JP2010500867A - 核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の材料および方法を開示、記載する前に、本明細書で使用する用語が特定の形態のみを記載することを目的としており、何らの制限を設けることも意図していないことが理解されるべきである。本明細書および添付する請求の範囲で使用する場合、「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という単数形には、他に明確に記載のない限り、複数の指示対象も含まれることに留意すべきである。本明細書における数値範囲の記載については、各数値間にある各数値も同様の正確さを有することは明確に意図されている。例えば、6〜9の範囲であれば、6および9に加えて、7および8の数値も意図されており、6.0〜7.0の範囲であれば、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9および7.0の数値も明確に意図される。
本明細書で用いられる「動物」は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、ならびにマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、類人猿およびヒト等の哺乳類を意味する場合がある。
本明細書で用いられる「anti−RNA」とは、例えばpri−miRNA、pre−miRNA、miRNAもしくはmiRNA*に結合すること(例えば、アンチセンスまたはRNAサイレンシング)、または標的結合部位に結合することにより、miRNAまたはmiRNA*の活性を阻害することができるRNAである。anti−miRNAは、合計5〜100個または10〜60個のヌクレオチドを含むことができる。また、anti−miRNAは、少なくとも合計5〜40個のヌクレオチドを含むことができる。anti−miRNAの配列は、(a)miRNAに結合してその活性を抑制する目的で、miRNAの5’側に実質的に相補的な少なくとも5個のヌクレオチド、およびmiRNAの5’末端の標的部位の隣接領域と実質的に同一な少なくとも5〜12個のヌクレオチド、または(b)miRNAが標的に結合する能力を阻害する目的で、miRNAの3’側と実質的に同一な少なくとも5〜12個のヌクレオチド、およびmiRNAの3’末端の標的部位の隣接領域と実質的に相補的な少なくとも5個のヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で用いられる、プローブまたは固相担体に関する「付着」または「固定化」は、プローブと固相担体との間の結合が、結合、洗浄、解析および除去の条件下で十分に安定であることを意味する場合がある。前記結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。共有結合は、プローブと固相担体との間に直接形成されてもよく、架橋剤または固相担体もしくはプローブのいずれか、またはその両方の分子上に特定の反応基を含ませることにより形成することができる。非共有結合は、静電的相互作用、親水性相互作用および疎水性相互作用の1種以上であってもよい。非共有結合には、ストレプトアビジン等の分子の担体への共有結合、およびビオチン標識プローブのストレプトアビジンへの非共有的結合が含まれる。固定化には、共有結合相互作用と非共有結合相互作用との組合せも含むことができる。
本明細書で用いられる「生体試料」とは、核酸を含む生体組織または体液の試料を意味する場合がある。このような試料には、これらに限定されないが、動物から単離された組織または体液が含まれる。生体試料は、生検試料および剖検試料等の組織切片、組織学的目的で採取された冷凍切片、毛髪および皮膚も含むことができる。生体試料には、動物組織もしくは患者組織由来の外植片、ならびに初代培養細胞および/または形質転換培養細胞も含まれる。生体試料は、血液、血液画分、血漿、血清、尿、胸水、粘液、腹水、羊水、大便、涙、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、胸部からの分泌物、株化細胞または組織試料であってもよい。生体試料は、動物から細胞試料を取り出すことにより提供される得るが、既に単離された(例えば、別の人物により、別の時間に、および/または別の目的で単離された)細胞を用いること、または本明細書に記載する方法をin vivoで行うことによっても得ることができる。処置された、または転帰歴を有する組織等の保存用組織(例えば、ホルマリン固定されてパラフィン包埋された(FFPE)組織)を用いることもできる。
本明細書で用いられる、核酸に関する「相補」または「相補的」とは、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間でのWatson−Crick塩基対(例えば、A−T/UおよびC−G)またはHoogsteenの塩基対を意味する場合がある。
「検出」とは、試料中のある成分の存在を検出することを意味する場合がある。また、検出とは、ある成分が存在しないことを検出することを意味する場合もある。また、検出とは、ある成分のレベルを、定量的または定性的に測定することを意味する場合もある。
「差次的発現」とは、細胞内および組織内、ならびに細胞間および組織間における、時間的遺伝子発現パターンおよび/または細胞内遺伝子発現パターンの定性的差異または定量的差異を意味する場合がある。したがって、差次的に発現する遺伝子は、例えば正常組織対疾患組織の比較で、活性化または不活性化のようにその発現が定性的に異なりうる。遺伝子は、他の状態と比べて、ある状態において発現がオンまたはオフになることができ、2以上の状態を比較することが可能となる。定性的に制御された遺伝子は、ある状態または細胞種の範囲内で発現パターンを示すことができ、これは標準的技術により検出することができる。ある遺伝子は、ある状態またはある細胞種で発現するが、両方では発現されない場合がある。また、例えば、発現増加して転写産物量が増大したり、発現減少して転写産物量が減少したりするように発現調節されて、発現の差異が定量性を示す場合もある。発現の差異の程度は、発現アレイ、定量的逆転写酵素PCR、ノーザン解析、リアルタイムPCR、およびRNase保護等の標準的な評価技術により定量できる程度であればよい。
本明細書で用いられる「遺伝子」とは、転写制御配列および/または翻訳制御配列、および/または翻訳領域、および/または非翻訳配列(例えば、イントロン、5’および3’非翻訳配列)を含む天然遺伝子(例えば、ゲノム)または合成遺伝子であってもよい。遺伝子の翻訳領域は、アミノ酸配列またはtRNA、rRNA、触媒RNA(catalytic RNA)、siRNA、miRNA、アンチセンスRNA等の機能的RNAをコードするヌクレオチド配列であってもよい。遺伝子は、任意に5’もしくは3’非翻訳配列を連結した形で含む、翻訳領域(例えば、エクソンやmiRNA)に相当するmRNAまたはcDNAであってもよい。遺伝子は、in vitroで生成され、翻訳領域および/またはこれに連結した5’もしくは3’非翻訳配列の全部または一部を含む、増幅された核酸分子であってもよい。
「グルーブバインダー(groove binder)」および/または「マイナーグルーブバインダー(minor groove binder)」は互換性を持って使用することができ、二本鎖DNAの副溝に、通常は配列特異的に適合する低分子を指す。マイナーグルーブバインダーは、半月状の形状をとることができる長く平らな分子であってもよく、しばしば水分子と置換して、二重螺旋の副溝にちょうど適合する。マイナーグルーブバインダー分子は、通常、フラン環、ベンゼン環またはピロール環等のねじれの無い結合により連結された複数の芳香族環を含むことができる。マイナーグルーブバインダーは、ネトロプシン、ジスタマイシン、ベレニル(berenil)、ペンタミジン、およびその他の芳香族ジアミジン等の抗生物質、Hoechst 33258、SN 6999、クロモマイシンおよびミトラマイシン等のオーレオリン系抗腫瘍薬、CC−1065、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド(DPI3)、1,2−ジヒドロ−(3H)−ピロロ[3,2−e]インドール−7−カルボキシレート(CDPI3)、ならびにその内容が参照により本明細書に組み込まれているNucleic Acids in Chemistry and Biology, 2d ed., Blackburn and Gait, eds., Oxford University Press, 1996およびPCT国際公開公報03/078450に記載されるような関連化合物および類似体であってもよい。マイナーグルーブバインダーは、プライマー、プローブ、ハイブリダイゼーションタグ相補体、またはこれらの組合せの成分であってもよい。マイナーグルーブバインダーは、結合するプライマーまたはプローブのTmを上昇させるので、これらのプライマーおよびプローブを高温でも効果的にハイブリダイズさせることができる。
本明細書において、二以上の核酸またはポリペプチド配列の関係における「同一」または「同一性」は、これらの配列が、特定の領域において同一である残基を特定の割合で有することを意味する場合がある。この割合は、2つの配列を最適な状態でアライメントし、特定の領域における2つの配列を比較して、両配列間で同一の残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得て、一致した位置の数をその特定の領域中の位置の合計数で割って、得られた値に100を掛けることで配列同一性の割合を得ることができる。2つの配列が異なる長さであるかまたはアライメントによって1以上の突出末端が生じて、比較される特定領域にたった1つの配列のみが含まれる場合は、前記1つの配列の残基は、計算では分母には含められるが分子には含められない。DNAとRNAを比較する場合、チミン(T)とウラシル(U)とは等価なものとして考慮されることができる。同一性は、手作業、またはBLASTもしくはBLAST 2.0等のコンピューターによる配列アルゴリズムを使用することにより決定することができる。
本明細書で用いられる「標識」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段または他の物理学的手段により検出可能な組成物を意味する場合がある。例えば、有用な標識には、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAで通常用いられるようなもの)、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン、およびその他の検出可能な物質が挙げられる。標識は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,541,618号に記載されるようなフルオロフォアであってもよい。標識は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,541,618号に記載されるような、別の標識の近傍に存在する場合に他の標識の検出可能なシグナル量を低下させるクエンチャー分子であってもよい。標識は、核酸およびタンパク質にいずれの位置で挿入されてもよい。
本明細書で用いられる「miRNA」は、mRNA配列を阻害可能なRNA配列を意味する場合がある。miRNAは、miRNA*またはその変異体を含むことができる。miRNA配列は、13〜33個、18〜24個または21〜23個のヌクレオチドを含むことができる。miRNAは、少なくとも合計5〜40個のヌクレオチドを含むことができる。miRNAの配列は、pre−miRNAの最初の13〜33個のヌクレオチドであってもよい。miRNAの配列は、pre−miRNAの最後の13〜33個のヌクレオチドであってもよい。miRNAの配列は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第11/384,049号、第11/418,870号または第11/429,720号に開示されるmiRNAの配列またはその変異体を含むことができる。
本明細書で用いられる「核酸」、「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、相互に共有結合で連結された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する場合がある。一本鎖の記載により、相補鎖の配列も定義されることになる。したがって、核酸には、記載された一本鎖の相補鎖も含まれる。核酸の多くの変異体を、任意の核酸と同一の目的に用いることができる。したがって、核酸には、実質的に同一な核酸およびこれに相補的な核酸も含むことができる。一本鎖からはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズすることができるプローブが提供される。したがって、核酸には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも含まれる。
本明細書で用いられる「pre−mRNA」とは、miRNAおよびmiRNA*を含むmRNA配列を意味する場合がある。pre−miRNA配列は、45〜90個、60〜80個または60〜70個のヌクレオチドから構成することができる。pre−miRNAの配列は、pri−miRNAの5’末端および3’末端から0〜160個のヌクレオチドを除いたpri−miRNAの配列であってもよい。pre−miRNAの配列は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第11/384,049号、第11/418,870号または第11/429,720号に開示されるpre−miRNAの配列の配列またはその変異体を含むことができる。
本明細書で用いられる「pri−mRNA」は、pre−miRNA、miRNAおよびmiRNA*を含むmRNA配列を意味する。pri−miRNAの配列は、その変異体を含むことができる。pri−miRNAの配列は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第11/384,049号、第11/418,870号または第11/429,720号に開示されるpri−miRNA配列またはその変異体を含むことができる。pri−miRNA配列は、45〜30,000個、50〜25,000個、100〜20,000個、1,000〜1,500個または80〜100個のヌクレオチドから構成されることができる。
