JP2004024247A - 遺伝子変異検出用プローブ及び遺伝子変異検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２の一部において、変異を明確に検出しうるプローブを提供することである。
【解決手段】ＤＲＢ１＊のエクソン２の一部の変異を標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションにより検出するにあたり、本来の変異箇所の他にミスマッチの塩基配列を設けたプローブを構築する。具体的には配列番号１〜６２に表されるいずれかのオリゴヌクレオチド又はこれらの相補鎖、あるいは置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブによる。これらのプローブは、単独で又は２以上を使用することにより、変異を明確に検出することが可能となる。
【解決手段】ＤＲＢ１＊のエクソン２の一部の変異を標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションにより検出するにあたり、本来の変異箇所の他にミスマッチの塩基配列を設けたプローブを構築する。具体的には配列番号１〜６２に表されるいずれかのオリゴヌクレオチド又はこれらの相補鎖、あるいは置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブによる。これらのプローブは、単独で又は２以上を使用することにより、変異を明確に検出することが可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床化学、薬物化学、生化学、食品化学の分野において、ハイブリダイゼーションの手法により核酸の塩基配列の変異を検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の塩基配列における塩基の変異を検出する方法として、（１）ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、（２）ＨＥＴ法（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、（３）ＲＮＡｓｅ Ａ Ｃｌｅａｖａｓｇｅ Ｍｅｔｈｏｄ、（４）ＣＣＭ法（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｍｅｔｈｏｄ）、（５）ＣＦＬＰ法（Ｃｌｅａｖａｓｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の手法が数多く報告されている。
【０００３】
ハイブリダイゼーションにより遺伝子の変異を検出する方法では、標的核酸とハイブリダイズしうるプローブを使用する。変異位置の塩基を各種多型の塩基に置き換えた配列に相補的な配列を有するプローブを用いて検出を行う場合に、多型に基づく配列にもかかわらず各反応系で交差反応を起こすことから、核酸配列の多型を明確に判別することが困難であった。標的核酸の変異標的を感度良く区別するために、変異があると分かっている位置とは別の少なくとも１つの位置において改変した塩基を人工的に設けたプローブを用いる方法が既に開示されている。
【０００４】
しかしながら、高度に多型のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子座における複雑に関連した遺伝子座間では、従来のハイブリダイゼーションによっては互いに区別が困難であることが知られ、かつ示されてきた。この領域において、すぐれた解析能を有するプローブについては報告されていないものも多い。
【０００５】
【先行文献】
【特許文献１】
特表２０００−５１１４３４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２の一部において、変異を明確に検出しうるプローブを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＤＲＢ１のエクソン２の一部の変異を標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションにより検出するにあたり、本来の変異箇所の他にミスマッチの塩基配列を設けることにより、核酸の塩基配列の多型が明確に判別可能となることに着目し、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、
１．オリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズさせて遺伝子多型を検出する方法において使用する以下の群より選択されるオリゴヌクレオチドを含むプローブ；
１）標的核酸と相補的な核酸配列を有する塩基配列であって、標的核酸に対しては少なくとも１以上のミスマッチ（人為的ミスマッチ）を有し、さらに標的核酸のアリル変異体の核酸配列に対しては前記人為的ミスマッチの他に少なくとも１以上のミスマッチ（本来のミスマッチ）を有するオリゴヌクレオチドであって、人為的ミスマッチ及び本来のミスマッチが異なる塩基位置にあり、配列番号２〜５又は７〜６２のいずれか１に表される配列からなるオリゴヌクレオチド、
２）前記１）に記載の本来のミスマッチ位置と人為的ミスマッチの位置の間に、０〜１５個のいずれかからなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
３）前記１）又は２）に記載のオチゴヌクレオチドの相補鎖、
４）前記１）〜３）のいずれか１）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、プローブ機能を有するオリゴヌクレオチド、
２．前項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブを使用することを特徴とする遺伝子変異検出方法、
３．前項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブから少なくとも２以上のプローブを選択し、組み合わせて使用することを特徴とする遺伝子変異検出方法、
４．遺伝子変異の検出が、変異特異遺伝子増幅方法、変異特異ＤＮＡシークエンシング、変異特異ＤＮＡチップ又はインベーダアッセイ法である前項３に記載の検出方法、
５．前項１に記載のプローブを含む遺伝子変異検出用試薬、
６．前項２〜４のいずれか１に記載の方法に使用する遺伝子変異検出用試薬を含む遺伝子変異検出キット、からなる。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明において、「標的核酸」は、ＨＬＡ遺伝子に関し、ＤＲＢ１アリルのエクソン２の一部に関する領域を含むものであれば良く、天然に現れるものであっても良く、核酸断片のような組換え核酸分子でも良く、又は化学的に合成されたものであっても良い。標的核酸の長さは、プローブ又はプライマーを相補するに足る長さであれば特に限定されるものではない。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであっても良い。本発明で選択される標的核酸は、高度に多型のヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１領域から選択され、好ましくはＤＲＢ１アリルのエクソン２の一部から選択される配列を有する。より具体的には図１〜４８に示す配列が例示される。
【００１０】
また、発明において、「変異」とは対照あるいは正常な標的核酸に対して、標的配列中のいかなる変化も含み得るものである。相違は１個の塩基の多型であっても良く、２以上の隣接する又は隣接しない塩基の変異であっても良い。
【００１１】
また本特許出願で「相補的な核酸配列」とは、互いに正常な塩基対を作る逆方向鎖上の配列をいう。「ミスマッチ」は２本の鎖の間の相補的な領域において、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の、直接のワトソン−クリック塩基対（Ａ／Ｔ，Ｇ／Ｃ， Ｃ／Ｇ， Ｔ／Ａ）対応が存在しないものをいう。人為的ミスマッチは、オリゴヌクレオチド中の１の塩基位置に形成しても良く、より広範な範囲で形成しても良い。
【００１２】
（プローブの選択）
本発明において選択されるプローブの一態様は、ＤＲＢ１アリルのエクソン２の一部を標的核酸として、該標的核酸と相補的な核酸配列を有する塩基配列が標的に対して少なくとも１つの本来のミスマッチと、標的核酸に対して少なくとも１つの人為的ミスマッチを含み、人為的ミスマッチ及び本来のミスマッチが異なる塩基位置にあるオリゴヌクレオチドを含んでなるものである。本来のミスマッチ位置と人為的ミスマッチの位置の間に、０〜１５のいずれか、好ましくは０〜５のいずれかの塩基数の塩基配列を有していても良い。また、上記のオリゴヌクレオチドの相補鎖であっても良い。さらにはこれらのオリゴヌクレオチドに対し、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むものであっても良い。具体的には、配列番号２〜５、７〜１０で表されるオリゴヌクレオチドを含むプローブが例示される。又、配列番号１１〜６２で表されるオリゴヌクレオチドを含むプローブが例示される。また、配列番号２〜５及び／又は配列番号７〜６２に表される塩基配列に対し、相補的配列であっても良く、これらのオリゴヌクレオチドに対し、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むものであっても良い。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとしての機能を有するものであり、使用の態様によってはプライマー機能を有していても良い。プライマー機能を有する場合には、プライマー機能を利用して検査に供することも可能である。
【００１３】
（オリゴヌクレオチドの製造）
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ， ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００１４】
（プローブの使用）
本発明で選択されるプローブは、ハイブリダイゼーションステップを含む変異検出方法であれば、いかなる既存の方法又はその応用にも適用される。例えば、固相に上記プローブを固定化して使用することもできるし、試験管内でプローブを遊離させた状態で使用することもできる。具体的には、変異特異ＰＣＲ、変異特異ＤＮＡシークエンシング、変異特異ＤＮＡチップ、インベーダアッセイあるいは変異特異ＬＡＭＰ法などの手法に適用することができる。選択されるプローブは、単独で使用しても良く、変異をより正確に検出するために、適宜組み合わせて使用しても良い。
【００１５】
例えば、変異特異的ＰＣＲ及び変異特異的ＤＮＡシーケンシングによる手法では、本発明のプライマーは１つのアリルとの間に安定な二重鎖を形成し、該プライマーと他のアリル間では二重鎖を形成しないハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、ｐＨ、及び塩）のもとで使用することができる。安定な二重鎖を形成した後、増幅又はシーケンシング反応は既存のプロトコルにより進行させることができ、単一アリルの選択的増幅（例えば、ＰＣＲあるいは他の増幅方法）又は、例えば、プライマー伸長にＤＮＡポリメラーゼを使用して連鎖伸長シーケンシングを行うことができる。
【００１６】
本発明のハイブリダイゼーションにおいて形成される安定二重鎖は、利用できるどんな方法又は手段によっても検出することができる。例えば、検出は、ＰＣＲ増幅断片の産生産物を確認することにより、又は、オリゴヌクレオチドを標識してしその存在を確認すること等により行うことができる。例えば、両二重鎖は、両者間の安定性の差異を監視、例えば、反応中の結合又は分裂の動力学を監視することにより検出することができる。さらに具体的には、例えば二重鎖情報の視覚的、聴覚的、又は他の知覚的確証を提供し得る自動化システムに検出することができる。
【００１７】
（ＤＲＢ１遺伝子群における変異の検出）
本発明の理解を容易にするために、配列番号１〜１０に表される配列を例示し、ヒトＨＬＡのＤＲＢ１＊遺伝子群Ａ及びＢについて具体的に説明する。ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａ及びＢでは、図１に示す塩基配列中矢印で示した箇所にアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）の塩基について多型を示す。尚、本発明のプローブは以下に示するオリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、人為的に導入するミスマッチの位置や、プローブの長さ等は任意に選択することができる。
【００１８】
ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに属する遺伝子を検出するためにＤＲＢ１＊遺伝子群Ａと相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（１０−１（１）：配列番号１）を作成し、該プローブに対する標的核酸であるＤＲＢ１＊遺伝子群Ａ及びＢとの反応性について検討すると、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａの反応性はＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂの１．６倍〜１．８倍程度である。これより、単に相補的な配列を用いてもＤＲＢ１＊遺伝子群ＡとＢを明確に識別することが出来ないことが示唆される。
次にＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに対して、図１に示す矢印の位置とは別の位置に１塩基ミスマッチを有する４つの相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（１０−１（２）〜１０−１（５）：配列番号２〜５）を作成する。配列番号２〜５に表される各配列は、標的核酸ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに対して１塩基ミスマッチを有し、標的核酸ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに対しては図１の矢印の位置及び別の位置にミスマッチを有する。これらのオリゴヌクレオチドプローブのＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに対する反応性の強さは、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに対する反応性の強さの約６倍〜１１倍に増大する。
【００１９】
同様に、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂと相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（１０−２（１）：配列番号６）プローブを作成して検討すると、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂとの反応性の強さは、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａとの反応性の強さの１．７倍程度である。次に、配列番号７〜１０に表される塩基配列からなる１０−２（１）プローブに１塩基の変異を導入したプローブを作成し、反応性を調べると、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに対する反応性の強さはＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに対する反応性の強さの約７倍〜１３倍に増大する。
このように、プローブに１塩基のミスマッチを人為的に導入することにより、反応する遺伝子群と反応しない遺伝子群を明確に区別することが可能となることが示唆される。
【００２０】
上記により、１又は複数の変異の配列を有するアリル変異体を、他のアリル変異体と区別して認識させるために、検出したい配列と相補的な配列のプローブに人為的にミスマッチを有するプローブを構築し、使用することが有効であることが示唆された。ＤＲＢ１＊遺伝子群には、数多くのアリル変異体が存在する。これらの変異体から、ある特定の変異体を区別して検出するために、例えば配列番号１１〜６２に表される配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブを使用することができる。これらのプローブは、標的核酸であるＤＲＢ１＊遺伝子群のうち、図４７及び４８に示す位置から選択することができる。
【００２１】
本発明において特定されるプローブは、１つ又は２つ以上を組合わせて使用することができる。複数のプローブを使用することで、より確実にＤＲＢ１遺伝子群における変異の検出を行うことができる。
【００２２】
（検査用試薬及び遺伝子変異検出キット）
本発明はまた、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の遺伝子検査に使用する検査試薬及び遺伝子変異検出キットも含むものである。検査試薬としては、例えば被検試料増幅用プライマー、被検用試料の塩基配列決定用プライマー、各種ポリメラーゼ、塩基基質、標識物質など本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであっても良い。また、検査用試薬キットは本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものを含むものであれば良い。
【００２３】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）変異検出用プローブ（１０−１シリーズ及び１０−２シリーズ）
本実施例で使用するプローブは、以下の配列番号１〜１０に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。各プローブについて、５’末端側から９位の位置に、多型に係る変異（アデニン又はチミン）が認められる。配列番号２〜５及び７〜１０で表されるプローブは、多型に係る変異の他に、標的核酸に対し、人為的にミスマッチを生じる塩基を導入したものである。各プローブについて、変異及び人為的ミスマッチに係る位置に下線を施した。
【００２５】
プローブ１０−１（１） ： ５’− ＧＧＧＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号１）
