KR20140094007A

KR20140094007A - 핵산의 고도로 다중화된 정량 검출

Info

Publication number: KR20140094007A
Application number: KR1020147016411A
Authority: KR
Inventors: 크리스 스카부; 패트릭 마르틴; 브라드 타프트; 제이슨 라
Original assignee: 엔브이에스 테크놀로지스 인코포레이티드
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2014-07-29
Also published as: EP2780479A1; CN104093857A; CA2855953A1; WO2013074163A1; JP2014533502A; MX338076B; IL232586A0; EP2780479A4; BR112014011937A2; AU2012337389A1; SG11201402341QA; HK1199746A1; MX2014005912A

Abstract

본 발명은 다중화된 단일 챔버 반응에서 샘플 중의 표적 핵산을 검출하고 정량하는 방법을 제공한다. 고효율 어레이(array) 근처의 신호 배경을 감소시키도록 최적화된 챔버를 포함하는 소모품뿐만 아니라 이의 사용 방법도 제공된다. 상기 소모품을 사용하여 본 방법을 실시하도록 구성된 디바이스 및 시스템도 본 발명의 특징이다.

Description

핵산의 고도로 다중화된 정량 검출{QUANTITATIVE, HIGHLY MULTIPLEXED DETECTION OF NUCLEIC ACIDS}

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2011년 2월 18일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/463,580호 및 2011년 11월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/561,198호(이들의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 도입됨)에 대한 우선권을 주장하는 2012년 2월 17일자로 출원된 미국 특허 출원 제13/399,872호에 대한 우선권을 주장한다.

연방정부 지원 연구 및 개발 하에서 만들어진 발명에 대한 권리에 관한 선언

본 발명은 미국 국토안보부 승인(계약번호 HSHQDC-10-C-00053)의 지원으로 만들어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 일부 권리를 갖는다.

발명의 분야

본 발명은 실시간 DNA 증폭, 검출 및 정량의 분야뿐만 아니라, 어레이(array)를 포함하는 관련 소모품(consumable), 디바이스(device) 및 시스템의 분야에 관한 것이다.

실시간 PCR은 생물학적 샘플 중의 관심 있는 핵산의 검출을 위해 통상적으로 사용된다. 실시간 PCR의 검토에 대해서는 예를 들면, 문헌(M TevfikDorak (Editor) (2006) Real - time PCR ( Advanced Methods ) Taylor & Francis, 1st edition ISBN-10: 041537734X ISBN-13: 978-0415377348) 및 문헌(Logan et al. (eds.) (2009) Real-Time PCR : Current Technology and Applications, Caister Academic Press, 1st edition ISBN-10: 1904455395, ISBN-13: 978-1904455394)을 참조한다. 추가 세부사항에 대해서는 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호(Gelfand et al. "Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity of A Nucleic Acid Polymerase"); 문헌(Leone et al. (1995) "Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA." Nucleic Acids Res. 26:2150-2155); 및 문헌(Tyagi and Kramer (1996) "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization" Nature Biotechnology 14:303-308)도 참조한다. 전통적으로, 단일 반응 용기(예를 들면, 다중웰 플레이트의 웰)에서 샘플 당 1종 초과의 표적 핵산을 검출하는 데에 이용되는 단일 웰 다중화(multiplexing)는 각각의 앰플리콘(amplicon)에 대해 특이적인 자체 소광 PCR 프로브, 예컨대, 택만(TAQMAN)™ 또는 분자 비이콘(Beacon) 프로브의 사용을 통해 달성된다. 용액 중의 앰플리콘과의 결합 시, 또는 PCR 동안 상기 프로브의 분해 시, 상기 프로브는 비소광되어 검출가능한 신호를 생성한다. 상기 프로브는 상이한 파장의 형광단으로 표지되어 단일 "1 용기(one pot)" 반응에서 최대 약 5종의 표적의 다중화 가망성을 허용한다. 실제 스펙트럼 범위 및 표지(label) 방사 한계로 인해 반응 당 약 5종 초과의 프로브는 달성하기 어렵다. 이것은 단일 반응의 다중화를 심하게 제한하여, 샘플 당 많은 표적이 스크리닝될 수 있는 방법을 상당히 제한하고 관심 있는 다수의 표적을 검출하는 데에 있어서 시약(reagent) 비용 및 기기 복잡성을 가중시킨다.

핵산 어레이는 증폭 생성물의 검출을 다중화하는 또 다른 방법을 대표한다. 가장 전형적으로, 샘플에 대한 증폭 반응이 수행되고, 앰플리콘이 핵산 어레이 상에서 별도로 검출된다. 예를 들면, 미국 특허 제6,350,580호(Sorge "Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure")는 증폭 혼합물로부터 프로브를 정제한 후 이 프로브를 검출함으로써 증폭 시 방출되는 프로브의 포획을 제안한다. 앰플리콘을 제조하고 검출하는 이 다단계 방법은 증폭 혼합물의 실시간 분석을 비현실적이게 만든다.

포획 핵산의 존재 하에서 반응물을 증폭하는 다양한 방법들도 제안되었다. 예를 들면, 미국 특허 제6,270,965호(Kleiber et al. "Integrated Method and System for Amplifying And Detecting Nucleic Acids")는 소멸(evanescence) 유도된 형광을 통한 앰플리콘의 검출을 제안한다. 마찬가지로, 미국 특허 제7,829,313호(Alexandre et al "Identification and Quantification of a Plurality of Biological (Micro) Organisms or Their Components")는 어레이 상에서의 앰플리콘의 검출을 제안한다. 또 다른 예에서, 예를 들면, 전극과의 결합에 이어서 전기화학적 검출을 이용하여 증폭의 결과로서 생성된 프로브 단편을 검출함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 검출한다. 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2007/0099211호(Aivazachvilli et al. "Detection of Nucleic Acid Amplification"); 미국 특허출원 공개 제2008/0193940호(Aivazachvilli et al. "Systems and Methods for Detecting Nucleic Acids"); 및 미국 특허출원 공개 제2008/0241838호(Scaboo et al. "Methods And Systems for Detecting Nucleic Acids")를 참조한다.

이들 방법은 모두 다중 표적 핵산 검출을 위한 이들의 이용을 제한하는 현실적 한계를 갖는다. 예를 들면, 클레이버(Kleiber)(미국 특허 제6,270,965호)는 어레이 표면에서 앰플리콘의 형광을 검출하기 위해 소멸 유도된 형광에 의존하고 복잡하고 값비싼 광학소자 및 어레이를 요구한다. 알렉산드르(Alexandre)(미국 특허 제7,829,313호)는 어레이 상에서의 앰플리콘의 검출을 제안하고, 클레이버의 특허에서와 마찬가지로 이것은 각각의 어레이가 각각의 앰플리콘을 검출하도록 주문제작되어야 하기 때문에 어레이 비용을 상당히 증가시킨다. 현실적으로, 특히 앰플리콘이 알렉산드레의 특허에서와 같이 상대적으로 큰 경우 어레이 상의 이질적인 앰플리콘들에 대해 유사한 혼성화 반응속도(kinetics)를 달성하는 것은 어려울 수 있다. 게다가, 이 기술은 높은 수준의 신호 배경도 포함하는 부수적인 용액상(solution phase)이 존재하는 어레이 상의, 또는 동일반응계 열 순환(in situ thermal cycling)을 통해 안정한 상태로 유지되는 어레이들의 신호를 어떻게 검출하는지에 관한 지침을 거의 제공하지 않는다.

본 발명은 당분야에서 이러한 문제점들 및 다른 문제점들을 해결한다. 본 발명의 보다 완전한 이해는 하기 설명의 완전한 검토 시 얻어질 것이다.

발명의 요약

본 발명은 예를 들면, 생물학적 샘플 중의 바이러스, 세균, 열원충(plasmodium), 진균 또는 다른 병원체의 검출을 위한 관심 있는 핵산의 고도로 다중화된 검출을 허용하는 방법, 및 관련 디바이스, 시스템 및 소모품을 제공한다. 상기 소모품은 챔버의 내면 상에 고효율 열안정성 핵산 검출 어레이를 갖는 신호-최적화된 챔버를 포함한다. 상기 어레이는 최대 약 100종 이상의 상이한 보편적 표지된 프로브를 검출하도록 구성된다. 상기 방법은 챔버에서 수행되는 증폭 반응에 의한 관심 있는 핵산의 일부의 증폭 동안 상기 보편적 표지된 프로브를 ("프로브 단편"으로서) 발생시킨다. 상기 보편적 프로브는 수회의 증폭 주기(사이클) 후 어레이에 혼성화된 후, 선택된 증폭 주기 후 샘플 중의 관심 있는 하나 이상의 핵산의 실시간 검출 및 정량 둘다를 가능하게 한다.

따라서, 제1 양태에서, 표적 핵산을 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 챔버의 하나 이상의 표면 상에 하나 이상의 고효율 핵산 검출 어레이를 갖는 검출 챔버를 제공하는 단계를 포함한다. 고효율 어레이는 전형적으로 챔버 내의 반응에 의해 생성된 검출가능한 프로브 단편의 증가된 포획 비율(속도)를 허용하는 비-비율 제한 수(non-rate limiting number)의 포획 핵산을 갖고, 상기 포획 핵산은 상대적으로 작은 프로브 핵산을 포획하도록 구성되어 있는데, 이것도 어레이 효율을 증가시킨다. 프로브와 어레이의 결합 검출은 바람직하게는 어레이 근처(proximal)에서 예를 들면, 비결합된 자유 프로브로부터 발생되는 배경 신호 수준을 감소시키도록 선택되거나 구성된 조건 하에서 수행된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 챔버 자체는 예를 들면, 배경을 감소시키도록 챔버를 성형하여(예를 들면, 챔버를 어레이 근처에서 상대적으로 얇게 만들어(예를 들면, 챔버는 전형적으로 어레이 위쪽에서 약 500 ㎛ 또는 이보다 얕음)) 어레이 근처의 신호 배경을 감소시키도록 구성된다. 또한, 보다 얇은 챔버는 보다 적은 열 질량을 갖고 보다 두꺼운 챔버보다 더 신속하고 더 효율적으로 온도 순환될 수 있다. 상기 시스템 및 방법이 배경 신호의 수준을 감소시키도록 구성되는 다른 방식은 보다 상세히 후술되어 있다.

검출될 표적 핵산의 하나 이상의 카피를 갖는 샘플은 검출 챔버 내로 로딩(load)된다. 증폭 프라이머 및 표지된 프로브는 상기 하나 이상의 표적 핵산 카피에 혼성화된다. 하나 이상의 표적 핵산 카피의 적어도 일부는 증폭 프라이머 의존적 증폭 반응에서 증폭된다. 상기 증폭 반응은 예를 들면, 증폭 효소의 핵산분해효소(nuclease) 활성으로 인해 표지된 프로브의 절단을 야기한다. 이것은 어레이에 의해 검출될 표지된 프로브 단편의 방출을 야기한다. 표지된 프로브 단편은 (전형적으로, 챔버에서 방출된 프로브 단편의 양을 증폭하기 위해 수회 증폭 주기가 실시된 후) 고효율 어레이에 혼성화된다. 그 다음, 표지된 프로브 단편이 어레이에 결합함으로써 생성된 표지 신호가 검출되고, 이로써 표적 핵산이 검출된다.

검출 챔버의 정밀한 구성은 다양할 수 있다. 상기 구성은 어레이 근처의 챔버 내에서 신호 배경을 감소시키도록 선택된다. 일반적으로, 챔버 내의 신호의 1% 이상, 종종 약 5% 이상이 어레이의 영역에서 어레이에 집중되어 있다(예를 들면, 약 6%, 8% 또는 심지어 10% 이상). 보다 낮은 수준이 종종 바람직하지만, 99% 이하의 총 배경 신호가 상기 시스템에 의해 표준화(normalizing)될 수 있다. 본원에 기재된 전형적인 실시양태에서, 95% 이하의 총 배경 수준은 어레이 근처의 챔버의 구성을 최적화함으로써 달성된다. 이러한 구성 최적화는 예를 들면, 어레이 위쪽 챔버의 깊이를 최소한으로 유지함으로써 달성된다. 전형적인 실시양태에서, 챔버는 어레이 근처의 깊이 또는 다른 치수가 약 1 mm 미만, 보다 전형적으로 어레이 근처의 하나 이상의 치수가 약 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 약 250 ㎛ 이하, 예를 들면, 약 10 ㎛ 내지 약 200 ㎛이고, 몇몇 실시양태에서 챔버는 어레이 근처의 치수가 약 150 ㎛이다. 본원의 일례에서, 챔버는 어레이 위쪽 깊이가 약 142 ㎛이다. 본원의 또 다른 예에서, 챔버는 깊이가 약 100 ㎛이다. 예를 들면, 광을 어레이 상으로 통과시킴으로써 신호를 발생시키는 경우, 관련 챔버 치수는 검출 시스템의 신호 검출 경로에 의해 좌우되고, 광의 일부가 어레이를 통해 빠져나와 어레이 위쪽 유체 내로 들어가는 경우, 관련 치수는 어레이 위쪽 챔버 깊이이다. 챔버 두께의 감소는 검출된 배경 신호의 수준을 감소시키는 것 이외에 배경 노이즈(noise) 성분, 예를 들면, 반응 유체로부터의 어레이 스폿(spot) 신호 및 배경 신호의 특이적 검출과 관련 없는 검출기 반응의 기여를 감소시키는 이점도 갖는다. 특히, 한 주요 노이즈 기여자는 일반적으로 반응 챔버의 두께에 비례하는 검출된 신호의 총량의 제곱근만큼 증가하는, 이용된 검출기로부터의 숏(shot) 노이즈이다. 따라서, 반응 챔버의 감소된 두께를 제공함으로써 배경 노이즈를 감소시키고, 결과적으로 전체 시스템의 신호 대 배경 노이즈 비(SNR)를 증가시킨다. 다른 잠재적 노이즈 기여자는 과량의 광, 예를 들면, 필터링되지 않은 여기 광, 비의도된 주변 광, 산란된 형광, 시스템 성분의 자가형광 등의 검출을 포함한다. 다수의 이들 노이즈 기여자들은 통상적인 방법, 예컨대, 과량의 여기 광을 제거하거나 감소시키기 위한 적절한 광학 필터의 이용, 검출기에서 주변 광을 감소시키거나 방지하는 밀봉된 광학 시스템의 이용, 및 검출기에서 신호 혼선을 감소시키거나 제거하기 위한 어레이 스폿 크기 및 간격의 구성을 통해 감소될 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 어세이 방법 및 시스템을 위한 SNR은 전형적으로 2.5 이상, 바람직하게는 3 초과, 4 초과, 5 초과, 10 초과, 또는 몇몇 경우 20 이상일 것이다.

