neoplasms according to the present invention simultaneously identifies V617F mutations and gene mutations present in Exxon 12 as gene mutations related to myeloproliferative neoplasms in JAK2. That is, the gene mutation evaluation kit exists in the V617F mutant probe corresponding to the V617F mutation, which is a gene mutation related to myeloid proliferative tumor in JAK2, and Exxon 12, which is a gene mutation related to myeloid proliferative tumor in JAK2.
  • the Exxon 12 mutant probe corresponding to the gene mutation is included as the JAK2 mutant probe.
  • the gene mutation evaluation kit includes a primer set for V617F mutation that amplifies the region containing the V617F mutation in JAK2, and a primer set for exon 12 that amplifies the region containing the gene mutation existing in exon 12 of the JAK2 gene. I'm out.
  • the V617F mutation in the JAK2 gene mutation means that the 617th valine is replaced with phenylalanine. This mutation contributes to the activation of the JAK-STAT pathway and is a prominent feature in polycythemia vera (PV).
  • the V617F mutation is also found at a frequency of 50-60% in patients with primary myelofibrosis (PMF) or patients with essential thrombocythemia (ET).
  • the nucleotide sequence of exon 14 containing valine at position 617 of the wild-type JAK2 gene is shown in SEQ ID NO: 11. In the case of having a V617F mutation, the 351st G in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 is substituted and mutated to T.
  • the gene mutation existing in exon 12 is known as a diagnostic criterion for MPN indicated by the World Health Organization (WHO), and is a gene mutation detected especially in polycythemia vera (PV).
  • WHO World Health Organization
  • the gene mutation existing in Exxon 12 of the JAK2 gene is not particularly limited, but for example, a mutation lacking the 542nd asparagine and the 543th glutamic acid (called the N542_E543del mutation), the 543th glutamic acid and the 544th asparagine.
  • E543_D544del mutation An acid-deficient mutation (called the E543_D544del mutation), a mutation in which arginine at position 541 to glutamate at position 543 becomes lysine (called R541_E543> K mutation), and phenylalanine at position 537 to lysine at position 539.
  • a mutation that becomes leucine referred to as F537_K539> L mutation
  • K539L (TT) mutation or K539L (CT) mutation a mutation in which the codon (AAA) encoding the 539th lysine becomes the codon (TTA) encoding leucine.
  • K539L (CT) mutation is a mutation in which the codon encoding lysine at position 539 (AAA) becomes the codon encoding leucine (CTA).
  • the base sequence encoding Exxon 12 among the wild-type JAK2 genes is shown in SEQ ID NO: 12. If it has the N542_E543del mutation, the 6th base from the 250th to the 255th will be deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12. If the E543_D544del mutation is present, the 6 bases 253 to 258 will be deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12. If the R541_E543> K mutation is present, the 6 bases at positions 248 to 253 will be deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the 6th base from the 237th to the 242nd will be deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the 241st and 242nd AA in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 are substituted mutations with TT.
  • CT K539L
  • the gene mutation evaluation kit according to the present invention has a configuration containing the CALR mutant probe described in the above ⁇ CARL gene mutation>, a configuration containing the JAK2 mutant probe described in the above ⁇ JAK2 gene mutation>, and these CALR mutant types. It may be configured to include a probe and a JAK2 mutant probe. Furthermore, the gene mutation evaluation kit according to the present invention may simultaneously identify gene mutations in MPL in addition to these gene mutations in CALR and / or JAK2. These gene mutations in CALR, JAK2 and MPL are gene mutations used in the diagnosis of myeloproliferative neoplasms in the classification by the World Health Organization (WHO) (for example, 2016 version).
  • WHO World Health Organization
  • examples of the gene mutation associated with myeloproliferative neoplasm in MPL include a W515K mutation (a mutation in which tryptophan at position 515 is replaced with lysine) or a mutation in W515L (a mutation in which tryptophan at position 515 is replaced with leucine).
  • This MPL gene mutation is found in 3-5% of patients with essential thrombocythemia (ET) and in 6-10% of primary myelofibrosis (PMF).
  • the nucleotide sequence encoding the wild-type MPL is shown in SEQ ID NO: 13.
  • the 305th and 306th TGs in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 are substituted and mutated to AA. If it has a W515L mutation, the 306th G in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 will be substituted and mutated to T.
  • any probe for identifying the gene mutation in JAK2 and MPL can be used. Further, when the gene mutation evaluation kit according to the present invention contains the JAK2 mutant probe described in the above ⁇ JAK2 gene mutation>, any probe for identifying the gene mutation in CALR and MPL may be used. it can.
  • an oligonucleotide containing, for example, CTCCACAGAaACATACTCC (SEQ ID NO: 14) corresponding to the above substitution mutation in SEQ ID NO: 11 can be used as a mutant probe.
  • the lowercase a corresponds to the substitution mutation at position 351 from G to T in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • a wild-type probe corresponding to wild-type JAK2 (a sequence in which the lowercase a in the above sequence is c) can also be used.
  • a mutant probe containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 may be used, or a probe set consisting of the mutant probe and a wild-type probe may be used. ..
  • an oligonucleotide containing CACAAAATCAGA-GATTTGATATTTG (SEQ ID NO: 15) can be used as a mutant probe.
  • the position of the hyphen in the above sequence corresponds to the 6-base deletion of the 250th to 255th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • an oligonucleotide containing CACAAAATCAGAAAT-TTGATATTTGT (SEQ ID NO: 16) can be used as the mutant probe.
  • the position of the hyphen in the above sequence corresponds to the 6-base deletion at positions 253 to 258 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • an oligonucleotide containing CACAAAATCA-AAGATTTGATATTTGT (SEQ ID NO: 17) can be used as the mutant probe.
  • the position of the hyphen in the above sequence corresponds to the 6-base deletion at positions 248 to 253 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • an oligonucleotide containing CCAAATGGTG-TTAATCAGAAATGAA (SEQ ID NO: 18) can be used as the mutant probe.
  • the position of the hyphen in the above sequence corresponds to the 6-base deletion at positions 237 to 242 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • an oligonucleotide containing GGTGTTTCACttAATCAGAAATGA (SEQ ID NO: 19) can be used as the mutant probe.
  • the lowercase tt in the above sequence corresponds to the 241st and 242nd AA in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • an oligonucleotide containing GTGTTTCACctAATCAGAAATGA (SEQ ID NO: 20) can be used as the mutant probe.
  • the lowercase ct in the above sequence corresponds to the 241st and 242nd AA in the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • a wild-type probe corresponding to the wild-type of each mutation can also be used.
  • each of the above mutations is very close to each other or partially overlaps with each other, it can be represented by one wild-type probe, or several wild-type probes can be used in combination.
  • two wild-type probes were used: a wild-type probe centered on the N542_E543del mutation, E543_D544del mutation, and R541_E543> K mutation, and a wild-type probe centered on the F537_K539> L mutation.
  • an oligonucleotide containing, for example, CTCCTTGT-CCGCTCCTCGTC (SEQ ID NO: 21) corresponding to the above 52 base deficiency in SEQ ID NO: 10 can be used as a probe.
  • the position of the hyphen in the above sequence corresponds to the 52nd base deletion at the 506th to 557th positions in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • Wild-type probes corresponding to wild-type CALR can also be used to identify type 1 mutations in CALR.
  • a mutant probe containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 may be used, or a probe set consisting of the mutant probe and a wild-type probe may be used. good.
  • an oligonucleotide containing, for example, ATCCTCCgacaaTTGTCCT (SEQ ID NO: 22) corresponding to the above-mentioned 5-base insertion in SEQ ID NO: 10 can be used as a probe.
  • lowercase gacaa has 5 bases inserted.
  • Wild-type probes corresponding to wild-type CALR can also be used to identify type 2 mutations in CALR. That is, in order to identify a type 2 mutation of CALR, a mutant probe containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 may be used, and a probe set consisting of the mutant probe and a wild-type probe may be used. Is also good.
  • an oligonucleotide containing, for example, GAAACTGCttCCTCAGCA (SEQ ID NO: 23) corresponding to the above substitution mutation in SEQ ID NO: 13 can be used as a mutant probe.
  • the lowercase tt corresponds to the substitution mutation of the 305th and 306th TGs to AA in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • a wild-type probe corresponding to the wild-type MPL (a sequence in which the lowercase tt in the above sequence is ca) can also be used.
  • a mutant probe containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 may be used, or a probe set consisting of the mutant probe and a wild-type probe may be used. ..
  • an oligonucleotide containing, for example, GGAAACTGCAaCCTCAG (SEQ ID NO: 24) corresponding to the above substitution mutation in SEQ ID NO: 13 can be used as a mutant probe.
  • the lowercase a corresponds to the substitution mutation of G at position 306 to T in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • a wild-type probe corresponding to the wild-type MPL (a sequence in which the lowercase a in the above sequence is c) can also be used.
  • a mutant probe containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 may be used, or a probe set consisting of the mutant probe and a wild-type probe may be used. ..
  • SEQ ID NOs: 95, 53, 54 and 55 are used as CARL mutant probes having mismatches for identifying type 1 mutations, type 3 mutations, type 4 mutations and / or type 5 mutations present in CALR.
  • the nucleotide sequence of the CARL mutant probe is not limited to SEQ ID NOs: 95, 53, 54 and 55, and the nucleotide sequence of the type 1 mutation shown in SEQ ID NO: 57 and the nucleotide sequence of the type 3 mutation shown in SEQ ID NO: 58. It can be appropriately designed based on the base sequence, the base sequence of the type 4 mutation shown in SEQ ID NO: 59, and the base sequence of the type 5 mutation shown in SEQ ID NO: 60.
  • mutant probe for identifying a gene mutation existing in JAK2 was exemplified, the base sequence of the mutant probe is not limited to SEQ ID NOs: 14 to 20, and the base sequence of JAK2 shown in SEQ ID NOs: 11 and 12 is not limited. Can be appropriately designed based on. SEQ ID NOs: 21 and 22, respectively, have been exemplified as mutant probes for identifying type 1 and type 2 mutations present in CALR, but the nucleotide sequences of the mutant probes are not limited to SEQ ID NOs: 21 and 22, and are SEQ ID NOs: It can be appropriately designed based on the base sequence of CALR shown in 10.
  • SEQ ID NOs: 23 and 24 have been exemplified as mutant probes for identifying gene mutations present in MPL
  • the nucleotide sequences of the mutant probes are not limited to SEQ ID NOs: 23 and 24, and the MPL shown in SEQ ID NO: 13 It can be appropriately designed based on the base sequence.
  • the base length of these probes is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 30 base lengths, preferably 15 to 25 base lengths.
  • the probe is a sum of the base sequence designed based on the region containing the gene mutation in the base sequences of SEQ ID NOs: 10 to 13 and the base sequences added to one or both ends of the base sequence.
  • the length can be, for example, 10 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases.
  • the probe designed as described above is preferably nucleic acid, more preferably DNA.
  • the DNA includes both double-stranded and single-stranded DNA, but is preferably single-stranded DNA.
  • the probe can be obtained, for example, by chemically synthesizing it with a nucleic acid synthesizer.
  • a nucleic acid synthesizer a device called a DNA synthesizer, a fully automatic nucleic acid synthesizer, an automatic nucleic acid synthesizer, or the like can be used.
  • the probe designed as described above is preferably used in the form of a microarray (for example, a DNA chip) by immobilizing its 5'end on a carrier.
  • the microarray has a mutant probe and a wild-type probe for each of the above-mentioned gene mutations.
  • the mutant probe and the wild-type probe preferably have a difference in length of 2 bases or less, and more preferably have the same length.
  • the microarray according to the present invention can be produced by fixing the above-mentioned probe on a carrier.
  • the material of the carrier those known in the art can be used and are not particularly limited.
  • precious metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and conductor materials such as carbon represented by graphite and carbon fiber; monocrystalline silicon, amorphous.
  • a carrier having a carbon layer and a chemically modifying group on the surface is preferably used as the carrier.
  • the carrier having a carbon layer and a chemical modification group on the surface includes a carrier having a carbon layer and a chemical modification group on the surface of the substrate and a carrier having a chemical modification group on the surface of the substrate composed of the carbon layer.