プローブ１０−１（２） ： ５’− ＧＧＧＧＧＡＡＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号２）
プローブ１０−１（３） ： ５’− ＧＧＧＧＧＣＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号３）
プローブ１０−１（４） ： ５’− ＧＧＧＧＡＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号４）
プローブ１０−１（５） ： ５’− ＧＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号５）
プローブ１０−２（１） ： ５’− ＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号６）
プローブ１０−２（２） ： ５’− ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号７）
プローブ１０−２（３） ： ５’− ＧＧＧＧＧＣＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号８）
プローブ１０−２（４） ： ５’− ＧＧＧＧＡＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号９）
プローブ１０−２（５） ： ５’− ＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号１０）
【００２６】
（実施例２）変異検出用プローブ（ＲＢ１−１−４）
プローブＲＢ１−１−４ ： ５’−ＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴ （配列番号１１）
配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１を検出するためにデザインしたプローブである。図２に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブでは、これらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１１の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００２７】
（実施例３）変異検出用プローブ（ＲＢ１−２−４）
プローブＲＢ１−２−４ ： ５’−ＴＡＣＴＣＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡ （配列番号１２）
配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３表中右上に示すに示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０３０１１， １１０１１， １３０１１， １３０２１， １３０２２， １４０１１， １４０２， １４０３， １４０５， １４０６， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図３に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１２の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００２８】
（実施例４）変異検出用プローブ（ＲＢ１−３−４）
プローブＲＢ１−３−４ ： ５’−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴ （配列番号１３）
配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０４０１１， ０４０１２， ０４０３１， ０４０３２， ０４０４， ０４０５１， ０４０５２， ０４０６， ０４０７， ０４１０， ０４１７を検出するためにデザインしたプローブである。図４に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１３の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００２９】
（実施例５）変異検出用プローブ（ＲＢ１−４−４）
プローブＲＢ１−４−４ ： ５’−ＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴ （配列番号１４）
配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０７０１１， ０７０１２ を検出するためにデザインしたプローブである。図５に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１４の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３０】
（実施例６）変異検出用プローブ（ＲＢ１−６−５）
プローブＲＢ１−６−５ ： ５’−ＴＡＣＴＣＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡ （配列番号１５）
配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０８０２１， ０８０２２， ０８０３２， １２０１， １２０２１， １２０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図６示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１５の下線を施した位置が通常Ｔであるところ人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３１】
（実施例７）変異検出用プローブ（ＲＢ１−７−４）
プローブＲＢ１−７−４ ： ５’−ＧＡＡＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴ （配列番号１６）
配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図７表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図７に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１６の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３２】
（実施例８）変異検出用プローブ（ＲＢ１−８−４）
プローブＲＢ１−８−４ ： ５’−ＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴ （配列番号１７）
配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図８表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１００１１， １００１２を検出するためにデザインしたプローブである。図８に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１７の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３３】
（実施例９）変異検出用プローブ（ＲＢ１−９−４）
プローブＲＢ１−９−４ ： ５’−ＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴ （配列番号１８）
配列番号１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図９表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２， １５０２３， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図９に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１８の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３４】
（実施例１０）変異検出用プローブ（２−１（１））
プローブ２−１（１） ： ５’−ＧＧＴＧＣＧＧＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡＧ （配列番号１９）
配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１０表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， １００１１， １００１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１０に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１９の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３５】
（実施例１１）変異検出用プローブ（２−５（１））
プローブ２−５（１） ： ５’−ＧＧＴＧＣＧＧＴＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧ （配列番号２０）
配列番号２０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１１表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１１に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２０の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３６】
（実施例１２）変異検出用プローブ（３−７（１））
プローブ３−７（１） ： ５’−ＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＧＣＧＴＣＣ （配列番号２１）
配列番号２１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１００１１， １００１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１２に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２１の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３７】
（実施例１３）変異検出用プローブ（４−１（２））
プローブ４−１（２） ： ５’−ＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＣＣＴＡＴＡＡＣ （配列番号２２）
配列番号２２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１３表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１を検出するためにデザインしたプローブである。図１３に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２１の下線を施し位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３８】
（実施例１４）変異検出用プローブ（４−４（３），４−４（４））
プローブ４−４（３） ： ５’−ＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＣＣ （配列番号２３）
プローブ４−４（４） ： ５’−ＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＣ （配列番号２４）
配列番号２３及び２４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図１４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０７０１１， ０７０１２を検出するためにデザインしたプローブである。これらは、いずれも等しい位置を認識するプローブであり、変異の位置も同一であるが、長さが異なる点で相違する。図１４に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２３及び２４の下線を施した位置が通常Ｃであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３９】
（実施例１５）変異検出用プローブ（４−６（２））
プローブ４−６（２） ： ５’−ＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＡＡＣ （配列番号２５）
配列番号２５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１５に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２５の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４０】
（実施例１６）変異検出用プローブ（２−１（１））
プローブ４−７（１） ： ５’−ＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＧＣＧＣＣＣＡＴＡＡ （配列番号２６）
配列番号２６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１００１１， １００１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１６のに示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２６の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４１】
（実施例１７）変異検出用プローブ（２−１（１））
プローブ４−８（２） ： ５’−ＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣ （配列番号２７）
配列番号２７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１７表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１２０１， １２０２１， １２０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図１７に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブでは、これらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２７の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４２】
（実施例１８）変異検出用プローブ（５−２（２））
プローブ５−２（２） ： ５’−ＴＡＣＴＴＣＣＡＴＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡ （配列番号２８）
配列番号２８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１８表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０３０１１， １２０１， １２０２１， １２０２２， １３０１１， １３０２１， １３０２２， １４０１１， １４０２， １４０３， １４０５， １４０６， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図１８に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２８の下線を施した位置が通常Ｃであるところ、人為的にＧに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４３】
（実施例１９）変異検出用プローブ（５−３（２））
プローブ５−３（２） ： ５’−ＴＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡ （配列番号２９）
配列番号２９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１９表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０４０１１， ０４０３１， ０４０３２， ０４０４， ０４０５１， ０４０５２， ０４０６， ０４０７， ０４１０， ０４１７を検出するためにデザインしたプローブである。図２９に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２９の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４４】
（実施例２０）変異検出用プローブ（７−１０（２），７−１０（４））
プローブ７−１０（２） ： ５’−ＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧ （配列番号３０）
プローブ７−１０（４） ： ５’−ＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＣＣＧＴＧ （配列番号３１）
配列番号３０及び３１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図２０表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２０に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３０及び３１の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４５】
（実施例２１）変異検出用プローブ（８−１（２），８−１（４））
プローブ８−１（２） ： ５’−ＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴ （配列番号３２）
プローブ８−１（４） ： ５’−ＡＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧ （配列番号３３）