本明細書で用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、第1の核酸配列(例えば、プローブ)が、第2の核酸配列(例えば、標的)に対して、例えば核酸の複合混合物の状態でハイブリダイズする条件を意味する場合がある。ストリンジェントな条件とは、配列に依存しており、状況に応じて異なるものである。ストリンジェント条件は、所定のイオン強度pHにおける特定の配列の熱融解点(Tm)よりも約5〜10℃低い温度になるよう選択することができる。Tmは、標的に相補的なプローブのうち50%が、平衡状態(標的配列が過剰量に存在する場合、Tmでは、50%のプローブが平衡状態を保っている)で標的配列にハイブリダイズする温度(所定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下)であってもよい。ストリンジェントな状態は、pH 7.0〜8.3において塩濃度がナトリウムイオン約1.0 M未満、例えば約0.01〜1.0 Mのナトリウムイオン濃度(または他の塩)であり、温度が、短いプローブ(例えば、約10〜50個のヌクレオチド)では少なくとも約30℃、長いプローブ(例えば、約50個のヌクレオチドを超える長さ)では少なくとも約60℃である条件であってもよい。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加により得ることができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性のシグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションに対して、少なくとも2〜10倍の強さであってもよい。典型的なストリンジェント条件には、以下が含まれる:50% ホルムアミド、5×SSC、および1% SDS、42℃でのインキュベーション、または、5x SSC、1% SDS、65℃でのインキュベーション、ならびに0.2×SSCおよび0.1% SDS中で65℃での洗浄。
本明細書で用いられる「実質的に相補的」とは、第1の配列が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20〜40、40〜60、60〜100個またはこれを超えるヌクレオチドからなる領域において、第2の配列の相補鎖と少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%の同一性を有するか、または、2つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する場合がある。
本明細書で用いられる「実質的に同一」とは、第1の配列と第2の配列が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20〜40、40〜60、60〜100個もしくはこれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸からなる領域において、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%の同一性を有するか、または、核酸の場合、第1の配列が、第2の配列の相補鎖と実質的に相補的であるかどうかを意味する場合がある。
本明細書で用いられる「標的核酸」とは、別の核酸により結合すうることができる酸またはその変異体を意味する場合がある。標的核酸は、DNA配列であってもよい。標的核酸は、RNAであってもよい。標的核酸は、mRNA、tRNA、shRNA、siRNAもしくはPiwi−相互作用RNA、pri−miRNA、pre−miRNA、miRNA、またはanti−miRNAを含むことができる。標的核酸は、標的miRNA結合部位またはその変異体を含むことができる。1以上のプローブが標的核酸に結合してもよい。標的結合部位は、5〜100個または10〜60個のヌクレオチドを含むことができる。標的結合部位は、合計で5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30〜40、40〜50、50〜60、61、62または63個のヌクレオチドを含むことができる。標的部位の配列は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第11/384,049号、第11/418,870号または第11/429,720号に開示される標的miRNA結合部位の配列のうち少なくとも5ヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で用いられる「変異体」とは、核酸に関するものであり、(i)基準となるヌクレオチド配列の一部;(ii)基準となるヌクレオチド配列の相補体またはその一部の相補体;(iii)基準となる核酸またはその相補体に実質的に同一な核酸;または(iv)基準となる核酸、その相補体、またはこれらと実質的に同一な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する場合がある。
本明細書においてはプローブも提供される。プローブは、核酸を含むことができる。プローブは、8〜500、10〜100または20〜60ヌクレオチドの長さを有していてもよい。プローブは、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280または300ヌクレオチドの長さを有していてもよい。プローブは、18〜25個のヌクレオチドからなる核酸を含むことができる。
プローブは、さらにリンカーを含むことができる。リンカーは、長さ10〜60ヌクレオチドであってもよい。リンカーは、長さ20〜27ヌクレオチドであってもよい。リンカーは、プローブが合計で長さ45〜60ヌクレオチドとなるのに十分な長さを有していてもよい。リンカーは、安定な二次構造を形成できなくてもよく、それ自体でフォールディングできなくてもよく、またはプローブに含まれる核酸の非リンカー部分でフォールディングできなくてもよい。リンカーの配列は、プローブの非リンカー核酸が由来する動物のゲノム中に存在していなくてもよい。リンカーは、表2に示す配列(配列番号:20952〜21063)から選択できる。
表2 リンカー配列
プローブは、テストプローブであってもよい。テストプローブは、miRNA、miRNA*、pre−miRNAまたはpri−miRNAに相補的な核酸配列を含むことができる。テストプローブの配列は、表3に示す配列(配列番号:1〜4167)から選択できる。
プローブは、ネガティブプローブであってもよい。ネガティブプローブは、生体試料中に存在しない核酸配列を含んでいてもよい。ネガティブプローブは、miRNA*に相補的であってもよい。ネガティブプローブの配列は、表4に示す配列(配列番号:20863〜20925)から選択できる。
表4 ネガティブコントロールプローブ
プローブは、ポジティブプローブであってもよい。ポジティブプローブは、低分子RNAに相補的であってもよい。低分子RNAは、哺乳動物細胞等の動物細胞内に存在していてもよい。低分子RNAは、200ヌクレオチド未満の長さを有する。低分子RNAは、リボソームRNAでもよい。核酸の配列は、表5の配列(配列番号:20926〜20937)から選択できる。
表5 ポジティブコントロールプローブ
プローブは、スパイクプローブであってもよい。スパイクプローブは、ゲノム中の20〜100個の連続するヌクレオチド(例えば、60個)に相補的ではない配列を含むことができる。前記ゲノムは、動物ゲノムであってもウィルスゲノムであってもよい。動物は、ヒト、マウスまたはラットであってもよい。スパイクプローブの配列は、表6に挙げられいる配列(配列番号:20938〜20951)から選択できる。
表6 スパイクプローブ
バイオチップも提供される。バイオチップは、本明細書に記載する1つのプローブまたは複数のプローブが付着した固相担体を含むことができる。プローブは、ストリンジェントな条件下で標的配列にハイブリダイズ可能である。プローブは、担体上の空間的に定められた位置に付着することができる。標的配列1つ当たり、オーバーラップするプローブ、または特定の標的配列の別の部分に対するプローブ等の1以上のプローブを用いてもよい。プローブは、単一の疾患と関連する標的配列にハイブリダイズ可能なものであってもよい。バイオチップは、ネガティブプローブ、ポジティブプローブ、スパイクプローブ、テストプローブ、またはこれらの組合せを含むことができる。
本明細書においては、標的核酸の検出方法も提供される。図5は、この方法の略図である。この方法は、あるプローブ(以下、「プローブ」)を用いて、実質的に同一な核酸(以下、「同胞核酸」)からある標的核酸(以下、「標的核酸」)を特異的に検出および区別することを含むことができる。同胞核酸は、部位(以下、「変異部位」)において標的核酸と異なっていてもよく、前記部位はわずか1個のヌクレオチドを含むものでもよい。
標的核酸の第1の部分は、同胞核酸の第1の部分と配列が実質的に同一であり、変異部位においてわずか1ヌクレオチドだけ異なっていてもよい。標的核酸の第2の部分は、同胞核酸の第2の部分と配列が同一であってもよい。
プローブの第1の部分および標的核酸の第1の部分は相補的であってもよい。プローブの第2の部分および標的核酸の第2の部分も実質的に相補的であってもよい。
プローブの第1の部分および同胞核酸の第1の部分は、実質的に相補的であってもよい。プローブの第2の部分および同胞核酸の第2の部分は実質的に相補的であってもよい。
理論に束縛されるわけではないが、プローブの第2の部分と同胞核酸の第2の部分との間の実質的な相補性により、プローブの第1の部分と同胞核酸の第1の部分との間のミスマッチに対するプローブの感度が増加し、全体としてプローブと同胞核酸との間のハイブリダイゼーション効率が悪くなるという効果を生じることができる。反対に、プローブの第2の部分と標的核酸の第2の部分との間の実質的な相補性により、プローブの第1の部分は、相補的な標的核酸の第1の部分に、より効率的に結合できるようになる。プローブおよび同胞核酸の第1の部分間および第2の部分間の実質的な相補性により、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションと比べてプローブと同胞核酸との間のハイブリダイゼーションは全体としてより弱いものになりうる。したがって、プローブは、標的核酸(その第1の部分はプローブの第1の部分に相補的である)を特異的に検出することができ、同胞核酸から標的核酸を区別することができる。本明細書に記載する方法により、低濃度から高濃度の範囲の実質的に同一な別の核酸の多様なバックグラウンド中で標的核酸を特異的に検出することを可能にすることができる。
本明細書においては、試料中の、第1の部分および第2の部分を含む標的核酸を検出する方法が提供される。標的核酸は、アダプター配列を含むことができる。アダプター配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応において、核酸の検出および増幅に用いられることが当該技術分野においてよく知られている。
本明細書においては、標的核酸を同胞核酸から区別する、標的核酸の検出方法が提供される。同胞核酸は、第1の部分および第2の部分を含むことができる。同胞核酸の第2の部分は、標的核酸の第2の部分と同一であってもよい。同胞核酸の第1の部分は、標的核酸の第1の部分と実質的に同一であってもよい。同胞核酸の第1の部分は、変異部位を含むことができる。
標的核酸の第1部位は、変異部位を含むことができる。同胞核酸の第1の部分も、変異部位を含むことができる。変異部分は、標的核酸と同胞核酸との間で異なっていてもよい。変異部位は、実質的に同一な同胞核酸間で異なっていてもよい。変異部位は、たった1つのヌクレオチドから構成されていてもよい。標的核酸の変異部位と、その核酸の変異部位との違いは、わずか1ヌクレオチドだけであってもよい。
標的核酸と同胞核酸は、同一の遺伝子ファミリーのメンバーであってもよい。遺伝子ファミリーは、複数の遺伝子を含むことができる。これらの遺伝子は、進化学的に関連していてもよい(すなわち、祖先遺伝子を共通している)。これらの遺伝子は共通の配列モチーフおよび構造を有していてもよい。これらの遺伝子は、配列が実質的に同一であってもよい。これらの配列は、遺伝子ファミリーの遺伝子間で異なっている変異部位を含むことができる。
変異部位は、多型を含んでいてもよい。本明細書で用いられる「多型」とは、ある集団における2以上の遺伝学的に決定された選択的配列またはアレルの発生を意味する場合がある。多型は、1つのヌクレオチド(すなわち、1塩基多型またはSNP)を含むことができ、このヌクレオチドは、A、C、G、TまたはUであってもよい。多型は、小規模な挿入または欠失を含むことができる。多型は、疾患もしくは健康状態と関連しているか、またはこれらの原因となる場合がある。多型は、薬物治療等の薬剤に対する個人の応答性と関連している場合もある。多型は、遺伝子のコーディング領域もしくは非コーディング領域に認められる場合もあり、遺伝子の間の遺伝子間領域に認められる場合もある。多型は、突然変異である場合もある。突然変異は、非同義変異(すなわち、サイレント変異)であってもよく、同義変異(例えば、ミスセンス、非センスまたはノンセンス変異)であってもよい。突然変異は、遺伝子のスプライシングまたは制御に変化をもたらす場合もある。
本明細書においては、プローブが標的核酸を特異的に検出する標的核酸の検出方法が提供される。プローブは、第1の部分および第2の部分を含むことができる。プローブの第1の部分は、標的核酸の第1の部分に相補的であってもよい。プローブの第2の部分は、標的核酸の第2の部分と実質的に相補的であってもよい。プローブは、標的核酸と相補的なヌクレオチドを、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100個含むことができる。プローブは、同胞核酸にも実質的に相補的であってもよい。プローブは、同胞核酸と相補的なヌクレオチドを、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100個含むことができる。
プローブの第1の部分は、検出部位を含むことができる。検出部位は1個のヌクレオチドを含んでいてもよい。検出部位は、複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。検出部位は、標的核酸の変異部位に相補的であってもよい。検出部位は、同胞核酸の変異部位に非相補的であってもよい。検出部位は、プローブの5’末端または3’末端に位置していてもよい。例えば、検出部位は、プローブの5’末端から2、3、4、5、6、7または8塩基離れていてもよく、または検出部位は、プローブの3’末端から2、3、4、5、6、7または8塩基離れていてもよい。検出部位は、標的核酸に相補的な、8〜10個のヌクレオチドであってもよい。