  • the material of the substrate those known in the art can be used, and without particular limitation, the same materials as those mentioned above as the carrier materials can be used.
  • a carrier having a fine flat plate-like structure is preferably used.
  • the shape is not limited to rectangular, square, round, etc., but usually 1 to 75 mm square, preferably 1 to 10 mm square, and more preferably 3 to 5 mm square is used. Since it is easy to produce a carrier having a fine flat plate-like structure, it is preferable to use a substrate made of a silicon material or a resin material, and in particular, a carrier having a carbon layer and a chemically modifying group on the surface of the substrate made of single crystal silicon is more preferable. preferable.
  • Single crystal silicon has a slight change in the orientation of the crystal axis in some parts (sometimes called a mosaic crystal), or contains turbulence on an atomic scale (lattice defect). Is also included.
  • the carbon layer formed on the substrate in the present invention is not particularly limited, but is limited to synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon, and carbon-based material (for example, graphite and fullerene). , Carbon nanotubes), a mixture thereof, or a laminate thereof is preferable. Further, carbides such as hafnium carbide, niobide carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide and vanadium carbide may be used.
  • soft diamond is a general term for incomplete diamond structures that are a mixture of diamond and carbon, such as so-called diamond-like carbon (DLC: Diamond Like Carbon), and the mixing ratio thereof is not particularly limited.
  • the carbon layer has excellent chemical stability and can withstand subsequent reactions in the introduction of chemical modifying groups and binding to the substance to be analyzed, and the bond is flexible because it is bonded to the substance to be analyzed by electrostatic bonding. It is advantageous in that it has the property, it is transparent to the detection system UV because it does not absorb UV, and it can be energized during electroblotting. It is also advantageous in that there is little non-specific adsorption in the binding reaction with the substance to be analyzed. As described above, a carrier whose substrate itself is made of a carbon layer may be used.
  • the carbon layer can be formed by a known method.
  • microwave plasma CVD Chemical vapor deposition
  • ECRCVD Electro cyclotron resonance chemical vapor deposit
  • ICP Inductive coupled plasma
  • DC sputtering method ECR (Electric cyclotron resonance) sputtering method
  • ionized vapor deposition method arc.
  • Examples include a formula vapor deposition method, a laser vapor deposition method, an EB (Electron beam) vapor deposition method, and a resistance heating vapor deposition method.
  • the raw material gas (methane) is decomposed by the glow discharge generated between the electrodes by the high frequency, and a carbon layer is synthesized on the substrate.
  • a carbon layer is synthesized on the substrate.
  • thermions generated by the tungsten filament are used to decompose and ionize the raw material gas (benzene), and a carbon layer is formed on the substrate by a bias voltage.
  • a carbon layer may be formed by an ionization vapor deposition method in a mixed gas consisting of 1 to 99% by volume of hydrogen gas and 99 to 1% by volume of remaining methane gas.
  • a DC voltage is applied between a solid graphite material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode) to cause an arc discharge in a vacuum to generate carbon atom plasma from the cathode, which is an evaporation source.
  • a solid graphite material cathode evaporation source
  • anode a vacuum vessel
  • carbon ions in the plasma can be accelerated toward the substrate to form a carbon layer.
  • a carbon layer can be formed by irradiating a graphite target plate with Nd: YAG laser (pulse oscillation) light to melt it and depositing carbon atoms on a glass substrate.
  • Nd: YAG laser pulse oscillation
  • the thickness of the carbon layer is usually about a monomolecular layer to about 100 ⁇ m, and if it is too thin, the surface of the underlying substrate may be locally exposed, and conversely, it is thick. As a result, the productivity is deteriorated, so it is preferably 2 nm to 1 ⁇ m, more preferably 5 nm to 500 nm.
  • the oligonucleotide probe By introducing a chemically modifying group on the surface of the substrate on which the carbon layer is formed, the oligonucleotide probe can be firmly immobilized on the carrier.
  • the chemically modifying group to be introduced can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited, and examples thereof include an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a formyl group, a hydroxyl group and an active ester group.
  • the introduction of the amino group can be carried out, for example, by irradiating the carbon layer with ultraviolet rays in ammonia gas or by plasma treatment.
  • the carbon layer can be chlorinated by irradiating the carbon layer with ultraviolet rays in chlorine gas, and further irradiated with ultraviolet rays in ammonia gas.
  • it can be carried out by reacting a polyvalent amine gas such as methylenediamine or ethylenediamine with a chlorinated carbon layer.
  • the introduction of the carboxyl group can be carried out, for example, by reacting the aminated carbon layer as described above with an appropriate compound.
  • Examples of the compound used for introducing a carboxyl group are represented by the formula: X-R1-COOH (in the formula, X represents a halogen atom and R1 represents a divalent hydrocarbon group having 10 to 12 carbon atoms).
  • Halocarboxylic acids such as chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3-chloroacrylic acid, 4-chlorobenzoic acid; formula: HOOC-R2-COOH (formula) Among them, R2 represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), and dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, and phthalic acid; polyacrylic acid.
  • Polycarboxylic acids such as polymethacrylic acid, trimellitic acid, butanetetracarboxylic acid; formula: R3-CO-R4-COOH (in the formula, R3 is a hydrogen atom or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms.
  • R4 represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), ketoic acid or aldehyde acid; formula: X-OC-R5-COOH (in the formula, X is a halogen atom, R5 is a single bond or A dicarboxylic acid monohalide represented by (representing a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), such as succinic acid monoclonal acid and malonic acid monoclonal acid; phthalic acid anhydride, succinic acid anhydride, oxalic acid anhydride, maleic acid anhydride. , Acid anhydrides such as butanetetracarboxylic acid anhydride.
  • the epoxy group can be introduced, for example, by reacting the aminated carbon layer as described above with an appropriate polyvalent epoxy compound. Alternatively, it can be obtained by reacting an organic peracid with a carbon-carbon double bond contained in the carbon layer.
  • the organic peracid include peracetic acid, perbenzoic acid, diperoxyphthalic acid, performic acid, and trifluoroperacetic acid.
  • the formyl group can be introduced, for example, by reacting the aminated carbon layer as described above with glutaraldehyde.
  • the introduction of the hydroxyl group can be carried out, for example, by reacting water with the chlorinated carbon layer as described above.
  • the active ester group means an ester group having a highly acidic electron-attracting group on the alcohol side of the ester group and activating the nucleophilic reaction, that is, an ester group having high reaction activity. It is an ester group that has an electron-attracting group on the alcohol side of the ester group and is more activated than the alkyl ester.
  • the active ester group has reactivity with groups such as amino group, thiol group and hydroxyl group. More specifically, active ester groups in which phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, cyanomethyl esters, heterocyclic hydroxy compound esters and the like have much higher activity than alkyl esters and the like. Known as.
  • examples of the active ester group include p-nitrophenyl group, N-hydroxysuccinimide group, succinimide group, phthalate imide group, 5-norbornene-2,3-dicarboxyimide group and the like.
  • an N-hydroxysuccinimide group is preferably used.
  • an active ester group for example, the carboxyl group introduced as described above is combined with a dehydration condensing agent such as cyanamide or carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide) and N-. It can be carried out by active esterification with a compound such as hydroxysuccinimide. By this treatment, a group to which an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide group is bonded can be formed at the end of the hydrocarbon group via an amide bond (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-139532).
  • the probe is dissolved in a spotting buffer to prepare a spotting solution, which is dispensed into a 96-well or 384-well plastic plate, and the dispensed solution is spotted on a carrier by a spotter device or the like.
  • a spotter device or the like Can produce microarrays immobilized on a carrier.
  • the spotting solution may be manually spotted with a micropipettor.
  • Incubation After spotting, it is preferable to carry out incubation because the reaction in which the probe binds to the carrier proceeds. Incubation is usually carried out at a temperature of ⁇ 20 to 100 ° C., preferably 0 to 90 ° C., usually for 0.5 to 16 hours, preferably 1 to 2 hours. Incubation is preferably carried out in a high humidity atmosphere, for example, in a humidity of 50 to 90%. Following the incubation, it is preferable to perform washing with a washing solution (for example, 50 mM TBS / 0.05% Tween20, 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS solution, ultrapure water, etc.) in order to remove DNA that is not bound to the carrier. ..
  • a washing solution for example, 50 mM TBS / 0.05% Tween20, 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS solution, ultrapure water, etc.
  • microarray configured as described above, it is possible to simultaneously determine the presence or absence of each gene mutation in the above-mentioned gene mutations existing in JAK2, CALR and MPL in the diagnosis target person.
  • the person to be diagnosed is usually a human being, and is not particularly limited to race, etc., but in particular, the yellow race, preferably the East Asian race, and particularly preferably the Japanese.
  • the diagnosis target can be a patient suspected of having a myeloproliferative neoplasm.
  • the sample derived from the person to be diagnosed is not particularly limited. Examples include blood-related samples (blood, serum, plasma, etc.), lymph, feces, cancer cells, crushed tissues or organs and extracts.
  • DNA is extracted from the sample collected from the person to be diagnosed.
  • the extraction means is not particularly limited.
  • a DNA extraction method using phenol / chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB or the like can be used.
  • an amplification reaction was performed using the obtained DNA as a template to obtain a region containing JAK2 (a region containing the V617F mutation site of JAK2, a region containing a gene mutation contained in exon 12), a region containing CALR, and MPL. Amplifies the area it contains.
  • a polymerase chain reaction PCR
  • LAMP Long-Mediated Isothermal Amplification
  • ICAN Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids
  • the method for labeling the amplified nucleic acid is not particularly limited, but for example, a method in which a primer used for the amplification reaction is labeled in advance may be used, or a labeled nucleotide is used as a substrate for the amplification reaction. You may use the method of The labeling substance is not particularly limited, but a radioisotope, a fluorescent dye, or an organic compound such as digoxigenin (DIG) or biotin can be used.
  • DIG digoxigenin
  • this reaction system includes a buffer required for nucleic acid amplification / labeling, heat-resistant DNA polymerase, a primer specific to the amplification region, and labeled nucleotide triphosphate (specifically, nucleotide triphosphate to which a fluorescent label or the like is added). , Nucleotide triphosphate, magnesium chloride and the like.
  • the gene mutation evaluation kit according to the present invention contains the CALR mutant probe described in the above ⁇ CALR gene mutation>, a region containing a type 1 mutation, a type 3 mutation, a type 4 mutation, and a type 5 mutation existing in CALR. That is, a primer set for amplifying the region containing the defect position (arrow in FIG. 1) can be included.
  • the primer set means a set of primers including a forward primer and a reverse primer.
  • the region containing the defect position amplified using the primer set is detected by the CARL mutant probe having the above-mentioned mismatch (for example, SEQ ID NOs: 95, 53, 54 and 55).
  • the type 1 mutation, type 3 mutation, type 4 mutation, and type 5 mutation have the same sequence as the wild type (underlined portion in FIG. 1) on the 3'side of the defect position. For this reason, if a probe designed so that the type 1 mutation, type 3 mutation, type 4 mutation, and type 5 mutation are completely matched including the defect position is used, it is not applicable to the wild type sample. May specifically hybridize.
  • a CARL mutant probe for example, SEQ ID NOs: 95, 53, 54 and 55
  • SEQ ID NOs: 95, 53, 54 and 55 there is a possibility of non-specific hybridization with the wild type due to the mismatch. Can be reduced. Therefore, by using the gene mutation evaluation kit according to the present invention, it is possible to reliably distinguish and detect a wild-type sample and a sample having a type 1 mutation. In addition, by using the gene mutation evaluation kit according to the present invention, it is possible to reliably distinguish and detect a wild-type sample and a sample having a type 3 mutation. In addition, by using the gene mutation evaluation kit according to the present invention, a wild-type sample and a sample having a type 4 mutation can be reliably distinguished and detected. Furthermore, by using the gene mutation evaluation kit according to the present invention, it is possible to reliably distinguish and detect a wild-type sample and a sample having a type 5 mutation.
  • Mutant probes can be designed for mutations as well.