配列番号３２及び３３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図２１表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， ０４０６を検出するためにデザインしたプローブである。図２１に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブでは、これらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４６】
（実施例２２）変異検出用プローブ（８−２（２））
プローブ８−２（２） ： ５’−ＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧ （配列番号３４）
配列番号３４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０３０１１， １３０１１， １３０２１， １３０２２，１４０２， １４０３， １４０６を検出するためにデザインしたプローブである。図２２に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３４の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４７】
（実施例２３）変異検出用プローブ（８−６（２））
プローブ８−６（２） ： ５’−ＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴ （配列番号３５）
配列番号３５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２３表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０７０１１， ０７０１２， １４０１１， １４０５， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図２３に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３５の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４８】
（実施例２４）変異検出用プローブ（２−１（１））
プローブ８−９（２） ： ５’−ＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＧＣＴ （配列番号３６）
配列番号３６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１２０１， １２０２１， １２０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２４に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３６の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４９】
（実施例２５）変異検出用プローブ（８ａ−１（２））
プローブ８ａ−１（２） ： ５’−ＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧ （配列番号３７）
配列番号３７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， ０４０６， １５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２， １５０２３， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２５に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３７の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５０】
（実施例２６）変異検出用プローブ（１２−１（２））
プローブ１２−１（２） ： ５’−ＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡ （配列番号３８）
配列番号３８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， ０３０１１， ０４０１１， ０４０１２， ０４０３１， ０４０４， ０４０６， ０４０７， ０８０２１， ０８０２２， １００１１， １００１２， １３０１１， １３０２１， １３０２２， １４０２， １４０３， １４０６， １５０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２６に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３８の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５１】
（実施例２７）変異検出用プローブ（１２−２（２））
プローブ１２−２（２） ： ５’−ＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡ （配列番号３９）
配列番号３９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２７表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０４０３２， １５０１１， １５０１２， １５０２１，１５０２３， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２７に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３９の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５２】
（実施例２８）変異検出用プローブ（１２−３（２））
プローブ１２−３（２） ： ５’−ＧＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＡ （配列番号４０）
配列番号４０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２８表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０４０５１， ０４０５２， ０４１０， ０４１７， ０８０３２を検出するためにデザインしたプローブである。図２８に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４０の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５３】
（実施例２９）変異検出用プローブ（１３−５（２），１３−５（４））
プローブ１３−５（２） ： ５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡ （配列番号４１）
プローブ１３−５（４） ： ５’−ＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＴＧＧＡ （配列番号４２）
配列番号４１及び４２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図２９表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１１０１１を検出するためにデザインしたプローブである。図２９に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４１の下線を施した位置が通常Ｇであるところに人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブ及び配列番号４２の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５４】
（実施例３０）変異検出用プローブ（１３−６（１），１３−６（２））
プローブ１３−６（１） ： ５’−ＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧ （配列番号４３）
プローブ１３−６（２） ： ５’−ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧＡ （配列番号４４）
配列番号４３及び４４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図３０表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１４０１１， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図３０に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４３及び４４の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５５】
（実施例３１）変異検出用プローブ（１５−４（３））
プローブ１５−４（３） ： ５’−ＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣ （配列番号４５）
配列番号４５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３１表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０８０３２， １２０１， １３０１１， １３０２１， １３０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図３１に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４５の下線を施した位置が通常Ｃであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５６】
（実施例３２）変異検出用プローブ（１５−５（２），１５−５（４））
プローブ１５−５（２） ： ５’−ＧＡＡＧＧＡＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＧ （配列番号４６）
プローブ１５−５（４） ： ５’−ＡＧＧＡＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡ （配列番号４７）
配列番号４６及び４７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図３２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図３２に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４６及び４７の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５７】
（実施例３３）変異検出用プローブ（１７−１０（１），１７−１０（２））
プローブ１７−１０（１） ： ５’−ＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＧＣ （配列番号４８）
プローブ１７−１０（２） ： ５’−ＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＧＣ （配列番号４９）
配列番号４８及び４９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図３３表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１３０１１， １３０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図３３に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４８の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブ、及び配列番号４９の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５８】
（実施例３４）変異検出用プローブ（１７−１２（１））
プローブ１７−１２（１） ： ５’−ＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣ （配列番号５０）
配列番号５０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２，１５０２３を検出するためにデザインしたプローブである。図３４に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５０の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５９】
（実施例３５）変異検出用プローブ（１８−１１（１））
プローブ１８−１１（１） ： ５’−ＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧ （配列番号５１）
配列番号５１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１３０１１， １３０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図３５に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５１の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６０】
（実施例３６）変異検出用プローブ（１８−１３（１））
プローブ１８−１３（１） ： ５’−ＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧ （配列番号５２）
配列番号５２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２，１５０２３を検出するためにデザインしたプローブである。図３６に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６１】
（実施例３７）変異検出用プローブ（１８ａ−２（１））
プローブ１８ａ−２（１） ： ５’−ＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＧＧＴＧ （配列番号５３）
配列番号５３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３７表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０３０１１を検出するためにデザインしたプローブである。図３７に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６２】
（実施例３８）変異検出用プローブ（１８ａ−６（１））
プローブ１８ａ−６（１） ： ５’−ＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧ （配列番号５４）
配列番号５４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３８表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０８０２１， ０８０２２， ０８０３２， １４０３を検出するためにデザインしたプローブである。図３８に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６３】
（実施例３９）変異検出用プローブ（１８ａ−１０（１））
プローブ１８ａ−１０（１）： ５’−ＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧ （配列番号５５）
配列番号５５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３９表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１１０１１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図３９に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブでは、これらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５５の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６４】
（実施例４０）変異検出用プローブ（１８ａ−１１（１））
プローブ１８ａ−１１（１）： ５’−ＧＡＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧ （配列番号５６）
配列番号５６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４０表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１２０１， １２０２１， １２０２２， １６０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図４０に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５６の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６５】
（実施例４１）変異検出用プローブ（１８ａ−１２（１））
プローブ１８ａ−１２（１）： ５’−ＧＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧ （配列番号５７）
配列番号５７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４１表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１３０１１， １３０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図４１に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５７の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６６】