배경 신호를 감소시키도록 본 발명의 시스템 및 방법을 구성하는 대안적 또는 추가적 방법도 본 발명의 디바이스 및 방법과 함께 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 디바이스 및 시스템은 총 내부 반사 형광 현미경관찰("TIRF") 구성을 이용하여 여기 조명을 포획 어레이에 제공하도록 구성될 수 있고, 이때 여기 광은 전체적으로 내부 반사되도록 포획 어레이 아래의 기재(substrate)로 향한다(예를 들면, 문헌(Tokunaga et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 235, 47 (1997)) 및 문헌(P. Ambrose, Cytometry, 36, 244 (1999)) 참조). 이것에도 불구하고, 표면으로부터 기하급수적으로 붕괴되어, 용액의 나머지 부분에서 형광단을 여기시키지 않으면서 표면 근처에서, 예를 들면, 100 nm의 깊이까지 효과적인 조명을 발생시키는 소멸파가 어레이의 기재-유체 계면에서 발생한다.

또 다른 대안적 또는 추가적 방법에서, 본 발명의 분석 방법에서 사용된 반응물은 실제 프로브/어레이 결합 신호에 비해 상대적으로 배경 신호를 감소시키도록 구성된다. 예를 들면, 배경 신호는 예를 들면, FRET 구축물에서 포획 어레이 프로브 및 표지된 프로브 단편 상의 협력적 형광단의 사용을 통해 감소될 수 있다. 구체적으로, 제1 여기 스펙트럼 및 제1 방출 스펙트럼을 갖는 공여체 형광단이 포획 프로브 및 표지된 프로브 단편 중 하나에 커플링될 수 있다. 상기 공여체의 방출 스펙트럼과 중첩되고 상기 공여체의 여기 스펙트럼과 상이한 여기 스펙트럼을 갖는 수용체 형광단이 다른 프로브에 커플링된다. 상기 포획 프로브와 상기 표지된 프로브 단편이 혼성화할 때, 상기 공여체 및 상기 수용체는 에너지 전달을 위해 충분히 인접하여 존재하게 되어 수용체 형광단의 방출 스펙트럼에 상응하는 독특한 형광 신호를 발생시킨다. 공여체의 여기 스펙트럼 내에서만 여기하고 공여체의 방출 스펙트럼을 여과하도록 광학 시스템을 구성함으로써 혼성화 시 수용체로부터의 에너지 전달 신호로부터 발생하는 신호를 선택적으로 검출할 수 있다. 매우 다양한 FRET 표지 쌍이 이미 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,008,373호(Waggoner) 및 제7,449,298호(Lee et al.) 참조).

대안적인 구성에서, 배경 신호에 대한 가능성을 더욱 감소시키기 위해 상호작용적 표지 기(interactive labeling groups)가 사용된다. 특히, 본 발명의 일 측면에서, 포획 프로브는, 신호 생성 표지가 어레이의 표면에 속박(tether)되도록, 형광단으로 표지된다. 이러한 관점에서, 표지된 프로브 및 표지된 프로브 단편은 형광단에 상보적인, 즉 포획 프로브 표지의 형광을 소광시킬 수 있는 소광제 기를 보유한다. 소광제는, 포획 프로브에 혼성화되는 경우, 형광 신호를 소광시키기 위해 포획 프로브 상의 형광단에 충분히 근접하도록, 표지된 프로브 단편의 일 위치 상에 제공된다. 예를 들면, 표지된 프로브 단편이 자신의 5' 말단에서 소광제로 표지되는 경우, 포획 프로브는 3' 또는 다른 상보성 위치에 형광단을 보유할 것이다. 본 발명의 어레이의 관점에서, 표적 서열의 증폭은, 표지된 포획 프로브와 혼성화되는 경우 어레이로부터의 형광 신호를 소광시키는 표지된 프로브 단편을 생성하고, 그 결과 표적 신호의 존재를 의미하는 음성 신호가 생성된다. 특히, 어레이 상의 포획 프로브는 혼성화되지 않은 상태에서 신호를 생성한다. 표적 서열의 증폭시, 소광제 보유 프로브 단편이 방출되어 어레이 상의 상보성 포획 프로브에 혼성화하여, 이의 회합된 형광단에서 나온 신호를 소광시키고, 혼성화되지 않은 어레이 위치와 비교해서 어레이 상에 어두운 위치를 만들어낸다. 어레이를 위한 검출 조건 하에 형광 신호를 생성하지 않는 소광제 기를 제공함으로써, 비절단된 프로브 또는 비결합된 표지된 프로브 단편에서 나온 임의의 배경 형광이 제거된다.

인식되는 바와 같이, 예를 들면, 신호를 검출기의 초점면 내에 집중시키도록 반응 챔버를 구성하는 방법, 용액에서 비결합되어 있을 때에 비해 어레이에 결합되어 있을 때 상이한 방출 스펙트럼을 제공하는 상호작용적 표지 기법을 이용하는 방법, 또는 절단된 프로브 단편으로 분리되어 있을 때에 비해 동일한 온전한 프로브로 존재할 때 감소된 형광을 갖는 자체 소광 프로브를 사용하는 방법을 포함하는 다수의 방법이 반응 용액 중의 비결합된 온전한 표지된 프로브로부터의 신호 또는 배경 신호의 기여를 결합된 표지된 프로브 단편으로부터 검출된 신호에 비해 상대적으로 감소시키기 위해 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다.

전술된 바와 같이, 어레이는 전형적으로 표지된 프로브 단편에 혼성화하는 비-비율 제한 수의 포획 핵산을 포함한다. 이것은 증폭 반응이 증폭 동안 다수의 프로브 단편을 생성하여 프로브 단편과의 결합에 이용될 수 있는 어레이 상의 부위의 수(예를 들면, 접근가능한 상보적 포획 핵산)에 대해 포화하지 않는 반응 혼합물 중의 프로브 단편 농도를 발생시키는 것을 의미한다. 다시 말하면, 어레이 상의 결합 부위의 수는 증폭 반응에서 생성된 프로브 단편의 농도에서 포화될 결합 부위의 수를 초과하여, 바람직하게는 충분히 초과하여 유지된다. 어레이 상의 부위의 수가 비율 제한적이지 않기 때문에, 어레이 상의 프로브 단편 대 용액 중의 배경 프로브 단편의 비가 최적화된다. 전형적인 어레이 밀도는 약 350 fmol/㎠ 이상, 예를 들면, 약 2,000 fmol/㎠ 이상, 2,500 fmol/㎠ 이상, 3,000 fmol/㎠ 이상, 4,000 fmol/㎠ 이상, 4,500 fmol/㎠ 이상 또는 5,000 fmol/㎠ 이상이다. 몇몇 실시양태에서, 어레이 상의 프로브에 결합하는 부위의 수는 증폭 동안 생성된 프로브 단편의 농도에 의해 포화될 부위의 수의 1배 이상이고 임의적으로 5배, 10배, 50배 또는 그 이상이다. 상기 비는 증폭 주기의 수 및 생성된 프로브의 양에 따라 달라질 것이다. 또한, 어레이의 효율은 포획될 프로브 단편의 길이의 함수이다. 프로브가 혼성화 동안 주어진 T_m에서 결합할 정도로 충분히 길어야 하지만, 보다 짧은 단편은 전형적으로 보다 효율적인 혼성화를 나타낸다. 어레이에 의해 포획될 전형적인 프로브 단편은 길이가 약 50개 뉴클레오티드 이하이고, 어레이는 상응하는 상보성 포획 핵산 서열을 갖는 부위를 포함한다(포획 핵산은 임의적으로 예를 들면, 표면 위의 상보성 부위를 이격시켜, 예를 들면, 표면 효과를 감소시키기 위해 추가 서열도 포함할 수 있다). 보다 전형적으로, 프로브 및 포획 서열은 길이가 약 40개 뉴클레오티드 이하, 예를 들면, 약 30개, 약 20개 또는 약 15개 뉴클레오티드이거나 이보다 짧다.

몇몇 경우, 주어진 분석에서 사용되는 포획 어레이 프로브 및 상보성 표지된 프로브 단편은 이들이 어레이의 모든 구성원들에 대해 좁은 범위의 T_m을 제공하도록 선택된다. 구체적으로, 포획 어레이와의 일관된 최적 혼성화를 보장하기 위해, 주어진 어레이에서 포획 프로브는 어레이의 모든 다른 구성원의 약 10℃ 이내의 T_m, 바람직하게는 어레이의 모든 다른 프로브의 약 7℃, 5℃ 또는 3℃ 이내의 T_m을 각각 가질 것이다. 이러한 좁은 T_m 범위는 일관된 혼성화를 가능하게 하고 어레이의 모든 구성원 전체에서의 신호 발생을 야기한다.

전형적인 실시양태에서, 혼성화 온도는 증폭 반응의 온도보다 낮으므로, 포획 핵산에 대한 프로브 단편의 T_m이 프로브의 분자내 T_m보다 낮을 수 있고/있거나(예를 들면, 프로브가 배경을 감소시키기 위해 소광제를 포함하는 경우), 표적 핵산에 대한 프로브의 T_m보다 낮을 수 있다. 즉, 전형적인 열순환 실시양태에서, 증폭 반응은 혼성화 단계보다 더 높은 온도에서 수행되므로, 표적 핵산에 대한 프로브의 T_m은 전형적으로 어레이에 대한 프로브 단편의 T_m보다 더 높을 것이다. 표지된 프로브는 전형적으로 표적 핵산에 상보적이지 않은 제1 오르토고날 플랩(orthogonal flap)을 포함하고, 이 플랩은 표지된 프로브로부터 절단되어 표지된 프로브 단편을 생성한다. 표지된 프로브는 임의적으로 (예를 들면, 제1 플랩 상의 표지의 인접성-기반(based) 소광을 제공하기 위해) 상기 제1 플랩에 적어도 부분적으로 상보적인 제2 오르토고날 플랩(예를 들면, 소광제 모이어티(moiety)에 커플링되어 있음)을 포함한다. 제1 플랩과의 결합에 대한 제2 플랩의 T_m이 어레이와의 결합에 대한 제1 플랩의 T_m보다 더 높은 경우 배경이 감소된다. 이러한 구성에서, 연장 반응은 제1 온도, 즉 표적 핵산에 대한 온전한 프로브의 T_m보다 낮지만 온전한 프로브의 분자내 T_m 및 어레이 상의 포획 프로브에 대한 프로브 단편의 T_m 둘다보다 높은 온도에서 일어난다. 연장 후, 반응 온도가 낮아지기 때문에, 반응 온도는 프로브의 분자내 T_m 아래에서 크로싱(cross)하여 프로브의 이차 구조의 형성 및 이로 인한 형광단의 소광을 가능하게 한다. 포획 프로브에 대한 프로브 단편의 T_m 미만까지 더 냉각시키는 것은 프로브 단편과 어레이의 혼성화 및 이의 회합된 형광단의 검출을 가능하게 한다. 온전한 프로브가 그의 이차 구조로 이미 형성되어 있기 때문에, 상기 온전한 프로브는 포획 프로브에 결합할 가능성이 보다 낮고 소광되므로, 온전한 프로브의 비의도된 포획 및 용액 중의 (또는 포획 프로브 어레이에 결합되어 있을 수 있는) 온전한 프로브 상에 존재하는 형광단으로부터의 배경 신호가 감소된다. 일부 양태에서, 소광제가 본 발명의 온전한 프로브 상에서 사용되지만, 놀랍게도, 소광제가 프로브로부터 누락됨으로써 배경이 증가되는 경우조차도 최적화된 챔버 디자인 및 고효율 어레이가 어레이 신호를 배경으로부터 구별하는 것을 달성하기 때문에, 일부 실시양태에서 소광제는 프로브 상에 존재할 필요가 없다는 것을 확인하였다.

다른 실시양태에서, 표지된 프로브 단편과 이의 상보성 포획 핵산은 연장 반응 온도보다 더 높은, 예를 들면, 10℃ 이상 더 높은 T_m을 갖도록 디자인되거나 선택된다. 따라서, 연장 반응이 예를 들면, 55℃ 내지 60℃에서 수행되는 경우, 표지된 프로브 단편과 포획 핵산의 T_m은 전형적으로 예를 들면, 71℃일 것이다. 이러한 경우, 어레이 상의 포획 핵산으로의 표지된 프로브 단편의 혼성화는 연장 반응과 동일한 온도에서 일어나므로, 어레이에 혼성화시키고 생성된 신호를 검출하기 위해 온도를 더 감소시킬 필요성이 없어진다. 그 결과, 3 단계 온도 프로파일보다는 오히려 2 단계 온도 프로파일이 이용될 수 있다.