  • a mutant probe can be designed in the same manner. More specifically, a deletion mutation having a length of 5 bases or more, preferably a deletion mutation having a length of 10 bases or more, and a deletion mutation longer than a suitable base length as a probe, including the deletion position in the wild-type base sequence. If there is a sequence within the base that matches the sequence after deletion by 2 bases or more, the mutant probe can be designed so that a part of the matching sequence is mismatched.
  • the defect is located 5'from the defect position in the wild type base sequence. Since there was a sequence that matched the later sequence, we designed a mutant probe that had a mismatch on the 3'side of the defect position. Conversely, on the 3'side of the defect position in the wild-type base sequence, after the deletion, In the case of a mutant having a sequence that matches the sequence, a mismatch can be set on the 5'side of the defect position to design a mutant probe.
  • the region containing the V617F mutation is used as a primer set for amplifying the region containing the gene mutation in JAK2. It contains a primer set for V617F mutation to be amplified and a primer set for Exxon 12 that amplifies the region containing the gene mutation present in Exxon 12 of the JAK2 gene.
  • the primer set means a set of primers including a forward primer and a reverse primer.
  • the primer set for V617F mutation is not particularly limited as long as it can specifically amplify the region encoding the amino acid corresponding to the 617th valine in the wild type, and can be appropriately designed by those skilled in the art.
  • Examples thereof include a set consisting of a forward primer JAK2-F: 5'-GAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGG-3'(SEQ ID NO: 25) and a reverse primer JAK2-R: 5'-CTGACACCTAGCTGTGATCCTGAAACTG-3' (SEQ ID NO: 26).
  • the concentration of one of the V617F mutation primer sets for example, the primer (for example, forward primer) labeled with a fluorescent label.
  • the concentration of the primer is preferably 1.0 ⁇ M or more.
  • the upper limit of the primer concentration is not particularly limited, and can be an upper limit of the primer concentration in a normal nucleic acid amplification reaction (for example, 10 ⁇ M).
  • the primer set for exon 12 at least 2, preferably 3, more preferably 4, still more preferably 5, and most preferably all 6 of the plurality of gene mutations contained in the exon 12 described above. It is preferable to design so that it can be amplified all at once. More specifically, as a primer set for exon 12, as shown in FIG. 3, a forward primer for exon 12 having a length of 10 consecutive bases or more selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a forward primer for exon 12 and SEQ ID NO: 2 It can be used as a reverse primer for exon 12 having a length of 10 consecutive bases or more selected from the base sequences shown in.
  • SEQ ID NO: 1 is the 178th to 228th sequence of the base sequence encoding exon 12
  • SEQ ID NO: 2 is the 399th to 435th sequence, both of which are partial sequences in SEQ ID NO: 12, between the two. All of the above 6 gene mutations are included.
  • the forward primer for exon 12 includes the forward primer F1 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, the forward primer F3 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the base shown in SEQ ID NO: 5. It can be one primer selected from the group consisting of the exon 12 forward primer F4 consisting of the sequence and the exon 12 forward primer F5 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the reverse primer for exon 12 is shown in the reverse primer R1 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, the reverse primer R2 for exon 12 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 9. It can be one primer selected from the group consisting of the reverse primer R3 for exon 12 consisting of the base sequence.
  • the exon 12 primer set is more preferably a combination of the exon 12 forward primer F5 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and the exon 12 reverse primer R2 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the base sequences of the above-mentioned forward primers F1, F3 to F5, and reverse primers R1 to R3 are represented by the corresponding positions on the base sequence encoding exon 12. Therefore, either the forward or reverse primer constituting the primer set becomes a complementary strand of the base sequence indicated by the SEQ ID NO:. In all the examples described later, the reverse side is made of a complementary strand.
  • the concentration of the reverse primer is preferably 2.5 ⁇ M or more.
  • the concentration of the primer is not particularly limited, and can be an upper limit of the primer concentration in a normal nucleic acid amplification reaction (for example, 10 ⁇ M).
  • the forward concentration and reverse concentration in the primer set may be the same or different. If they are different, one of them may satisfy the above concentration conditions.
  • the primer concentration on the fluorescently labeled side is set high in any of the primer sets of JAK2 V617F, exon 12, CALR, and MPL.
  • the concentration ratio of the labeled primer in the V617F mutation primer set to the labeled primer in the exon 12 primer set [primer concentration for exon 12] / [primer concentration for V617F mutation] is 1.0 to 5.5. Is preferable. By setting the concentration ratio within this range, the region containing the V617F mutation and the region containing the gene mutation existing in exon 12 can be satisfactorily amplified.
  • the primer used for the amplification reaction of the region containing the gene mutation in CALR is not particularly limited as long as it can specifically amplify the region containing the gene mutation, and can be appropriately designed by those skilled in the art.
  • Examples thereof include a set of primers consisting of the primer CALR-F: 5'-CGTAACAAAGGTGAGGCCTGGT-3'(SEQ ID NO: 27) and the primer CALR-R: 5'-GGCCTCTCTACAGCTCGTCCTTG-3' (SEQ ID NO: 28).
  • the primer used for the amplification reaction of the region containing the gene mutation in MPL is not particularly limited as long as it can specifically amplify the region containing the gene mutation, and can be appropriately designed by those skilled in the art.
  • examples thereof include a set of primers consisting of the primer MPL-F: 5'-CTCCTAGCCTGGATCTCCTTGG-3'(SEQ ID NO: 29) and the primer MPL-R: 5'-ACAGAGCGAACCAAGAATGCCTGTTTAC-3' (SEQ ID NO: 30).
  • the nucleic acid fragment amplified by the primer is not particularly limited as long as it contains a region corresponding to the designed probe.
  • 1 kbp or less is preferable, 800 bp or less is more preferable, 500 bp or less is further preferable, and 350 bp or less is preferable. Especially preferable.
  • the presence or absence of the above gene mutation in the diagnosis subject can be determined. Can be evaluated. That is, it can be measured that the amplified nucleic acid hybridizes to the mutant probe, for example, by detecting a label.
  • the fluorescent signal is detected by using a fluorescent scanner, and the signal intensity can be quantified by analyzing this with image analysis software.
  • the hybridization reaction is preferably carried out under stringent conditions.
  • the stringent condition is a condition in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS 25 Refers to the conditions for washing at °C, 10 minutes and 2 ⁇ SSC, 25 °C, 5 minutes.
  • the hybridization temperature can be 45 to 60 ° C.
  • the presence or absence of the above-mentioned gene mutation can be evaluated using the signal intensities from these mutant probes and the wild-type probe. .. Specifically, the signal intensity of the wild-type probe and the signal intensity of the mutant probe are measured, respectively, and a determination value for evaluating the signal intensity derived from the mutant probe is calculated. Examples of calculation of the determination value include a method using the formula: [Signal intensity derived from mutant probe] / ([Signal intensity derived from wild-type probe] + [Signal intensity derived from mutant probe]).
  • the determination value calculated by the above formula is compared with a predetermined threshold value (cutoff value), and if the determination value exceeds the threshold value, it is determined that the amplified nucleic acid contains the above gene mutation, and the determination value is determined. If is below the threshold value, it is determined that the amplified nucleic acid does not contain the above gene mutation.
  • the threshold value is not particularly limited, but is, for example, a determination value calculated by the above formula using a sample in which each of the above-mentioned gene mutations present in JAK2, CALR, and MPL is confirmed to be a wild type. Can be specified based on. More specifically, a plurality of judgment values were calculated using a plurality of samples in which each of the above-mentioned gene mutations present in JAK2, CALR and MPL was confirmed to be wild type, and the average value + 3 ⁇ ( The value of ⁇ : standard deviation) can be used as the threshold value. The average value + 2 ⁇ or the average value + ⁇ can also be used as the threshold value.
  • JAK2, CALR and MPL Information on each gene mutation present in JAK2, CALR and MPL can be used, for example, in the diagnosis of myeloproliferative neoplasms in the WHO classification (2016 version).
  • the presence of the above gene mutation in JAK2 is one requirement for the diagnosis of polycythemia vera (PV).
  • PV polycythemia vera
  • E essential thrombocythemia
  • JAK2, CALR and JAK2, CALR and CALR are used to diagnose prefibrotic / early primary myelofibrosis (prefibrotic / early PMF) or primary myelofibrosis (PMF).
  • prefibrotic / early PMF prefibrotic / early PMF
  • PMF primary myelofibrosis
  • One requirement is the presence of any of the gene mutations present in MPL.
  • microarrays equipped with mutant probes for identifying mutations in each gene present in JAK2, CALR and MPL should be used. Can be done.
  • Example 1 1. Sample preparation In this example, genomic DNA derived from healthy human peripheral blood (manufactured by Biochain) was used as a wild-type sample. In this example, in order to detect the gene mutation shown in Table 1, the target regions (4 locations) containing the gene mutation were amplified.
  • the primers shown in Table 2 were designed in order to amplify the four target regions shown in Table 1.
  • Exon12-F is F5
  • exon12-R is a complementary strand of R2.
  • the four target regions of the JAK2 gene, CALR gene, and MPL gene were amplified by PCR, respectively.
  • the genomic DNA used as a template was 8 or 16 ng / ⁇ L.
  • the composition of the reaction solution is shown in Table 3.
  • the PCR thermal cycle was carried out at 95 ° C. for 5 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 59 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 45 seconds as one cycle, and then at 72 ° C. for 10 minutes. Finally, the temperature was maintained at 4 ° C.
  • the chip was covered with a cover film, and the fluorescence intensity of the chip was detected by BIOSHOT (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.).
  • BIOSHOT manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.
  • the fluorescence intensity of the wild probe and mutant probe measured as described above, the following formulas are used for the JAK2 gene mutation (V617F mutation and 6 gene mutations contained in Exxon 12), CALR gene mutation, and MPL gene mutation.
  • probes having defective mismatches at predetermined positions hybridize specifically to mutant samples with high specific fluorescence intensity * 1 and low nonspecific fluorescence intensity * 2. It became clear that soybeans can be produced. As shown in Table 6, probes capable of very specifically hybridizing to mutant samples having a specific fluorescence intensity * 1 of 10000 or more and a nonspecific fluorescence intensity * 2 of 1000 or less are available. I was able to design. Furthermore, among the designed mutant probes, a probe that can hybridize very specifically to a mutant sample such that the specific fluorescence intensity * 1 is 15,000 or more and the non-specific fluorescence intensity * 2 is 500 or less.
  • type4 mutant probe 5 and the type4 mutant probe 7, which are probes for identifying the type4 mutation are more preferably the type4 mutant probe 5 because of the high specific fluorescence intensity * 1.
  • the type 5 mutant probe 4 and the type 5 mutant probe 5 which are probes for identifying the type 5 mutation it can be said that the type 5 mutant probe 4 is more preferable because of the high specific fluorescence intensity * 1.
  • each probe shown in Table 5 was used to fluoresce each mutation model sample (type 1 mutation model plasmid, type 2 mutation model plasmid, type 3 mutation model plasmid, type 4 mutation model plasmid, and type 5 mutation model plasmid). The intensity and fluorescence intensity for the wild model sample (plasmid) were measured. The results are shown in Table 7.
  • FIG. 7 shows the results measured using the type 1 mutant probe 7 (the probe sequence actually prepared is Table 4) among the results shown in Experimental Example 1-2 described later.
  • Example 1-2 In this experimental example, a plurality of CARL mutant probes for detecting a type 1 mutation, which is a defective gene mutation existing in CARL, were designed and evaluated. That is, for the type 1 mutation, a plurality of CARL mutant probes that completely match the region including the defect position (arrow in FIG. 1) and a plurality of CARL mutant probes having a mismatch in the region were designed (Table 8). The actually prepared probe has a linker (continuous portion of T) bound to the 5'-side of the complementary strand of the designed sequence.
  • a linker continuous portion of T
  • a probe having a defective mismatch at a predetermined position hybridizes specifically with a mutant sample having a high specific fluorescence intensity * 1 and a low nonspecific fluorescence intensity * 2. It became clear that soybeans can be produced. As shown in Table 9, probes capable of very specifically hybridizing to mutant samples having a specific fluorescence intensity * 1 of 15,000 or more and a non-specific fluorescence intensity * 2 of 3000 or less are available. It was possible to design (type1 mutant probe 7).
  • Example 2 In this experimental example, a plurality of primer sets for amplifying a region containing 6 gene mutations contained in exon 12 of JAK2 were designed and evaluated.