プローブの第2の部分は、増感部位を含むことができる。増感部位は、標的核酸に対して非相補的であってもよい。増感部位は、同胞核酸に対して非相補的であってもよい。増感部位は、検出部位から離れた位置にあってもよい。増感部位は、プローブと同胞核酸の第1の部分との間の付加的なミスマッチに対してプローブを増感し、プローブと同胞核酸との間のハイブリダイゼーション効率が悪くなるという全体的効果を生じることができる。反対に、プローブと標的核酸との間のより効率的なハイブリダイゼーションという全体的効果のために、プローブの増感部位によってプローブの第1の部分を相補的な標的核酸の第1の部分に効率的に結合させうる。増感部位は、5’末端、3’末端またはプローブの両末端間等のいずれかの部位であって、検出部位から離れたいずれの部位に存在することができる。増感部位は、1個のヌクレオチドを含んでいてもよい。増感部位は、複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。増感部位は、1〜20個のヌクレオチドを含むことができる。増感部位は、ポリ(A)結合領域を含んでいていてもよい。ポリ(A)結合領域は、cDNAのポリ(A)に相補的であってもよい。
本明細書においては、標的核酸を特異的に検出し、バックグラウンド核酸から標的核酸を区別する方法も提供される。バックグラウンド核酸は、複数の核酸を含むことができる。バックグラウンド核酸は、同胞核酸を含むことができる。バックグラウンド核酸は、多様な非標的核酸および非同胞核酸を含むことができる。バックグラウンド核酸は、標的核酸と同一でなくても、実質的に同一でなくてもよい。
本明細書においては、標的核酸の作製方法も提供される。標的核酸は、標的核酸の第2の部分に位置するアダプター配列を含むことができる。アダプター配列を用いることで、標的核酸の第2の部分とプローブの第2の部分との間に非相補性を生じさせることができる。アダプター配列は、増感部位に非相補的な配列を含んでいてもよい。
(1)RNA抽出/ポリアデニル化
標的核酸は、RNAであってもよい。RNAの標的配列を単離および増幅する方法には、全RNAの抽出、ポリアデニル化反応および逆転写(RT)反応が含まれる。標的RNAは、mRNA、tRNA、shRNA、siRNA、Piwi−相互作用RNA、pri−miRNA、pre−miRNA、miRNA、またはanti−miRNAであってもよい。RNAは、ポリアデニル化されていてもよい。ポリアデニル化は、ポリ(A)ポリメラーゼにより行うことができる。ポリアデニル化は、ポリ(A)末端付加キットを用いて行うこともできる。ポリアデニル化は、その内容が参照により本明細書に組み込まれているShi and Chiang(Biotechniques, 2005;39(4):519−25の方法により行うこともできる。ポリアデニル化により、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240または250個のアデノシンを標的に付加することができる。
cDNAの標的配列は、標的RNAの逆転写により作製することがきる。cDNAの作製方法は、ポリアデニル化RNA、または、アダプター配列がライゲーションされたRNAの逆転写であってもよい。cDNAは、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第11/384,049号に概説される方法により合成することができる。
逆転写の前に、RNAをアダプター配列にライゲーションすることができる。ライゲーション反応は、T4 RNAリガーゼにより行い、アダプター配列をRNAの3’末端にライゲーションすることができる。次いで、アダプター配列の3’末端に相補的な配列を含むプライマーを用いて逆転写(RT)反応を行うことができる。
5’アダプター配列を含むポリ(T)プライマーを用いた逆転写(RT)反応において、ポリアデニル化RNAを用いることができる。ポリ(T)配列は、8、9、10、11、12、13または14個の連続したチミンを含むことができる。逆転写プライマーは、以下の配列のうち1つを含んでいてもよい:
5’GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTACCCGTTTTTTTTTTTTVN 3’
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTACGCGTTTTTTTTTTTTVN−3’
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN−3’
ここで、VはA、CおよびGの混合物、Nは4種類のヌクレオチド全ての混合物である。
RNAの逆転写産物は、標的核酸および5’末端配列に相補的な少なくとも15個の核酸を含む特異的なフォワードプライマー;アダプター配列の3’末端に相補的なリバースプライマー;ならびに標的核酸と相補的な少なくとも8個の核酸を含むプローブを用いたリアルタイムPCRにより増幅することができる。プローブは、アダプター配列の5’末端と部分的に相補的であってもよい。
標的核酸の増幅方法も本明細書に記載される。増幅は、PCRを含む方法により行うことができる。PCR反応の第1サイクルは、56℃、57℃、58℃、59℃または60℃のアニーリング温度を有していてもよい。第1サイクルは、1〜10サイクルを含んでいてもよい。PCR反応の残りのサイクルは、60℃で行われてもよい。残りのサイクルは、2〜40サイクルを含んでいてもよい。アニーリング温度により、PCRの感度をより高めることもできる。PCRは、より高いストリンジェンシーを有するPCR用鋳型として機能できる、より長い生成物を生成することができる。
PCR反応は、フォワードプライマーを含むことができる。フォワードプライマーは、標的核酸と同一な15、16、17、18、19、20または21個のヌクレオチドを含むことができる。
PCR反応は、リバースプライマーを含むことができる。リバースプライマーは、標的核酸に相補的なものであってもよい。リバースプライマーは、アダプター配列と相補的な配列を含んでいてもよい。アダプター配列に相補的な配列は、12〜24個のヌクレオチドを含むことができる。リバースプライマーは、5’−GCGAGCACAGAATTAATACGAC−3’の配列を含んでいてもよい。
本明細書においては、疾患または病的状態と関連する標的核酸の同定方法が提供される。標的核酸は、変異部位を含んでいてもよい。変異部位は、疾患、病的状態または体質と関連するものであってもよい。体質は、色、身長、大きさまたは素因等のいずれの同定可能な状態であってもよい。前記方法は、標的核酸をプローブと接触させることを含むことができる。コントロールと比較した、標的核酸へのプローブ結合レベルは、疾患、病的状態または体質の指標とすることができる。
診断方法も提供される。前記方法は、生体試料中の疾患関連標的核酸の差次的発現レベルを検出することを含むことができる。この試料は、患者に由来していてもよい。患者における疾患状態の診断により、予後診断と治療戦略の選択が可能になる。さらに、一時的に発現する疾患関連標的核酸を測定することにより、細胞の発生段階を分類することができる。
本明細書においては、本明細書に記載するプローブを用いてSNP等の多型を検出する遺伝子型同定方法も提供される。本明細書で用いられる「遺伝子型同定」とは、個人がゲノム中の1以上の位置に保持する遺伝子情報を決定することを意味する場合がある。例えば、遺伝子型同定には、個人が保持するいずれのアレルもしくはアリル群が単一のSNPに相当するのかを決定すること、または個人が保持するいずれのアレルもしくはアリル群が複数のSNPに相当するのかを決定することを含むことができる。遺伝子型は、個人において存在する、1以上の多型部位での対立遺伝子のアイデンティティーである場合がある。
遺伝子型同定は、疾患または健康状態に対するヒトの素因の測定のために行ってもよい。例えば、遺伝子型同定は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第7,127,355号に記載されるように用いることもできる。また、遺伝子型同定は、薬物治療または他の治療に対する個人の応答性を予測するために用いることもできる。
遺伝子型同定は、例えば、HIV、B型肝炎ウィルスまたはヒトパピローマウィルス等のウィルスゲノム中の変異の存在を検出するために行ってもよい。このような遺伝子型同定の例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,797,464号および同第6,653,081号ならびに米国特許公開公報第20050112554号および同第2005014379号に見出される。
遺伝子型同定は、細菌の抗生物質耐性等の、細菌の種類および変異を検出するために行ってもよい。例えば、遺伝子型同定は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,913,753号に記載されるようなものであってもよい。
治療薬のスクリーニング方法も提供される。前記方法は、疾患関連核酸を発現可能な病的細胞を候補治療薬と接触させること、および疾患関連標的核酸の発現プロファイルに対する薬物候補の効果を評価することを含むことができる。差次的に発現する標的核酸が同定されたら、種々のアッセイを実行することできる。試験化合物は、疾患関連核酸の遺伝子発現を調節する能力に関してスクリーニングすることができる。調節には、遺伝子発現の上昇および抑制の両方が含まれる。
細胞、組織または器官内の標的遺伝子の発現を低下させる方法も提供される。標的遺伝子の発現は、本明細書に記載する標的mRNAの1以上の結合部位に実質的に相補的な配列を含む核酸を発現させることによって減少させることができる。核酸は、miRNAまたはその変異体であってもよい。核酸は、プロセッシングを受けてmiRNAを生じることができる、pri−miRNA、pre−miRNAまたはその変異体であってもよい。発現miRNAは、標的mRNA上の実質的に相補的な結合部位にハイブリダイズし、これによってRISC介在性の遺伝子サイレンシングを活性化することができる。miRNAの過剰発現を用いた研究の例としては、その内容が参照により本明細書に組み込まれているYekta et al 2004, Science 304−594が挙げられる。当業者であれば、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,506,559号および第6,573,099号に記載されるRNAi法等の当該技術分野でよく知られるアンチセンス法により標的遺伝子の発現を阻害したり、miRNAの活性を阻害したりするために本明細書に記載する核酸を用いることもできることを理解するであろう。
細胞、組織または器官内の標的遺伝子の発現を増加させる方法も提供される。標的遺伝子の発現は、本明細書に記載するpri−miRNA、pre−miRNA、miRNAまたはその変異体に実質的に相補的な配列を含む核酸を発現させることによって増加させることができる。核酸は、anti−miRNAであってもよい。anti−miRNAは、pri−miRNA、pre−miRNAまたはmiRNAとハイブリダイズし、それによってその遺伝子抑制活性を低下させることができる。標的遺伝子中の結合部位の一部に実質的に相補的な核酸を、核酸の結合部位への結合がmiRNAの結合を阻害するように発現させることによって、標的核酸の発現を増加させることもできる。
発生障害に関連した疾患または障害の調節方法も提供される。この疾患または障害は、前立腺癌や肝癌等の癌であってもよい。一般的に、本明細書に記載する核酸分子は、前記核酸分子と少なくとも部分的に相補的な遺伝子の発現の調節剤として用いることができる。さらに、miRNA分子は、治療薬のスクリーニング方法における標的となってもよく、例えば、miRNA分子の阻害または活性化が、増殖またはアポトーシス等の細胞分化プロセスを調節してもよい。さらにまた、癌遺伝子、多剤耐性遺伝子または別の治療標的遺伝子等の標的特異性を改変するために、既存のmiRNA分子を配列改変miRNA分子の製造の出発物質として用いることもできる。さらにまた、プロセッシングされて治療関連標的に対する二本鎖siRNAを生じるよう、miRNA分子を修飾することができる。さらにまた、miRNA分子を、組織の再プログラム方法に用いることも可能であり、例えば、miRNA分子の発現によって、分化した株化細胞を異なる種類の細胞または幹細胞に形質転換させることもできる。
標的核酸またはmiRNAの検出方法には、本明細書において議論される多数の工程が含まれる。全RNAを組織から抽出する。短鎖RNA画分をYM100カラムを用いて濃縮する。低分子RNA画分は、種々の方法(例えば、ビオチン標識)により標識することができる。これと並行して、miRNAアンチセンスDNA、またはアミン修飾ロックド核酸(LNA)プローブを、EDCを用いてカルボキシル化した色コードLuminexマイクロスフェア(carboxylated color−coded Luminex microsphere)(ビーズ)に結合させることによって、各混合物が100種類のmiRNAプローブを含み、各プローブが異なる特異的な分光的特徴もしくは色を有するビーズとカップリングしたカップリングビーズ混合物を作製することができる。ビーズは、Luminexアナライザーで差次的に検出可能な、別個の100種類のセットとして調製することができる。次いで、標識miRNAはプローブ結合色素ビーズの混合物とハイブリダイズしてもよい。ハイブリダイズしたmiRNA結合ビーズ混合物はストレプトアビジン−R−フィコエリトリン色素で処理してもよい。反応は、Luminexアナライザーを用いて分析することできる。レーザーにより、各マイクロスフェア粒子ならびにmiRNAに結合したレポーター色素を同定する内部色素が励起される。各ビーズ上の色素の中間強度は、組織内の特定のRNAの発現に比例し得る。
a.化学標識
例には、miRNAのビオチン標識にPerkinElmer Micromax キットの一部を用いたULS技術が含まれる。この方法により、miRNAはその長さに沿ってビオチン標識される。この方法は、再現性を有し、強力であることがわかる。
この方法では、PerkinElmerと類似する技術でmiRNAもしくはプローブまたは標的核酸がビオチン標識されるが、感度がある程度低いことが示された。
例には、ジヌクレオチドのビオチン系物質(pCU−bio)とのライゲーションが含まれる。
a.TSA
チラミドシグナル増幅(TSA)により、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)複合体が結合した1つのビオチンから、その場でビオチンの数が増幅される。チラミドビオチン基質は、HRPにより加工され、その場で沈殿する不溶性ビオチンを生じ、適切なマイクロスフェア上にビオチンのクラスターを作り出す。
当該方法は、大量のビオチン分子が結合した分岐DNAの3DNAシステムを利用するものであり、少量の出発物質しか入手できない場合のmiRNA検出に有用である。
a.直接転写
当該方法では、RNAの直線増幅のための、ビオチン標識された転写産物が作り出される。当該方法では、標的核酸からビオチン標識された転写産物を作り出すことができる。
当該方法は、Genisphereキットを用いたmiRNA増幅を利用する。本明細書には複数の態様が記載されており、以下の非限定的な実施例により例示されている。