온전한 표지된 프로브와 관련하여, 표적 서열에 결합하는 프로브 부분을 기준으로 한 오르토고날 표지된 프로브 단편의 배향은 변경될 수 있다. 구체적으로, 방출 표지된 프로브 단편은 프로브의 표적 특이적 부분으로부터 절단된 말단이 포획 프로브와 어레이 표면의 커플링 지점에 가깝게 또는 멀게 존재하는 배향으로 어레이 상의 포획 프로브와 혼성화할 수 있다. 몇몇 경우, 예를 들면, 임의의 온전한 프로브가 프로브의 표적 특이적 부분을 어레이의 표면 쪽으로 돌출시키는 배향으로만 포획 프로브에 결합하게 함으로써, 그 결합과의 잠재적인 표면 간섭을 이용하여 어레이에 의한 온전한 프로브의 원치 않는 포획 가능성을 더 감소시킬 수 있다. 이러한 방법은 어레이 상의 고체 표면, 예를 들면, 실리카 기재 등의 경우 특히 유용하다.

샘플은 소모품의 정밀한 구성에 따라 임의의 다양한 기작에 의해 챔버 내로 로딩될 수 있다. 한 편리한 적용에서, 샘플은 챔버와 작동가능한 소통(communication) 상태에 있는 하나 이상의 포트(port) 또는 유체 채널을 통해 로딩된다. 예를 들면, 포트는 챔버 내로 안내하는 포트를 갖도록 소모품의 상면에서 제작될 수 있다. 이것은 예를 들면, 피펫 또는 다른 유체 전달 디바이스를 통한 단순화된 로딩를 제공한다. 대안적으로, 유체 또는 미세유체 채널, 모세관 등이 샘플 전달을 위해 이용될 수 있다.

본원의 방법은 샘플 중의 관심 있는 핵산의 검출 및/또는 상기 핵산의 정량을, 예를 들면, 실시간으로 수행하는 데에 이용될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 신호를 검출하기 전에 임의적으로 표적 핵산을 다회 증폭 주기에서 증폭하는데, 이때 표적 핵산 부분은 신호 검출 후에 즉, 추가 카피의 표지된 프로브의 존재 하에서 추가로 증폭된다. 그 결과 방출된 표지된 프로브 단편은 어레이에 후속적으로 혼성화되고 검출되는데, 이때 검출된 신호 강도는 샘플에 존재하는 표적 핵산의 존재 및/또는 양과 상호관련되어 있다. 전형적으로, 증폭에 의해 방출된 프로브 단편의 수를 증가시켜 신호 수준을 증가시키기 위해 초기 검출 전에 샘플을 1회 초과의 주기 동안 증폭한다. 예를 들면, 어레이로부터의 신호를 검출하기 전에 임의적으로 표적 핵산을 예를 들면, 적어도 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상의 증폭 주기 동안 증폭할 수 있다.

표지된 프로브는 전형적으로 형광 또는 발광 표지를 포함하지만, 다른 표지, 예컨대, 양자점도 이용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 표지는 형광 염료이다. 프로브 단편에 의해 생성된 신호는 전형적으로 광학 신호이다. 표지된 프로브는 임의적으로 표지 및 표지 소광제를 포함하고, 표지된 프로브의 절단은 표지와 소광제를 분리시켜 표지를 비소광시킨다. 그러나, 전술된 바와 같이, 소광제는 본 발명의 실시에서 요구되지 않는다.

신호는 전형적으로 프로브 또는 프로브 단편 상의 광학 표지에 상응하는 하나 이상의 광학 신호 파장을 검출함으로써 검출된다. 어레이 상의 프로브 단편의 결합 위치는 상이한 프로브 간을 구별하는 데에 이용될 수 있기 때문에, 다중화된 증폭 반응(1종 초과의 표적이 샘플에 존재하는 경우 다수의 표적 핵산을 증폭하도록 디자인된 증폭 반응)에서 프로브를 구별하기 위해 상이한 프로브 상의 상이한 표지를 사용할 필요가 없다. 그러나, 다중화 성능을 향상시키기 위해 다수의 프로브 표지가 사용될 수 있다. 다수의 프로브가 사용되는 경우, 신호의 검출은 다수의 상이한 표지(예를 들면, 상이한 프로브 상의 상이한 형광 염료 모이어티)에 의해 발생된 다수의 신호로부터 다수의 광학 신호 파장을 검출하는 것을 포함할 수 있다.

어레이에 결합하는 프로브 단편, 예를 들면, 표지된 프로브 단편에 부착되는 표지 기의 관점에서 일반적으로 기재되어 있지만, 미리 표지된 프로브의 사용을 필요로 하지 않는 다른 검출 방법이 이용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 인터칼레이팅(intercalating) 염료가 사용될 수 있다. 인터칼레이팅 염료는 전형적으로 이중 가닥 핵산 내로의 도입 시 또는 삽입 시 검출가능한 신호를 제공한다. 본 발명과 관련하여, 절단된 프로브 단편과 어레이 상의 상보성 프로브의 혼성화는 인터칼레이팅 염료를 도입하여 상기 혼성화를 표시하는 독특한 신호를 제공할 수 있는 이중 가닥 이중체를 어레이 표면에서 생성한다. 인터칼레이팅 염료는 당분야에 잘 공지되어 있고 예를 들면, 모든 목적을 위해 본원에 참고로 도입되는 문헌(Gudnason et al., Nucleic Acids Research, (2007) Vol. 35, No. 19, e127)에 기재된 인터칼레이팅 염료를 포함한다. 마찬가지로, 광학 신호 검출 방법이 특히 바람직하지만, 비광학 표지 및/또는 검출 방법을 이용하여, 예를 들면, 임의적으로 검출기 표면에서 또는 검출기 표면 근처에서 프로브 단편과 어레이 프로브의 혼성화의 검출을 증폭하기 위해 예를 들면, 큰 하전된 기를 보유하는 전기화학적 표지 기와 함께 전기화학적 검출 방법, 예를 들면, ChemFETS, ISFETS 등을 이용하여 프로브 구성 및 어세이 방법을 일반적으로 실시할 수도 있다.

어레이의 하나 이상의 영역에 대한 국소 배경(local background)이 검출될 수 있는데, 이때 신호 강도 측정치는 상기 배경에 대해 보정됨으로써 표준화된다. 전형적으로, 표준화된 신호 강도는 총 신호의 약 10% 미만, 예를 들면, 총 신호의 약 1% 내지 약 10%이다. 한 예시적 부류의 실시양태에서, 표준화된 신호 강도는 총 신호의 약 4% 내지 약 7%이다. 전형적으로, 대략 1% 이상의 신호가 어레이에 국지화되어 있는(localized) 경우, 예를 들면, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 그 이상의 신호가 챔버의 한 영역에 대한 어레이에 국지화되어 있는 경우, 어레이 신호를 배경으로부터 구별할 수 있다. 훨씬 더 낮은 수준의 신호를 배경으로부터 구별할 수 있지만, 이것은 일반적으로 바람직하지 않다. 본원의 방법은 어레이 포획 핵산 스폿팅(spotting)에서의 가변성에 대해 보정함으로써(예를 들면, 스폿 크기, 스폿 밀도, 또는 이들 둘다에 대해 보정함으로써), 또는 어레이의 상이한 영역들의 불균일한 시야에 대해 보정함으로써 신호 강도를 표준화하는 단계도 포함할 수 있다.

샘플 중의 다수의 표적 핵산을 동시에 검출하는 능력은 본 발명의 바람직한 양태를 나타낸다. 샘플은 하나의 표적 핵산 또는 다수의 표적 핵산을 가질 수 있고, 이때 어레이는 샘플 당 하나 초과의 표적을 검출할 수 있는 다수 종류의 포획 핵산을 포함한다. 상기 다수 종류의 포획 핵산은 어레이 상에서 공간적으로 분리되어, (전술된 바와 같이, 다수의 표지가 사용될 수 있지만) 다수의 표지의 사용에 대한 필요성을 없앤다. 다중 방법에서, 상이한 핵산 표적에 대해 각각 특이적인 다수의 증폭 프로브는 하나 이상의 표적 핵산을 포함할 수 있는 샘플과 함께 인큐베이팅된다. 예를 들면, 약 5종 내지 약 100종 이상의 포획 핵산이 존재할 수 있다. 검출될 각각의 잠재적 표적도 상이한 프로브를 사용할 것이며, 예를 들면, 임의적으로 증폭 반응에서 관심 있는 잠재적 표적에 대해 각각 특이적인 약 5종 내지 약 100종 이상의 표지된 프로브가 존재한다. 어레이는 상응하는 포획 핵산, 예를 들면, 약 5종 내지 약 100종 이상의 포획 핵산을 포함한다. 이것은 상응하는 수의 신호가 어레이에 의해 검출되고 프로세싱되게 한다. 예를 들면, 프로브 단편과 어레이의 혼성화 후 어레이 상의 신호의 배치(positioning)에 기초하여 약 5종 내지 약 100종 이상의 상이한 신호를 검출할 수 있다. 인식되는 바와 같이, 어레이 상의 포획 프로브 종류의 수는 일반적으로 단일 반응 부피 내에서 다중화될 수 있는 상이한 증폭 반응의 수에 의해 영향을 받을 것이다. 그러나, 보다 많은 수의 상이한 포획 프로브, 예를 들면, 100종 초과, 1,000종 초과 또는 10,000종 이상의 포획 프로브를 갖는 포획 어레이도 몇몇 경우, 예를 들면, 증폭 반응이 어레이에 의한 정보전송(interrogation), 등을 위해 풀링되는 경우에 사용될 수 있다.

본 발명의 이점은 하나의 포획 어레이 구성이 다수의 상이한 표적 핵산 서열 패널을 위해 이용될 수 있다는 점이다. 구체적으로, 제1 패널을 위한 프로브 세트는 패널 내의 표적에 대해 특이적인 제1 표적 특이적 부분 및 포획 어레이 상의 개별 프로브에 상보적인 제2 포획 부분을 갖는 프로브를 포함할 것이다. (부분적으로 중첩되든 아니면 완전히 상이하든 관계없이) 제2의 상이한 패널을 위한 프로브 세트는 그 패널에 대한 표적 특이적 부분을 포함할 것이지만, 포획 부분은 제1 패널의 프로브 세트의 포획 부분과 동일할 것이다. 다시 말하면, 임의의 표적 패널에 있어서, 프로브 세트는 그 패널을 위해 사용된 프로브의 반고정된 부분을 포함할 것이고, 상기 반고정된 부분은 포획 어레이의 구성원에 항상 상보적일 것이다. 프로브는 표적 핵산의 특이적 패널을 위해 선택되는 가변 부분도 포함할 것이다. 예를 들면, 분석 공정에서, 제1 세트 내의 각각의 프로브가 포획 프로브 어레이 상의 상이한 포획 프로브에 상응하는 제1 고정된 부분을 갖는 경우 제1 프로브 세트가 사용된다. 각각의 프로브는 제1 패널 내의 주어진 표적 서열에 상보적인 표적 특이적 부분도 포함한다. 제2 패널의 경우, 세트 내의 각각의 프로브가 동일한 제1 고정된 부분을 포함하되 그 패널 내의 표적에 대해 특이적인 제2 표적 특이적 부분을 갖는 경우 제2 프로브 세트가 사용된다.

도 1a를 참조하건대, 표지된 프로브의 부분 A는 가변 부분에 상응하지만, 부분 B는 어레이 상의 프로브에 상보적일 고정된 부분에 상응할 것이다. 보편적인 또는 일반적인 포획 어레이 및 포획 프로브 세트의 사용은 본 발명에서 사용된 소모품의 보다 효율적이고 보다 저렴한 제작을 가능하게 한다.

따라서, 샘플이 다수의 표적 핵산을 포함하는 한 실시양태에서, 본원의 방법은 상이한 표적 핵산에 대해 각각 특이적인 다수의 표지된 프로브를 표적 핵산과 함께 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 증폭 프라이머 의존적 증폭 반응에서 표적 핵산의 적어도 일부의 증폭은 다수 종류의 표지된 프로브의 절단 및 이로 인한 다수 종류의 표지된 프로브 단편의 방출을 야기한다. 다수 종류의 프로브 단편은 어레이에 혼성화된다. 상이한 종류의 프로브 단편 각각이 공간적으로 분리된 포획 핵산 종류에 혼성화된다. 표지 신호의 검출은 어레이 상의 공간적으로 분리된 포획 핵산에 상응하는 다수의 공간적으로 분리된 영역으로부터 다수의 표지 신호를 검출하는 것을 포함한다. 임의적으로, 몇몇 바람직한 실시양태에서, 다수 종류의 표지된 프로브는 동일한 표지 모이어티를 포함하지만, 추가 다중화 및/또는 차별적 대조군 또는 정합(registration) 프로브의 사용은 다수의 상이한 표지 모이어티의 사용을 포함할 수 있다. 전형적으로, 다수 종류의 표지된 프로브는 하나 이상의 상이한 표지 모이어티를 포함할 수 있는데, 이때 상이한 모이어티의 수는 표지된 프로브 종류의 수보다 적다.