  • the designed primer set is as shown in FIG.
  • the primer sets shown in Table 10 below were evaluated.
  • F1 to F5 and R1 to R3 in Table 10 correspond to FIG.
  • the forward primers F1 and F3 to F5 are included in the range of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the forward primer F2 is designed at a position outside the range (SEQ ID NO: 52).
  • Experimental Example 1 and Experimental Example 2 described later wild-type peripheral blood genomic DNA derived from a healthy person was used as a sample, and the fluorescence intensity of the wild-type probe was evaluated.
  • Fig. 4 The results are shown in Fig. 4. As can be seen from FIG. 4, it is clear that excellent fluorescence intensities can be achieved for all the amplified fragments when a primer set other than the primer set 2 using F2 is used among the primer sets designed in this example. became. Of these sets, primer sets 1, 4 and 5 having high fluorescence intensity as a whole are preferable, and primer sets 1 and 5 having a relatively small intensity difference between the analysis target regions are more preferable. In the following evaluation, primer set 5 (combination of F5 and R2) was adopted as shown in Table 2.
  • Figures 5 and 6 show the four regions amplified, with the concentration of the primer in the primer mix mixed in the PCR reaction solution and the concentration of the labeled primer (forward primer) in the primer set that amplifies the region containing the V617F mutation site on the horizontal axis.
  • a characteristic diagram with the fluorescence intensity derived from the above as the vertical axis is shown.
  • FIGS. 7 and 8 show the concentration of the primer in the primer mix mixed in the PCR reaction solution and the concentration of the labeled primer (reverse primer) in the primer set for amplifying JAK2 Exxon 12 as the horizontal axis, and in the four amplified regions.
  • a characteristic diagram with the derived fluorescence intensity as the vertical axis is shown.
  • the concentration of one of the labeled primer sets for amplifying exon 12 is 3.0 to 4.0 ⁇ M, it is labeled among the primer sets for amplifying the region containing the V617F mutation site.
  • the primer concentration was 0.5 ⁇ M, the fluorescence intensity of 12000 or more could not be achieved.
  • one of the primer sets that amplifies the region containing the V617F mutation site has a primer concentration of 1.0 ⁇ M or more, and one of the primer sets that amplifies exon 12 is labeled. Fluorescence intensity of 12000 or more could be achieved under the condition that the primer concentration of was 2.5 ⁇ M or more.
  • FIG. 9 shows the concentration of primers in the primer mix mixed with the PCR reaction solution, the labeled primer (reverse primer) in the primer set for amplifying exon 12, and the labeled primer in the primer set for amplifying the region containing the V617F mutation site.
  • a characteristic diagram is shown in which the concentration ratio with (forward primer) is on the horizontal axis and the fluorescence intensity derived from the four amplified regions is on the vertical axis. As can be seen from FIG. 9, when the concentration ratio was in the range of 1.0 to 5.5, the fluorescence intensity of 12000 or more could be achieved for all the amplified fragments.
  • Example 2 in the mutation model sample, an artificial gene (plasma) carrying a wild-type or mutant sequence of the gene analysis target region is constructed, and a wild-type artificial gene and a mutant artificial gene are arbitrarily mixed. Using the reaction solution composition shown in Table 11, PCR was performed for mutation detection.
  • the blocker oligo DNA shown in Table 12 was added to the PCR reaction solution.
  • the blocker is added for the purpose of suppressing non-specific hybridization of the mutation detection probe so that sufficient detection sensitivity can be obtained even when the mutation rate of the gene to be analyzed is small, and is derived from the wild type. It is designed to specifically hybridize with the amplification products of.
  • the proportion of mutant model specimens was set to 1% or 5%.
  • the results are shown in FIG.
  • the error bar in FIG. 10 is 5 ⁇ .

Abstract

骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちCARL又はJAK2に存する複数タイプの遺伝子変異の有無を正確に判定する。CALR変異型プローブは、骨髄増殖性腫瘍に関連するタイプ１、タイプ３、タイプ４及びタイプ５変異のいずれかに対応し、人為的欠損によるミスマッチを有し、JAK2変異型プローブはV617F変異型プローブとエクソン12変異型プローブを含む。

Description

骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キット
　本発明は、骨髄増殖性腫瘍の診断項目として有用な遺伝子変異を評価できるプローブセット、当該プローブセットを備えるマイクロアレイに関する。
　骨髄増殖性腫瘍（MPN：Myeloproliferative neoplasms）は、骨髄系細胞の腫瘍化によって発症する疾患である。MPNは、骨髄系細胞（顆粒球、芽球、骨髄巨核球及び肥満細胞等）の著しい増殖を特徴としている。MPNには、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia：CML）、慢性好中球性白血病（chronic neutrophilic leukemia：CNL）、真性赤血球増加症又は真性多血症（polycythemia vera：PV）、原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）、本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）、慢性好酸球性白血病（chronic eosinophilic leukemia：CEL）、好酸球増加症候群（hypereosinophilic syndrome：HES）、肥満細胞症（mastocytosis）及び分類不能骨髄増殖性腫瘍（myeloproliferative neoplasms，unclassifiable：MPN, U）が含まれる。
　MPNの診断については、非特許文献１に記載されるように、臨床的パラメータ、骨髄形態及び遺伝子変異データを指標としている。フィラデルフィア染色体陰性の患者に対して、これらを組み合わせて診断することでCMLを除くMPNを診断することができる。遺伝子変異データとしては、具体的に３つの遺伝子：JAK2、CALR及びMPLに関する変異情報、更には追加的に、ASXL1、EZH2、TET2、IDH1/IDH2、SRSF2及びSF3B1に関する変異情報が利用される。特に、JAK2、CALR及びMPLは、MPN発症の分子基盤であると考えられることから当該遺伝子群における変異の有無がMPNの確定診断における重要な要素となっている。
　また、非特許文献２には、JAK2に関してJAK2V617F変異（617番目のバリンがフェニルアラニンへ置換変異）がPV、ET及びPMFにおいて多く見られること、また少数のPVにおいては上記変異に加えてエクソン12への挿入/欠損型変異が見られることが開示されている。JAK2（Janus activating kinase 2）は、エリスロポエチン受容体のシグナルをつかさどるタンパク質をコードする遺伝子である。これに加えて、非特許文献３には、JAK2に関してエクソン１２に存在する変異が真性多血症（polycythemia vera：PV）や特発性赤血球増加症（idiopathic erythrocytosis：IE）に関連していることが開示されている。さらに、特許文献５には、骨髄増殖性疾患を示す変異として、JAK2遺伝子のエクソン１２に存在する変異のうちc2035t変異（T514M変異）を検出することが開示されている。
　非特許文献２には、更にMPLに関してMPLW515L/K変異PMFがPMF及びETにおいて見られたことが開示されている。MPLは、トロンボポイエチン受容体をコードする遺伝子である。
　非特許文献２には、更にまたCALRに関して、52塩基欠損のタイプ１と5塩基挿入のタイプ２の変異が最も頻度が高く、ET及びPMFにおいてこれら変異が見られることが開示されている。タイプ１変異は、PMFにおいてより高頻度であり、ETにおける骨髄線維症への変換に関連していることが開示されている。CALRは小胞体の分子シャペロンの1つであるcalreticulinをコードする遺伝子である。
　さらに、特許文献１には、JAK2遺伝子の変異解析方法として、JAK2V617F部位特異的な蛍光標識プローブが開示されている。特許文献２には、JAK2V617F変異が陰性であって骨髄増殖性腫瘍を示す患者において見いだされた、JAK2V617F変異とは異なる変異を検出する技術が開示されている。
　さらにまた、特許文献３には、MPL遺伝子多型検出用プローブとして、MPLにおけるW515K変異及びW515L変異を検出するためのプローブセットが開示されている。
　さらにまた、特許文献４には、CALRにおける変異を同定するための技術が開示されている。
　さらにまた、特許文献５には、JAK2核酸中の変異検出が開示され、JAK2におけるエクソン12に存在する遺伝子変異が開示されている。さらにまた、特許文献６には、上述した実情に鑑みて、骨髄増殖性腫瘍に関連する複数の遺伝子変異について同時に簡便に検出する手段として、各遺伝子変異についてプライマーやプローブを設計したことが開示され、JAK2におけるV617F変異、CALRにおけるタイプ１変異及びタイプ２変異、MPLにおけるW515L変異及びW515K変異が検出対象の遺伝子変異として開示されている（３遺伝子における５つの遺伝子変異）。
　なお、目的とする遺伝子変異を検出するためのプローブの設計方法としては、当該遺伝子変異を含む周辺領域の塩基配列に基づいてプローブを設計する。このとき、プローブとしては、特許文献７に開示されるように、遺伝子変異を含む周辺領域の塩基配列に完全に一致する配列、或いは、１又は数個の非天然ヌクレオチドを含む塩基配列として設計される。１又は数個の非天然ヌクレオチドを含むプローブは、当該非天然ヌクレオチドの箇所において、遺伝子変異を含む周辺領域との間でハイブリダイズを形成しない（ミスマッチ）。特許文献７によれば、このミスマッチにより、サンプル中の標的核酸が遺伝子変異を有するかどうかを高精度に検出できると記載されている。
特開2012-034580 WO2009/060804 WO2011/052755 特表2016-537012 特許第6017136号 WO2019/004334 特表2000-511434
Francesco Passamonti and Margherita Maffioli, Hematology 2016, p. 534-542 NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines), Myeloproliferative Neoplasms, Version 2.2017, October 19, 2016 Linda M. Scott et al., N Engl J Med. 2007 Feb 1;356(5):459-68
　本発明は、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちCARLに存する複数タイプの遺伝子変異の有無を正確に判定できるとともに、骨髄増殖性腫瘍の有無をより高精度に判定することができる遺伝子変異評価用キットを提供し、また、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちJAK2に存する複数の遺伝子変異の有無を同時に判定できるとともに、骨髄増殖性腫瘍の有無をより高精度に判定することができる遺伝子変異評価用キットすることを目的とする。
　本発明は以下を包含する。
　（１）CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であって、配列番号１０に示した野生型CARL遺伝子の塩基配列における506番目から557番目の52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ１変異、同塩基配列における509番目から554番目の46塩基が欠損する46塩基欠損のタイプ３変異、同塩基配列において516番目から549番目の34塩基が欠損する34塩基欠損のタイプ４変異及び同塩基配列において505番目から556番目の52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異に対応するCALR変異型プローブを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、　上記CALR変異型プローブは、人為的欠損によるミスマッチを有することを特徴とする遺伝子変異評価用キット。
　（２）上記タイプ１変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における558番目から564番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を有し、
　上記タイプ３変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における555番目から559番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を有し、
　上記タイプ４変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における550番目から558番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を有し、
　上記タイプ５変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における558番目から564番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を有することを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（３）上記タイプ１変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号９５に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ３変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号５３に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ４変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号５４に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ５変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号５５に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含むことを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（４）　配列番号１０に示した野生型CARL遺伝子の塩基配列における568番目と569番目の間にTTGTCが挿入されたタイプ２変異に対応するCALR変異型プローブを更に有することを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（５）JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するJAK2変異型プローブ及び/又はMPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するMPL変異型プローブを更に有することを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（６）上記（１）～（５）いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、CARLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異を同定する、骨髄増殖性腫瘍の診断に関するデータ分析方法。