（実施例４２）変異検出用プローブ（１９−５（１））
プローブ１９−５（１） ： ５’−ＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣ （配列番号５８）
配列番号５８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０８０２１， ０８０２２， ０８０３２， １４０３を検出するためにデザインしたプローブである。図４２に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５８の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６７】
（実施例４３）変異検出用プローブ（１９−７（１））
プローブ１９−７（１） ： ５’−ＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣ （配列番号５９）
配列番号５９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４３表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１００１２， １２０１， １２０２１， １２０２２， １３０２２， １６０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図４３に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５９の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６８】
（実施例４４）変異検出用プローブ（２０−２（２））
プローブ２０−２（２） ： ５’−ＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＣＡ （配列番号６０）
配列番号６０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０７０１１， ０７０１２， ０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図４４に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号６０の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６９】
（実施例４５）変異検出用プローブ（２０−３（２））
プローブ２０−３（２） ： ５’−ＧＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡ （配列番号６１）
配列番号６１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１２０１， １２０２１， １４０１１， １４０５， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図４５に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号６１の下線を施した位置が通常Ｃであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００７０】
（実施例４６）変異検出用プローブ（２２−１（１））
プローブ２２−１（１） ： ５’−ＣＧＧＧＧＴＴＧＧＴＡＡＧＡＧＣＴＴ （配列番号６２）
配列番号６２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， ０４０１１， ０４０１２， ０４０５１， ０４０５２， ０４０７， ０４１７， ０７０１１， ０７０１２， ０８０２１， ０８０２２， ０８０３２， ０９０１２， １００１１， １００１２， １１０１１， １３０２１， 、１３０２２， １４０２， １４０３， １４０７， １５０２１， １５０２２， １５０２３， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図４６に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号６２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００７１】
（実験例１）
実施例１に示す各プローブの効果を以下に従い確認した。
１）材料及び方法
ａ） 試薬：
ＴＥ
トレハロース ２０％（ｗ／ｖ）
１０ × Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ （宝酒造製）
Ｅｘ Ｔａｑ ポリメラーゼ（宝酒造製）
ｄＮＴＰｓ （宝酒造製） ２．５ｍＭ
２０ × ＳＳＰＥ （ｐＨ７．４）
ＳＤＳ ５％
ｂ） 標的核酸：
ＤＲＢ１＊アリル（０１０１， ０４０５１， ０８０２２， １１０１１， １２０１， １３０１１）
【００７２】
ｃ） オリゴアレイの作成
まず、５’末端をチオール化修飾したオリゴヌクレオチドプローブ（日本バイオサービス社製）を、２０μＭとなるように１０％（ｗ／ｖ）トレハロース／ＴＥ溶液に溶解した。この溶液をスポッティング溶液として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ（宝酒造製）を用いてＥＭＣＳコートスライドグラスにスポットした。室温で一晩静置した後、２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＰＢＳ溶液を加え、室温で３時間ブロッキングした。その後、流水洗浄し、風乾し、オリゴアレイとした。
【００７３】
ｄ） ハイブリダイゼーション用の試料（標的核酸）をＰＣＲにて調製した。クローン化したＤＲＢ１＊アリル（プラスミドＤＮＡ）を鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし、次の条件でＰＣＲを行った。
【００７４】
ＰＣＲ用プライマー：
ＤＲ−Ｆ１ ： ５’− ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ（配列番号６３）
ＤＲ−Ｒ１（Ｃｙ５） ： ５’− ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ （配列番号６４）
混合割合：
１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ
ＭｇＣｌ２ （２５ｍＭ） ８μＬ
ｄＮＴＰｓ （２．５ｍＭ） ８μＬ
ＤＲ−Ｆ１ （１０μＭ） ０．５μＬ
ＤＲ−Ｒ１（Ｃｙ５）（１０μＭ） ５μＬ
Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
鋳型 １μＬ
Ｈ２Ｏ １００μＬ
条件：
９４℃５分
９４℃２０秒、５９℃２０秒、７２℃２０秒を４０サイクル
７２℃７分
その後４℃
【００７５】
ｅ） ハイブリダイゼーション
以下の条件で、標的核酸と各プローブとのハイブリダイゼーションを行った。
２０×ＳＳＰＥ ４５μＬ
５ ％ ＳＤＳ １５μＬ
ＰＣＲ産物（標的核酸） ５０μＬ
Ｈ２Ｏ ４０μＬ
９５℃で５分間加温後、直接オリゴアレイ上に添加した。
その後、４５℃で２時間加温し、２×ＳＳＰＥ （４５℃）で６回洗浄した。
【００７６】
ｆ） 解析方法
ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いてスライドをスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏソフトウェアを用いてシグナル強度を測定した。
【００７７】
２）配列比較
まず、日本人集団に見られるＤＲＢ１＊アリルを１０−１（１）プローブ（配列番号１）と完全マッチする群（ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａ）、及び１０−２（１）プローブ（配列番号５）と完全マッチする群（ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂ）に分けた（表１）。
上記のうち、遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５１、ＤＲＢ１＊０８０２２、ＤＲＢ１＊１１０１１のｅｘｏｎ２の配列の一部を比較したものを図１に示した。
【００７８】
【表１】
【００７９】
３）各プローブとの反応性比較
配列番号１〜１０に表される各オリゴヌクレオチドプローブを、スライドグラス上に固定化したオリゴアレイを用いて、各アリルとの反応性を検討した。各プローブと各アリルとの反応の強さ、及び、ＤＲＢ１＊遺伝群ＡとＢに対する反応性の比を結果を表２に示した。
【００８０】
【表２】
【００８１】
オリゴプローブ１０−１（１）（配列番号１）に対する反応についてみてみると、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに属するアリル（ＤＲＢ１＊０１０１， ＊０４０５１， ＊０８０２２）の反応性の強さは、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに属するアリル（ＤＲＢ１＊１１０１１）の反応性の強さの１．６倍〜１．８倍であった。同様に、プローブ１０−２（１）（配列番号５）に対しては、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに属するアリルの方が、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに属するアリルよりも１．７倍〜２．０倍強く反応した。しかしながら、（１０−１（２）〜１０−１（５）（配列番号２〜４）及び１０−２（２）〜１０−２（５）（配列番号６〜１０））に示すようにプローブに１塩基の変異を導入することによって、ＤＲＢ１＊遺伝子群ＡとＢに対する反応性の比が約６倍〜１３倍に増大した。
【００８２】
（実験例２）
本実施例２〜４６に示す配列番号１１〜６２に示す塩基配列を有するプローブの効果を確認した。
１）材料及び方法は、次に示す事項の他は、実験例１に従った。
遺伝子型ＤＲＢ１＊アリル
（＊０１０１， ＊０３０１， ＊０４０３， ＊０４０５， ＊０４０６， ＊０４１０， ＊０７０１， ＊０８０２， ＊０８０３， ＊０９０１， ＊１００１， ＊１１０１， ＊１２０１， ＊１２０２， ＊１３０１， ＊１３０２， ＊１４０１， ＊１４０５， ＊１４０６， ＊１５０１， ＊１５０２， ＊１６０２）
２）配列比較
図２〜４６に、各プローブ及び標的核酸の配列比較を示した。表中最上段の配列は、検出すべき核酸配列を示した。表中２段目以降の配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示す。
【００８３】
３）各プローブとの反応性比較
表３に、各部ローブと各遺伝子型ＤＲＢ１＊アリルとの反応値を示した。強い陽性反応を示した部分を表中、太線及び下線を施して示した。その結果、非特異的な反応が抑えられ、特異的な変異体の検出が確認された。
【００８４】
【発明の効果】
上記説明したように、本発明のプローブを用いると、ＨＬＡのＤＲＢ１＊の特定領域における遺伝子変異の検出を容易に行うことができる。
【００８５】
【表３】
【００８６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＲＢ１＊アリルのｅｘｏｎ ２（一部）の配列比較を示す図である。（実施例１）
【符号の説明】図１の↓：ＤＲＢ１＊遺伝子群ＡとＢで塩基が異なる位置を示す。
（アデニン又はチミン）
図１の下線部分はプローブの位置を示す。
【図２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２）
【図３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３）
【図４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４）
【図５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例５）
【図６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例６）
【図７】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例７）
【図８】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例８）
【図９】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例９）
【図１０】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１０）
【図１１】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１１）
【図１２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１２）
【図１３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１３）
【図１４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１４）
【図１５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１５）
【図１６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１６）
【図１７】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１７）
【図１８】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１８）
【図１９】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１９）
【図２０】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２０）
【図２１】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２１）
【図２２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２２）
【図２３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２３）
【図２４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２４）
【図２５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２５）
【図２６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２６）
【図２７】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２７）
【図２８】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２８）
【図２９】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２９）
【図３０】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３０）
【図３１】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３１）
【図３２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３２）
【図３３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３３）
【図３４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３４）
【図３５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３５）
【図３６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３６）
【図３７】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３７）
【図３８】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３８）
【図３９】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３９）
【図４０】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４０）
【図４１】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４１）
【図４２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４２）
【図４３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４３）
【図４４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４４）
【図４５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４５）
【図４６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４６）
【図４７】アリル変異体に特異的なプローブの位置を示す図である。（実施例２〜４６）
【図４８】アリル変異体に特異的なプローブの位置を示す図である。（実施例２〜４６）
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床化学、薬物化学、生化学、食品化学の分野において、ハイブリダイゼーションの手法により核酸の塩基配列の変異を検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の塩基配列における塩基の変異を検出する方法として、（１）ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、（２）ＨＥＴ法（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、（３）ＲＮＡｓｅ Ａ Ｃｌｅａｖａｓｇｅ Ｍｅｔｈｏｄ、（４）ＣＣＭ法（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｍｅｔｈｏｄ）、（５）ＣＦＬＰ法（Ｃｌｅａｖａｓｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の手法が数多く報告されている。