본원의 방법을 수행하기 위한 디바이스 및 시스템은 본 발명의 특징이다. 상기 디바이스 또는 시스템은 챔버의 하나 이상의 표면 상에서 하나 이상의 고효율 핵산 검출 어레이를 포함하는 검출 챔버를 포함할 수 있다. 본원의 방법과 관련하여 전술된 바와 같이, 상기 챔버는 어레이로부터 검출된 신호에 대한 신호 배경을 감소시키도록 구성된다. 상기 디바이스 또는 시스템은 전형적으로 상기 디바이스의 작동 동안 챔버 내의 온도를 조절하는, 검출 챔버에 작동가능하게 커플링된 온도 조절 모듈을 포함한다. 광학 트레인(train)은 상기 디바이스의 작동 동안 어레이에서 생성된 신호(들)를 검출한다.

본원의 방법과 관련하여 전술된 바와 같이 배경을 감소시키기 위한 챔버의 치수적 특징들 전부가 임의적으로 상기 디바이스에 적용된다. 예를 들면, 상기 디바이스는 어레이 근처의 하나 이상의 치수에서 약 500 ㎛ 미만의 깊이, 예를 들면, 어레이 근처의 하나 이상의 치수에서 약 10 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 어레이가 형성되는 챔버 표면은 임의의 적합한 재료, 예를 들면, 세라믹, 유리, 석영 또는 중합체로 구성될 수 있다. 여러 실시양태에서, 예를 들면, 에피형광을 이용하는 실시양태에서, 표면은 적어도 부분적으로 투명할 것이다.

본원의 방법과 관련하여 전술된 바와 같이, 어레이 상의 포획 핵산은 전형적으로 디바이스의 작동 동안 비-비율 제한 밀도로 존재한다. 어레이는 임의적으로 예를 들면, 어레이의 공간적으로 분리된 상이한 영역에 국지화되어 있는 다수 종류의 포획 핵산을 포함한다. 예를 들면, 5종 이상의 상이한 포획 핵산, 예를 들면, 최대 약 100종 이상의 상이한 포획 핵산이 어레이 상에 존재할 수 있다. 포획 핵산은 어레이의 열순환을 용이하게 하는, 챔버의 표면 상의 열안정성 코팅에 임의적으로 커플링된다. 예시적 코팅은 임의적으로 화학적 반응성 기, 친전자성 기, NHS 에스테르, 테트라플루오로페닐 또는 펜타플루오로페닐 에스테르, 모노니트로페닐 또는 디니트로페닐 에스테르, 티오에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아실 아지드, 에폭사이드, 아지리딘, 알데하이드, 비닐 케톤 또는 말레이미드를 포함하는 α,β-불포화 케톤 또는 아미드, 아실 할라이드, 설포닐 할라이드, 이미데이트, 사이클릭 산 무수물, 고리화 첨가반응(cycloaddition reaction)에서 활성을 나타내는 기, 알켄, 디엔, 알킨, 아지드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

열 조절(thermo-regulatory) 모듈은 경우에 따라 열순환을 용이하게 하는 특징부, 예컨대, 열전기 모듈, 펠티에(Peltier) 디바이스, 냉각 팬, 방열재(heat sink), 챔버의 외면의 일부와 교접하도록 구성된 금속 플레이트 등을 포함한다. 전형적으로, 열 조절 모듈은 이 모듈을 제어하거나 이 모듈의 일부인 컴퓨터에 작동가능하게 커플링된 피드백 가능한(feedback enabled) 제어 시스템을 갖는다.

광학 트레인은 에피형광 검출 시스템을 포함할 수 있거나 이 시스템에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 전형적인 광학 트레인 부품은 하기 부품들 중 임의의 부품을 포함한다: 여기 광원, 아크(arc) 램프, 수은 아크 램프, LED, 렌즈, 광학 필터, 프리즘, 카메라, 광검출기, CMOS 카메라, 및/또는 CCD 어레이. 본원의 디바이스는 어레이에서의 신호의 위치를 검출될 핵산과 상호관련시키는 어레이 판독기 모듈도 포함할 수 있거나 이 모듈에 커플링될 수 있다.

본원의 디바이스 또는 시스템은 예를 들면, 컴퓨터 또는 컴퓨터 판독가능한 매체에서 구현되는 시스템 명령어를 포함할 수 있거나 이 시스템 명령어에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 상기 명령어는 예를 들면, 신호 강도의 하나 이상의 측정치를 열 조절 모듈에 의해 수행된 증폭 주기의 수와 상호관련시켜 상기 디바이스에 의해 검출되는 표적 핵산의 농도를 확인하기 위해 상기 디바이스 또는 시스템의 임의의 양태를 제어할 수 있다.

시스템은 예를 들면, 컴퓨터에 작동가능하게 커플링된 상기 디바이스를 포함할 수 있다. 컴퓨터는 예를 들면, 열 조절 모듈에 의한 열순환을 제어하고/하거나 영상이 광학 트레인에 의해 촬영되거나 가시화될 때를 특정하는 명령어를 포함할 수 있고/있거나, 영상 정보를 시간의 함수로서의 신호 강도 곡선으로 전환시킬 수 있고/있거나, 디바이스에 의해 분석된 표적 핵산의 농도를 측정할 수 있고/있거나, 기타 기능을 수행할 수 있다. 컴퓨터는 신호 강도를 표준화하여 배경 문제를 처리하기 위한 명령어, 예를 들면, 어레이의 하나 이상의 영역에 대한 국소 배경을 검출하고 상기 배경에 대해 보정함으로써 어레이 신호 강도 측정치를 표준화하기 위한 명령어를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 컴퓨터는 어레이 포획 핵산 스폿팅에서의 가변성, 어레이의 상이한 영역의 불균일한 시야 등에 대해 보정함으로써 신호 강도를 표준화하기 위한 명령어를 포함할 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 예를 들면, 본 발명의 방법을 실시하기 위해 예를 들면, 본 발명의 디바이스 및 시스템과 함께 사용될 핵산 검출 소모품을 포함한다. 상기 소모품은 예를 들면, 약 500 ㎛ 미만의 깊이를 갖는 얇은 챔버를 포함할 수 있고, 이때 상기 챔버는 윈도우(window)의 내면 상에 배치된 고효율 포획 핵산 어레이를 갖는 광학적으로 투명한 윈도우를 포함한다. 상기 소모품은 예를 들면, 상기 챔버에 유체 커플링된 하나 이상의 시약 전달 포트도 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 소모품은 챔버 내의 유체의 열순환을 허용하도록 구성된다.

본 발명의 디바이스, 시스템 및 방법과 관련하여 어레이 및 챔버에 대하여 전술된 모든 특징들은 소모품에도 적용된다(역의 경우도 성립). 예를 들면, 핵산 어레이는 이 어레이의 공간적으로 분리된 영역에 위치하는 다수의 상이한 종류의 포획 핵산을 포함할 수 있다. 포획 핵산의 밀도는 예를 들면, 약 2,000 fmol/㎠ 이상, 2,500 fmol/㎠ 이상, 3,000 fmol/㎠ 이상, 4,000 fmol/㎠ 이상, 4,500 fmol/㎠ 이상 또는 5,000 fmol/㎠ 이상일 수 있다.

마찬가지로, 챔버는 시약 전달 포트를 포함하는 제1 상면, 및 윈도우를 포함하는 투명한 하면을 포함할 수 있고, 예를 들면, 이때 상기 상면과 하면은 압력-민감성 접착재로 형성된 측벽에 의해 연결된다. 상기 상면과 하면을 연결하여 챔버를 형성하는 다른 구조도 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 상면과 하면은 이 상면 또는 하면, 또는 이들 둘다 상의 개스킷(gasket) 또는 형태를 갖는 특징부(shaped feature)에 의해 함께 연결될 수 있다. 상기 개스킷 또는 특징부는 임의적으로 상기 상면 또는 하면, 또는 이들 둘다의 상응하는 영역에 융합되거나 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 개스킷 또는 특징부는 UV 경화성 접착제의 유동을 유도하는데, 상기 접착제는 상기 상면과 하면 사이에서 유동하고 UV 광에 노출되어 상기 상면과 하면을 연결한다. 다른 실시양태에서, 융합되는 영역의 한계를 정하는 상기 개스킷 또는 특징부를 이용하여 상기 상면과 하면을 함께 초음파 융합시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 특징부는 상기 상면 또는 하면 상의 투명한 영역, 및 동족(cognate) 상면 또는 하면 상의 상응하는 가려진(shaded) 영역이다. 이 실시양태에서, 레이저 광을 상기 투명한 영역을 통해 상기 가려진 영역 상으로 향하게 함으로써 상기 상면과 하면을 함께 레이저 용접시킬 수 있다.

포획 핵산 어레이는 전형적으로 윈도우 상의 열적으로 안정한 코팅에 커플링된다. 예를 들면, 상기 코팅은 화학적 반응성 기, 친전자성 기, NHS 에스테르, 테트라플루오로페닐 또는 펜타플루오로페닐 에스테르, 모노니트로페닐 또는 디니트로페닐 에스테르, 티오에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아실 아지드, 에폭사이드, 아지리딘, 알데하이드, 비닐 케톤 또는 말레이미드를 포함하는 α,β-불포화 케톤 또는 아미드, 아실 할라이드, 설포닐 할라이드, 이미데이트, 사이클릭 산 무수물, 고리화 첨가반응에서 활성을 나타내는 기, 알켄, 디엔, 알킨, 아지드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 윈도우 자체는 예를 들면, 유리, 석영, 세라믹, 중합체 또는 다른 투명한 재료를 포함할 수 있다.

본원의 방법, 시스템 및 디바이스에 대하여 전술된 특징들 전부가 본원의 소모품 내의 챔버의 구성에 대해 적용된다. 예를 들면, 상기 챔버는 약 10 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 깊이, 예를 들면, 약 140 ㎛의 깊이를 가질 수 있다. 상기 챔버는 다른 치수에서 상당히 더 넓을 수 있다(예를 들면, 약 1 mm 내지 약 50 mm의 평균 직경을 가질 수 있다). 한 특정 실시양태에서, 상기 챔버는 약 10 mm 내지 약 20 mm의 평균 직경을 갖는다.

본 발명은 예를 들면, 본 발명의 소모품을 포함하는 키트를 포함한다. 상기 키트는 포장재, 방법의 실시에 대한 설명서 및 대조군 시약(예를 들면, 대조군 주형, 프로브 또는 프라이머, 예를 들면, 소모품의 어레이 상의 대조군 부위에 결합하는 대조군 주형, 프로브 또는 프라이머)도 포함할 수 있다.

상기 방법, 시스템, 디바이스, 소모품 및 키트는 조합하여 사용될 수 있는데, 예를 들면, 키트는 본 발명의 방법을 실시하기 위해 예를 들면, 본 발명의 시스템 또는 디바이스에서 사용될 소모품을 제공한다. 달리 명시되어 있지 않은 한, 상기 방법의 단계는 임의적으로 상기 시스템, 디바이스, 소모품 또는 키트의 상응하는 구조적 특징을 갖는다(역의 경우도 성립).

도 1a 및 1b는 본 발명의 PCR 프로브를 개략적으로 보여준다.
도 2는 본 발명의 PCR 챔버의 개략도이다.
도 3은 3 단계 증폭 반응을 위한 카피 수 적정에 대한 어레이-기반 실시간 PCR 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 4는 용액의 분취액으로부터 발생된 용액-기반 실시간 PCR 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 5는 비소광된 프로브를 사용하여 발생시킨 어레이-기반 실시간 PCR 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 6은 다중화된 증폭에 대한 실시간 PCR 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 7은 표적이 첨가되지 않은 10-중(plex) 반응에 대한 어레이-기반 실시간 PCR 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 8은 10-중 패널 및 각각 10⁴개의 카피로 존재하는 3종의 표적을 사용한 어레이-기반 실시간 PCR 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 9는 5' 플랩 모방체(mimic)의 혼성화의 실시간 반응속도를 보여주는 그래프이다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 양태를 개략적으로 보여준다.
도 11은 시스템을 개략적으로 보여준다.
도 12는 2 단계 증폭 반응을 위한 카피 수 적정에 대한 어레이-기반 실시간 PCR 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 13은 반응 챔버 두께와 신호 대 배경 비의 관계를 보여주는 도면이다.
도 14는 본 발명의 이동 기재 실시양태에 대한 전체 검출 시스템을 개략적으로 보여준다.
도 15는 소광제 보유 프로브를 이용한 실시간 PCR에서, 반응 추이에 따른 형광 신호의 감소를 보여주는 도면이다.

표적 핵산 증폭, 검출 및 실시간 정량을 수행하는 방법은 본 발명의 특징이다. 상기 방법에서, 표적 핵산의 증폭은 어레이에 혼성화되는 표적 특이적 표지된 프로브 단편을 방출하고, 상기 어레이는 증폭이 일어나는 챔버 내에 분포되어 있다. 표적 핵산의 검출 및 실시간 정량 둘다를 제공하는 신호는 어레이로부터 검출된다.

본 발명은 전형적으로, 챔버 내에 핵산 검출 어레이를 포함하는 소모품으로서 포맷팅된 반응 챔버뿐만 아니라 상기 소모품과 상호작용하는 디바이스 및 시스템도 제공한다.

방법

본 발명은 샘플 중의 하나 이상의 표적 핵산을 실시간으로 검출하고 정량하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이용가능한 용액-기반 실시간 핵산 검출 방법의 이용에 의해 달성될 수 있는 수보다 더 많은 수의 상이한 표적 핵산을 하나의 챔버 반응 및 검출을 이용하여 특이적으로 검출하고 정량할 수 있게 하는 다중화에 매우 적합하다. 이것은 본 발명이 용액상 스펙트럼 검출보다는 오히려 분석물의 어레이-기반 검출(이때, 어레이는 분석물과 접촉하고 있음)을 이용하기 때문이다. 핵산 검출 어레이는 예를 들면, 용액 중의 상이한 염료 표지들의 구별에 비해 어레이 위치 구별을 통해 분석물을 해상하는 상당히 더 굉장한 능력을 갖는다. 비교하건대, 수천 종의 상이한 분석물을 동시에 검출하는 어레이를 구축할 수 있지만, 전형적으로 약 5종 초과의 상이하게 표지된 형광단을 용액에서 검출하는 것은 불가능하다.