Luminex技術を用いた低分子RNA検査は、迅速で信頼性の高い技術であり、一度に多数の試料に対してハイスループット様式で適用できる。このシステムは、感度と特異性が高く、したがって、基礎生物学研究、診断および治療のための、miRNAまたは標的核酸の広範囲な検証およびプロファイリングに適用することができる。この技術は再現性が高いため、信頼性の高いものとなっている。
キットも提供され、このキットは、本明細書に記載する核酸の他に、以下に記載するもののいずれかもしくは全てを含むことができる:アッセイ用試薬、バッファー、プローブおよび/またはプライマー、ならびに滅菌生理食塩水または他の医薬的に許容可能なエマルジョンおよび懸濁基剤。これに加え、キットは、本明細書に記載される方法を実施するための指示(例えば、プロトコル)を含む説明書を含むことができる。
標的核酸の作製方法
以下に、miRNAから標的核酸を作製する方法を記載する。培養CHO細胞から全RNAを単離・抽出した。ポリアデニル化によりアダプター配列を作製するか、または逆転写前にアダプター配列をアダプター配列にライゲーションした。次いで、T4 RNAリガーゼによりライゲーション反応を行い、RNAの3’末端にアダプター配列をライゲーションした。
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTACCCGTTTTTTTTTTTTVN−3’(配列番号:2083
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATCGGTTTTTTTTTTTTVN−3’(配列番号:2083
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTACCCGTTTTTTTTTTVN−3’(配列番号:20853)
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATCCGTTTTTTTTTTTTVN−3’(配列番号:2085
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATCCCTTTTTTTTTTTTVN−3’(配列番号:2085
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATCCGTTTTTATTTTTTVN−3’(配列番号:2085
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN−3’(配列番号:2085
5’−GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATCCGATTTTTTTTTTTVN−3’(配列番号:2085
ここで、VはA、CおよびGの混合物であり、Nは4種類のヌクレオチド全ての混合物である。RNAの逆転写産物は、標的核酸および5’末端配列に相補的である特異的フォワードプライマーを用いたリアルタイムPCR反応により増幅した。フォワードプライマーは、配列5’−CAGTCATTTGGG−3’(配列番号:20839)または表7の「FD−P」欄に含まれる配列番号に対応する配列から選択した。
標的核酸検出用プローブ
ここでは、標的核酸検出用プローブについて記載する。5’−CCGTTTTTTTTTTTT−3’(配列番号:20845)の配列を用いてポリアデニル化cDNAに対するプローブを作製した。この配列には、標的結合領域に相補的な配列が連結されており、これによってプローブが標的核酸のアダプター配列の3’末端に部分的に相補的であることが確実となる。合成された標的結合領域には、3種類の変異があり、各変異は、標的核酸に対して1ヌクレオチドだけシフトしている。
プローブ_v1
5’−CCGTTTTTTTTTTTTAACTATAC−3’(配列番号:20846)
プローブ_v2
5’−CCGTTTTTTTTTTTTACTATACA−3’(配列番号:20847)
プローブ_v3
5’−CCGTTTTTTTTTTTTCTATACAA−3’(配列番号:20848)
プローブ_v1
5’−CCGTTTTTTTTTTTTCTACCCAC−3’(配列番号:20850)
プローブ_v2
5’−CCGTTTTTTTTTTTTACCCACAG−3’(配列番号:20851)
プローブ_v3
5’−CCGTTTTTTTTTTTTCCCACAGA−3’(配列番号:20852)
1ヌクレオチドの違いの検出:let−7a対let−7d
実施例1に記載する方法により、1ヌクレオチドだけ異なるヒトLet−7ファミリーのメンバーであるmiRNAを検出した。このファミリーの2つのメンバーの配列は、以下の通りである:
hsa−Let−7a 5’−UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU−3’(配列番号:20840)
hsa−Let−7c 5’−UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU−3’(配列番号:20841)
hsa−Let−7d 5’−AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGU−3’(配列番号:20842)
表7 Let−7aプローブによるLet−7ファミリーメンバーの検出
表8A Let−7ファミリプローブによるLet−7ファミリーメンバーの検出
表8 異なる位置にミスマッチを含むオリゴdTプライマーを用いたLet−7ファミリーメンバーの検出
実施例1および2に記載の方法と同様の方法によりリアルタイムPCRを用いてmiRNAであるmiR−99aとmiR−100との間の1ヌクレオチドの違いも検出した。miRNAの配列は以下の通りである:
miR−99a:5’−AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG−3’(配列番号:20843)
miR−100:5’−AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG−3’(配列番号:20844)
表9 hsa−miR−99aおよびhsa−miR−100の検出
標的核酸の検出感度
リアルタイムPCRの感度を試験した。miR−122a特異的プローブを用いて実施例1および2に記載する方法により、リアルタイム逆転写PCRにより、異なるRNA供給源(脳、肝臓、およびHeLa細胞またはこれらの混合物)から肝臓に特異的なmiRNAであるhsa−miR−122aを増幅した。逆転写反応1回あたりのRNAの初期量は、0.5ngの全RNAであった。脳の全RNAの量は増加したが、肝臓の全RNA量は減少した(表10に挙げられる比率に従って)。
表10 異なる供給源に由来するRNA中のmiR−122aの検出
多様なRNAバックグラウンド中の合成miR124aの検出
特定標的核酸の検出を、低濃度の標的ヌクレオチド配列が高濃度の核酸バックグラウンド中に存在する場合において行うことにより、実施例1および2に記載する方法の感度を試験した。バックグラウンドであるHeLa細胞由来の全RNA 0.05ngに対して少量の合成miR−124aを、miR−124a標的核酸配列の最終濃度が2.35×10-6 fmol〜1.16×10-9 fmolとなるように添加した。各濃度につき、5つの重複する系で試験を行った。平均CTおよび標準偏差を計算した。表11は、HeLa細胞由来のバックグラウンドRNAが、47.61CTのシグナルを与えたことを示す。高濃度においては、合成124a−RNAの量が半分に減少した場合、CTは約1増加した。バックグラウンドシグナルを超えるシグナルを与えた合成124a−RNAの最少量は、1.86×10-8 fmolである。
表11 多様なRNAバックグラウンド中の合成miR−124aの検出
ヒト血清中の異なるmiRNA標的配列の検出
次いで、実施例1および2に記載する方法を、ヒト血清中の多くのmiRNA標的配列の検出に応用した。LSバッファー(Promega社)をMirvanaキット(Ambion社)と組み合わせて用いて、3名の個人の血清試料から全RNAを抽出した。RNA精製のために、対象番号5および7から300μlの容量の血清を得て、対象番号6からは150μlの血清を得た。上記に記載する方法による各PCR反応およびハイブリダイゼーション反応には、合計で10%の精製RNAを用いた。miR標的配列に特異的なプローブを、以下の表12に示した。表12は、miR−21、hsa−miR−142−3pおよびLet−7d等の異なるマイクロRNAが、血清試料中で特異的に検出可能であったことを示す。表12からは、ヒト血清等の生体液から種々のmiRNA標的配列を、抽出、単離および検出することが可能なことが示唆される。
表12 ヒト血清中の異なるマイクロRNA標的配列の検出
ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織中の異なるmiRNA標的配列の検出
膀胱、前立腺および大腸転移を有する肝臓由来のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織からRNAを単離した。
表13 (FFPE)組織中の異なるマイクロRNA標的配列の検出
羊水中の異なるmiRNA標的配列の検出
帝王切開手術中に20mlの羊水(非胎便性)を2本の15ml試験管に回収した。4℃、1000gで10分間遠心分離を行って細胞を回収した。上清を回収してエッペンドルフチューブに400μlの容量で分注し、−80℃で冷凍した。細胞ペレットをPBSで再懸濁し、同様の条件で再度遠心分離した。次いでペレットを0.5mlのバッファーA(Biological Industries社のEZ−RNA IIキットに付属)に再懸濁し、エッペンドルフチューブに移して−80℃で保存した。
表14 羊水中の異なるマイクロRNA標的配列の検出
ヒトの尿中の異なるmiRNA標的配列の検出
尿(500μl)からのmiRNA抽出に用いたプロトコルは、実施例9に記載されたものと同様である。表15は、ヒトの尿試料中においても異なるマイクロRNAが特異的に検出可能であったことを示す。表15には、ヒトの尿から種々のマイクロRNA標的配列を抽出、単離および検出することが可能なことが初めて示されている。
表15 ヒトの尿中の異なるマイクロRNA標的配列の検出
唾液、胸水および胸部分泌物中の異なるmiRNA標的配列の検出
唾液、胸水および胸部分泌物からのmiRNA抽出に用いたプロトコルは、実施例9に記載されたものと同様であるが、僅かに変更を加えた。抽出される唾液RNAの純度を高めるため、プロテイナーゼKとのインキュベーションを3時間に延長し、RNAは、−80℃で一晩沈殿させた。
表16 ヒトの唾液中の異なるマイクロRNA標的配列の検出
標的核酸の検出のためのeclipseプローブの使用
MGB eclipseプローブは、マイナーバインダー部分を含んでおり、これによって短いプローブを非常に高い特異性で用いることが可能になる。これらは5’末端にマイナーグルーブバインダーおよびフルオロフォア(またはクエンチャー)を有し、3’末端にクエンチャー(またはフルオロフォア)を有する短い直鎖状プローブであり、実施例3で用いたMGB分子(TaqMan MGBプローブ)とは反対の方向性を有する。マイナーグルーブバインダーにより、Taqポリメラーゼがプローブを切断するエキソヌクレアーゼ活性を阻害することができる。
プローブLet7A21:CCGTTTTTTTTTTAACTATAC(配列番号:20860)
プローブLet7C21:CCGTTTTTTTTTTAACCATAC(配列番号:20861)
eclipse反応に用いたRTプライマー配列:
RT10:GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATCGGTTTTTTTTTTVN(配列番号:20862)
表17 eclipse MGBプローブによるLet−7ファミリーメンバーの検出
miRNAの予測
miRNAを予測するため、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第60/522,459、第10/709,577号および第10/709,572号に記載される方法と同様の計算論的アプローチを用いて、全ヒトゲノムに渡って潜在的なmiRNAコーディング遺伝子を調査した。つまり、全ヒトゲノムの非タンパク質コーディング領域を、ヘアピン構造に基づいて調査した。予測上のヘアピンおよび潜在的なmiRNAについて、熱力学的安定性、構造上の特徴および前後関係の特徴に基づいてスコアリングした。アルゴリズムは、既に有効性が実証されているサンガーデータベースにあるmiRNAを用いてキャリブレーションした。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第11/429,720号の表1には、コンピューターによるスクリーニングで予測された各ヘアピン(「HID」)が記載されている。また、米国特許出願第11/429,720号の表1には、各ヘアピンのゲノム上の位置(「ヘアピン位置」)が列挙されている。ゲノム上の位置のフォーマットは、<chr_id><strand><start position>という連結である。例えば、19+135460000は、19番染色体の+鎖、開始位置135460000を指す。23〜25番染色体は、それぞれ、X染色体、Y染色体およびミトコンドリアDNAを指す。染色体上の位置は、NCBI Build35 バージョン1(35.1)に基づいてInternational Human Genome Sequencing Consortiumで作製された、UCSC(http://genome.ucsc.edu)によるヒトゲノムのhg17アセンブリーに基づいている。
標的遺伝子の予測
次に、実施例13のコンピューターによるスクリーニングで予測されたmiRNAを用い、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第60/522,459、第10/709,577号および第10/709,572号に記載される方法と類似する2種類の計算論的アプローチをmiRNAの予測に用いて、標的遺伝子とその結合部位を予測した。
miRNAの差次的発現
1.配列決定
ヘアピン(「HID」)を確認するため、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第60/522,459号、第10/709,577号および第10/709,572号に記載される方法と同様の配列決定法により多数のmiRNAを評価した。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第11/429,720号の表3には、示されている組織(「組織」)における、miRNA(「MID」)の配列決定により確認されたヘアピン(「HID」)が示されている。その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第11/429,720号の表6には、組織の数字コードが示されている。