【０００３】
ハイブリダイゼーションにより遺伝子の変異を検出する方法では、標的核酸とハイブリダイズしうるプローブを使用する。変異位置の塩基を各種多型の塩基に置き換えた配列に相補的な配列を有するプローブを用いて検出を行う場合に、多型に基づく配列にもかかわらず各反応系で交差反応を起こすことから、核酸配列の多型を明確に判別することが困難であった。標的核酸の変異標的を感度良く区別するために、変異があると分かっている位置とは別の少なくとも１つの位置において改変した塩基を人工的に設けたプローブを用いる方法が既に開示されている。
【０００４】
しかしながら、高度に多型のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子座における複雑に関連した遺伝子座間では、従来のハイブリダイゼーションによっては互いに区別が困難であることが知られ、かつ示されてきた。この領域において、すぐれた解析能を有するプローブについては報告されていないものも多い。
【０００５】
【先行文献】
【特許文献１】
特表２０００−５１１４３４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２の一部において、変異を明確に検出しうるプローブを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＤＲＢ１のエクソン２の一部の変異を標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションにより検出するにあたり、本来の変異箇所の他にミスマッチの塩基配列を設けることにより、核酸の塩基配列の多型が明確に判別可能となることに着目し、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、
１．オリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズさせて遺伝子多型を検出する方法において使用する以下の群より選択されるオリゴヌクレオチドを含むプローブ；
１）標的核酸と相補的な核酸配列を有する塩基配列であって、標的核酸に対しては少なくとも１以上のミスマッチ（人為的ミスマッチ）を有し、さらに標的核酸のアリル変異体の核酸配列に対しては前記人為的ミスマッチの他に少なくとも１以上のミスマッチ（本来のミスマッチ）を有するオリゴヌクレオチドであって、人為的ミスマッチ及び本来のミスマッチが異なる塩基位置にあり、配列番号２〜５又は７〜６２のいずれか１に表される配列からなるオリゴヌクレオチド、
２）前記１）に記載の本来のミスマッチ位置と人為的ミスマッチの位置の間に、０〜１５個のいずれかからなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
３）前記１）又は２）に記載のオチゴヌクレオチドの相補鎖、
４）前記１）〜３）のいずれか１）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、プローブ機能を有するオリゴヌクレオチド、
２．前項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブを使用することを特徴とする遺伝子変異検出方法、
３．前項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブから少なくとも２以上のプローブを選択し、組み合わせて使用することを特徴とする遺伝子変異検出方法、
４．遺伝子変異の検出が、変異特異遺伝子増幅方法、変異特異ＤＮＡシークエンシング、変異特異ＤＮＡチップ又はインベーダアッセイ法である前項３に記載の検出方法、
５．前項１に記載のプローブを含む遺伝子変異検出用試薬、
６．前項２〜４のいずれか１に記載の方法に使用する遺伝子変異検出用試薬を含む遺伝子変異検出キット、からなる。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明において、「標的核酸」は、ＨＬＡ遺伝子に関し、ＤＲＢ１アリルのエクソン２の一部に関する領域を含むものであれば良く、天然に現れるものであっても良く、核酸断片のような組換え核酸分子でも良く、又は化学的に合成されたものであっても良い。標的核酸の長さは、プローブ又はプライマーを相補するに足る長さであれば特に限定されるものではない。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであっても良い。本発明で選択される標的核酸は、高度に多型のヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１領域から選択され、好ましくはＤＲＢ１アリルのエクソン２の一部から選択される配列を有する。より具体的には図１〜４８に示す配列が例示される。
【００１０】
また、発明において、「変異」とは対照あるいは正常な標的核酸に対して、標的配列中のいかなる変化も含み得るものである。相違は１個の塩基の多型であっても良く、２以上の隣接する又は隣接しない塩基の変異であっても良い。
【００１１】
また本特許出願で「相補的な核酸配列」とは、互いに正常な塩基対を作る逆方向鎖上の配列をいう。「ミスマッチ」は２本の鎖の間の相補的な領域において、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の、直接のワトソン−クリック塩基対（Ａ／Ｔ，Ｇ／Ｃ， Ｃ／Ｇ， Ｔ／Ａ）対応が存在しないものをいう。人為的ミスマッチは、オリゴヌクレオチド中の１の塩基位置に形成しても良く、より広範な範囲で形成しても良い。
【００１２】
（プローブの選択）
本発明において選択されるプローブの一態様は、ＤＲＢ１アリルのエクソン２の一部を標的核酸として、該標的核酸と相補的な核酸配列を有する塩基配列が標的に対して少なくとも１つの本来のミスマッチと、標的核酸に対して少なくとも１つの人為的ミスマッチを含み、人為的ミスマッチ及び本来のミスマッチが異なる塩基位置にあるオリゴヌクレオチドを含んでなるものである。本来のミスマッチ位置と人為的ミスマッチの位置の間に、０〜１５のいずれか、好ましくは０〜５のいずれかの塩基数の塩基配列を有していても良い。また、上記のオリゴヌクレオチドの相補鎖であっても良い。さらにはこれらのオリゴヌクレオチドに対し、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むものであっても良い。具体的には、配列番号２〜５、７〜１０で表されるオリゴヌクレオチドを含むプローブが例示される。又、配列番号１１〜６２で表されるオリゴヌクレオチドを含むプローブが例示される。また、配列番号２〜５及び／又は配列番号７〜６２に表される塩基配列に対し、相補的配列であっても良く、これらのオリゴヌクレオチドに対し、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むものであっても良い。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとしての機能を有するものであり、使用の態様によってはプライマー機能を有していても良い。プライマー機能を有する場合には、プライマー機能を利用して検査に供することも可能である。
【００１３】
（オリゴヌクレオチドの製造）
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ， ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００１４】
（プローブの使用）
本発明で選択されるプローブは、ハイブリダイゼーションステップを含む変異検出方法であれば、いかなる既存の方法又はその応用にも適用される。例えば、固相に上記プローブを固定化して使用することもできるし、試験管内でプローブを遊離させた状態で使用することもできる。具体的には、変異特異ＰＣＲ、変異特異ＤＮＡシークエンシング、変異特異ＤＮＡチップ、インベーダアッセイあるいは変異特異ＬＡＭＰ法などの手法に適用することができる。選択されるプローブは、単独で使用しても良く、変異をより正確に検出するために、適宜組み合わせて使用しても良い。
【００１５】
例えば、変異特異的ＰＣＲ及び変異特異的ＤＮＡシーケンシングによる手法では、本発明のプライマーは１つのアリルとの間に安定な二重鎖を形成し、該プライマーと他のアリル間では二重鎖を形成しないハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、ｐＨ、及び塩）のもとで使用することができる。安定な二重鎖を形成した後、増幅又はシーケンシング反応は既存のプロトコルにより進行させることができ、単一アリルの選択的増幅（例えば、ＰＣＲあるいは他の増幅方法）又は、例えば、プライマー伸長にＤＮＡポリメラーゼを使用して連鎖伸長シーケンシングを行うことができる。
【００１６】
本発明のハイブリダイゼーションにおいて形成される安定二重鎖は、利用できるどんな方法又は手段によっても検出することができる。例えば、検出は、ＰＣＲ増幅断片の産生産物を確認することにより、又は、オリゴヌクレオチドを標識してしその存在を確認すること等により行うことができる。例えば、両二重鎖は、両者間の安定性の差異を監視、例えば、反応中の結合又は分裂の動力学を監視することにより検出することができる。さらに具体的には、例えば二重鎖情報の視覚的、聴覚的、又は他の知覚的確証を提供し得る自動化システムに検出することができる。
【００１７】
（ＤＲＢ１遺伝子群における変異の検出）
本発明の理解を容易にするために、配列番号１〜１０に表される配列を例示し、ヒトＨＬＡのＤＲＢ１＊遺伝子群Ａ及びＢについて具体的に説明する。ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａ及びＢでは、図１に示す塩基配列中矢印で示した箇所にアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）の塩基について多型を示す。尚、本発明のプローブは以下に示するオリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、人為的に導入するミスマッチの位置や、プローブの長さ等は任意に選択することができる。
【００１８】
ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに属する遺伝子を検出するためにＤＲＢ１＊遺伝子群Ａと相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（１０−１（１）：配列番号１）を作成し、該プローブに対する標的核酸であるＤＲＢ１＊遺伝子群Ａ及びＢとの反応性について検討すると、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａの反応性はＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂの１．６倍〜１．８倍程度である。これより、単に相補的な配列を用いてもＤＲＢ１＊遺伝子群ＡとＢを明確に識別することが出来ないことが示唆される。
次にＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに対して、図１に示す矢印の位置とは別の位置に１塩基ミスマッチを有する４つの相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（１０−１（２）〜１０−１（５）：配列番号２〜５）を作成する。配列番号２〜５に表される各配列は、標的核酸ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに対して１塩基ミスマッチを有し、標的核酸ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに対しては図１の矢印の位置及び別の位置にミスマッチを有する。これらのオリゴヌクレオチドプローブのＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに対する反応性の強さは、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに対する反応性の強さの約６倍〜１１倍に増大する。
【００１９】
同様に、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂと相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（１０−２（１）：配列番号６）プローブを作成して検討すると、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂとの反応性の強さは、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａとの反応性の強さの１．７倍程度である。次に、配列番号７〜１０に表される塩基配列からなる１０−２（１）プローブに１塩基の変異を導入したプローブを作成し、反応性を調べると、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに対する反応性の強さはＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに対する反応性の強さの約７倍〜１３倍に増大する。
このように、プローブに１塩基のミスマッチを人為的に導入することにより、反応する遺伝子群と反応しない遺伝子群を明確に区別することが可能となることが示唆される。
【００２０】
上記により、１又は複数の変異の配列を有するアリル変異体を、他のアリル変異体と区別して認識させるために、検出したい配列と相補的な配列のプローブに人為的にミスマッチを有するプローブを構築し、使用することが有効であることが示唆された。ＤＲＢ１＊遺伝子群には、数多くのアリル変異体が存在する。これらの変異体から、ある特定の変異体を区別して検出するために、例えば配列番号１１〜６２に表される配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブを使用することができる。これらのプローブは、標的核酸であるＤＲＢ１＊遺伝子群のうち、図４７及び４８に示す位置から選択することができる。
【００２１】
本発明において特定されるプローブは、１つ又は２つ以上を組合わせて使用することができる。複数のプローブを使用することで、より確実にＤＲＢ１遺伝子群における変異の検出を行うことができる。
【００２２】
（検査用試薬及び遺伝子変異検出キット）
本発明はまた、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の遺伝子検査に使用する検査試薬及び遺伝子変異検出キットも含むものである。検査試薬としては、例えば被検試料増幅用プライマー、被検用試料の塩基配列決定用プライマー、各種ポリメラーゼ、塩基基質、標識物質など本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであっても良い。また、検査用試薬キットは本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものを含むものであれば良い。
【００２３】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）変異検出用プローブ（１０−１シリーズ及び１０−２シリーズ）
本実施例で使用するプローブは、以下の配列番号１〜１０に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。各プローブについて、５’末端側から９位の位置に、多型に係る変異（アデニン又はチミン）が認められる。配列番号２〜５及び７〜１０で表されるプローブは、多型に係る変異の他に、標的核酸に対し、人為的にミスマッチを生じる塩基を導入したものである。各プローブについて、変異及び人為的ミスマッチに係る位置に下線を施した。
【００２５】
プローブ１０−１（１） ： ５’− ＧＧＧＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号１）
プローブ１０−１（２） ： ５’− ＧＧＧＧＧＡＡＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号２）
プローブ１０−１（３） ： ５’− ＧＧＧＧＧＣＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号３）
プローブ１０−１（４） ： ５’− ＧＧＧＧＡＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号４）
プローブ１０−１（５） ： ５’− ＧＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号５）
プローブ１０−２（１） ： ５’− ＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号６）
プローブ１０−２（２） ： ５’− ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号７）
プローブ１０−２（３） ： ５’− ＧＧＧＧＧＣＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号８）
プローブ１０−２（４） ： ５’− ＧＧＧＧＡＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号９）
プローブ１０−２（５） ： ５’− ＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ （配列番号１０）
【００２６】
（実施例２）変異検出用プローブ（ＲＢ１−１−４）
プローブＲＢ１−１−４ ： ５’−ＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴ （配列番号１１）