도 10a는 본 방법의 부분적인 개략도를 제공한다. 도시된 바와 같이, 프라이머(102)가 표지된 프로브(104)와 함께 주형 또는 표적 서열(100)에 혼성화된다. 프로브(104)는 표적 또는 주형 서열(100)에 상보적인 부분(104a), 및 표지 모이어티(106)에 커플링된, 주형에 상보적이지 않은 오르토고날 서열(104b)("플랩")을 포함한다. 오르토고날 서열(104b) 또는 프로브 단편은 증폭 반응(예를 들면, PCR 증폭 주기) 동안 절단된다. 일 편리한 접근법에서, 플랩을 절단하기 위해 중합효소의 천연 핵산분해효소 활성이 사용되는데 - 이러한 접근법에서, 중합효소에 의한 프라이머 연장이 플랩(104b)과 주형(100) 간의 연접부와 만날 때 상기 중합효소의 핵산분해효소 활성에 의한 플랩(104b)의 절단을 유도한다. 이것은 플랩을 표지된 프로브 단편(104b)으로서 방출하고, 그 후 상기 표지된 프로브 단편은 예를 들면, 특정 혼성화를 허용하는 조건까지 온도를 조절함에 의해 방출된 프로브 단편(104b)에 상보적인 포획 프로브(112)를 보유한 어레이(110)에 혼성화된다. 어레이 상의 표지의 검출은 주형의 실시간 검출 및 정량을 제공한다.

일반적으로, 하나 이상의 표적 핵산(들)의 존재(또는 부재)에 대해 시험될 샘플에 대한 증폭 반응을 수행한다. 상기 반응은 단일 반응 챔버에서 약 10개 내지 약 100개 이상의 상이한 핵산을 증폭하고, 검출하고 정량하도록 용이하게 다중화될 수 있다. 예를 들면, 약 10개, 약 20개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개 또는 약 100개 이상의 핵산이 단일 증폭/검출 챔버에서 검출될 수 있다. 하나의 반응/검출 챔버에서 10개의 상이한 표적 핵산의 동시적인 증폭, 검출 및 정량을 입증하는 본원의 실시예가 하기에 제시되어 있다. 이 실시예 및 본원의 방법의 성능은 전형적인 스펙트럼-제한된 용액-기반 다중 검출의 성능을 능가한다.

상기 방법에서, 검출될 각각의 표적 핵산은 하나 이상, 일반적으로 2종의 증폭 프라이머의 사용을 통해 특이적으로 증폭된다(2종의 프라이머의 사용은 단일 프라이머에 비해 반응에 특이성을 부가하고 생성물 형성의 속도를 증가시킨다). 상기 프라이머들은 전형적으로 샘플 중의 표적 핵산(들)에 특이적으로 혼성화되고, 예를 들면, 표준 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 중합효소의 사용을 통해 연장된다. 관심 있는 표적 핵산의 증폭에 사용될 수 있는 증폭 프라이머의 디자인 및 구축은 공지된 방법을 따른다. PCR 프라이머 디자인에 관한 세부사항에 대해서는 예를 들면, 문헌(Anton Yuryev (Editor) (2007) PCR Primer Design ( Methods in Molecular Biology) [Hardcover] Humana Press; 1st edition ISBN-10: 158829725X, ISBN-13: 978-1588297259) 및 하기 언급된 참고문헌들을 참조한다.

표준 증폭 완충제, 효소, 온도 및 주기 횟수의 이용을 포함하는 적절한 반응 조건을 이용하여 표적 주형 핵산에 대한 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 수행할 수 있다. 혼성화 조건, 완충제, 시약, 반응 주기 횟수 등을 포함하는 PCR 기법의 검토를 위해서는 예를 들면, 하기 참고문헌들을 참조한다: 문헌(Yuryev (above), van Pelt-Verkuil et al. (2010) Principles and Technical Aspects of PCR Amplification Springer; 1st Edition ISBN-10: 9048175798, ISBN-13: 978-9048175796); 문헌(Bustin (Ed) (2009) The PCR Revolution : Basic Technologies and Applications Cambridge University Press; 1st edition ISBN-10: 0521882311, ISBN-13: 978-0521882316); 문헌(Viljoen et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer, ISBN 1402034032); 문헌(Kaufman et al. (2003) Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine Second Edition Ceske (ed) CRC Press (Kaufman)); 문헌(The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc (Rapley)); 문헌(Chen et al. (ed) PCR Cloning Protocols , Second Edition (Methods in Molecular Biology, volume 192) Humana Press); 및 문헌(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al.eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis)). 증폭 조건, 프라이머 디자인, 및 실시간-기반 PCR 방법에 적용될 수 있는 다른 세부사항은 예를 들면, 문헌(Logan et al. (eds.) (2009) Real - Time PCR : Current Technology and Applications, Caister Academic Press, 1st edition ISBN-10: 1904455395, ISBN-13: 978-1904455394) 및 문헌(M TevfikDorak (Editor) (2006) Real - time PCR (Advanced Methods ) Taylor & Francis, 1st edition ISBN-10: 041537734X ISBN-13: 978-0415377348)에 기재되어 있다.

샘플 중의 각각의 표적 핵산에 대해 특이적인 표지된 프로브는 증폭 프라이머(들)와 함께 표적 핵산(들)에 혼성화된다. 증폭 반응은 주형-혼성화된 표지된 프로브를 절단하여 표지된 프로브 단편을 방출한다. 그 다음, 이 표지된 단편은 도 10a에 나타낸 바와 같이 반응 챔버 내의 어레이에 혼성화된다.

도 1a는 본 발명의 방법에서 유용한 프로브를 개략적으로 보여준다. 상기 프로브는 표적 핵산에 상보적인 영역(A)을 포함한다. 상기 프로브는 표적 핵산에 상보적이지 않는 "플랩"(B)도 포함한다. 표지(E)는 플랩(B)에 부착된다. 표지(E)는 말단 위치에 표시되어 있지만, 상기 표지는 사실상 플랩(B)의 임의의 지점에 포맷팅될 수 있다. 예를 들면, 임의의 다양한 뉴클레오티드가 표준 또는 다소 변경된 핵산 합성 프로토콜에서 표지되고 사용되어 상기 프로브 상의 임의의 원하는 위치에서 표지를 제공할 수 있다.

도 1a에서, 표지 소광제(D)를 포함하는 임의적 영역(C)은 플랩(B)의 일부에 상보적이다. 적절한 용액 조건 하에서 영역(C)은 플랩(B)과 염기쌍을 형성하여 표지(E)와 소광제(D)를 인접하게 위치시킴으로써 표지(E)를 소광시킨다. 이것은 반응/검출 챔버에서 용액상의 신호 배경을 감소시키지만, 프로브 소광이 본 발명의 실시를 위해 요구되지 않는다. 본 발명의 한 놀라운 양태는 어레이 근처의 용액에 비소광된 프로브가 존재하는 경우조차도 어레이에 결합된 프로브 단편을 특이적으로 검출할 수 있다는 것이다. 이 실시양태의 실시예는 본원에 기재되어 있다. 일반적으로, 용액상 배경을 감소시키도록 구성되어 있는 반응/검출 챔버 내에서의 고효율 어레이의 사용은 본 발명의 방법, 소모품, 디바이스 및 시스템에서 어레이에서의 신호를 용액 중의 신호 배경으로부터 구별할 수 있게 한다.

어세이 구성에 따라, 매우 다양한 상이한 표지 기가, 표지된 프로브를 표지하는 데에 사용될 수 있다. 전술된 바와 같이, 이러한 표지는 전형적으로 개별 형광단 또는 상호작용적 염료 쌍 또는 기, 예를 들면, FRET 쌍뿐만 아니라 공여체/소광제 쌍을 포함할 수 있는 형광 표지 기를 포함한다. 핵산 프로브를 표지하는 데에 적합한 일 범주의 상이한 형광 표지 기가 예를 들면, 문헌(Molecular Probes Handbook, 11^th Edition (Life Technologies, Inc.))에 기재되어 있다.

본원의 논의 중 대부분이 PCR-기반 증폭에 관한 것이지만, 다른 증폭 반응이 대신 이용될 수 있다. 예를 들면, 증폭 반응에 커플링된 절단 반응을 수반하는 다중효소 시스템, 예컨대, 자를 수 있는 결합의 절단(예를 들면, 미국 특허 제5,011,769호, 제5,660,988호, 제5,403,711호 및 제6,251,600호 참조) 및 갈라진 핵산 구조(미국 특허 제7,361,467호, 제5,422,253호, 제7,122,364 및 제6,692,917호)를 포함하는 시스템이 이용될 수 있다. 택만 유사 절단에 커플링된 헬리카제(helicase) 의존적 증폭(Tong, Y et al 2008 BioTechniques 45:543-557)도 이용될 수 있다. 핵산 서열-기반 증폭(NASBA) 또는 연결효소(ligase) 연쇄 반응(LCR)이 이용될 수 있다. NASBA-기초 방법에서, 프로브는 PCR에서와 같이 증폭 프라이머(들)와 함께 주형에 혼성화될 수 있다. 상기 프로브는 역전사효소 또는 첨가된 핵산내부분해효소(endonuclease)의 핵산분해효소 작용에 의해 절단되어, PCR에서의 중합효소에 의한 방출과 유사한 방식으로 프로브 단편을 방출할 수 있다. NASBA의 한 잠재적 이점은 열순환이 요구되지 않는다는 점이다. 이것은 전체 디바이스 및 시스템 요건을 단순화한다. NASBA의 설명에 대해서는 예를 들면, 문헌(Compton (1991), "Nucleic acid sequence-based amplification," Nature 350 (6313): 91-2)을 참조한다. 예를 들면, 병원성 핵산의 검출을 위한 NASBA의 이용에 대해서는 예를 들면, 문헌(Keightley et al. (2005) "Real-time NASBA detection of SARS-associated coronavirus and comparison with real-time reverse transcription-PCR," Journal of Medical Virology 77 (4): 602-8)을 참조한다. LCR 방식의 반응이 이용되는 경우, 프로브는 증폭 효소의 핵산분해효소 활성에 의존하기보다는 핵산내부분해효소의 사용을 통해 절단될 수 있다.

본원의 방법에서, 챔버의 하나 이상의 내면 상에서 하나 이상의 고효율 핵산 검출 어레이를 갖는 검출 챔버가 제공된다. 상기 고효율 어레이는 전형적으로 챔버에서의 증폭 반응에 의해 생성된 프로브 단편의 효율적인 포획을 가능하게 하는 비-비율 제한 수의 포획 핵산을 갖는다. 상기 포획 핵산은 상대적으로 작은 프로브 핵산을 포획하도록 구성되는데, 이것도 어레이 효율을 증가시킨다. 상기 챔버는 예를 들면, 배경을 감소시키도록 챔버를 성형함으로써 어레이 근처의 신호 배경을 감소시키도록 구성된다. 예를 들면, 배경은 어레이 근처(예를 들면, 어레이의 위 또는 아래)의 챔버 두께를 얇게(얕게) 만듦으로써 감소되고, 예를 들면, 1 mm 이상만큼 깊은 챔버에서의 검출이 수행될 수 있지만, 챔버는 전형적으로 어레이 위에서 또는 아래에서 약 500 ㎛ 이하만큼 얕다. 반응 챔버 및 어레이에 관한 추가 세부사항은 본원의 방법에서 유용한 소모품과 관련하여 후술되어 있다.

어레이에 의해 포획된 신호를 검출하고 신호 강도를 측정한다. 신호 강도는 샘플 중에 존재하는 표적 핵산의 존재 및/또는 양과 상호관련된다. 전형적으로, 초기 검출 이전에 1회 초과 주기 동안 샘플을 증폭하여, 증폭에 의해 방출된 프로브 단편의 수를 증가시킴으로써 신호의 수준을 증가시킨다. 예를 들면, 표적 핵산은 경우에 따라 어레이에서 나온 신호를 검출하기 이전에 적어도, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상의 증폭 주기 동안 증폭될 수 있다.

도 10b는 본 발명의 어세이의 대안적인 구성을 제공한다. 도시된 바와 같이, 앞서 도 10a에서 언급한 대로, 표적 특이 프로브에 오르토고날 플랩 부분(104b)이 제공된다. 그러나, 형광 신호를 생성하는, 도 10a에서와 같이 형광 표지 모이어티(106)로 표지되기 보다는, 플랩(104b)이 소광제 기(116)를 보유한다. 반면에, 어레이(110) 상의 포획 프로브(112)는 상응하는 형광 기(114)로 표지되는데, 즉, 플랩(104b) 상의 소광제 기(116)에 의해 소광되는 상응하는 형광 기(114)로 표지된다. 표적 서열(100)의 증폭시 플랩 부분(104b)이 절단되어 전장 프로브(104)로부터 방출되면, 플랩은 포획 프로브(112)에 혼성화할 수 있고 이와 회합된 형광단(114)에서 나온 신호를 소광시킨다. 그 결과, 관심있는 표적 서열의 존재는, 서열 증폭과 프로브(104)로부터 소광제-플랩(104b)의 절단을 야기하며, 이는 다시 어레이(110) 상의 포획 프로브(112)에 혼성화할 수 있고, 그 결과 어레이 상의 정해진 포획 프로브 위치에 대해 형광 신호를 감소시키거나 부재하도록 한다. 플랩 또는 프로브 단편 및 포획 프로브 각각의 상보성 부분 상에 소광제 및 형광단을 위치시킴으로써, 이들 기가 에너지 전이 및 소광을 위해 충분히 근접한 범위 내에 있도록 할 수 있다.