実施例13で予測されたヘアピンおよびmiRNAの確認を行うため、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第60/522,459号、第10/709,577号および第10/709,572号に記載される方法と同様のハイスループットマイクロアレイを用いて、種々の組織における発現(対コントロール)の検出を行った。マイクロアレイ画像の解析には、Feature Extractionソフトウェア(バージョン7.1.1、Agilent社)を用いた。次いで、上記に記載する方法と同様の方法を用いて種々の疾患組織におけるmiRNAの差次的発現を解析した。米国特許出願第11/429,720号の表2には、示されている疾患について、正常組織との比較における疾患関連発現(「R」)の比率が示されている。これら疾患の疾患コードが、米国特許出願第11/429,720号の表7に示されている。米国特許出願第11/429,720号の表2には、正規化したシグナルの統計解析(「RPval」)が示されている。各プローブのシグナルは、その中央値の強度として設定した。シグナルは、バックグラウンドレベル400から飽和レベル66,000の範囲である。2チャンネルのハイブリダイゼーションを行い、Cy3シグナルをCy5シグナルと比較し、ここで、蛍光を入れ替えてチップを行い(fluor reversed chip)(正常対疾患)、プローブシグナルはその平均シグナルに設定した。最初に対数変換(log2)を行い、その後に二次多項式グラフを適用した。正規化の後、各miRNAおよび疾患についてt検定を行った。p値は、重複実験における同程度またはこれを超えるシグナル比の出現率に基づいて評価した。米国特許出願第11/429,720号の表2にはp値が<0.05のmiRNAが示されている。米国特許出願第11/429,720号の表2には、各解析に用いた試料の総数(「N」)が示されている。米国特許出願第11/429,720号の表2に示す差次的発現の解析は、多数のmiRNAの発現が、疾患組織において有意に変化することを示す。
バイオチップ
1.プローブプリンティング
表7に記載する配列(配列番号:1〜4167)を有する乾燥マイクロRNA核酸プローブを3×塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウムバッファー(SSC)+0.001%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)または2×SSC+0.0035%SDS中に核酸の最終濃度が20μMまたは10μMになるように溶解した。次いで、Genomic Solutions(登録商標) BioRobotics MicroGrid II をMicroGridの製造元の指示に従って用いてSchott Nexterion(登録商標) Slide Eコートされたマイクロアレイスライド上にプローブをスポット(すなわち、プリント)した。プローブをスポットした後、マイクロアレイスライドの製造元の指示に従って、バイオチップに処理を施した。つまり、湿潤箱中で、42℃で0.5×SSCを用いてバイオチップを再水和し、直ちに130℃のヒートブロック上で3秒間乾燥させ、ブロッキングバッファー(1M Tris pH9、50mM エタノールアミン、0.1% SDS)中に浸し、頻繁に混合しながら50℃で20分間インキュベートした。次いで、バイオチップを、ヌクレアーゼフリーの水で1分間、2回リンスした。最後にバイオチップを遠心分離によって乾燥させた。
新鮮な組織、株化細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋RNA、および(サイズに応じてRNAを分離するカラム/ゲルを用いた後)低分子RNA分子が濃縮された分画化RNA由来の全RNAを、バイオチップにハイブリダイズしたRNAの検出を可能にする蛍光色素で標識した。RNAは、1分子当たり1種類のフルオロフォアで標識し、異なる低分子RNA分子間で標識は均一なものであった。フルオロフォアは、試料中のマイクロRNAの3’末端にRNAリガーゼによって酵素的に結合させた。次いで、以下の試薬を混合した:最大で3.5μLのRNA、スパイク 1μL、10×ライゲーションバッファー(NEB社)1μLまたはRNAリガーゼバッファー(Amersham社)p−CU−Cy3/Cy5* 1μL、DMSO 1.5μL、RNAsine 1μL、T4 RNAリガーゼ(NEB社)1μLまたはRNAリガーゼ(Amersham社)、最終容量(10μL)までDDWで希釈。*5’ホスフェート−rCrU−3−Cy3;5’ホスフェート−rCr−U−3−Cy5(r=リボ核酸ヌクレオチド)。前記の混合物を、ヒートブロック上で、40℃で1時間、次いで37℃で1時間インキュベートするか、または0℃で2〜16時間、あるいは16℃で2〜16時間(少量のRNAの場合)インキュベートした。
標識RNAを以下のようにしてバイオチップにハイブリダイズさせた。Ambion社(登録商標)の3×miRNAハイブリダイゼーションバッファーを、少なくとも5分間、70℃に予備加熱した。プリントしたバイオチップ上に清浄なカバースリップを置いた。ハイブリダイゼーションバッファーを標識RNA(RNA−Cy3標識およびRNA−Cy5標識)と混合して1×バッファーの最終濃度にし、次いで、この混合物(30μl)をバイオチップ上に注いでプローブを覆った。もしくは、1×バッファーの最終濃度にあるバッファーおよび前記混合物(110μl)をAgilentチャンバーベースが付いたAgilentガスケットスライド上に注いだ。バイオチップを3分間、95℃に加熱し、次いで、室温で最大速度にて1分間遠心分離することにより室温まで冷却した。最後に、ウォーターバスまたはAgilentオーブンにおいて、バイオチップを42℃で12〜16時間または48時間(低量のRNAの場合)標識RNA混合物とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、バイオチップをバッファーA(1×SSC、0.2%SDS)で室温にて約30秒間洗浄し、バッファーB(0.1×SSC)で室温にて30秒間で2回洗浄し、次いで、遠心分離により乾燥させた。
100%の出力または100%の後に10%の出力で10μmまたは5μmの解像度が可能なAgilent Microarray Scanner Bundle G2565BAを用いてバイオチップをスキャンした。データは、SpotReaderソフトウェアまたはFeature extractionソフトウェアを用いて解析した。
LuminexマイクロスフェアへのDNAプローブのハイスループットカップリング
5.Luminexカップルビーズの調製
カルボキシル化Luminexマイクロスフェア(Luminex xMap technology社;カタログ番号 L100−C(101−200)−01)またはビーズを、EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド−HCl;Pierce社、製品番号77149)を用いてアミノ修飾したDNAプローブにカップリングする。mirVana miRNAプローブセット(Ambion社;カタログ番号1564)由来の、標的miRNAの逆相補体であるDNAプローブを用いる。プローブは、42〜46ヌクレオチド(nt)長であり、そのうち18〜24ntが特異的なmiRNAを標的にする。
パラフィン包埋組織もしくは凍結組織または体液(例えば、血液、尿、痰等)からRNAを単離する。抽出工程を最適化して、短鎖RNAも確実に回収できるようにする。最終段階では、RNAを、RNaseフリーの滅菌蒸留脱イオン水(DDW)で希釈する。
5μgのRNAを50〜150μlのDDWに希釈する。RNAをYM100カラム上にアプライする。カラムを14,000×Gにて4℃で25分間遠心分離する(Microcon YM100フィルター装置;Millipore社;Amicon;カタログ番号42413)。次に、流出液を、8μlの(50mg/ml)グリコーゲン、10%容量の3M NaOAc(pH5.2)および3〜4倍量の100%冷却EtOHを用いて、80℃で1時間、沈殿させる。次に、チューブを最大速度にて4℃で40分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを85%冷却EtOHで洗浄する。ペレットを乾燥させ、DDWに再懸濁する。5〜10%の回収率が期待される。
5μgの全RNAから単離した濃縮低分子RNAを、MicroMax標識検出キット(Perkin−Elmer社;カタログ番号MP5545)を用いてビオチン標識する。「ネイキッド(naked)」スパイク(非ヒト配列を有するコントロールRNA分子、22nt長)を、標識工程のコントロールとして添加する(1反応系当たり5〜20fmol)。0.5μlのASAPビオチン試薬および2.5μlのASAP標識バッファーを添加する。最終容量が10μlになるようDDWを添加する。
各ハイブリダイゼーション反応系には、以下が含まれる:MicroMax−標識miRNAs;ハイブリダイゼーションコントロールとして1〜5fmolの事前にビオチン標識されたスパイク(非ヒト配列を有するコントロールRNA分子、22nt長、5’側にビオチンを含む);および、miRNAプローブ核酸にカップルしたLuminexマイクロスフェアの混合物(すなわち、カップルビーズの混合物)。
ハイブリダイゼーション反応物を、マルチスクリーン96ウェルフィルタープレート(Millipore社;カタログ番号MABVN1210)に移す。バキューム吸引を行い、各ウェルに×1 TMACハイブリダイゼーションバッファーに希釈した20μg/mlのストレプトアビジン−R−フィコエリスリン(PhycoLink社;Prozyme;カタログ番号PJ315)を75μl添加する。懸濁液を完全に混和して96ウェルプレート(Thermowell96ウェルプレート、ポリカーボネート製;Costar社、6511)に移す。
LuminexマイクロスフェアへのLNAプローブのハイスループットカップリング
mirVana miRNAプローブセットを用いる代わりにExiqon LNA miRNAプローブセットを用いる以外は、前述の実施例17の1〜6項と同様に行う。LNAプローブを用いる場合、カップルビーズ混合物へのハイブリダイゼーションは、65℃〜75℃の温度で行われる。
DNAカップルビーズプローブの感度
検出感度を評価するため、前述の実施例17(4項)に記載のように行うmiRNAビオチン標識反応の反応系に、濃度を上昇させた各種「ネイキッド」スパイク(非ヒト配列を有するコントロールRNA分子、22nt長)を添加した。
感度
濃度を上昇させた各種スパイクをmiRNA標識反応系に添加した。この実験ではAmbion社のプローブセットを用いた。このシステムは、0.06 fmolのmiRNAまでを感知し、2オーダーの範囲で直線性を示した。結果は、対数スケールで表す。図6参照。
特異性
Let−7a合成miRNAを標識し、種々のLet−7ファミリーメンバーとカップリングしたビーズの混合物とハイブリダイズさせた。この系の特異性は、配列間の類似性、ミスマッチ数、配列中のミスマッチの位置およびミスマッチの特性(すなわち、どのヌクレオチドが変化したのか)に比例相関していた。図8参照。
再現性
実施例17〜19の記載と同様にヒト胎盤を標識してハイブリダイズさせた。図10は2つの個別の実験の再現性を示す。
組織特異的miRNAの同定
新鮮な脳および胎盤組織由来のRNAを標識してカップル混合物にハイブリダイズさせた。100種類のmiRNAセットの発現プロファイルを図11および図12に示す。前述したように、脳または胎盤に特異的なmiRNAが検出され、これらは図に示されている。結果は、対数スケールで表す。
癌組織でのmiRNA発現のプロファイリング
正常または腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋された肺組織および膀胱組織からRNAを抽出した。miRNAの発現プロファイリングは先の記載と同様に行った。差次的に発現するmiRNAは図13a、bにマークされている。結果は、対数スケールで表す。
その他の標識方法の詳細なプロトコル
1.直接標識法
a.Kreatech化学標識
この標識法は、Kreatech社製のULS低分子RNA標識キットにより行うことができる。
この標識プロセスは、前述のプロセス(PerkinElmer社製品の場合)と類似する。
50ngの低分子RNAに対して1μlの試薬である最適比率は維持されるべきである。好ましくは、10μlの反応容量に対して少なくとも12.5μgの低分子RNAを用いるべきである。1μlの×10バッファーを添加する。
ビオチン系物質を用いたジヌクレオチドの酵素的末端標識。異なるライゲーション系を用いてもよい。
5μlのDDWに再懸濁する。Luminexの前にTE 12μlを添加する(最終容量:17μl)。
シグナル増幅法
1.TSA(チラミドシグナル増幅法)のプロトコル
開始前に:
1.ビオチン化チラミドを0.3mlのDMSOに再懸濁する−ストック溶液(4℃で6ヶ月間安定)。
2.×1増幅バッファーを用いてストック溶液を1:50に希釈する(ワーキング溶液)。
3.TNT洗浄バッファー:0.1M Tris−HCl(pH7.5)、0.15M NaCl、0.05% Tween−20、を調製する。
4.TNBブロッキングバッファー:0.1M Tris−HCl(pH=7.5)、0.15M NaCl、0.5%ブロッキング試薬、を調製する。
完全に溶解させるため撹拌して加熱する(60℃を超えないようにする)。
溶液をろ過、分注して4℃で保存する。
1.前述のようにマイクロスフェアへのカップリング、miRNA化学標識およびハイブリダイゼーションを行う
2.試料を遠心分離してハイブリダイゼーション反応物を洗浄
3.100μlのTNBブロッキングバッファーに再懸濁
4.室温で30分間インキュベート
5.遠心分離
6.TNBで1:100に希釈した100μlのSA−HRPに再懸濁
7.室温で30分間インキュベート
8.Milliporeフィルタープレート上へロード
9.TNTバッファーで3回洗浄(バキューム吸引および懸濁を3回)。
10.100μlのビオチン化チラミドワーキング溶液(×1増幅バッファーを用いてストック溶液を1:50に希釈−ワーキング溶液)を添加
11.ピぺッティングにより混合
12.室温で10分間インキュベート
13.TNTで3回洗浄(10と同様)
14.20μg/mlのSAPE 75μlをTMACに添加
15.50℃で10分間インキュベート
16.Luminexで測定
図14は、TSA反応によりビオチン標識スパイクが増幅される様子を示す。
LuminexプラットホームへのGenisphereシグナル増幅キットの使用プロトコル。(Genisphere社から提供されるプロトコル)
1.全RNAをYM−100カラム上に注ぎmiRNA画分を濃縮する。
a.マイクロRNAへのポリ(A)末端の付加:
2.