配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１を検出するためにデザインしたプローブである。図２に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブでは、これらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１１の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００２７】
（実施例３）変異検出用プローブ（ＲＢ１−２−４）
プローブＲＢ１−２−４ ： ５’−ＴＡＣＴＣＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡ （配列番号１２）
配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３表中右上に示すに示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０３０１１， １１０１１， １３０１１， １３０２１， １３０２２， １４０１１， １４０２， １４０３， １４０５， １４０６， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図３に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１２の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００２８】
（実施例４）変異検出用プローブ（ＲＢ１−３−４）
プローブＲＢ１−３−４ ： ５’−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴ （配列番号１３）
配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０４０１１， ０４０１２， ０４０３１， ０４０３２， ０４０４， ０４０５１， ０４０５２， ０４０６， ０４０７， ０４１０， ０４１７を検出するためにデザインしたプローブである。図４に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１３の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００２９】
（実施例５）変異検出用プローブ（ＲＢ１−４−４）
プローブＲＢ１−４−４ ： ５’−ＧＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＴ （配列番号１４）
配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０７０１１， ０７０１２ を検出するためにデザインしたプローブである。図５に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１４の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３０】
（実施例６）変異検出用プローブ（ＲＢ１−６−５）
プローブＲＢ１−６−５ ： ５’−ＴＡＣＴＣＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＧＴＴＡ （配列番号１５）
配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０８０２１， ０８０２２， ０８０３２， １２０１， １２０２１， １２０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図６示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１５の下線を施した位置が通常Ｔであるところ人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３１】
（実施例７）変異検出用プローブ（ＲＢ１−７−４）
プローブＲＢ１−７−４ ： ５’−ＧＡＡＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴ （配列番号１６）
配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図７表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図７に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１６の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３２】
（実施例８）変異検出用プローブ（ＲＢ１−８−４）
プローブＲＢ１−８−４ ： ５’−ＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴ （配列番号１７）
配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図８表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１００１１， １００１２を検出するためにデザインしたプローブである。図８に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１７の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３３】
（実施例９）変異検出用プローブ（ＲＢ１−９−４）
プローブＲＢ１−９−４ ： ５’−ＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴ （配列番号１８）
配列番号１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図９表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２， １５０２３， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図９に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１８の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＴに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３４】
（実施例１０）変異検出用プローブ（２−１（１））
プローブ２−１（１） ： ５’−ＧＧＴＧＣＧＧＴＴＧＣＣＧＧＡＡＡＧ （配列番号１９）
配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１０表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， １００１１， １００１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１０に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号１９の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３５】
（実施例１１）変異検出用プローブ（２−５（１））
プローブ２−５（１） ： ５’−ＧＧＴＧＣＧＧＴＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧ （配列番号２０）
配列番号２０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１１表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１１に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２０の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３６】
（実施例１２）変異検出用プローブ（３−７（１））
プローブ３−７（１） ： ５’−ＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＧＣＧＴＣＣ （配列番号２１）
配列番号２１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１００１１， １００１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１２に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２１の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３７】
（実施例１３）変異検出用プローブ（４−１（２））
プローブ４−１（２） ： ５’−ＧＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＡＣＣＴＡＴＡＡＣ （配列番号２２）
配列番号２２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１３表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１を検出するためにデザインしたプローブである。図１３に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２１の下線を施し位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３８】
（実施例１４）変異検出用プローブ（４−４（３），４−４（４））
プローブ４−４（３） ： ５’−ＴＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＣＣ （配列番号２３）
プローブ４−４（４） ： ５’−ＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＣ （配列番号２４）
配列番号２３及び２４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図１４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０７０１１， ０７０１２を検出するためにデザインしたプローブである。これらは、いずれも等しい位置を認識するプローブであり、変異の位置も同一であるが、長さが異なる点で相違する。図１４に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２３及び２４の下線を施した位置が通常Ｃであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００３９】
（実施例１５）変異検出用プローブ（４−６（２））
プローブ４−６（２） ： ５’−ＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＡＡＣ （配列番号２５）
配列番号２５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１５に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２５の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４０】
（実施例１６）変異検出用プローブ（２−１（１））
プローブ４−７（１） ： ５’−ＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＧＣＧＣＣＣＡＴＡＡ （配列番号２６）
配列番号２６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１００１１， １００１２を検出するためにデザインしたプローブである。図１６のに示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２６の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４１】
（実施例１７）変異検出用プローブ（２−１（１））
プローブ４−８（２） ： ５’−ＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣ （配列番号２７）
配列番号２７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１７表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１２０１， １２０２１， １２０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図１７に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブでは、これらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２７の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４２】
（実施例１８）変異検出用プローブ（５−２（２））
プローブ５−２（２） ： ５’−ＴＡＣＴＴＣＣＡＴＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡ （配列番号２８）
配列番号２８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１８表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０３０１１， １２０１， １２０２１， １２０２２， １３０１１， １３０２１， １３０２２， １４０１１， １４０２， １４０３， １４０５， １４０６， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図１８に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２８の下線を施した位置が通常Ｃであるところ、人為的にＧに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４３】
（実施例１９）変異検出用プローブ（５−３（２））
プローブ５−３（２） ： ５’−ＴＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡ （配列番号２９）
配列番号２９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図１９表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０４０１１， ０４０３１， ０４０３２， ０４０４， ０４０５１， ０４０５２， ０４０６， ０４０７， ０４１０， ０４１７を検出するためにデザインしたプローブである。図２９に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号２９の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４４】
（実施例２０）変異検出用プローブ（７−１０（２），７−１０（４））
プローブ７−１０（２） ： ５’−ＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧ （配列番号３０）
プローブ７−１０（４） ： ５’−ＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＣＣＧＴＧ （配列番号３１）
配列番号３０及び３１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図２０表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２０に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３０及び３１の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４５】
（実施例２１）変異検出用プローブ（８−１（２），８−１（４））
プローブ８−１（２） ： ５’−ＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴ （配列番号３２）
プローブ８−１（４） ： ５’−ＡＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＧ （配列番号３３）
配列番号３２及び３３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図２１表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， ０４０６を検出するためにデザインしたプローブである。図２１に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブでは、これらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４６】
（実施例２２）変異検出用プローブ（８−２（２））
プローブ８−２（２） ： ５’−ＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧ （配列番号３４）
配列番号３４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０３０１１， １３０１１， １３０２１， １３０２２，１４０２， １４０３， １４０６を検出するためにデザインしたプローブである。図２２に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３４の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４７】
（実施例２３）変異検出用プローブ（８−６（２））
プローブ８−６（２） ： ５’−ＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴ （配列番号３５）
配列番号３５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２３表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０７０１１， ０７０１２， １４０１１， １４０５， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図２３に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３５の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４８】