플랩 및 포획 프로브에 커플링될 수 있는 형광단-소광제 기 쌍은 업계에 익히 알려져 있으며, 예를 들면, 형광단-소광제 쌍 예컨대 블랙 홀(black hole) 소광제 2/Cy 3 및 아이오와 블랙(Iowa Black) RQ/Cy3이 있다.

인지하고 있는 바와 같이, 상기 소광제 프로브 어세이 구성은 유체(fluid borne) 형광 성분을 제거하고 그 결과, 유체에서 발산될 수 있는 임의의 배경 형광 신호를 없애준다. 대신에, 신호전달 이벤트(signaling event)가 표면 결합된 형광단의 소광으로 인한 형광 신호의 손실이다.

한 전형적인 실시양태에서, 증폭 반응 동안 형광 또는 다른 광학 영상을 선택된 시간, 온도 및 증폭 주기 간격에서 어레이로부터 포착한다. 이들 영상을 분석하여 표적 핵산(들)이 샘플에 존재하는지를 확인하고 샘플 중의 출발 표적 핵산 농도의 정량을 제공한다. 평균 그레이(gray) 강도 측정, 배경 보정 및 기준 조절을 병용하여 영상을 분석한다. 어레이에서 각각의 스폿에 대한 배경을 국소적으로 측정할 수 있다. 관심 있는 어레이 영역(예를 들면, 어레이 스폿)을 둘러싸는 용액의 동심원의 영상 강도를 측정함으로써 배경을 계산한다. 그 다음, 각각의 영역으로부터의 신호를 보정하여 상기 영역 내의 국소 배경 문제를 처리한다. 각각의 영역으로부터의 보정된 신호를 추가로 표준화하여 스폿팅에서의 가변성뿐만 아니라 시야에서의 불균일한 조명 문제를 처리할 수 있다. 처음 수회 주기, 전형적으로 5회 내지 15회 주기로부터 수득된 보정된 강도 측정치의 평균을 이용하여 기준을 조절하고 각각의 영역으로부터의 측정치를 표준화한다.

증폭 후 신호 강도 측정치를 기초로 핵산을 정량하는 방법에 관한 추가 세부사항은 예를 들면, 상기 본 단락에서 언급된 참고문헌 및 문헌(Jang B. Rampal (Editor) (2010) Microarrays: Volume 2, Applications and Data Analysis (Methods in Molecular Biology ) Humana Press; 2nd Edition ISBN-10: 1617378526, ISBN-13: 978-1617378522); 문헌(Stephen A. Bustin (Editor) (2004) A-Z of Quantitative PCR ( IUL Biotechnology , No . 5) ( IUL Biotechnology Series ) International University Line; 1st edition ISBN-10: 0963681788, ISBN-13: 978-0963681782); 및 문헌(Kamberova and Shah (2002) DNA Array Image Analysis: Nuts & Bolts ( Nuts & Bolts series ) DNA Press; 2nd edition ISBN-10: 0966402758, ISBN-13: 978-0966402759)에서 찾을 수 있다.

대안적 구성에서, 포획 프로브를 임의적으로 정지 상태 기재보다는 오히려 이동 기재, 예컨대, 비드, 수지, 입자 등(일반적으로 본원에서 "비드"로서 상호교환적으로 지칭됨)에 커플링시킬 수 있다. 예를 들면, 본원의 임의의 부분에서 전술된 바와 같이, 평면 기재를 사용하여 샘플 재료 내의 표적 핵산 서열 또는 서열들의 증폭 동안 생성된 절단된 프로브 단편에 혼성화될 어레이된 포획 프로브를 제공할 수 있다. 프로브 단편이 어레이 상의 어느 포획 프로브 위치에 혼성화되는지를 검출함으로써 주어진 표적 핵산 서열의 존재를 검출한다. 각각의 프로브 단편이 특정 표적 서열에 대해 특이적이기 때문에, 그 프로브 단편이 존재하는 경우, 이것은 상기 표적이 존재하고 증폭되었다는 것을 의미한다. 이동상 기재에서, 주어진 분석에서 각각의 상이한 종류의 포획 프로브가 독특한 표지도 보유하는 상이한 이동 기재에 커플링된다. 그 다음, 비드 및 함축적으로 포획 프로브 둘다를 확인하고 표지된 프로브 단편이 존재하는지를 확인하기 위해 이동 기재를 검출 채널에 통과시킨다. 표지된 프로브가 특정 포획 프로브에 상응하는 주어진 비드 상에서 검출되는 경우, 이것은 상기 프로브 단편(및 상보적인 포획 프로브)과 회합된 표적 서열이 샘플에 존재하고 증폭되었다는 것을 의미한다. 본 발명의 이 양태는 예를 들면, 전체적인 증폭 반응의 완결 후 종점(endpoint) 검출에 이용될 수 있으나, 정량 분석, 예를 들면, 1회 이상의 증폭 주기 후 증폭 혼합물로부터 비드의 분획을 흡입관으로 흡입하고 상기 비드로부터의 표지된 프로브 단편 신호 강도를 측정하는 데에도 이용될 수 있다.

주어진 비드 상에서 포획된 표지된 프로브 단편의 농도는 반응 혼합물로부터의 비드의 분리가 필요하지 않을 정도로 검출 채널에서 충분히 높은 신호 대 배경 비를 제공할 것이다. 추가로, 어레이-기반 기재와 마찬가지로, 이차 구조를 온전한 프로브 및/또는 임의적 소광 기에 포함시키는 것은 프로브 단편 신호와 (용액 중의 온전한 프로브 배경 신호이든 아니면 이동 기재와의 비의도된 결합으로부터 발생한 온전한 프로브 배경 신호이든 관계없이) 온전한 프로브 배경 신호를 구별하는 보다 굉장한 능력을 허용한다. 몇몇 경우, 온전한 프로브의 이차 구조의 성질은 이동 기재 상의 포획 프로브와의 결합에 있어서 입체장애를 발생시켜, 몇몇 경우 온전한 프로브가 비드에 결합할 가능성을 감소시킬 것으로 예측되었다.

본 발명의 이 양태와 함께 다양한 상이한 종류의 비드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리스티렌 입자, 셀룰로스성 입자, 아크릴계 입자, 비닐 입자, 실리카 입자, 상자성 입자 또는 다른 무기 입자, 또는 임의의 다양한 다른 종류의 비드를 사용할 수 있다. 전술된 바와 같이, 비드는 전형적으로 독특한 표지 표식(signature)으로 상이하게 표지될 수 있다. 또한, 유기 형광 표지, 무기 형광 표지(예를 들면, 양자점), 발광 표지, 전기화학적 표지 등을 포함하는 다양한 상이한 종류의 표지를 사용할 수 있다. 이러한 표지는 널리 상업적으로 입수가능하고 적절하게 활성화된 비드에 용이하게 커플링되도록 구성된다. 형광 표지 기의 경우, 넓은 스펙트럼의 여기 방사선, 예를 들면, 다수의 레이저를 이용할 필요 없이 넓은 범위의 독특한 표지 표식을 제공하도록 스펙트럼에서 상이한 2개, 3개 또는 4개 이상의 형광 표지 기와 상이한 수준의 각각의 표지의 상이한 조합을 제공함으로써 많은 수의 표지 표식을 제공할 수 있다.

본원의 방법은 전형적으로 본원에 기재된 디바이스, 시스템, 소모품 및 키트의 사용을 통해 수행된다. 상기 디바이스, 시스템 및 소모품의 모든 특징들은 본원의 방법을 실시하기 위해 제공될 수 있고, 본원의 방법은 상기 디바이스, 시스템, 소모품 및 키트와 함께 실시될 수 있다.

소모품

본 발명의 1-용기 반응 챔버는 신호 배경을 감소시키도록 구성된다. 고효율 어레이는 상기 챔버의 하나 이상의 내면 상에서 형성된다. 상기 어레이는 전형적으로 본원의 방법의 증폭 단계 및 어레이 혼성화 단계 동안 증폭 반응물 및 생성물과 접촉한다. 이것은 사용자가 1회 이상의 증폭 반응 주기를 실시할 수 있게 하고 어레이로부터의 신호를 실시간으로 모니터링하여 결과를 검출할 수 있게 하고 1회 이상의 추가 증폭 주기에 이어서 다시 검출을 실시할 수 있게 한다. 따라서, 어레이로부터의 신호 강도를 이용하여 관심 있는 핵산을 실시간으로 검출하고 정량할 수 있다.

본 발명의 소모품은 챔버, 및 이 챔버의 내면 상의 고효율 어레이를 포함한다. 상기 챔버는 전형적으로 얇다(얕다)(예를 들면, 약 1 mm 미만의 깊이를 갖는다). 일반적으로, 챔버가 얇을수록 어레이 위의 용액이 적어지는데, 이것은 용액 중의 표지된 프로브 또는 프로브 단편으로부터의 신호 배경을 감소시킨다. 전형적인 바람직한 챔버 깊이는 약 1 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 범위 내에 있다. 상기 소모품의 용이한 제작을 위해, 상기 챔버는 종종 어레이 위에서 약 10 ㎛ 내지 약 250 ㎛의 범위 내의 깊이, 예를 들면, 약 100 ㎛ 내지 약 150 ㎛의 범위 내의 깊이를 갖는다. 상기 챔버는 예를 들면, 수동 또는 자동화된 피펫터(pipettor)에 의한 샘플의 전달을 위해 시약 전달 포트를 갖는 표면을 포함할 수 있다.

도 2는 예시적 소모품의 확대 개략도를 제공한다. 이 예에서, 하면 층(1)과 상면 층(2)은 중간 층(3)에 의해 연결되어 있다. 컷아웃(Cutout)(4)은 층들(1, 2 및 3)의 조립 시 챔버를 형성한다. 포트(들)(5)는 조립 시 완충제 및 시약을 챔버로 전달하는 편리한 방식을 형성한다. 고효율 어레이는 컷아웃의 상면 또는 하면을 형성하는 영역 내의 상층 또는 하층 상에서 형성될 수 있다. 에피형광 검출을 이용하여 어레이에 결합된 표지를 검출하는 한 편리한 실시양태에서, 어레이는 하면 상에서 제작되고, 이때 소모품은 상기 하면 아래에서 본 발명의 디바이스 및 시스템에 위치하는 검출 광학소자에 의해 가시화되도록 구성된다. 일반적으로, 상면 또는 하면(또는 이들 둘다)은 윈도우를 포함할 것이고, 이 윈도우를 통해 검출 광학소자가 어레이를 가시화할 수 있다.

중간 층(3)은 이용되는 소모품 조립 방법에 따라 임의의 다양한 형태를 취할 수 있다. 한 편리한 실시양태에서, 상면(1)과 하면(2)은 압력-민감성 접착재로 형성된 층(3)에 의해 연결된다. 압력-민감성 접착층(예를 들면, 테이프)은 잘 공지되어 있고 널리 입수가능하다. 예를 들면, 문헌(Benedek and Feldstein (Editors) (2008) Handbook of Pressure - Sensitive Adhesives and Products: Volume 1: Fundamentals of Pressure Sensitivity, Volume 2: Technology of Pressure -Sensitive Adhesives and Products, Volume 3: Applications of Pressure -Sensitive Products, CRC Press; 1st edition ISBN-10: 1420059343, ISBN-13: 978-1420059342)을 참조한다.

상면과 하면을 연결하여 챔버를 형성하는 다른 제작 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 상면과 하면은 상기 상면 또는 하면, 또는 이들 둘다 상의 개스킷 또는 형태를 갖는 특징부에 의해 함께 연결될 수 있다. 상기 개스킷 또는 특징부는 임의적으로 상기 상면 또는 하면, 또는 이들 둘다의 상응하는 영역에 융합되거나 접착된다. 실리콘 및 중합체 칩 제작 방법을 적용하여 상기 상면 또는 하면에서 특징부를 형성할 수 있다. 미세특징부 제작을 포함하는 특징부 제작 방법에 대한 개론에 대해서는 예를 들면, 하기 참고문헌들을 참조한다: 문헌(Franssila (2010) Introduction to Microfabrication Wiley; 2nd edition ISBN-10: 0470749830, ISBN-13: 978-0470749838); 문헌(Shen and Lin (2009) "Analysis of mold insert fabrication for the processing of microfluidic chip" Polymer Engineering and Science Publisher: Society of Plastics Engineers, Inc. Volume: 49 Issue: 1 Page: 104(11)); 문헌(Abgrall (2009) Nanofluidics ISBN-10: 159693350X, ISBN-13: 978-1596933507); 문헌(Kaajakari (2009) Practical MEMS : Design of microsystems, accelerometers , gyroscopes , RF MEMS , optical MEMS , and microfluidic systems Small Gear Publishing ISBN-10: 0982299109, ISBN-13: 978-0982299104); 문헌(Saliterman (2006) Fundamentals of BioMEMS and Medical Microdevices SPIE Publications ISBN-10: 0819459771, ISBN-13: 978-0819459770); 및 문헌(Madou (2002) Fundamentals of Microfabrication : The Science of Miniaturization, Second Edition CRC Press; ISBN-10: 0849308267, ISBN-13: 978-0849308260). 이들 제작 방법을 이용하여 상면 또는 하면 상에서 요구되는 본질적으로 임의의 특징부를 형성함으로써 중간 층에 대한 필요성을 없앨 수 있다. 예를 들면, 상면 또는 하면(또는 이들 둘다)에서 함몰부(depression)를 형성할 수 있고 상기 2개의 층을 연결함으로써 챔버를 형성할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 상기 개스킷 또는 특징부는 UV 또는 방사선 경화성 접착제의 유동을 유도한다. 이 접착제는 상면과 하면 사이에서 유동하고 UV 광 또는 방사선(예를 들면, 전자 광선, 또는 "EB" 방사선)에 노출됨으로써 상기 상면과 하면을 연결한다. UV 및 방사선 경화성 접착제를 포함하는 사용가능한 접착제의 설명에 대해서는 예를 들면, 문헌(Ebnesajjad (2010) Handbook of Adhesives and Surface Preparation: Technology , Applications and Manufacturing William Andrew; 1st edition ISBN-10: 1437744613, ISBN-13: 978-1437744613); 및 문헌(Drobny (2010) Radiation Technology for Polymers , Second Edition CRC Press; 2 edition ISBN-10: 1420094041, ISBN-13: 978-1420094046)을 참조한다.