a.miRNAの濃縮画分にネイキッドスパイクを添加する。
b.濃縮マイクロRNAおよびスパイクの容量をヌクレアーゼフリー水(バイアル10)で15.5μlに調整する。アレイの品質にもよるが、品質データを得るには50ng〜500ngの濃縮マイクロRNAが必要となる。
c.以下の式に従って、ATP(バイアル4)を1mM Tris pH8.0で希釈する:
a.5μlの5×miRNA反応バッファー(バイアル2)
b.2.5μlのMnCl2(バイアル3)
c.1μlの希釈ATP(工程2で希釈したバイアル4)
d.1μlのPAP酵素(バイアル5)
4.緩やかに混和して遠心分離する。
5.37℃のヒートブロックで15分間インキュベート。
6.25μlの末端付加マイクロRNAを短時間遠心分離する。
7.室温で以下の成分を加えて容量を36μlにする:
a.6μlの6×「cplCap03」ライゲーションミックス(バイアル9)
b.2μlのT4 DNAリガーゼ(バイアル8)
c.3μlのヌクレアーゼフリー水(バイアル10)
8.緩やかに混和して遠心分離する。
9.室温(20〜28℃)で30分間インキュベート。
10.4μlの0.5M EDTA pH8を添加して反応を停止させる。短時間ボルテックス撹拌して遠心分離する。
11.60μlの1×TEバッファーを添加して最終容量を100μlにする。短時間ボルテックス撹拌して遠心分離する。これがタグ化マイクロRNAである。
12.以下のように、MinElute PCR精製キット(Qiagen社、カタログ番号28006)を用いて、100μlのタグ化マイクロRNAを精製する。
a.500μlのバッファーPBを100μlの試料に添加してボルテックス撹拌する。短時間、遠心分離する。
b.混合物をMinEluteカラムにアプライし、通常の卓上マイクロ遠心器にて10〜14,000×g(約13,000rpm)で1分間遠心分離を行う。
c.流出液を捨てる。MinEluteカラムを同一の回収用チューブにセットする。
d.MinEluteカラムに750μlのバッファーPEを加え、1分間遠心分離する。
e.流出液を捨てる。MinEluteカラムを同一の回収用チューブにセットする。
f.2分間遠心して残留PEバッファーを除去する。
g.MinEluteカラムを、清浄な、ラベルを付した1.5mLマイクロ遠心チューブにセットする。
h.10μlのバッファーEBをカラムメンブランの中央部分に加える。室温で2分間インキュベーションを行う。2分間遠心分離する。カラムを捨てて10μlの流出液を保存する。これがタグ化マイクロRNAである。
1.適切なLuminexカップルビーズセット(ミックス)を選択する。
2.カップルビーズを10〜20秒間ボルテックス撹拌する。
3.ホルムアミド含有または不含の1.5×TMAC(4.5M TMAC)で、1回の反応当たり1500個のLuminexビーズ(ビーズ1種類当たり)を含むようにLuminexカップルビーズのストックを希釈することによりワーキングLuminexビーズ混合物を調製する。(留意事項:各反応には、合計で33μlのワーキングLuminexビーズ混合物が必要。)10〜30%のホルムアミドをTMAC溶液に添加して、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めることもできる。TMACバッファー中でビーズをボルテックス撹拌する。
4.33μlのLuminexビーズ混合物(上記の工程3で調製)をヌクレアーゼフリーのキャップ付き0.2mLストリップPCRチューブ(ISC Bioexpress社、カタログ番号T−3034−1)に添加する。
5.各チューブに、適切なバイオスパイク(bio−spike)を含む1×TE pH8.0で希釈したタグ化LMW RNA(上記プロトコルで調製)を17μl添加する。20〜150ng当量(タグ化プロセス前に測定)のLMW RNAを添加する。300rpmで振とうしながら50℃(プローブがLNAの場合は65℃)で16時間インキュベートする。
6.各チューブから全反応物を、(1×PBSで)事前に湿らせたMultiscreen−BVフィルタープレート(Millipore社、カタログ番号MABVN1210)に移す。
7.バキューム装置を用いて、1×TMAC(50℃に予熱)でビーズ(フィルタープレート中で)を1回洗浄する。
8.Genisphereの結合バッファーIで1.0ng/μLに希釈したビオチン標識Cap03デンドリマーを50μL添加する。300rpmで振とうしながら37℃で2時間インキュベートする。
9.ビーズを50℃に予熱した1×TMACで1回洗浄する。
10.1×PBSで20ng/μLに希釈したSA−PE(ProZyme社)を50μL添加する。300rpmで振とうしながら37℃で30分間インキュベーションを行う。
11.ビーズを1×PBSで1回洗浄する。
12.75μLの1×PBSを各ウェルに添加し、ウェルの内容物を別のマイクロタイタープレートに移す。
13.低RP1キャリブレーションで調製したLuminex 100で解析を行う。
抗PEビオチン(デンドリマー)試薬
miRNAのLuminexアッセイの感度をさらに向上させるため、上記デンドリマー試薬を用いたところ、我々の手法では、多重ビーズアッセイ(6〜12重)1回当たりに僅か1〜3ngのLMW RNA(50〜150ngの全RNAに相当)を用いても成功した。抗PEデンドリマー試薬を用いる追加工程はかなり単純であり、本発明のmiRNA Luminexプロトコルの最後(本プロトコルの工程11の後)に付け加えられる。
工程12.所望の各ビーズ反応(マイクロタイターウェル)用に、5.5μLの抗PEビオチン(デンドリマー)試薬を49.5μLの結合バッファーIに添加することにより抗PEビオチンデンドリマーを結合バッファーIで希釈する。
フィルターマイクロタイタープレート中の各ビーズ反応系に、希釈した抗PEビオチンデンドリマー50μLを添加し、300rpmで振とうしながら室温で60分間インキュベートする。
工程13.ビーズを1×PBSで1回洗浄する。
工程14.50×SA−PEを1×PBSで希釈する。各ウェルに50μLの希釈SA−PEを添加し、プレートを5秒間ボルテックス撹拌する。300rpmで振とうしながら37℃で30分間インキュベーションを行う。
工程15.ビーズを1×PBSで1回洗浄する。
工程16.150μLの1×PBSを各ウェルに加える。ピぺッティングによりビーズを5〜6回混和し、次にウェルの内容物を別のマイクロタイタープレートに移す。
工程17.Luminex装置で解析を行う。
転写方法
1.直接転写
この可能性を用いる場合は、miRNAのセンスプローブセットがマイクロスフェアにカップリングされていなければならない。
直接転写標識法には、RNA:DNAハイブリッドアダプターのライゲーションおよびビオチン標識ヌクレオチドを用いた転写が含まれる。
1.以下の反応混合物を調製する:
3.0.5〜2倍量(12.5μl)のローディングミックス(SB尿素)を添加して反応を停止し、二相アクリルアミド尿素ゲル(すなわち、上相が6%、下相が13%)で電気泳動する。
4.200V、80mAで約55分間泳動する。RNAマーカーに基づき、遊離のアダプターと低分子RNAの間のゲル部分を切り出す。
5.midi GeBAflex(カットオフ値:3500)を用いて、120V、40分間、次いで120秒間逆方向に電流を流すことによってRNAを0.8mlのDDWに溶出した。
6.400μlのRNAに、8μlのグリコーゲン(5mg/ml)、1/10倍量のNaoAcおよび3〜4倍量の冷却100%エタノールを添加してRNAを沈殿させる。−20℃で一晩保存する。
7.最大速度で40分間遠心分離し、85%エタノールで洗浄する。3μlに再懸濁する。(2本のチューブを用いる場合、一本目を65℃で3分間再懸濁して、2本目に移し、最初のチューブを2μlで洗浄して、一つにまとめる)。
8.アニーリングプライマーを添加する。20p/μlのストックから1μlのプローブ19578176 RT−DT− T7 avrll−short。段階的アニーリングを行う。
1.T7 10×反応バッファーおよびリボヌクレオチド溶液を室温で融解させる。T7酵素ミックスを氷上で保存する。室温で反応系を調製する。
2.反応ミックスを以下のように調製する:
4.短時間遠心分離する。
5.鋳型DNAを除去:
1μlのDNase Lを添加して十分に混合し、37℃で15分間インキュベートする。
6.酸性フェノール:クロロホルム抽出
125μlのヌクレアーゼフリー水、15μlの3M酢酸ナトリウムおよび150μlの酸性フェノール:クロロホルムを添加する。十分に混合する。最大速度で10分間遠心分離する。
7.RNAの沈殿:
新しいチューブ内で最上相を8μlのグリコーゲン(5mg/ml)、3.6倍量のエタノール(550μl)と混合する。−20℃で一晩(または−80℃で2時間)保存する。最大速度で40分間遠心し、85%エタノールで洗浄して25μlに再懸濁する。
8.濃度:
濃度を測定する。
9.遊離ヌクレオチドの精製:
転写産物をG−25カラムにローディングする。
10.ハイブリダイゼーションコントロール用にbio−RNAスパイクを添加する:
C−lin4−bio−AS−RNA 5f
C−mir2−bio−AS−RNA 1f
1.5μgの転写産物、または
2.0.5μgの精製転写産物。
SenseAmp Plus(商標)− Genisphereを用いたマイクロRNAの増幅
1.手順(全RNAから始める場合)
a.マイクロRNAの濃縮:
Microcon YM−100カラム(Millipore社、カタログ番号42413)および通常の卓上マイクロ遠心機。
10mMのTris−HCl、pH 8.0で全RNA試料を100μlに希釈する。
希釈した全RNA100μlを試料リザーバーに添加する。ピペットチップがメンブランに触れないように留意する。チューブのキャップをしっかりと締めて13,000gで6分間遠心する。
流出液(約95μl)を回収する。この流出液が、80〜100塩基長未満の平均サイズを有する目的のLMW RNAである。
濃縮:
Microcon YM−3カラム(Millipore社、カタログ番号42404)および通常の卓上マイクロ遠心機。
上記の工程3で得たLMW RNA(YM−100の約95μlの流出液)をYM−3試料リザーバーに添加する。ピペットチップがメンブランに触れないように留意する。チューブのキャップをしっかりと締めて13,000gで30分間遠心する。
流出液の容量を確認し、流出液の容量がローディング時の容量(約95μl)より6〜8μl少ない容量と等しくなるか、または下部のリザーバーに追加した液体がたまらなくなるまで遠心分離を続ける。例えば、95μlをYM−3にローディングした場合、流出液は、87〜89μlとなる。
10μlの10mM Tris−HCl、pH 8.0を試料リザーバーに添加して、側面を軽く叩いて穏やかに混和する。
慎重に試料リザーバーを新しい回収チューブに逆さに入れる。13,000gで3分間遠心して濃縮されたLMW RNAを回収する。以下の章のマイクロRNAのポリ(A)末端付加に進む。
ヌクレアーゼフリー水(バイアル10)で容量を18mlに調整する。
以下の式に従って、ATP(バイアル14)を1 mM Tris、pH 8.0で希釈する。
1mlのATP(バイアル14)を125mlの1mM Tris、pH 8.0に添加してATPを1:125に希釈する。
以下の成分を18mlのマイクロRNAに添加して容量を25mlにする:
2.5mlの10×反応バッファー(バイアル6)
2.5mlの25mM MnCl2(バイアル17)
1mlの希釈ATP(工程2で調製したバイアル14の希釈物)
1mlのPAP酵素(バイアル16)
穏やかに混和して遠心分離する。
37℃のヒートブロックで15分間インキュベートする。
25mlの末端付加マイクロRNAを短時間遠心分離して氷上に静置する。
1mlのSenseAmp dTプライマー(バイアル1)を9mlの0.1×TEに添加してSenseAmp dTプライマーを1:10に希釈する。ボルテックス撹拌して短時間遠心分離する。