（実施例２４）変異検出用プローブ（２−１（１））
プローブ８−９（２） ： ５’−ＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＧＣＴ （配列番号３６）
配列番号３６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１２０１， １２０２１， １２０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２４に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３６の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００４９】
（実施例２５）変異検出用プローブ（８ａ−１（２））
プローブ８ａ−１（２） ： ５’−ＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧ （配列番号３７）
配列番号３７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， ０４０６， １５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２， １５０２３， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２５に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３７の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５０】
（実施例２６）変異検出用プローブ（１２−１（２））
プローブ１２−１（２） ： ５’−ＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡ （配列番号３８）
配列番号３８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， ０３０１１， ０４０１１， ０４０１２， ０４０３１， ０４０４， ０４０６， ０４０７， ０８０２１， ０８０２２， １００１１， １００１２， １３０１１， １３０２１， １３０２２， １４０２， １４０３， １４０６， １５０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２６に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３８の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５１】
（実施例２７）変異検出用プローブ（１２−２（２））
プローブ１２−２（２） ： ５’−ＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡ （配列番号３９）
配列番号３９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２７表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０４０３２， １５０１１， １５０１２， １５０２１，１５０２３， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図２７に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号３９の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５２】
（実施例２８）変異検出用プローブ（１２−３（２））
プローブ１２−３（２） ： ５’−ＧＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＡ （配列番号４０）
配列番号４０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図２８表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０４０５１， ０４０５２， ０４１０， ０４１７， ０８０３２を検出するためにデザインしたプローブである。図２８に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４０の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５３】
（実施例２９）変異検出用プローブ（１３−５（２），１３−５（４））
プローブ１３−５（２） ： ５’−ＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡ （配列番号４１）
プローブ１３−５（４） ： ５’−ＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＴＧＧＡ （配列番号４２）
配列番号４１及び４２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図２９表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１１０１１を検出するためにデザインしたプローブである。図２９に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４１の下線を施した位置が通常Ｇであるところに人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブ及び配列番号４２の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５４】
（実施例３０）変異検出用プローブ（１３−６（１），１３−６（２））
プローブ１３−６（１） ： ５’−ＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧ （配列番号４３）
プローブ１３−６（２） ： ５’−ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧＡ （配列番号４４）
配列番号４３及び４４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図３０表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１４０１１， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図３０に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４３及び４４の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５５】
（実施例３１）変異検出用プローブ（１５−４（３））
プローブ１５−４（３） ： ５’−ＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣ （配列番号４５）
配列番号４５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３１表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０８０３２， １２０１， １３０１１， １３０２１， １３０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図３１に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４５の下線を施した位置が通常Ｃであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５６】
（実施例３２）変異検出用プローブ（１５−５（２），１５−５（４））
プローブ１５−５（２） ： ５’−ＧＡＡＧＧＡＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＧ （配列番号４６）
プローブ１５−５（４） ： ５’−ＡＧＧＡＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡ （配列番号４７）
配列番号４６及び４７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図３２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図３２に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４６及び４７の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５７】
（実施例３３）変異検出用プローブ（１７−１０（１），１７−１０（２））
プローブ１７−１０（１） ： ５’−ＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＧＣ （配列番号４８）
プローブ１７−１０（２） ： ５’−ＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＧＣ （配列番号４９）
配列番号４８及び４９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、いずれも図３３表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１３０１１， １３０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図３３に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号４８の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブ、及び配列番号４９の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５８】
（実施例３４）変異検出用プローブ（１７−１２（１））
プローブ１７−１２（１） ： ５’−ＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＣＧＧＧＣ （配列番号５０）
配列番号５０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２，１５０２３を検出するためにデザインしたプローブである。図３４に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５０の下線を施した位置が通常Ａであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００５９】
（実施例３５）変異検出用プローブ（１８−１１（１））
プローブ１８−１１（１） ： ５’−ＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＣＣＧ （配列番号５１）
配列番号５１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１３０１１， １３０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図３５に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５１の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６０】
（実施例３６）変異検出用プローブ（１８−１３（１））
プローブ１８−１３（１） ： ５’−ＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧ （配列番号５２）
配列番号５２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１５０１１， １５０１２， １５０２１， １５０２２，１５０２３を検出するためにデザインしたプローブである。図３６に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＣに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６１】
（実施例３７）変異検出用プローブ（１８ａ−２（１））
プローブ１８ａ−２（１） ： ５’−ＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＧＧＴＧ （配列番号５３）
配列番号５３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３７表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０３０１１を検出するためにデザインしたプローブである。図３７に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６２】
（実施例３８）変異検出用プローブ（１８ａ−６（１））
プローブ１８ａ−６（１） ： ５’−ＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧ （配列番号５４）
配列番号５４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３８表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０８０２１， ０８０２２， ０８０３２， １４０３を検出するためにデザインしたプローブである。図３８に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６３】
（実施例３９）変異検出用プローブ（１８ａ−１０（１））
プローブ１８ａ−１０（１）： ５’−ＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧ （配列番号５５）
配列番号５５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図３９表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１１０１１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図３９に示す配列は、下線を施した箇所において、表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブでは、これらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５５の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６４】
（実施例４０）変異検出用プローブ（１８ａ−１１（１））
プローブ１８ａ−１１（１）： ５’−ＧＡＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧ （配列番号５６）
配列番号５６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４０表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１２０１， １２０２１， １２０２２， １６０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図４０に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５６の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６５】
（実施例４１）変異検出用プローブ（１８ａ−１２（１））
プローブ１８ａ−１２（１）： ５’−ＧＡＣＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧ （配列番号５７）
配列番号５７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４１表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１３０１１， １３０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図４１に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５７の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６６】
（実施例４２）変異検出用プローブ（１９−５（１））
プローブ１９−５（１） ： ５’−ＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣ （配列番号５８）
配列番号５８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４２表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０８０２１， ０８０２２， ０８０３２， １４０３を検出するためにデザインしたプローブである。図４２に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５８の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６７】
（実施例４３）変異検出用プローブ（１９−７（１））
プローブ１９−７（１） ： ５’−ＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣ （配列番号５９）
配列番号５９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４３表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１００１２， １２０１， １２０２１， １２０２２， １３０２２， １６０２１を検出するためにデザインしたプローブである。図４３に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号５９の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６８】