다른 실시양태에서, 융합되는 영역의 한계를 정하는 개스킷 또는 표면 특징부, 및 소모품에서 생성될 챔버 또는 다른 구조적 특징부를 갖도록 상기 상면과 하면을 함께 초음파 융합시킬 수 있다. 재료들을 융합시키는 데에 유용한 초음파 용접 및 관련 기술은 예를 들면, 문헌(Astashev and Babitsky (2010) Ultrasonic Processes and Machines : Dynamics , Control and Applications (Foundations of Engineering Mechanics) Springer; 1st Edition. edition ISBN-10: 3642091245, ISBN-13: 978-3642091247); 및 문헌(Leaversuch (2002) "How to use those fancy ultrasonic welding controls," Plastics Technology 48(10): 70-76)에 교시되어 있다.

또 다른 예에서, 상기 특징부는 상면 또는 하면 상의 투명한 영역, 및 동족 상면 또는 하면 상의 상응하는 가려진 영역이다. 이 실시양태에서, 레이저 광을 상기 투명한 영역을 통해 상기 가려진 영역 상으로 향하게 함으로써 상기 상면과 하면을 함께 레이저 용접시킬 수 있다. 레이저 용접 방법은 예를 들면, 문헌(Steen et al. (2010) Laser Material Processing Springer; 4th ed. edition ISBN-10: 1849960615, ISBN-13: 978-1849960618); 문헌(Kannatey-Asibu (2009) Principles of Laser Materials Processing (Wiley Series on Processing of Engineering Materials) Wiley ISBN-10: 0470177985, ISBN-13: 978-0470177983); 및 문헌(Duley (1998) Laser Welding Wiley-Interscience ISBN-10: 0471246794, ISBN-13: 978-0471246794)에서 교시되어 있다.

포획 핵산 어레이는 전형적으로 윈도우 상의 열적으로 안정한 코팅에 커플링된다. 윈도우 자체는 예를 들면, 유리, 석영, 세라믹, 중합체 또는 다른 투명한 재료를 포함할 수 있다. 윈도우를 코팅하는 데에 적합한 다양한 코팅이 이용가능하다. 일반적으로, 코팅은 어레이 기재와의 상용가능성(예를 들면, 어레이가 부착되어 있는 챔버 표면이 유리인지 아니면 중합체인지), 어레이 구성원을 부착시키는 데에 적합한 반응성 기를 포함하도록 유도체화되거나 처리되는 능력, 및 공정 조건(예를 들면, 열안정성, 광안정성 등)과의 상용가능성을 기초로 선택된다. 예를 들면, 코팅은 화학적 반응성 기, 친전자성 기, NHS 에스테르, 테트라플루오로페닐 또는 펜타플루오로페닐 에스테르, 모노니트로페닐 또는 디니트로페닐 에스테르, 티오에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아실 아지드, 에폭사이드, 아지리딘, 알데하이드, 비닐 케톤 또는 말레이미드를 포함하는 α,β-불포화 케톤 또는 아미드, 아실 할라이드, 설포닐 할라이드, 이미데이트, 사이클릭 산 무수물, 고리화 첨가반응에서 활성을 나타내는 기, 알켄, 디엔, 알킨, 아지드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 표면 코팅, 및 생체분자를 표면에 부착시키는 데에 있어서 상기 코팅의 사용에 관한 설명에 대해서는 예를 들면, 하기 참고문헌들을 참조한다: 문헌(Plackett (Editor) (2011) Biopolymers : New Materials for Sustainable Films and Coatings Wiley ISBN-10: 0470683414, ISBN-13: 978-0470683415); 문헌(Niemeyer (Editor) (2010) Bioconjugation Protocols : Strategies and Methods (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 1st Edition. edition ISBN-10: 1617373540, ISBN-13: 978-1617373541); 문헌(Lahann (Editor) (2009) Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science Wiley ISBN-10: 0470699701, ISBN-13: 978-0470699706); 문헌(Hermanson (2008) Bioconjugate Techniques , Second Edition Academic Press; 2nd edition ISBN-10: 0123705010, ISBN-13: 978-0123705013); 문헌(Wuts and Greene (2006) Greene's Protective Groups in Organic Synthesis Wiley-Interscience; 4th edition ISBN-10: 0471697540, # ISBN-13: 978-0471697541); 문헌(Wittmann (Editor) (2006) Immobilisation of DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry) Springer; 1st edition ISBN-10: 3540284362, ISBN-13: 978-3540284369); 문헌(Licari (2003) Coating Materials for Electronic Applications : Polymers , Processing , Reliability , Testing (Materials and Processes for Electronic Applications ) William Andrew ISBN-10: 0815514921, ISBN-13: 978-0815514923); 문헌(Conk (2002) Fabrication Techniques for Micro - Optical Device Arrays Storming Media ISBN-10: 1423509641, ISBN-13: 978-1423509646) 및 문헌(Oil and Colour Chemists' Association (1993) Surface Coatings - Raw materials and their usage , Third Edition Springer; 3rd edition, ISBN-10: 0412552108, ISBN-13: 978-0412552106).

핵산 어레이의 제조 방법은 이용가능하고 상기 어레이를 챔버 내면 상에서 형성함으로써 본 발명에 응용될 수 있다. 챔버 내면 상에서 어레이를 형성하는 데에 이용될 수 있는, 핵산 마이크로어레이를 형성하는 기법은 예를 들면, 하기 참고문헌들에 기재되어 있다: 문헌(Rampal (Editor) Microarrays : Volume I: Synthesis Methods (Methods in Molecular Biology ) Humana Press; 2nd Edition ISBN-10: 1617376639, ISBN-13: 978-1617376634); 문헌(Muller and Nicolau (Editors) (2010) Microarray Technology and Its Applications ( Biological and Medical Physics , Biomedical Engineering ) Springer; 1st Edition. ISBN-10: 3642061826, ISBN-13: 978-3642061820); 문헌(Xing and Cheng (Eds.) (2010) Biochips : Technology and Applications ( Biological and Medical Physics , Biomedical Engineering ) Springer; 1st Edition. ISBN-10: 3642055850, ISBN-13: 978-3642055850); 문헌(Dill et al. (eds) (2010) Microarrays: Preparation, Microfluidics, Detection Methods , and Biological Applications ( Integrated Analytical Systems) Springer ISBN-10: 1441924906, ISBN-13: 978-1441924902); 문헌(Whittmann (2010) Immobilisation of DNA on Chips II ( Topics in Current Chemistry) Springer; 1st Edition ISBN-10: 3642066666, ISBN-13: 978-3642066665); 문헌(Rampal (2010) DNA Arrays: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology ) Humana Press; 1st Edition ISBN-10: 1617372048, ISBN-13: 978-1617372049); 문헌(Schena (Author, Editor) (2007) DNA Microarrays ( Methods Express) Scion Publishing; 1st edition, ISBN-10: 1904842151, ISBN-13: 978-1904842156); 문헌(Appasani (Editor) (2007) Bioarrays: From Basics to Diagnostics Humana Press; 1st edition ISBN-10: 1588294765, ISBN-13: 978-1588294760); 및 문헌(Ulrike Nuber (Editor) (2007) DNA Microarrays ( Advanced Methods) Taylor & Francis ISBN-10: 0415358663, ISBN-13: 978-0415358668). DNA를 표면에 부착시켜 어레이를 형성하는 기법은 임의의 다양한 스폿팅 방법, 화학적 반응성 표면 또는 코팅의 사용, 광에 의해 유도된 합성, DNA 프린팅 기법, 및 당분야에서 이용가능한 많은 다른 방법을 포함할 수 있다.

어레이 밀도를 정량하는 방법은 상기 언급된 참고문헌들 및 문헌(Gong et al. (2006) "Multi-technique Comparisons of Immobilized and Hybridized Oligonucleotide Surface Density on Commercial Amine-Reactive Microarray Slides" Anal. Chem. 78:2342-2351)에서 제공되어 있다.

소모품은 용기 또는 포장재 내에 포장되어 키트를 형성할 수 있다. 상기 키트는 소모품을 사용하는 데에 있어서 유용한 성분, 예를 들면, 대조군 시약(예를 들면, 대조군 주형, 대조군 프로브, 대조군 프라이머 등), 완충제 등도 포함할 수 있다.

디바이스 및 시스템

상기 소모품을 이용하고/하거나 본 발명의 방법을 실시하는 디바이스 및 시스템도 본 발명의 특징이다. 상기 디바이스 또는 시스템은 상기 소모품, 예를 들면, (소모품으로서 포맷팅된 것인지 아니면 디바이스의 전용된 부분으로서 포맷팅된 것인지 관계없이) 반응 챔버 및 어레이의 특징을 포함할 수 있다. 가장 전형적으로, 상기 디바이스는 전형적으로 어레이를 모니터링하기 위한 검출 광학소자, 챔버를 열순환시키기 위한 모듈, 및 열순환, 검출 및 포스트-신호 프로세싱을 제어하는 시스템 명령어를 갖는 컴퓨터와 함께 수용기(receiver), 예를 들면, 전술된 소모품을 탑재하는 스테이지(stage)를 가질 것이다.

예시적인 개략적 시스템이 도 11에 도시되어 있다. 나타낸 바와 같이, 소모품(10)은 스테이지(20) 상에 탑재되어 있다. 환경 제어 모듈(ECM)(30)(예를 들면, 펠티에 디바이스, 냉각 팬 등을 포함함)은 환경 제어(예를 들면, 온도의 열순환)를 제공한다. 조명 광은 광원(40)(예를 들면, 램프, 아크 램프, LED, 레이저 등)에 의해 제공된다. 광학 트레인(50)은 광이 조명 광원(40)으로부터 소모품(10)으로 향하게 한다. 소모품(10)으로부터의 신호는 광학 트레인에 의해 검출되고, 신호 정보는 컴퓨터(60)로 전송된다. 컴퓨터(60)도 임의적으로 ECM(30)을 제어한다. 신호 정보는 컴퓨터(60)에 의해 프로세싱될 수 있고 사용자가 볼 수 있는 디스플레이(70) 또는 프린터, 또는 이들 둘다로 출력될 수 있다. ECM(30)은 소모품(10) 위에 또는 아래에 탑재될 수 있고, (스테이지(20) 위에 또는 아래에 위치한) 추가 가시화 광학소자(80)가 포함될 수 있다.

스테이지/수용기는 열순환 및 분석을 위해 소모품을 탑재하도록 구성된다. 스테이지는 소모품의 상응하는 특징부와 교접하는 정합 및 정렬 특징부, 예컨대, 정렬 아암(arm), 멈춤쇠(detent), 홀(hole), 페그(peg) 등을 포함할 수 있다. 스테이지는 소모품을 수용하고 배향시켜 상기 소모품을 다른 디바이스 소자와 작동가능하게 연결된 상태에 놓이게 하는 카세트를 포함할 수 있으나, 이것은 예를 들면, 소모품이 스테이지에 직접적으로 탑재되는 많은 실시양태에서 필요하지 않다. 디바이스 소자는 소모품과 함께 작동하도록 구성되고 완충제 및 시약을 소모품, 열순환 또는 다른 온도 제어 또는 환경 제어 모듈, 검출 광학소자 등으로 전달하기 위한 유체 전달 시스템을 포함할 수 있다. 챔버가 소모품 내로 도입되어 있기보다는 디바이스 내에 내장되어 있는 실시양태에서, 상기 디바이스 소자는 전형적으로 챔버 상에서 또는 챔버 근처에서 작동하도록 구성된다.