氷上にて、2mlの1:10希釈したSenseAmp dTプライマー(工程2で調製したバイアル1希釈物)を添加する。
穏やかに混和して、遠心分離する。
65℃で10分間インキュベーションを行った後、直ちに氷上に移して2分間静置する。
氷上にて以下の成分を加えて容量を50mlにする:
10mlの5×ファーストストランドバッファー(または逆転写酵素と共に提供される同等のバッファー)
5mlの0.1M DTT(逆転写酵素と共に提供される場合:提供されていない場合には、ヌクレアーゼフリー水を用いる)
2.5mlのdNTPミックス(バイアル3)
1mlのSuperase−in(商標)RNase阻害剤(バイアル4)
2mlのSuperScript II逆転写酵素、200ユニット(または同等の逆転写酵素)2.5mlのヌクレアーゼフリー水(バイアル10)
穏やかに混和し(ボルテックス撹拌はしない)、42℃で1時間インキュベートする。
8.75mlの0.5M NaOH/50mM EDTAを添加して反応を停止させる。短時間ボルテックス撹拌を行って遠心分離する。
留意事項:反応系は、褐色に変化する場合があるが、これは正常なことである。
65℃で30分間インキュベートしてmiRNAを分解する。
留意事項:反応系は、褐色から無色に変化する場合があるが、これは正常なことである。
12.5mlの1M Tris、pH 8.0で反応系を中和する。これがcDNAである。短時間ボルテックス撹拌して遠心分離する。28.75mlの1×TEバッファーを添加して試料量を100mlにする。
Microcon YM−100カラム(Millipore社、カタログ番号42413)と通常の卓上マイクロ遠心機を用いて100μlのcDNAを精製する。
100μlのcDNAを試料リザーバーに添加する。ピペットチップがメンブランに触れないように留意する。チューブのキャップをしっかりと締めて13,000gで6分間遠心する。
メンブランに触れることなく、200μlの1×TEバッファーを試料リザーバーに添加する。ピぺッティングを5回行って穏やかに混和する。チューブのキャップをしっかりと締めて13,000gで6分間遠心する。
慎重に試料リザーバーを回収用チューブから取り外す。流出液を捨てる。YM−100カラムを同一の回収用チューブに設置する。
メンブランに触れることなく、200μlの1×TEバッファーを試料リザーバーに添加する。ピぺッティングを5回行って穏やかに混和する。チューブのキャップをしっかりと締めて13,000gで6分間遠心する。
慎重に試料リザーバーを回収用チューブから取り外す。回収用チューブを捨てる。
メンブランに触れることなく、5μlの1mM Tris(pH 8.0)を試料リザーバーに添加する。リザーバーの側面を軽く叩いて混和する。
慎重に試料リザーバーを新たな回収用チューブに逆さにセットする。13,000gで3分間遠心する。
チューブの底に回収されたcDNAの容量(5〜10μl)を記録する。ヌクレアーゼフリー水(バイアル10)でcDNAの容量を10μlにする。
精製したcDNA(10ml)を80℃に10分間加熱する。直ちに氷上に1〜2分間静置する。短時間遠心分離を行い、氷上に戻す。
各反応系に、氷上で別のチューブにマスターミックス(10ml)を調製する:
2mlの10×反応バッファー(バイアル6)
2mlのヌクレアーゼフリー水(バイアル10)
4mlの10mM dTTP(バイアル5)
2mlのTdT酵素(バイアル7)
マスターミックスとcDNAを混合して20mlの容量にする。緩やかに混和して遠心分離する。37℃のヒートブロックで3分間インキュベートする。3分間を超えないように留意する。
80℃に10分間加熱して反応を停止させる。短時間、遠心分離を行って1〜2分間室温に冷却する。
末端付加したcDNAに2mlのSenseAmp T7鋳型オリゴ(バイアル8)を添加して容量を22mlにする。短時間ボルテックス撹拌して遠心分離する。
37℃で10分間インキュベートして鎖をアニーリングする。
各反応系に以下の成分を添加して容量を25mlにする:
1mlの10×反応バッファー(バイアル6)
1mlのdNTPミックス(バイアル3)
1mlのKlenow酵素(バイアル9)
穏やかに混和して遠心分離する。室温で30分間インキュベートする。
65℃で10分間加熱して反応を停止させる。氷上に静置する。
プロモーター修飾cDNAの半分の量(12.5ml)を用いてin vitro転写反応に進む。
後日使用するため、または並行しておこなう増幅反応で使用するために残りの修飾cDNAを−20℃で保存する。
12.5mlのcDNAを37℃で10分間インキュベートして、鎖を再度アニーリングさせる。
T7ヌクレオチドミックス(バイアル11)および10×T7反応バッファー(バイアル12)を室温で融解させ、使用時まで室温で保存する。10×T7反応バッファー(バイアル12)を十分にボルテックス撹拌してバッファー成分の沈殿を防ぐ。
各反応系に、室温にて12.5mlのcDNAに対して以下の成分を加え、最終容量を25mlにする:
8.0mlのT7ヌクレオチドミックス(バイアル11)
2.5mlの10×T7反応バッファー(バイアル12)
2.0mlのT7酵素ミックス(バイアル13)
緩やかに混和して遠心分離する。サーマルサイクラー(加熱蓋付き)中で、37℃で4〜16時間インキュベートする。または、反応系を37℃のヒートブロック内で5分間静置して、次に、37℃のエアハイブリダイゼーションオーブンに移して4〜16時間静置する。この工程においては反応系の蒸発と濃縮を回避することが不可欠である。
Qiagen社のRNAクリーンアッププロトコルに従ってRNeasy MinEluteキット(Qiagen社、カタログ番号74204)を用いてセンスRNAを精製する。溶出には、14mlのヌクレアーゼフリー水を添加して2分間インキュベートし、次いで遠心する。回収される容量は12ml前後となる。
RiboGreen RNA定量キット(Molecular Probes社、カタログ番号R−11490)を用いてセンスRNAの濃度を測定する。このキットに提供されるリボソームRNAスタンダードを用いて検量線を作成する。1μlの精製センスRNAを用いて定量を行う。確実に適切な参照用「ブランク」試料を用いることで不正確な濃度測定を回避する。
EDCを用いた、プローブのビーズへのハイスルーブットカップリング
バッファー:MESバッファー、0.1M(pH=4.5)、Tween−20、0.02% SDS、0.1% TE(pH=8.0)
1.カップリングプロトコル
カップリングは、EDCを用いてカルボキシル化ビーズとアミン修飾プローブとの間で行う。
カップリングはチューブ内で行い、界面活性剤に対する耐性を有する96マルチウェルフィルタープレート(Millipore社、Solvinert)を用いて洗浄する。
1.全てのプローブをDDWに再懸濁して最終濃度を1mMにする。
2.DDWを用いて全てのプローブについて1:10希釈液(0.1mM)を調製する。
3.分取したEDC粉末は室温になっていなければならない。
4.行うべきカップリング反応の結合表を作成する。
5.符号を付したチューブのセットを用意する。
6.もとのチューブ内でボルテックス撹拌および約20秒間の超音波処理によりビーズを再懸濁する。
7.それぞれの種類のビーズから200μl(2.5×106個のビーズ)を、符号を付した新しいチューブに移す。
8.最大速度で2分間遠心分離する。
9.上清を取り除き、25μlのMES(pH=4.5)に再懸濁する。ボルテックス撹拌し、20秒間超音波処理する。
10.1μlの希釈プローブをビーズに添加する。適切なビーズ/プローブの結合を知るために、先に作成した表を用いる。
11.ボルテックス撹拌で混和する。
12.10mgの分取物を1mlのDDWに懸濁して、濃度10mg/mlのEDCを調製する。
13.各カップル反応系に1.5μlのEDCを添加してボルテックス撹拌する。
14.暗室にて室温で30分間インキュベートする。
15.新たなEDC懸濁液の分取物を調製する。
16.各反応系に再度新たなEDCを1.5μl添加してボルテックス撹拌する。
17.暗室にて室温で30分間インキュベートする。
18.Solvinertフィルタープレート(Millipore社)を100μlの水で事前に湿らせる。
19.事前に作成した表に従ってカップル反応系の内容物をチューブからフィルタープレートに移す。
20.カップル反応系に150μlの0.02% Tween−20を添加する。
21.プレートをバキューム装置上に静置してバキューム吸引を行う。
22.再度カップル反応系に150μlの0.02% Tween−20を添加する。
23.再度バキューム吸引を行う。
24.150μlの0.1% SDSを添加してバキューム吸引を行う。
25.150μlの0.1% SDSを再度添加して、再度バキューム吸引を行う。
26.カップルビーズを50μlのTE(pH=8.0)に再懸濁し、ピぺッティングにより混和する。
27.カップルビーズを新しい96ウェルプレート(フィルター無し)または新たなチューブに移して4℃で保存する。
工程
1.YM−100により5μgの全RNAから低分子RNAを単離する。
2.ネイキッドスパイクセットを添加する。
3.0.5μlのASAPビオチン試薬を添加する。
4.2.5μlのASAP標識バッファーを添加する。
5.最終容量が10μlになるようDDWを添加する。
6.ピぺッティングで混合する。
7.85℃で30分間インキュベートする。
8.4℃で5分間冷却する(PCR装置を使用)。
9.Kreapureカラムを用いた標識miRNAの精製:
a.カラムを室温にする(20分間)
b.樹脂を底部に集めるように振る
c.底を折り、2mlのマイクロチューブに設置する。
d.キャップを緩め、14,000rpmで1分間の事前遠心を行う。
e.カラムを新しいマイクロチューブに設置する。
f.樹脂の上部に標識反応物をアプライする。
g.14,000で1分間遠心分離する。
h.流出液を回収し、−20℃で保存するかまたはハイブリダイゼーションに用いる。
17μlの被標識物質:
標識RNA +33μlの混合ビーズ
2μlのBio−スパイク (×1.5 TMAC中)。ビーズ1500個/反応
×1 TEで容量を17μlにする。
1.ボルテックス撹拌および約20秒間の超音波処理によりマイクロスフェアを再懸濁する。
2.各試料ウェルまたはバックグラウンドウェルに33μLのワーキングマイクロスフェアミックスを添加する。反応は、0.5mlチューブ内で行う。
3.各バックグラウンドウェルに17μLのTE、pH 8を添加する。
4.各試料ウェルに標識および事前にビオチン標識したスパイクを含む検査物質を添加し、TE pH8.0を添加して最終容量を17μlにする。
5.数回ピぺッティングして反応ウェルを緩やかに混和する。
6.チューブを85℃のPCR−100装置(プログラム可能な温度制御装置)に5分間静置して、試料中の二次構造を変性させる。反応チューブを50℃(ハイブリダイゼーション温度)で一晩インキュベートする。
7.試料を96ウェルフィルタープレートに移す。バキューム吸引を行う。
8.ストレプトアビジン−R−フィコエリトリン試料(PhycoLink−SteptAvidin、カタログ番号PJ315)を1×TMACハイブリダイゼーションバッファーで20μg/mlに希釈することで新たにレポーターミックスを調製する。
9.各ウェルに75μlのレポーターミックスを添加して、ピぺッティングを数回行って緩やかに混和し、PCRプレートに移す。
10.Luminex装置内で試料プレートをハイブリダイゼーション温度の50℃に10分間戻す。
11.装置のマニュアルに従って、Luminexアナライザーで、ハイブリダイゼーション温度において50μlを分析する。
1. Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real−time quantification of microRNAs by stem−loop RT−PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27; 33(20):e179.