（実施例４４）変異検出用プローブ（２０−２（２））
プローブ２０−２（２） ： ５’−ＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＣＡ （配列番号６０）
配列番号６０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４４表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０７０１１， ０７０１２， ０９０１２を検出するためにデザインしたプローブである。図４４に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号６０の下線を施した位置が通常Ｔであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００６９】
（実施例４５）変異検出用プローブ（２０−３（２））
プローブ２０−３（２） ： ５’−ＧＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡ （配列番号６１）
配列番号６１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４５表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊１２０１， １２０２１， １４０１１， １４０５， １４０７を検出するためにデザインしたプローブである。図４５に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号６１の下線を施した位置が通常Ｃであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００７０】
（実施例４６）変異検出用プローブ（２２−１（１））
プローブ２２−１（１） ： ５’−ＣＧＧＧＧＴＴＧＧＴＡＡＧＡＧＣＴＴ （配列番号６２）
配列番号６２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブである。本プローブは、図４６表中右上に示す遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１， ０４０１１， ０４０１２， ０４０５１， ０４０５２， ０４０７， ０４１７， ０７０１１， ０７０１２， ０８０２１， ０８０２２， ０８０３２， ０９０１２， １００１１， １００１２， １１０１１， １３０２１， 、１３０２２， １４０２， １４０３， １４０７， １５０２１， １５０２２， １５０２３， １６０２１， １６０２２を検出するためにデザインしたプローブである。図４６に示す配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示すが、通常のプローブではこれらのアリル変異体も検出してしまう可能性がある。そこで、配列番号６２の下線を施した位置が通常Ｇであるところ、人為的にＡに変異させ、ミスマッチ部分を有するプローブを構築した。
【００７１】
（実験例１）
実施例１に示す各プローブの効果を以下に従い確認した。
１）材料及び方法
ａ） 試薬：
ＴＥ
トレハロース ２０％（ｗ／ｖ）
１０ × Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ （宝酒造製）
Ｅｘ Ｔａｑ ポリメラーゼ（宝酒造製）
ｄＮＴＰｓ （宝酒造製） ２．５ｍＭ
２０ × ＳＳＰＥ （ｐＨ７．４）
ＳＤＳ ５％
ｂ） 標的核酸：
ＤＲＢ１＊アリル（０１０１， ０４０５１， ０８０２２， １１０１１， １２０１， １３０１１）
【００７２】
ｃ） オリゴアレイの作成
まず、５’末端をチオール化修飾したオリゴヌクレオチドプローブ（日本バイオサービス社製）を、２０μＭとなるように１０％（ｗ／ｖ）トレハロース／ＴＥ溶液に溶解した。この溶液をスポッティング溶液として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ（宝酒造製）を用いてＥＭＣＳコートスライドグラスにスポットした。室温で一晩静置した後、２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＰＢＳ溶液を加え、室温で３時間ブロッキングした。その後、流水洗浄し、風乾し、オリゴアレイとした。
【００７３】
ｄ） ハイブリダイゼーション用の試料（標的核酸）をＰＣＲにて調製した。クローン化したＤＲＢ１＊アリル（プラスミドＤＮＡ）を鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし、次の条件でＰＣＲを行った。
【００７４】
ＰＣＲ用プライマー：
ＤＲ−Ｆ１ ： ５’− ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧ（配列番号６３）
ＤＲ−Ｒ１（Ｃｙ５） ： ５’− ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ （配列番号６４）
混合割合：
１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ
ＭｇＣｌ２ （２５ｍＭ） ８μＬ
ｄＮＴＰｓ （２．５ｍＭ） ８μＬ
ＤＲ−Ｆ１ （１０μＭ） ０．５μＬ
ＤＲ−Ｒ１（Ｃｙ５）（１０μＭ） ５μＬ
Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
鋳型 １μＬ
Ｈ２Ｏ １００μＬ
条件：
９４℃５分
９４℃２０秒、５９℃２０秒、７２℃２０秒を４０サイクル
７２℃７分
その後４℃
【００７５】
ｅ） ハイブリダイゼーション
以下の条件で、標的核酸と各プローブとのハイブリダイゼーションを行った。
２０×ＳＳＰＥ ４５μＬ
５ ％ ＳＤＳ １５μＬ
ＰＣＲ産物（標的核酸） ５０μＬ
Ｈ２Ｏ ４０μＬ
９５℃で５分間加温後、直接オリゴアレイ上に添加した。
その後、４５℃で２時間加温し、２×ＳＳＰＥ （４５℃）で６回洗浄した。
【００７６】
ｆ） 解析方法
ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いてスライドをスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏソフトウェアを用いてシグナル強度を測定した。
【００７７】
２）配列比較
まず、日本人集団に見られるＤＲＢ１＊アリルを１０−１（１）プローブ（配列番号１）と完全マッチする群（ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａ）、及び１０−２（１）プローブ（配列番号５）と完全マッチする群（ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂ）に分けた（表１）。
上記のうち、遺伝子型ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５１、ＤＲＢ１＊０８０２２、ＤＲＢ１＊１１０１１のｅｘｏｎ２の配列の一部を比較したものを図１に示した。
【００７８】
【表１】
３）各プローブとの反応性比較
配列番号１〜１０に表される各オリゴヌクレオチドプローブを、スライドグラス上に固定化したオリゴアレイを用いて、各アリルとの反応性を検討した。各プローブと各アリルとの反応の強さ、及び、ＤＲＢ１＊遺伝群ＡとＢに対する反応性の比を結果を表２に示した。
【００８０】
【表２】
オリゴプローブ１０−１（１）（配列番号１）に対する反応についてみてみると、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに属するアリル（ＤＲＢ１＊０１０１， ＊０４０５１， ＊０８０２２）の反応性の強さは、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに属するアリル（ＤＲＢ１＊１１０１１）の反応性の強さの１．６倍〜１．８倍であった。同様に、プローブ１０−２（１）（配列番号５）に対しては、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ｂに属するアリルの方が、ＤＲＢ１＊遺伝子群Ａに属するアリルよりも１．７倍〜２．０倍強く反応した。しかしながら、（１０−１（２）〜１０−１（５）（配列番号２〜４）及び１０−２（２）〜１０−２（５）（配列番号６〜１０））に示すようにプローブに１塩基の変異を導入することによって、ＤＲＢ１＊遺伝子群ＡとＢに対する反応性の比が約６倍〜１３倍に増大した。
【００８２】
（実験例２）
本実施例２〜４６に示す配列番号１１〜６２に示す塩基配列を有するプローブの効果を確認した。
１）材料及び方法は、次に示す事項の他は、実験例１に従った。
遺伝子型ＤＲＢ１＊アリル
（＊０１０１， ＊０３０１， ＊０４０３， ＊０４０５， ＊０４０６， ＊０４１０， ＊０７０１， ＊０８０２， ＊０８０３， ＊０９０１， ＊１００１， ＊１１０１， ＊１２０１， ＊１２０２， ＊１３０１， ＊１３０２， ＊１４０１， ＊１４０５， ＊１４０６， ＊１５０１， ＊１５０２， ＊１６０２）
２）配列比較
図２〜４６に、各プローブ及び標的核酸の配列比較を示した。表中最上段の配列は、検出すべき核酸配列を示した。表中２段目以降の配列は、下線を施した箇所において表中最上に示す配列とは相違するアリル変異体を示す。
【００８３】
３）各プローブとの反応性比較
表３に、各部ローブと各遺伝子型ＤＲＢ１＊アリルとの反応値を示した。強い陽性反応を示した部分を表中、太線及び下線を施して示した。その結果、非特異的な反応が抑えられ、特異的な変異体の検出が確認された。
【００８４】
【発明の効果】
上記説明したように、本発明のプローブを用いると、ＨＬＡのＤＲＢ１＊の特定領域における遺伝子変異の検出を容易に行うことができる。
【００８５】
【表３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＲＢ１＊アリルのｅｘｏｎ ２（一部）の配列比較を示す図である。（実施例１）
【符号の説明】図１の↓：ＤＲＢ１＊遺伝子群ＡとＢで塩基が異なる位置を示す。
（アデニン又はチミン）
図１の下線部分はプローブの位置を示す。
【図２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２）
【図３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３）
【図４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４）
【図５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例５）
【図６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例６）
【図７】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例７）
【図８】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例８）
【図９】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例９）
【図１０】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１０）
【図１１】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１１）
【図１２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１２）
【図１３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１３）
【図１４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１４）
【図１５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１５）
【図１６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１６）
【図１７】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１７）
【図１８】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１８）
【図１９】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例１９）
【図２０】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２０）
【図２１】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２１）
【図２２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２２）
【図２３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２３）
【図２４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２４）
【図２５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２５）
【図２６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２６）
【図２７】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２７）
【図２８】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２８）
【図２９】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例２９）
【図３０】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３０）
【図３１】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３１）
【図３２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３２）
【図３３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３３）
【図３４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３４）
【図３５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３５）
【図３６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３６）
【図３７】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３７）
【図３８】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３８）
【図３９】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例３９）
【図４０】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４０）
【図４１】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４１）
【図４２】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４２）
【図４３】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４３）
【図４４】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４４）
【図４５】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４５）
【図４６】検出用プローブ及び関連するアリル変異体を示す図である。（実施例４６）
【図４７】アリル変異体に特異的なプローブの位置を示す図である。（実施例２〜４６）
【図４８】アリル変異体に特異的なプローブの位置を示す図である。（実施例２〜４６）
Claims (6)
- オリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズさせて遺伝子多型を検出する方法において使用する以下の群より選択されるオリゴヌクレオチドを含むプローブ；
１）標的核酸と相補的な核酸配列を有する塩基配列であって、標的核酸に対しては少なくとも１以上のミスマッチ（人為的ミスマッチ）を有し、さらに標的核酸のアリル変異体の核酸配列に対しては前記人為的ミスマッチの他に少なくとも１以上のミスマッチ（本来のミスマッチ）を有するオリゴヌクレオチドであって、人為的ミスマッチ及び本来のミスマッチが異なる塩基位置にあり、配列番号２〜５又は７〜６２のいずれか１に表される配列からなるオリゴヌクレオチド。
２）前記１）に記載の本来のミスマッチ位置と人為的ミスマッチの位置の間に、０〜１５個のいずれかからなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオチゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、プローブ機能を有するオリゴヌクレオチド。 - 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブを使用することを特徴とする遺伝子変異検出方法。
- 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブから少なくとも２以上のプローブを選択し、組み合わせて使用することを特徴とする遺伝子変異検出方法。
- 遺伝子変異の検出が、変異特異遺伝子増幅方法、変異特異ＤＮＡシークエンシング、変異特異ＤＮＡチップ又はインベーダアッセイ法である請求項３に記載の検出方法。
- 請求項１に記載のプローブを含む遺伝子変異検出用試薬。
- 請求項２〜４のいずれか１に記載の方法に使用する遺伝子変異検出用試薬を含む遺伝子変異検出キット。
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