　（７）JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するJAK2変異型プローブと、当該遺伝子変異を含む領域を増幅するプライマーセットとを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、
　上記JAK2変異型プローブは、V617F変異に対応するV617F変異型プローブと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異に対応するエクソン12変異型プローブとを含み、
　上記プライマーセットは、V617F変異を含む領域を増幅するV617F変異用プライマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を増幅するエクソン12用プライマーセットとを含む、
　ことを特徴とする遺伝子変異評価用キット。
　（８）上記エクソン12変異型プローブは、JAK2におけるN542-E543の欠損変異に対応するN542_E543del変異型プローブ、JAK2におけるE543-D544の欠損変異に対応するE543_D544del変異型プローブ、JAK2におけるR541-E543がリシンとなる変異に対応するR541_E543>K変異型プローブ、JAK2におけるF537-K539がロイシンとなる変異に対応するF537_K539>L変異型プローブ、JAK2におけるK539L(TT)変異に対応するK539L(TT)変異型プローブ及びJAK2におけるK539L(CT)変異に対応するK539L(CT)変異型プローブからなる群から選ばれる少なくとも１以上の変異型プローブであることを特徴とする（７）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（９）V617F変異用プライマーセットに含まれる一方のプライマーの濃度が1.0μM以上であることを特徴とする（７）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１０）エクソン12用プライマーセットに含まれる一方のプライマーの濃度が2.5μM以上であることを特徴とする（７）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１１）V617F変異用プライマーセットにおける標識されたプライマーとエクソン12用プライマーセットにおける標識されたプライマーとの濃度比[エクソン12用プライマーの濃度]/[V617F変異用プライマーの濃度]が1.0～5.5であることを特徴とする（７）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１２）上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用フォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用リバースプライマーとからなることを特徴とする（７）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１３）上記エクソン12用フォワードプライマーは、配列番号３に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF1、配列番号４に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF3、配列番号５に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF4及び配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5からなる群から選ばれる1つのプライマーであることを特徴とする（１２）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１４）上記エクソン12用リバースプライマーは、配列番号７に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR1、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2及び配列番号９に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR3からなる群から選ばれる1つのプライマーであることを特徴とする（１２）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１５）上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5と、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2とからなることを特徴とする（１２）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１６）CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するCALR変異型プローブと、
　CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する当該遺伝子変異を含む領域を増幅するCALR用プライマーセットと、
　MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するMPL変異型プローブと、
　MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する当該遺伝子変異を含む領域を増幅するMPL用プライマーセットと、
　を更に含むことを特徴とする（７）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１７）上記V617F変異型プローブと、上記エクソン12変異型プローブとが担体に固定されたマイクロアレイを備えることを特徴とする（７）記載の遺伝子変異評価用キット。
　（１８）上記（７）～（１７）いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちV617F変異とエクソン12に存在する遺伝子変異とを同時に同定する、骨髄増殖性腫瘍の診断に関するデータ分析方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-158722号、日本国特許出願番号2019-176891号及び日本国特許出願番号2020-133602号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうち特にCARLに存する複数の遺伝子変異（タイプ１変異、タイプ３変異～タイプ５変異）を正確に判定することができる。したがって、本発明によれば、診断対象者の上記遺伝子変異の情報を利用した骨髄増殖性腫瘍の診断精度を向上させることができる。
　また、本発明によれば、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうち特にJAK2に存する複数の遺伝子変異（V617F変異とエクソン12に存在する遺伝子変異）を同時に判定することができる。したがって、本発明によれば、診断対象者の上記遺伝子変異の情報を利用した骨髄増殖性腫瘍の診断精度を向上させることができる。
CARLにおけるタイプ１遺伝子変異、タイプ３遺伝子変異、タイプ４遺伝子変異及びタイプ５遺伝子変異における欠損領域を説明するための構成図である。 実施例で設計したtype3変異プローブ5、type4変異プローブ5及びtype5変異プローブ4を用いて各変異サンプル及び野生型サンプルを測定した結果を示す特性図である。 JAK2のエクソン12に含まれる複数の遺伝子変異を含む領域を増幅するために設計したプライマーを説明する構成図である。 実施例１で設計したプライマーセットを用いて得られた、４つの増幅断片に由来する蛍光強度を測定した結果を示す特性図である。 V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（フォワードプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。 V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（フォワードプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。 JAK2 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。 JAK2 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）とV617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識されたプライマー（フォワードプライマー）との濃度比を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図である。 変異モデル検体を使用して、JAK2のV617F変異及びエクソン12に存在する遺伝子変異等を検出した結果を示す特性図である。
＜CARL遺伝子変異＞
　本発明に係る骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットは、CARLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異として、いわゆるタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異を同定するCALR変異型プローブを備える。
　なお、CALRの遺伝子変異としては、52塩基欠損のタイプ１変異と、5塩基挿入のタイプ２変異と、46塩基欠損のタイプ３変異、34塩基欠損のタイプ４変異及びタイプ１変異とは異なる52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ５変異が主として知られている。これらタイプ１変異からタイプ５変異は、CALRタンパク質のＣ末端に位置している。原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）患者或いは本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）患者において、これらいずれかの変異が20～25％の頻度で見られる。主として、タイプ２の変異が本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）に関連し、タイプ１の変異が原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）に関与している。また、CALRの遺伝子変異は、詳細を後述するJAK2における遺伝子変異を有さない骨髄増殖性腫瘍において見られる変異でもある。
　野生型CALRをコードする塩基配列を配列番号１０に示す。タイプ１変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において506番目から557番目の52塩基が欠損することとなる。タイプ２変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において568番目と569番目の間にTTGTCが挿入されることとなる。タイプ３変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において509番目から554番目の46塩基が欠損することとなる。タイプ４変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において516番目から549番目の34塩基が欠損することとなる。タイプ５変異を有する場合、配列番号１０に示した塩基配列において505番目から556番目の52塩基が欠損することとなる。
　欠損型の遺伝子変異であるタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異について、野生型CALRをコードする塩基配列の一部（配列番号５６）を基準として欠損する領域を図１に模式的に示した。図１に示すように、野生型CALRの52塩基が欠損したタイプ１変異（配列番号５７）、野生型CALRの46塩基が欠損したタイプ３変異（配列番号５８）、野生型CALRの34塩基が欠損したタイプ４変異（配列番号５９）、野生型CALRの52塩基が欠損したタイプ５変異（配列番号６０）は、それぞれ欠損位置（図中矢印）より３’側において欠損前後で非常に類似した配列を有している。なお、図１に示したタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異の各塩基配列において、欠損前後で一致する配列に下線を付した。
　本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、CALR変異型プローブとして、タイプ１変異を検出するためのタイプ１変異プローブ、タイプ３変異を検出するためのタイプ３変異プローブ、タイプ４変異を検出するためのタイプ４変異プローブ及びタイプ５変異を検出するためのタイプ５変異プローブからなる群から選ばれる少なくとも１つのプローブを含む。すなわち、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、タイプ１変異プローブ、タイプ３変異プローブ、タイプ４変異プローブ及びタイプ５変異プローブの全てを含んでいても良いし、タイプ３変異プローブ、タイプ４変異プローブ及びタイプ５変異プローブのうち１つ又は任意の２つのプローブを含んでいても良い。
　これらCALR変異型プローブは、人為的欠損によるミスマッチを有している。すなわち、CARL変異型プローブは、図１に示したタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異の欠損変異後の配列に対して、少なくとも１塩基（１～数塩基、例えば１～５塩基、好ましくは１～３塩基、より好ましくは１塩基）を欠損（すなわち人為的欠損）した相補鎖として設計する。ここで、人為的に欠損させる塩基としては、図１に示したように、タイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異それぞれの欠損後の配列において、野生型の配列と一致する領域（図１の下線部）から選ばれることが好ましい。なお、CALR変異型プローブは、所定の塩基配列に対する相補鎖として設計することができるが、当該塩基配列と同じ鎖として設計しても良い。
　すなわち、これらタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異又はタイプ５変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）よりも３’末端側の１０塩基以内、好ましくは８塩基以内、より好ましくは５塩基以内の領域に少なくとも１塩基が欠損した相補鎖として設計することができる。
　より具体的に、タイプ１変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）から数えて３’末端側の７塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、タイプ１変異に対応するCALR変異型プローブは558番目～564番目の７塩基の範囲から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ１変異に対応するCALR変異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における560番目～562番目のAGAを欠損したGACGAGGAGCGGACAAGGAG（配列番号９５）の相補鎖として設計することが好ましい（配列番号９５の塩基配列でもよい）。
　タイプ３変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）よりも３’末端側の５塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、タイプ３変異に対応するCALR変異型プローブは555番目～559番目の５塩基の範囲から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ３変異に対応するCALR変異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における558番目のGを欠損したGAGGAGCAGAGCAGAGGACAA（配列番号５３）の相補鎖として設計することが好ましい（配列番号５３の塩基配列でもよい）。
　タイプ４変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）から数えて３’末端側の９塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、タイプ４変異に対応するCALR変異型プローブは550番目～558番目の９塩基の範囲から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ４変異に対応するCALR変異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における552番目のGを欠損したCAGAGGCTTAGAGGAGGCAGAG（配列番号５４）の相補鎖として設計することが好ましい（配列番号５４の塩基配列でもよい）。
　タイプ５変異に対応するCALR変異型プローブは、欠損位置（図１の矢印）から数えて３’末端側の２～８番目の７塩基の範囲（図１の下線部）から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。配列番号１０に示した塩基配列を基準とすると、タイプ５変異に対応するCALR変異型プローブは558番目～564番目の７塩基の範囲から少なくとも１塩基を欠損させた相補鎖として設計することができる。特に、タイプ５変異に対応するCALR変異型プローブは、配列番号１０に示した塩基配列における560～562番目のAGAを欠損したGACGAGGGGCGGACAAGGAG（配列番号５５）の相補鎖として設計することが好ましい（配列番号５５の塩基配列でもよい）。
＜JAK2遺伝子変異＞
　本発明に係る骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットは、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異として、V617F変異及びエクソン12に存在する遺伝子変異を同時に同定するものである。すなわち、遺伝子変異評価用キットは、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であるV617F変異に対応するV617F変異型プローブと、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であるエクソン12に存在する遺伝子変異に対応するエクソン12変異型プローブとをJAK2変異型プローブとして含んでいる。また、遺伝子変異評価用キットは、JAK2におけるV617F変異を含む領域を増幅するV617F変異用プライマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を増幅するエクソン12用プライマーセットとを含んでいる。
　具体的に、JAK2の遺伝子変異におけるV617F変異は、617番目のバリンがフェニルアラニンへ置換変異することを意味する。この変異は、JAK-STATパスウェイの活性化に寄与し、真性多血症（polycythemia vera：PV）における顕著な特徴である。また、原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）患者或いは本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）患者においても、当該V617F変異は50～60％の頻度で見られる。なお、野生型JAK2遺伝子のうち617番目のバリンを含むエクソン14の塩基配列を配列番号１１に示す。V617F変異を有する場合、配列番号１１に示した塩基配列において351番目のGがTへ置換変異することとなる。