2. Fu HJ, Zhu J, Yang M, Zhang ZY, Tie Y, Jiang H, Sun ZX, Zheng XF. A novel method to monitor the expression of microRNAs. Mol Biotechnol. 2006 Mar; 32(3): 197−204.
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Claims (58)
- 第1の部分および第2の部分を含む標的核酸の検出方法であって、
(a)標的核酸を含む試料を提供すること;および
(b)前記標的核酸をプローブと接触させることを含み、
ここで、前記プローブは前記標的核酸の第1の部分と相補的な第1の部分を含み、前記プローブは前記標的核酸の第2の部分と実質的に相補的な第2の部分を含むものであり、
コントロールと比較した前記標的核酸へのプローブ結合レベルが前記試料中に存在する標的核酸のレベルの指標となる
当該検出方法。 - 前記試料が第1の部分および第2の部分を含む同胞核酸(sibling nucleic acid)をさらに含み、
前記標的核酸の第1の部分および前記同胞核酸の第1の部分は実質的に同一であり、
前記同胞核酸の第1の部分は前記プローブの第1の部分と実質的に相補的であり、
前記同胞核酸の第2の部分は前記プローブの第2の部分と実質的に相補的である
請求項1に記載の方法。 - 前記標的核酸がRNAである請求項1に記載の方法。
- 前記RNAがmiRNAである請求項3に記載の方法。
- 前記標的核酸がcDNAである請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が増幅される請求項1に記載の方法。
- フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅が行われる請求項6に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーが配列番号:4168〜8334のいずれか1つからなる群から選択される配列を含む請求項7に記載の方法。
- 前記プローブが標識を含む請求項1に記載の方法。
- 前記標識がフルオロフォアを含む請求項9に記載の方法。
- 前記標識がさらにクエンチャー分子を含み、前記フルオロフォアがプローブ上の前記クエンチャー分子の遠位に存在する請求項10に記載の方法。
- 前記プローブが配列番号:8335〜20835のいずれか1つからなる群から選択される配列を含む請求項1に記載の方法。
- 前記試料が生体試料である請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、血液、血液画分、尿、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、羊水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、株化細胞および組織試料からなる群から選択される請求項13に記載の方法。
- 疾患または健康状態の検出方法であって、
(a)標的核酸を含む試料を提供すること;および
(b)請求項1に記載の方法により前記試料中の前記標的核酸のレベルを測定することを含み、
コントロールと比較した前記標的核酸のレベルの差異が疾患または健康状態の指標である
当該検出方法。 - 前記試料が生体試料を含み、該生体試料が血液、血液画分、尿、羊水、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物、精液、株化細胞および組織試料からなる群から選択される請求項15に記載の方法。
- 前記疾病が癌である請求項15に記載の方法。
- 複数の標的核酸の検出方法であって、
各標的核酸が第1の部分および第2の部分を含み、
(a)複数の標的核酸を含む試料を提供すること;および
(b)前記標的核酸を複数のプローブと接触させることを含み、
各プローブが前記標的核酸のうちの1つの第1の部分と相補的な第1の部分を含み、各プローブが前記標的核酸のうちの1つの第2の部分と実質的に相補的な第2の部分を含むものであり、
コントロールと比較した各標的核酸への各プローブの結合レベルが前記試料中に存在する各標的核酸のレベルの指標となる
当該検出方法。 - 前記試料がさらに複数の同胞核酸を含み、各同胞核酸が第1の部分および第2の部分を含み、前記プローブの第1の部分が前記同胞核酸の第1の部分と実質的に相補的である請求項18に記載の方法。
- 前記試料が個人から単離されたDNAであり、前記試料中に存在する各標的核酸のレベルが前記個人の遺伝子型の指標となる請求項18に記載の方法を含む遺伝子型同定方法。
- 被験者から得られる体液試料中のマイクロRNA発現同定方法であって、
(a)試料からマイクロRNAを含むRNAを提供すること;
(b)ポリアデニル化RNAの逆転写産物を生成すること;および
(c)フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを含むポリメラーゼ連鎖反応により工程(c)の逆転写産物を増幅すること
を含む当該同定方法。 - 前記体液試料が、血液、血清、尿、羊水、腹水、唾液、子宮頸管分泌物、膣分泌物、滲出液、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、痰、胸水、胸部からの分泌物、卵巣嚢胞からの分泌物および精液からなる群から選択される請求項21に記載の方法。
- 前記プローブがさらにマイナーグルーブバインダー(minor groove binder)を含む請求項21に記載の方法。
- 前記フォワードプライマーが配列番号:4168〜8334のいずれか1つからなる群から選択される配列を含む請求項21に記載の方法。
- 前記プローブが配列番号:8335〜20835のいずれか1つからなる群から選択される配列を含む請求項21に記載の方法。
- (a)複数のネガティブプローブ;
(b)複数のポジティブプローブ;
(c)複数のスパイクプローブ;および
(d)複数のテストプローブ
を含むバイオチップ。 - ネガティブプローブがmiRNA*と実質的に相補的な核酸を含む請求項26に記載のバイオチップ。
- 前記核酸の配列が配列番号:20863〜20925のいずれか1つからなる群から選択される請求項27に記載のバイオチップ。
- ポジティブプローブが低分子RNAと実質的に相補的な核酸を含む、請求項26に記載のバイオチップ。
- 前記核酸の配列が配列番号:20926〜20937のいずれか1つからなる群から選択される請求項29に記載のバイオチップ。
- スパイクプローブがゲノム中の60個のヌクレオチドからなるいずれの配列とも相補的ではない配列を有する核酸を含む請求項26に記載のバイオチップ。
- 前記ゲノムがヒト、ラット、ウィルスおよびマウスからなる群から選択される請求項31に記載のバイオチップ。
- 前記核酸の配列が配列番号:20938〜20951のいずれか1つからなる群から選択される請求項31に記載のバイオチップ。
- テストプローブが、
(a)miRNAと実質的に相補的な核酸;および
(b)リンカーを含み、前記テストプローブが40〜60個のヌクレオチド
を含む請求項26に記載のバイオチップ。 - 前記核酸が16〜29個のヌクレオチドを含む請求項34に記載のバイオチップ。
- 前記核酸の配列が配列番号:1〜4167のいずれか1つからなる群から選択される請求項35に記載のバイオチップ。
- 前記リンカーが配列番号:20952〜21063のいずれか1つからなる群から選択される核酸を含む請求項34に記載のバイオチップ。
- 核酸の検出方法であって、
(a)生体試料を提供すること;
(b)請求項26に記載のバイオチップを前記生体試料と接触させること;および
(c)核酸の濃度を測定することを含み、
コントロールと比較した前記核酸のレベルの差異が前記生体試料中で検出される核酸の指標となる
当該検出方法。 - 前記核酸がpri−miRNA、pre−miRNAおよびmiRNAからなる群から選択される請求項38に記載の方法。
- 前記生体試料がフルオロフォアで標識された核酸を含む請求項38に記載の方法。
- 標的核酸集団の発現レベルの溶液系測定方法であって、
(a)各標的特異的ビーズセットが個別に検出可能なものであり個別ビーズセットと呼ばれる個別の標的核酸に対応する捕捉プローブを含む、標的特異的ビーズセット集団を溶液中に提供すること;
(b)各標的核酸が、対応する個別の標的特異的ビーズセットに特異的に結合しうる対応する検出可能な標的分子へと変換されている、前記標的特異的ビーズセット集団を検出可能な標的分子の集団を含む可能性のある分子集団と溶液中でハイブリダイズさせること;および
(c)標的特異的ビーズにハイブリダイズした検出可能な標的分子を溶液中でスクリーニングして前記標的核酸集団の発現レベルを測定することを含み、
前記スクリーニングがLuminexアナライザーを用いて行われる
当該測定方法。 - 前記標的特異的ビーズセット集団が、対応する標的核酸セットに結合可能な個別ビーズセットを少なくとも1つ含む請求項41に記載の方法。
- 前記標的特異的ビーズの集団が、対応する標的核酸セットに結合可能な個別ビーズセットを少なくとも100個含む請求項42に記載の方法。
- 前記標的核酸集団がmRNAの集団である請求項41に記載の方法。
- 前記標的核酸がmiRNAの集団である請求項41に記載の方法。
- 前記miRNAが疾患と関連しており、コントロールと比較した前記miRNAの発現レベルが疾患関連性の指標となる請求項45に記載の方法。
- 前記標的特異的ビーズセットが、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを用いてカルボキシル化Luminexマイクロスフェア(microsphere)に結合したアミン修飾捕捉プローブを含む請求項41に記載の方法。
- 前記捕捉プローブがDNAまたはLNAである請求項41記載の方法。
- 各標的核酸が、
(a)miRNAに少なくとも1つのアダプターを付加して、アダプター−miRNA分子を生成する工程;および
(b)前記アダプター−miRNA分子を検出可能なように標識して前記標的核酸に対応する検出可能な標的分子を生成する工程を含む工程
により、対応する検出可能な標的分子へと変換されたmiRNAである請求項41に記載の方法。 - 前記アダプターがビオチンである請求項49に記載の方法。
- 前記アダプターが直接化学標識法または酵素末端標識法から選択される1つの方法により付加される請求項49に記載の方法。
- 前記アダプター−miRNA分子の検出がチラミドシグナル増幅または3DNAシステムから選択される1つの方法により増幅される請求項50に記載の方法。
- 前記アダプターがストレプトアビジン−R−フィコエリトリンを用いて検出可能に標識される請求項50に記載の方法。
- 前記標的核酸に対応する前記検出可能な標的分子が前記標的核酸の転写により生成され、前記転写が前記アダプターを取り込む請求項49に記載の方法。
- 前記アダプターがビオチンである請求項54に記載の方法。
- 前記アダプター−miRNA分子がチラミドシグナル増幅または3DNAシステムから選択される1つの方法により検出可能に標識される請求項55に記載の方法。
- 前記アダプターがストレプトアビジン−R−フィコエリトリンを用いて検出可能に標識される請求項55に記載の方法。
- 標的核酸集団の発現レベルを溶液中で測定するためのキットであって、
(a)各標的特異的ビーズセットが個別に検出可能であり、対象となる個別の標的核酸に対応する捕捉プローブに結合可能なものである、検出可能なビーズセット集団;
(b)対象となる標的核酸を、対応する個別の標的特異的ビーズセットに特異的に結合することになる対応する標的分子に変換するための成分;および
(c)請求項41に記載の方法を行うための説明書
を含む当該キット。
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