　また、エクソン12に存在する遺伝子変異は、世界保健機関（WHO）が示すMPNの診断基準として知られており、特に真性多血症（polycythemia vera：PV）において検出される遺伝子変異である。JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異としては、特に限定されないが、例えば、542番目のアスパラギンと543番目のグルタミン酸が欠損する変異（N542_E543del変異と呼称する）、543番目のグルタミン酸と544番目のアスパラギン酸とが欠損する変異（E543_D544del変異と呼称する）、541番目のアルギニンから543番目のグルタミン酸までがリシンとなる変異（R541_E543＞K変異と呼称する）、537番目のフェニルアラニンから539番目のリシンまでがロイシンとなる変異（F537_K539＞L変異と呼称する）、539番目のリシンがロイシンとなる変異（K539L(TT)変異又はK539L(CT)変異と呼称する）。なお、K539L(TT)変異とは、539番目のリシンをコードするコドン（AAA）がロイシンをコードするコドン（TTA）となる変異である。K539L(CT)変異とは、539番目のリシンをコードするコドン（AAA）がロイシンをコードするコドン（CTA）となる変異である。
　ここで、野生型JAK2遺伝子のうちエクソン12をコードする塩基配列を配列番号１２に示す。N542_E543del変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において250番目から255番目の6塩基が欠損することとなる。E543_D544del変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において253番目から258番目の6塩基が欠損することとなる。R541_E543＞K変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において248番目から253番目の6塩基が欠損することとなる。F537_K539＞L変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において237番目から242番目の6塩基が欠損することとなる。K539L(TT)変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において241番目と242番目のAAがTTに置換変異することとなる。K539L(CT)変異を有する場合、配列番号１２に示した塩基配列において241番目と242番目のAAがCTに置換変異することとなる。
　＜遺伝子変異評価用キット＞
　本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、上記＜CARL遺伝子変異＞で説明したCALR変異型プローブを含む構成、上記＜JAK2遺伝子変異＞で説明したJAK2変異型プローブを含む構成、及びこれらCALR変異型プローブ並びにJAK2変異型プローブを含む構成のいずれであっても良い。さらに、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、これらCALR及び/又はJAK2における遺伝子変異に加えてMPLにおける遺伝子変異を同時に同定するものであっても良い。これらCALR、JAK2及びMPLにおける遺伝子変異は、世界保健機関（WHO）による分類（例えば、2016年度バージョン）において骨髄増殖性腫瘍の診断に利用されている遺伝子変異である。
　ここで、MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異としては、W515K変異（515番目のトリプトファンがリシンへ置換変異）又はW515L変異（515番目のトリプトファンがロイシンへ置換変異）を挙げることができる。このMPLの遺伝子変異は、本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）患者の3～5％において見られ、原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）の6～10％において見られる。なお、野生型MPLをコードする塩基配列を配列番号１３に示す。W515K変異を有する場合、配列番号１３に示した塩基配列において305番目と306番目のTGがAAへと置換変異することとなる。W515L変異を有する場合、配列番号１３に示した塩基配列において306番目のGがTへと置換変異することとなる。
　本発明に係る遺伝子変異評価用キットが上記＜CARL遺伝子変異＞で説明したCALR変異型プローブを含む場合、JAK2及びMPLにおける遺伝子変異を同定するためのプローブは任意のものを使用することができる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットが上記＜JAK2遺伝子変異＞で説明したJAK2変異型プローブを含む場合、CALR及びMPLにおける遺伝子変異を同定するためのプローブは任意のものを使用することができる。
　より具体的に、JAK2のV617F変異については、配列番号１１における上記置換変異に対応する、例えば、CTCCACAGAaACATACTCC（配列番号１４）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のaが配列番号１１に示した塩基配列における351番目のGからTへの置換変異に対応している。また、JAK2のV617F変異を同定する際、野生型のJAK2に対応する野生型プローブ（上記配列における小文字のaをcとした配列）を使用することもできる。すなわち、JAK2のV617F変異を同定するには、配列番号１４の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
　また、JAK2のN542_E543del変異については、CACAAAATCAGA-GATTTGATATTTG（配列番号１５）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩基配列における250番目から255番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のE543_D544del変異については、CACAAAATCAGAAAT-TTGATATTTGT（配列番号１６）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩基配列における253番目から258番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のR541_E543＞K変異については、CACAAAATCA-AAGATTTGATATTTGT（配列番号１７）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩基配列における248番目から253番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のF537_K539＞L変異については、CCAAATGGTG-TTAATCAGAAATGAA（配列番号１８）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列番号１２に示した塩基配列における237番目から242番目の6塩基欠損に対応している。JAK2のK539L(TT)変異については、GGTGTTTCACttAATCAGAAATGA（配列番号１９）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列における小文字のttが、配列番号１２に示した塩基配列における241番目と242番目のAAに対応している。JAK2のK539L(CT)変異については、GTGTTTCACctAATCAGAAATGA（配列番号２０）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列における小文字のctが、配列番号１２に示した塩基配列における241番目と242番目のAAに対応している。
　また、上記のJAK2のエクソン12における各変異を同定する際、各変異の野生型に対応する野生型プローブを使用することもできる。ここで、上記の各変異は互いにごく近いか一部重複しているため、ひとつの野生型プローブで代表させることもできるし、いくつかの野生型プローブを組み合わせて使用することもできる。後述する実施例では、N542_E543del変異、E543_D544del変異およびR541_E543＞K変異を中心になるようにした野生型プローブと、F537_K539＞L変異を中心になるようにした野生型プローブの二つを使用した。
　さらに、CALRのタイプ１の変異については、配列番号１０における上記52塩基欠損に対応する、例えば、CTCCTTGT-CCGCTCCTCGTC（配列番号２１）を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することができる。なお、上記配列においてハイフンの位置が、配列番号１０に示した塩基配列における506番目から557番目の52塩基欠損に対応している。また、CALRのタイプ１変異を同定する際、野生型のCALRに対応する野生型プローブを使用することもできる。すなわち、CALRのタイプ１変異を同定するには、配列番号２１の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
　さらに、CALRのタイプ２変異については、配列番号１０における上記5塩基挿入に対応する、例えば、ATCCTCCgacaaTTGTCCT（配列番号２２）を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のgacaaが5塩基挿入である。また、CALRのタイプ２変異を同定する際、野生型のCALRに対応する野生型プローブを使用することもできる。すなわち、CALRのタイプ２の変異を同定するには、配列番号２２の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
　さらにまた、MPLのW515K変異については、配列番号１３における上記置換変異に対応する、例えば、GAAACTGCttCCTCAGCA（配列番号２３）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のttが配列番号１３に示した塩基配列における305番目と306番目のTGのAAへの置換変異に対応している。また、MPLのW515K変異を同定する際、野生型のMPLに対応する野生型プローブ（上記配列における小文字のttをcaとした配列）を使用することもできる。すなわち、MPLのW515K変異を同定するには、配列番号２３の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
　さらにまた、MPLのW515L変異については、配列番号１３における上記置換変異に対応する、例えば、GGAAACTGCAaCCTCAG（配列番号２４）を含むオリゴヌクレオチドを変異型プローブとして使用することができる。なお、上記配列において小文字のaが配列番号１３に示した塩基配列における306番目のGのTへの置換変異に対応している。また、MPLのW515L変異を同定する際、野生型のMPLに対応する野生型プローブ（上記配列における小文字のaをcとした配列）を使用することもできる。すなわち、MPLのW515L変異を同定するには、配列番号２４の塩基配列を含む変異型プローブを使用すれば良く、また、当該変異型プローブと野生型プローブとからなるプローブセットを使用しても良い。
　以上のように、CALRに存在するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及び/又はタイプ５変異を同定するための、ミスマッチを有するCARL変異型プローブとして配列番号９５、５３、５４及び５５をそれぞれ例示したが、CARL変異型プローブの塩基配列は配列番号９５、５３、５４及び５５に限定されず、配列番号５７に示したタイプ１変異の塩基配列、配列番号５８に示したタイプ３変異の塩基配列、配列番号５９に示したタイプ４変異の塩基配列及び配列番号６０に示したタイプ５変異の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。
　さらに、JAK2に存在する遺伝子変異を同定するための変異型プローブを例示したが、変異型プローブの塩基配列は配列番号１４～２０に限定されず、配列番号１１及び１２に示したJAK2の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。CALRに存在するタイプ１変異及びタイプ２変異を同定するための変異型プローブとして配列番号２１及び２２をそれぞれ例示したが、変異型プローブの塩基配列は配列番号２１及び２２に限定されず、配列番号１０に示したCALRの塩基配列に基づいて適宜設計することができる。MPLに存在する遺伝子変異を同定するための変異型プローブとして配列番号２３及び２４を例示したが、変異型プローブの塩基配列は配列番号２３及び２４に限定されず、配列番号１３に示したMPLの塩基配列に基づいて適宜設計することができる。
　これらプローブの塩基長としては、特に限定しないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。なお、プローブは、上述のように、配列番号１０～１３の塩基配列における遺伝子変異を含む領域に基づいて設計した塩基配列と、当該塩基配列における一方又は両方の末端に付加した塩基配列とを合計して、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２５塩基長とすることが好ましい。
　また、上述のように設計したプローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNAである。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、好ましくは一本鎖DNAである。プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
　上述のように設計したプローブは、その５’末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイ（一例としてDNAチップ）の形態で用いるのが好ましい。このとき、マイクロアレイは、上述した各遺伝子変異について、変異型プローブ及び野生型プローブを有することが好ましい。各遺伝子変異について、変異型プローブと野生型プローブとを利用することによって、変異の有無のみならず変異の割合を正確に判定することができる。ここで、変異型プローブと野生型プローブとは、長さが２塩基以内の差であることが好ましく、長さが同じであることがより好ましい。
　本発明に係るマイクロアレイは、上述したプローブを担体上に固定することで作製することができる。
　担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ－ボンファイバ－に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
　本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
　本発明に係るマイクロアレイにおいては、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1～75mm四方のもの、好ましくは1～10mm四方のもの、より好ましくは3～5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
　本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収がないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。
　本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
　高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1～99体積％と残りメタンガス99～1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。
　アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
　レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
　基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層～100μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm～1μm、より好ましくは5nm～500nmである。
　カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、オリゴヌクレオチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
　アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
　カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合または炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素原子または炭素数1～12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5は単結合または炭素数1～12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
　エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
　ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
　ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
　活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。
　活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開2001-139532）。
　プローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、プローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
　スポッティング後、プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常－20～100℃、好ましくは0～90℃の温度で、通常0.5～16時間、好ましくは1～2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50～90％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
　以上のように構成されたマイクロアレイを用いることで、診断対象者における、JAK2、CALR及びMPLに存在する上記遺伝子変異について、それぞれの遺伝子変異の有無を同時に判定することができる。
　具体的に、JAK2、CALR及びMPLに存在する上記遺伝子変異の有無を判定する際には、診断対象者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、JAK2における上記遺伝子変異を含む領域（JAK2のV617F変異部位を含む領域、エクソン12に含まれる遺伝子変異を含む領域）、CALRにおける上記遺伝子変異を含む領域及びMPLにおける上記遺伝子変異を含む領域をそれぞれ増幅する工程と、上述したマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるJAK2、CALR及びMPLに存在する上記遺伝子変異の有無をそれぞれ検出する工程とを含む。
　診断対象者は通常ヒトであり、人種等には特に限定されないが、特に、黄色人種、好適には東アジア人種、特に好適には日本人とする。また、診断対象者としては、骨髄増殖性腫瘍が疑われる患者とすることができる。
　診断対象者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。
　まず、診断対象者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。
　次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、JAK2を含む領域（JAK2のV617F変異部位を含む領域、エクソン12に含まれる遺伝子変異を含む領域）、CALRを含む領域及びMPLを含む領域を増幅する。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
　またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、増幅領域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
　本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、上記＜CALR遺伝子変異＞で説明したCALR変異型プローブを含む場合、CALRに存在するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異を含む領域、すなわち、欠損位置（図１における矢印）を含む領域を増幅するためのプライマーセットを含むことができる。ここで、プライマーセットとは、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなる一組のプライマーを意味する。
　プライマーセットを用いて増幅した欠損位置を含む領域は、上述したミスマッチを有するCARL変異型プローブ（例えば配列番号９５、５３、５４及び５５）により検出する。図１に示したように、タイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異は、欠損位置の３’側に野生型と同じ配列（図１中下線部）を有している。このため、仮に、タイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異について、欠損位置を含んで完全一致となるように設計したプローブを使用した場合、野生型の検体に対しても非特異的にハイブリダイズする可能性がある。
　これに対して、上述のようにCARL変異型プローブ（例えば配列番号９５、５３、５４及び５５）を使用した場合には、当該ミスマッチがあるため野生型との非特異的なハイブリダイズの可能性を低減することができる。したがって、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを使用することによって、野生型検体とタイプ１変異を有する検体とを確実に区別して検出することができる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを使用することによって、野生型検体とタイプ３変異を有する検体とを確実に区別して検出することができる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを使用することによって、野生型検体とタイプ４変異を有する検体とを確実に区別して検出することができる。さらに、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを使用することによって、野生型検体とタイプ５変異を有する検体とを確実に区別して検出することができる。
　以上の説明においては、CALRに存在するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異を検出するためのミスマッチを有するCARL変異型プローブの設計について説明したが、CALR遺伝子以外の他の変異についても同様に変異型プローブを設計することができる。例えば、所定の長さを超える欠損変異であって、欠損変異後の配列が野生型配列に類似する場合については、同様に変異型プローブを設計することができる。より具体的には、５塩基長以上の欠損変異、好ましくは１０塩基以上の欠損変異、プローブとしての好適な塩基長よりも長い欠損変異であって、野生型の塩基配列における欠損位置を含む１０塩基以内に、欠損後の配列と２塩基長以上一致する配列がある場合には、一致する配列の一部をミスマッチとするように変異型プローブを設計することができる。
　なお、CALRに存在するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異を検出するためのミスマッチを有するCARL変異型プローブでは、野生型の塩基配列における欠損位置から５’側に、欠損後の配列と一致する配列があったため、欠損位置の３’側にミスマッチを有するような変異型プローブを設計した、逆に、野生型の塩基配列における欠損位置から３’側に、欠損後の配列と一致する配列がある変異型の場合には、欠損位置の５’側にミスマッチを設定して変異型プローブを設計することができる。
　一方、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、上記＜JAK2遺伝子変異＞で説明したJAK2変異型プローブを含む場合、JAK2における遺伝子変異を含む領域を増幅するプライマーセットとして、V617F変異を含む領域を増幅するV617F変異用プライマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を増幅するエクソン12用プライマーセットを含んでいる。ここで、プライマーセットとは、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなる一組のプライマーを意味する。
　V617F変異用プライマーセットとしては、野生型における617番目のバリンに相当するアミノ酸をコードする領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、
フォワードプライマーJAK2-F：5'-GAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGG-3'（配列番号２５）及びリバースプライマーJAK2-R：5'-CTGACACCTAGCTGTGATCCTGAAACTG-3'（配列番号２６）からなるセットが挙げられる。
　ここで、V617F変異用プライマーセットを用いてV617F変異を含む領域を増幅する際には、V617F変異用プライマーセットのうちいずれか一方、例えば蛍光標識を付した方のプライマー（例えばフォワードプライマー）の濃度を1.0μＭ以上とすることが好ましい。当該プライマーの濃度をこの範囲とすることで、V617F変異を含む領域及びエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を良好に増幅することができる。なお、当該プライマー濃度の上限としては、特に限定されず、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度の上限値（例えば10μＭ）とすることができる。
　一方、エクソン12用プライマーセットとしては、上述したエクソン12に含まれる複数の遺伝子変異の少なくとも２個、好ましくは３個、より好ましくは４個、更に好ましくは５個、最も好ましくは６個すべてを一括して増幅できるように設計することが好ましい。より具体的に、エクソン12用プライマーセットとしては、図３に示すように、配列番号１に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用フォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用リバースプライマーとすることができる。ここで、配列番号１はエクソン12をコードする塩基配列の178番目から228番目、配列番号２は399番目から435番目であり、いずれも配列番号１２の中の部分配列であり、両者の間に上記した６個の遺伝子変異が全て含まれている。
　さらに具体的に、エクソン12用フォワードプライマーは、配列番号３に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF1、配列番号４に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF3、配列番号５に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF4及び配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5からなる群から選ばれる1つのプライマーとすることができる。
　また、具体的に、エクソン12用リバースプライマーは、配列番号７に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR1、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2及び配列番号９に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR3からなる群から選ばれる1つのプライマーとすることができる。
　特に、エクソン12用プライマーセットは、配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5と、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2の組み合わせとすることがより好ましい。
　なお、上記したフォワードプライマーF1，F3～F5、およびリバースプライマーR1～R3の塩基配列は、エクソン12をコードする塩基配列上の対応する位置によって表している。そのため、プライマーセットを構成するフォワードあるいはリバースのいずれか一方のプライマーは、配列番号で示した塩基配列の相補鎖となる。後述する実施例においてはすべて、リバース側を相補鎖で作製している。
　ここで、エクソン12用プライマーセットを用いてエクソン12に含まれる遺伝子変異を含む領域を増幅する際には、エクソン12用プライマーセットのうちいずれか一方、例えば蛍光標識を付した方のプライマー（例えばリバースプライマー）の濃度を2.5μＭ以上とすることが好ましい。当該プライマーの濃度をこの範囲とすることで、V617F変異を含む領域及びエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を良好に増幅することができる。なお、当該プライマー濃度の上限としては、特に限定されず、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度の上限値（例えば10μＭ）とすることができる。
　エクソン12用に限らないが、プライマーセットにおけるフォワードの濃度とリバースの濃度は同一でもよいし、異なっていてもよい。異なる場合はいずれか一方が上記濃度条件を満たせばよい。後述する実施例ではJAK2 V617F、エクソン12、CALR、MPLのいずれのプライマーセットにおいても蛍光標識した側のプライマー濃度を高く設定している。
　また、V617F変異用プライマーセットにおける標識されたプライマーとエクソン12用プライマーセットにおける標識されたプライマーとの濃度比[エクソン12用プライマー濃度]/[V617F変異用プライマー濃度]を1.0～5. 5とすることが好ましい。当該濃度比をこの範囲とすることで、V617F変異を含む領域及びエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を良好に増幅することができる。
　CALRにおける上記遺伝子変異を含む領域の増幅反応に用いるプライマーは、上記遺伝子変異を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、
プライマーCALR-F：5'-CGTAACAAAGGTGAGGCCTGGT-3'（配列番号２７）及びプライマーCALR-R：5'-GGCCTCTCTACAGCTCGTCCTTG-3'（配列番号２８）からなるプライマーのセットが挙げられる。
　MPLにおける上記遺伝子変異を含む領域の増幅反応に用いるプライマーは、上記遺伝子変異を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、
プライマーMPL-F：5'-CTCCTAGCCTGGATCTCCTTGG-3'（配列番号２９）及びプライマーMPL-R：5'-ACAGAGCGAACCAAGAATGCCTGTTTAC-3'（配列番号３０）からなるプライマーのセットが挙げられる。
　また、プライマーにより増幅される核酸断片は、設計したプローブに対応する領域を含んでいれば特に限定されず、例えば1kbp以下が好ましく、800bp以下がより好ましくは、500bp以下が更に好ましく、350bp以下が特に好ましい。
　上記のようにして得られた増幅核酸と、担体に固定されたプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、変異型プローブに対する増幅核酸のハイブリダイズを検出することで診断対象者における上記遺伝子変異の有無を評価することができる。すなわち、変異型プローブに対して増幅核酸がハイブリダイズしたことを例えば標識を検出することにより測定できる。
　標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.5×SSCのとき、45～60℃とすることができ、プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低くすることがより好ましく、鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとすることがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまでもない。
　また、上述した各遺伝子変異について変異型プローブと野生型プローブとを備えるマイクロアレイを使用した場合、これら変異型プローブ及び野生型プローブからのシグナル強度を用いて上記遺伝子変異の有無を評価することができる。具体的には、野生型プローブにおけるシグナル強度及び変異型プローブにおけるシグナル強度をそれぞれ測定し、変異型プローブに由来するシグナ強度を評価するための判定値を算出する。判定値の算出例としては、例えば、式：[変異型プローブ由来のシグナル強度]/([野生型プローブ由来のシグナル強度]+[変異型プローブ由来シグナル強度])を使用する方法が挙げられる。
　そして、上記式にて算出される判定値と予め定めた閾値（カットオフ値）とを比較し、判定値が閾値を上回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれると判断し、判定値が閾値を下回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれないと判断する。このように判定値を利用することで、上述したJAK2、CALR及びMPLにおける各遺伝子変異の有無を判定することができる。
　ここで、閾値としては、特に限定されないが、例えば、JAK2、CALR及びMPLに存在する上述した各遺伝子変異が野生型であることが確定している検体を用いて上記式により算出された判定値に基づいて規定することができる。より具体的には、JAK2、CALR及びMPLに存在する上述した各遺伝子変異が野生型であることが確定している複数の検体を用いて複数の判定値を算出し、その平均値+３σ（σ：標準偏差）の値を閾値とすることができる。なお、平均値+２σや平均値+σの値を閾値とすることもできる。
　以上のように、JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異を同定するための変異型プローブを備えるマイクロアレイを利用することで、JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異を同時に同定することができる。JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異に関する情報は、例えば、WHOによる分類（2016年度バージョン）における骨髄増殖性腫瘍の診断に利用することができる。詳細には、WHOによる分類では、真性赤血球増加症又は真性多血症（polycythemia vera：PV）の診断には、JAK2における上記遺伝子変異が存在することが一つの要件となっている。また、WHOによる分類では、本態性血小板血症（essential thrombocythemia：ET）の診断には、JAK2、CALR及びMPLに存在する遺伝子変異のいずれかが存在することが一つの要件となっている。さらに、WHOによる分類では、前線維／早期の原発性骨髄線維症（prefibrotic/early primary myelofibrosis：prefibrotic/early PMF）若しくは原発性骨髄線維症（primary myelofibrosis：PMF）の診断には、JAK2、CALR及びMPLに存在する遺伝子変異のいずれかが存在することが一つの要件となっている。
　このように、例えばWHOによる分類（2016年度バージョン）を利用した骨髄増殖性腫瘍の診断に、JAK2、CALR及びMPLに存在する各遺伝子変異を同定するための変異型プローブを備えるマイクロアレイを利用することができる。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
　［実施例１］
　１．サンプル調製
　本実施例では、野生型検体として健常人末梢血由来ゲノムＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社製）を用いた。
　本実施例では、表１に示した遺伝子変異を検出するため、当該遺伝子変異を含む対象領域（４箇所）をそれぞれ増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本実施例では、表１に示した４つの対象領域を増幅するため、表２に示したプライマーを設計した。なお、exon12-FはF5であり、exon12-RはR2の相補鎖である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以上のように調製したDNAサンプルを用いて、JAK2遺伝子、CALR遺伝子及びMPL遺伝子について４つの対象領域をそれぞれPCRにより増幅した。なお、PCRでは鋳型となるゲノムDNAを8又は16ng/μLとした。反応液組成を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　そして、PCRのサーマルサイクルを、９５℃で５分間の後、９５℃で３０秒、５９℃で３０秒及び７２℃で４５秒を１サイクルとして４０サイクル行い、その後、７２℃で１０分間とし、最終的に４℃を維持した。
　２．マイクロアレイ
　本実施例では、JAK2遺伝子におけるV617F変異並びにエクソン12に含まれる6つの遺伝子変異、CALR遺伝子におけるタイプ１変異～タイプ５変異及びMPL遺伝子におけるW515L/K変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表４にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　３．遺伝子変異の同定
　上記プローブを有するチップを用いて以下のようにハイブリダイズを行った。先ず、規定温度（52℃）に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱を十分予熱しておいた。PCR反応液4μLとハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5標識オリゴDNA（ライフテクノロジーズジャパン社製））2μLを混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、52℃に設定したハイブリダイズチャンバー装置（東洋鋼鈑社製）で１時間反応させた。ハイブリダイズ反応終了後、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットし、洗浄用ステンレスホルダーを0.1×SSC/0.1% SDS溶液に浸した。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を検出するまでホルダーを1×SSC溶液（室温）に浸した。
　検出直前にチップにカバーフィルムを被せ、BIOSHOT（東洋鋼鈑製）でチップの蛍光強度を検出した。以上のように測定した野生型プローブ及び変異型プローブにおける蛍光強度を用い、JAK2の遺伝子変異（V617F変異並びにエクソン12に含まれる6つの遺伝子変異）、CALRの遺伝子変異及びMPLの遺伝子変異について下記式によって判定値を算出した。
判定値＝[変異型プローブの蛍光強度]/([野生型プローブの蛍光強度]+[変異型プローブの蛍光強度])
　［実験例１－１］
　本実験例では、CARLに存在する欠損型の遺伝子変異である、タイプ３変異、タイプ４変異又はタイプ５変異を検出するためのCARL変異型プローブを複数設計し、評価した。すなわち、タイプ３変異、タイプ４変異又はタイプ５変異のそれぞれについて、欠損位置（図１中矢印）を含む領域に完全一致する複数のCARL変異型プローブ、当該領域にミスマッチを有する複数のCARL変異型プローブを設計した（表５）。なお、実際に作製したプローブは、設計した配列の相補鎖の5’-側にリンカー（Tの連続部分）を結合したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本実験例では、表５に示した各プローブを用いて、変異モデルサンプル(変異100%プラスミド）に対する蛍光強度及び野生型モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を測定した。その結果を表６に示した。なお、表６中、「特異的蛍光強度*1」が変異モデルサンプルに対する蛍光強度であり、「非特異的蛍光強度*2」が野生型モデルサンプルに対する蛍光強度である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示したように、欠損型のミスマッチを所定の位置に有するプローブは、特異的蛍光強度*1が高く、非特異的蛍光強度*2が低い、変異型サンプルに対して特異的にハイブリダイズできることが明らかとなった。表６に示したように、特異的蛍光強度*1が10000以上であり、非特異的蛍光強度*2が1000以下となるような変異型サンプルに対して非常に特異的にハイブリダイズできるプローブを設計することができた。さらにまた、設計した変異プローブのうち、特異的蛍光強度*1が15000以上、非特異的蛍光強度*2が500以下となるような、変異型サンプルに対して非常に特異的にハイブリダイズできるプローブを設計することができた（例えばtype3変異プローブ5、type4変異プローブ5、type4変異プローブ7、type5変異プローブ4及びtype5変異プローブ5）。なお、タイプ４変異を同定するためのプローブであるtype4変異プローブ5及びtype4変異プローブ7は、特異的蛍光強度*1の高さからtype4変異プローブ5がより好ましいと言える。また、タイプ５変異を同定するためのプローブであるtype5変異プローブ4及びtype5変異プローブ5は、特異的蛍光強度*1の高さからtype5変異プローブ4がより好ましいと言える。
　また、表５に示した各プローブを用いて、各変異モデルサンプル(タイプ１変異モデルプラスミド、タイプ２変異モデルプラスミド、タイプ３変異モデルプラスミド、タイプ４変異モデルプラスミド及びタイプ５変異モデルプラスミド）に対する蛍光強度及び野生型モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を測定した。その結果を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、欠損型のミスマッチを所定の位置に有するプローブは、各変異タイプを特異的に検出できることが明らかとなった。表７に示した結果のうち、type3変異プローブ5、type4変異プローブ5及びtype5変異プローブ4を用いて測定した結果をまとめて図２に示した。type3変異プローブ5、type4変異プローブ5及びtype5変異プローブ4の実際に作製したプローブ配列は、表４に示したとおりである。なお、図２には、後述する実験例１－２に示した結果のうち、type1変異プローブ7（実際に作製したプローブ配列は表４）を用いて測定した結果を併せて示した。
　［実験例１－２］
　本実験例では、CARLに存在する欠損型の遺伝子変異であるタイプ１変異を検出するためのCARL変異型プローブを複数設計し、評価した。すなわち、タイプ１変異について、欠損位置（図１中矢印）を含む領域に完全一致する複数のCARL変異型プローブ、当該領域にミスマッチを有する複数のCARL変異型プローブを設計した（表８）。なお、実際に作製したプローブは、設計した配列の相補鎖の5’-側にリンカー（Tの連続部分）を結合したものである。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本実験例では、表８に示した各プローブを用いて、変異モデルサンプル(変異5%プラスミド）に対する蛍光強度及び野生型モデルサンプル(プラスミド）に対する蛍光強度を測定した。その結果を表９に示した。なお、表９中、「特異的蛍光強度*1」が変異モデルサンプルに対する蛍光強度であり、「非特異的蛍光強度*2」が野生型モデルサンプルに対する蛍光強度である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示したように、欠損型のミスマッチを所定の位置に有するプローブは、特異的蛍光強度*1が高く、非特異的蛍光強度*2が低い、変異型サンプルに対して特異的にハイブリダイズできることが明らかとなった。表９に示したように、特異的蛍光強度*1が15000以上であり、非特異的蛍光強度*2が3000以下となるような変異型サンプルに対して非常に特異的にハイブリダイズできるプローブを設計することができた（type1変異プローブ7）。
　［実験例２］
　本実験例では、JAK2のエクソン12に含まれる６つの遺伝子変異を含む領域を増幅するためのプライマーセットを複数設計し、評価した。設計したプライマーセットは、図３に示した通りである。本実施例では、下記表１０に示すプライマーセットについて評価した。表１０におけるF1～F5及びR1～R3は図１に対応している。図３に示すように、フォワードプライマーF1、F3～F5は、配列番号１に示した塩基配列の範囲に含まれ、フォワードプライマーF2は当該範囲から外れる位置に設計した（配列番号５２）。なお、実験例１及び後述する実験例２では検体として野生型である健常人由来末梢血ゲノムＤＮＡを使用し、野生型プローブの蛍光強度で評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　結果を図４に示した。図４から判るように、本実施例で設計したプライマーセットのうち、F2を使用したプライマーセット２以外のプライマーセットを使用した場合に、全ての増幅断片について優れた蛍光強度を達成できることが明らかとなった。これらのセットのうち、全体的に蛍光強度が高いプライマーセット１、４及び５が好ましいと言え、また各解析対象領域間の強度差が比較的小さいプライマーセット１及び５がより好ましいと言える。以下の評価では、表２に示したとおりプライマーセット５（F5とR2の組合せ）を採用した。
　［実験例３］
　図５及び６にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおけるプライマーの濃度、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（フォワードプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図を示した。また、図７及び８にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおけるプライマーの濃度、JAK2 エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）の濃度を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図を示した。
　図５から判るように、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度0.5μMのとき、蛍光強度12000以上を達成できなかった。また、図６から判るように、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が2.5μMであっても、エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が2.0μMのとき、蛍光強度12000以上を達成できなかった。
　一方、図７から判るように、エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が3.0～4.0μMであっても、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が0.5μMのとき、蛍光強度12000以上を達成できなかった。また、図８から判るように、V617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が1.0μM以上であって、エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識された一方のプライマー濃度が2.5μM以上の条件で蛍光強度12000以上を達成できた。
　図９にPCR反応液に混合したプライマーミックスにおけるプライマーの濃度、エクソン12を増幅するプライマーセットのうち標識したプライマー（リバースプライマー）とV617F変異部位を含む領域を増幅するプライマーセットのうち標識されたプライマー（フォワードプライマー）との濃度比を横軸とし、増幅した４つの領域に由来する蛍光強度を縦軸とした特性図を示した。図９から判るように、上記濃度比が1.0～5.5の範囲にある場合には全ての増幅断片について蛍光強度12000以上を達成できた。
　［実施例２］
　本実施例では、変異モデル検体には、遺伝子解析対象領域の野生型又は変異型配列を搭載した人工遺伝子（プラスミド）を構築し、野生型人工遺伝子と変異型人工遺伝子を任意で混合したものを用い、表１１に示した反応液組成で変異検出のためのPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　また、本実施例では、PCRの反応液に表１２に示したブロッカーオリゴDNAを添加した。ブロッカーは、解析対象遺伝子の変異割合が小さい場合でも十分な検出感度が得られるように、変異検出用プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制することを目的として添加されるもので、野生型由来の増幅産物と特異的にハイブリダイズするように設計されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　なお、本実施例では、全ての解析対象遺伝子領域が野生型である野生型検体（n=9）と、解析対象領域の一部が変異型である変異モデル検体（n=3）を使用し、変異体モデル検体の割合を1%又は5%とした。結果を図１０に示した。なお、図１０におけるエラーバーは5σである。
　図１０に示したように、1%又は5%の遺伝子変異について全て識別できることが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (18)

  1. 　CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異であって、配列番号１０に示した野生型CARL遺伝子の塩基配列における506番目から557番目の52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ１変異、同塩基配列における509番目から554番目の46塩基が欠損する46塩基欠損のタイプ３変異、同塩基配列において516番目から549番目の34塩基が欠損する34塩基欠損のタイプ４変異及び同塩基配列において505番目から556番目の52塩基が欠損する52塩基欠損のタイプ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異に対応するCALR変異型プローブを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、
    　上記CALR変異型プローブは、人為的欠損によるミスマッチを有することを特徴とする遺伝子変異評価用キット。
  2. 　上記タイプ１変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における558番目から564番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を有し、
    　上記タイプ３変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における555番目から559番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を有し、
    　上記タイプ４変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における550番目から558番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を有し、
    　上記タイプ５変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号１０における558番目から564番目の範囲から選ばれる１又は複数塩基が欠損した塩基配列又はその相補的塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  3. 　上記タイプ１変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号９５に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ３変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号５３に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ４変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号５４に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含み、上記タイプ５変異に対するCALR変異型プローブは、配列番号５５に示した塩基配列又はその相補的塩基配列を含むことを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  4. 　配列番号１０に示した野生型CARL遺伝子の塩基配列における568番目と569番目の間にTTGTCが挿入されたタイプ２変異に対応するCALR変異型プローブを更に有することを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  5. 　JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するJAK2変異型プローブ及び/又はMPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するMPL変異型プローブを更に有することを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
  6. 　請求項１～５いずれか一項記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、CARLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連するタイプ１変異、タイプ３変異、タイプ４変異及びタイプ５変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子変異を同定する、骨髄増殖性腫瘍の診断に関するデータ分析方法。
  7. 　JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するJAK2変異型プローブと、当該遺伝子変異を含む領域を増幅するプライマーセットとを含む、骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キットであって、
    　上記JAK2変異型プローブは、V617F変異に対応するV617F変異型プローブと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異に対応するエクソン12変異型プローブとを含み、
    　上記プライマーセットは、V617F変異を含む領域を増幅するV617F変異用プライマーセットと、JAK2遺伝子のエクソン12に存在する遺伝子変異を含む領域を増幅するエクソン12用プライマーセットとを含む、
    　ことを特徴とする遺伝子変異評価用キット。
  8. 　上記エクソン12変異型プローブは、JAK2におけるN542-E543の欠損変異に対応するN542_E543del変異型プローブ、JAK2におけるE543-D544の欠損変異に対応するE543_D544del変異型プローブ、JAK2におけるR541-E543がリシンとなる変異に対応するR541_E543>K変異型プローブ、JAK2におけるF537-K539がロイシンとなる変異に対応するF537_K539>L変異型プローブ、JAK2におけるK539L(TT)変異に対応するK539L(TT)変異型プローブ及びJAK2におけるK539L(CT)変異に対応するK539L(CT)変異型プローブからなる群から選ばれる少なくとも１以上の変異型プローブであることを特徴とする請求項７記載の遺伝子変異評価用キット。
  9. 　V617F変異用プライマーセットに含まれる一方のプライマーの濃度が1.0μM以上であることを特徴とする請求項７記載の遺伝子変異評価用キット。
  10. 　エクソン12用プライマーセットに含まれる一方のプライマーの濃度が2.5μM以上であることを特徴とする請求項７記載の遺伝子変異評価用キット。
  11. 　V617F変異用プライマーセットにおける標識されたプライマーとエクソン12用プライマーセットにおける標識されたプライマーとの濃度比[エクソン12用プライマーの濃度]/[V617F変異用プライマーの濃度]が1.0～5.5であることを特徴とする請求項７記載の遺伝子変異評価用キット。
  12. 　上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用フォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列から選ばれる連続する10塩基以上の長さを有するエクソン12用リバースプライマーとからなることを特徴とする請求項７記載の遺伝子変異評価用キット。
  13. 　上記エクソン12用フォワードプライマーは、配列番号３に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF1、配列番号４に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF3、配列番号５に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF4及び配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5からなる群から選ばれる1つのプライマーであることを特徴とする請求項１２記載の遺伝子変異評価用キット。
  14. 　上記エクソン12用リバースプライマーは、配列番号７に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR1、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2及び配列番号９に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR3からなる群から選ばれる1つのプライマーであることを特徴とする請求項１２記載の遺伝子変異評価用キット。
  15. 　上記エクソン12用プライマーセットは、配列番号６に示す塩基配列からなるエクソン12用フォワードプライマーF5と、配列番号８に示す塩基配列からなるエクソン12用リバースプライマーR2とからなることを特徴とする請求項１２記載の遺伝子変異評価用キット。
  16. 　CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するCALR変異型プローブと、　CALRにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する当該遺伝子変異を含む領域を増幅するCALR用プライマーセットと、
    　MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異に対応するMPL変異型プローブと、
    　MPLにおける骨髄増殖性腫瘍に関連する当該遺伝子変異を含む領域を増幅するMPL用プライマーセットと、
    　を更に含むことを特徴とする請求項７記載の遺伝子変異評価用キット。
  17. 　上記V617F変異型プローブと、上記エクソン12変異型プローブとが担体に固定されたマイクロアレイを備えることを特徴とする請求項７記載の遺伝子変異評価用キット。
  18. 　請求項７～１７いずれか一項記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、JAK2における骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異のうちV617F変異とエクソン12に存在する遺伝子変異とを同時に同定する、骨髄増殖性腫瘍の診断に関するデータ分析方法。
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