소모품으로의 유체 전달은 디바이스 또는 시스템에 의해 수행될 수 있거나 소모품이 디바이스 또는 시스템 내로 로딩되기 전에 수행될 수 있다. 유체 취급 소자는 디바이스 또는 시스템 내에 삽입될 수 있거나 디바이스 또는 시스템으로부터 분리된 별개의 프로세싱 스테이션(station) 내에 포맷팅될 수 있다. 유체 취급 소자는 시약 또는 완충제를 소모품의 포트로 전달하는 (수동 또는 자동) 피펫터를 포함할 수 있거나, 모세관, 미세제작된 디바이스 채널 등을 포함할 수 있다. 소모품을 로딩하는 데에 이용될 수 있는 수동 및 자동 피펫터 및 피펫터 시스템은 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)(미국 소재), 에펜도르프(Eppendorf)(독일 소재), 라브트로닉스(Labtronics)(캐나다 소재) 등을 포함하는 다양한 공급원으로부터 입수될 수 있다. 일반적으로 말하면, 다양한 유체 취급 시스템이 입수될 수 있고 본 발명의 디바이스 및 시스템 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 하기 참고문헌들을 참조한다: 문헌(Kirby (2010) Micro - and Nanoscale Fluid Mechanics : Transport in Microfluidic Devices ISBN-10: 0521119030, ISBN-13: 978-0521119030); 문헌(Bruus (2007) Theoretical Microfluidics ( Oxford Master Series in Physics ) Oxford University Press, USA ISBN-10: 0199235090, ISBN-13: 978-0199235094); 문헌(Nguyen (2006) Fundamentals And Applications of Microfluidics, Second Edition (Integrated Microsystems) ISBN-10: 1580539726, ISBN-13: 978-1580539722); 및 문헌(Wells (2003) High Throughput Bioanalytical Sample Preparation: Methods and Automation Strategies (Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis) Elsevier Science; 1st edition ISBN-10: 044451029X, ISBN-13: 978-0444510297). 소모품은 임의적으로 전달 시스템과 교접하도록 구성된 포트, 예를 들면, 피펫 또는 모세관 전달 디바이스에 의한 로딩에 적합한 치수의 포트를 포함한다.

ECM 또는 열 조절 모듈은 열순환을 용이하게 하는 특징부, 예컨대, 열전기 모듈, 펠티에 디바이스, 냉각 팬, 방열재, 챔버의 외면의 일부와 교접하도록 구성된 금속 플레이트, 유체 배쓰(bath) 등을 포함할 수 있다. 많은 이러한 열 조절 부품들이 본 발명의 디바이스 및 시스템 내로의 도입을 위해 입수될 수 있다. 예를 들면, 하기 참고문헌들을 참조한다: 문헌(Kennedy and Oswald (Editors) (2011) PCR Troubleshooting and Optimization : The Essential Guide, Caister Academic Press ISBN-10: 1904455727; ISBN-13: 978-1904455721); 문헌(Bustin (2009) The PCR Revolution: Basic Technologies and Applications Cambridge University Press; 1st edition ISBN-10: 0521882311, ISBN-13: 978-0521882316); 문헌(Wittwer et al. (eds.) (2004) Rapid Cycle Real - Time PCR - Methods and Applications Springer; 1 edition, ISBN-10: 3540206299, ISBN-13: 978-3540206293); 문헌(Goldsmid (2009) Introduction to Thermoelectricity (Springer Series in Materials Science) Springer; 1st edition, ISBN-10: 3642007155, ISBN-13: 978-3642007156); 및 문헌(Rowe (ed.) (2005) Thermoelectrics Handbook: Macro to Nano CRC Press; 1 edition, ISBN-10: 0849322642, ISBN-13: 978-0849322648). 열 조절 모듈은 예를 들면, 소모품을 수용하는 카세트 내에 포맷팅될 수 있거나 소모품에 작동가능하게 인접한 상태로 스테이지 상에 탑재될 수 있다.

전형적으로, ECM 또는 열 조절 모듈은 상기 모듈을 제어하거나 상기 모듈의 일부인 컴퓨터에 작동가능하게 커플링된 피드백 가능한 제어 시스템을 갖는다. 컴퓨터에 의해 유도된 피드백 가능한 제어는 이용가능한 기기 제어 방법이다. 예를 들면, 문헌(Tooley (2005) PC Based Instrumentation and Control , Third Edition, ISBN-10: 0750647167, ISBN-13: 978-0750647168); 및 문헌(Dix et al. (2003) Human-Computer Interaction (3 rd Edition ) Prentice Hall, 3rd edition ISBN-10: 0130461091, ISBN-13: 978-0130461094)을 참조한다. 일반적으로, 시스템 제어는 예를 들면, 목표 온도 및 주기 시간을 발생시키고 영상이 검출 광학소자에 의해 가시화/촬영될 때를 특정하기 위한 입력정보로서 스크립(script) 파일을 사용할 수 있는 컴퓨터에 의해 수행된다. 사진 영상은 전형적으로 반응 동안 상이한 시간에서 촬영되고, 강도 곡선을 시간의 함수로서 발생시켜 표적의 농도를 유추하기 위해 컴퓨터로 분석된다.

광학 트레인은 임의의 전형적인 광학 트레인 부품을 포함할 수 있거나 이러한 부품에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 광학 트레인은 조명이 소모품 또는 어레이 영역으로 향하게 한다(예를 들면, 초점이 소모품의 어레이 상에 맞추어진다). 광학 트레인은 어레이로부터 방출된 광(예를 들면, 형광 또는 발광 신호)도 검출할 수 있다. 이용가능한 광학 부품에 대한 설명에 대해서는 예를 들면, 하기 참고문헌들을 참조한다: 문헌(Kasap et al. (2009) Cambridge Illustrated Handbook of Optoelectronics and Photonics Cambridge University Press; 1st edition ISBN-10: 0521815967, ISBN-13: 978-0521815963); 문헌(Bass et al. (2009) Handbook of Optics, Third Edition Volume I: Geometrical and Physical Optics, Polarized Light, Components and Instruments(set) McGraw-Hill Professional; 3rd edition, ISBN-10: 0071498893, ISBN-13: 978-0071498890); 문헌(Bass et al. (2009) Handbook of Optics , Third Edition Volume II : Design , Fabrication and Testing , Sources and Detectors, Radiometry and Photometry McGraw-Hill Professional; 3rd edition ISBN-10: 0071498907, ISBN-13: 978-0071498906); 문헌(Bass et al. (2009) Handbook of Optics, Third Edition Volume III: Vision and Vision Optics McGraw-Hill Professional, ISBN-10: 0071498915, ISBN-13: 978-0071498913); 문헌(Bass et al. (2009) Handbook of Optics , Third Edition Volume IV : Optical Properties of Materials , Nonlinear Optics , Quantum Optics McGraw-Hill Professional, 3rd edition, ISBN-10: 0071498923, ISBN-13: 978-0071498920); 문헌(Bass et al. (2009) Handbook of Optics , Third Edition Volume V: Atmospheric Optics, Modulators, Fiber Optics, X-Ray and Neutron Optics McGraw-Hill Professional; 3rd edition, ISBN-10: 0071633138, ISBN-13: 978-0071633130); 및 문헌(Gupta and Ballato (2006) The Handbook of Photonics , Second Edition, CRC Press, 2nd edition ISBN-10: 0849330955, ISBN-13: 978-0849330957). 전형적인 광학 트레인 부품은 하기 부품들 중 임의의 부품을 포함한다: 여기 광원, 아크 램프, 수은 아크 램프, LED, 렌즈, 광학 필터, 프리즘, 카메라, 광검출기, CMOS 카메라, 및/또는 CCD 어레이. 한 바람직한 실시양태에서, 에피형광 검출 시스템이 이용된다. 또한, 디바이스는 어레이 내의 신호의 위치를 검출될 핵산과 상호관련시키는 어레이 판독기 모듈을 포함할 수 있거나 어레이 판독기 모듈에 커플링될 수 있다.

본 발명의 이동 기재 실시양태와 관련하여, 일부 양태에서, 반응 용기는 예를 들면, 통합된 미세유체 채널 시스템 내의 검출 채널에 직접적으로 커플링될 수 있거나 증폭 혼합물과 검출 채널 사이의 적절한 유체 계면을 통해 커플링될 수 있다. 대안적으로, 유체 계면, 예컨대, 통상적인 유세포분석기에 존재하는 유체 계면이 증폭 반응 혼합물을 샘플링하기 위해 검출 채널 상에 제공될 수 있다. 전형적으로, 검출 채널은 실질적으로 단일 비드만이 주어진 시간에서 상기 채널을 관통하게 하는 치수를 갖도록 구성된다. 검출 채널은 전형적으로 비드의 여기 및 비드로부터 나오는 형광 신호의 수집을 가능하게 하는 검출 윈도우를 포함할 것이다. 많은 경우, 융합된 실리카 또는 유리 모세관 또는 다른 투명한 미세유체 채널이 검출 채널로서 사용된다.

본 발명의 광학 검출 시스템은 전형적으로 하나 이상의 여기 파장에서 여기 광을 전달할 수 있는 하나 이상의 여기 광원을 포함할 것이다. 검출 채널로부터 나오는 광을 수집하고 형광 신호로부터 여기 광을 여과하도록 구성되어 있는 광학 트레인도 포함될 것이다. 광학 트레인은 전형적으로 형광 신호를 전달하고 비드로부터 나오는 형광 신호 성분(들)과 포획된 프로브 단편으로부터 나오는 신호 성분(들)을 분리하기 위한 추가 분리 소자도 포함한다.

도 14는 전체 검출 시스템(1400)의 계략도를 제공한다. 나타낸 바와 같이, 상기 시스템은 상이한 파장에서 여기 광을 각각 제공하는 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원, 예컨대, 레이저(1402 및 1404)를 포함한다. 대안적으로, 단일 넓은 스펙트럼 광원 또는 다수의 좁은 스펙트럼 광원을 이용하여 적절한 파장 범위 또는 범위들에서 여기 광을 전달함으로써 샘플 중의 검출가능한 표지, 예를 들면, 비드와 회합된 표지 및 표지된 프로브 단편과 회합된 표지를 여기시킬 수 있다.

각각의 레이저로부터의 여기 광선(직선 화살표로서 표시됨)은 예를 들면, 지향성 광학소자, 예컨대, 이색성 소자(106)의 이용을 통해 검출 채널(1408)로 향하게 된다. 검출 채널(1408)에서 비드(1410)로부터 나오는 광은 수집 광학소자, 예를 들면, 대물렌즈(1412)에 의해 수집된다. 그 다음, 수집된 광은 수집된 여기 방사선을 거부하면서 방사된 형광(쇄선 화살표로서 표시됨)을 통과시키도록 구성되어 있는 필터(1414)를 통과한다. 수집된 형광은 제1 방출 스펙트럼에서 포획된 프로브 단편 상의 표지로부터 방출된 형광뿐만 아니라 비드에서 사용된 표지의 수에 따라 하나 이상의 상이한 방출 스펙트럼에서 비드 표지 표식으로부터 나오는 형광 신호도 포함한다. 그 다음, 수집된 형광은 포획된 프로브 단편으로부터 나오는 형광을 제1 검출기(1420)로 반사시키는 이색성 소자(1416)를 통과한다. 그 다음, 비드로부터 나오는 남은 형광 신호는 이 신호를 제2 이색성 소자(1418)에 통과시킴으로써 더 분리되고, 상기 제2 이색성 소자는 제1 비드 신호 성분을 제2 검출기(1422)로 반사시키고 제2 비드 신호 성분을 제3 검출기(1424)에 통과시킨다. 검출기는 전형적으로 검출된 비드와 회합된 신호 데이터를 저장하고 상기 신호 데이터를 분석하여 비드의 실체(identity)를 확인함으로써 포획 프로브 및 회합된 표적 핵산 서열을 확인하기 위한 적절한 프로세서 또는 컴퓨터에 커플링된다. 추가로, 상기 프로세서 또는 컴퓨터는 신호 데이터를 정량하고 표적 서열 카피 수를 유추하기 위한 프로그래밍을 포함할 수 있는데, 이때 시간 경과 실험이 수행된다(예를 들면, 비드가 전체 증폭 반응에서 1회 이상의 증폭 주기 후에 샘플링된다).

디바이스 또는 시스템은 예를 들면, 컴퓨터 또는 컴퓨터 판독가능한 매체에서 구현된 시스템 명령어를 포함할 수 있거나 이 시스템 명령어에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 상기 명령어는 예를 들면, 신호 강도의 하나 이상의 측정치를 열 조절 모듈에 의해 수행된 증폭 주기의 수와 상호관련시켜 상기 디바이스에 의해 검출된 표적 핵산의 농도를 측정하도록 상기 디바이스 또는 시스템의 임의의 양태를 제어할 수 있다.

시스템은 예를 들면, 적절한 배선을 통해 또는 무선 연결을 통해 다른 디바이스 부품에 작동가능하게 커플링된 컴퓨터를 포함할 수 있다. 상기 컴퓨터는 예를 들면, 전술된 바와 같이 피드백 제어를 이용하는 열 조절 모듈에 의한 열순환을 제어하고/하거나, 영상이 광학 트레인에 의해 촬영되거나 가시화될 때를 특정하는 명령어를 포함할 수 있다. 상기 컴퓨터는 영상 정보를 수용할 수 있거나 영상 정보를 디지털 정보 및/또는 시간의 함수로서의 신호 강도 곡선으로 전환시킬 수 있고/있거나, 디바이스에 의해 분석된 표적 핵산의 농도를 측정할 수 있고/있거나, 기타 기능을 수행할 수 있다. 상기 컴퓨터는 신호 강도를 표준화하여 배경 문제를 처리하기 위한 명령어, 예를 들면, 어레이의 하나 이상의 영역에 대한 국소 배경을 검출하고 상기 배경에 대해 보정함으로써 어레이 신호 강도 측정치를 표준화하기 위한 명령어를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상기 컴퓨터는 어레이 포획 핵산 스폿팅에서의 가변성, 어레이의 상이한 영역의 불균일한 시야 등에 대해 보정함으로써 신호 강도를 표준화하기 위한 명령어를 포함할 수 있다.

추가 정의

본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명이 특정 디바이스 또는 생물학적 시스템(이들은 물론 변경될 수 있음)으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해해야 한다. 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수형 용어 "1개 ", "하나" 및 "한"은 복수형 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "표면", 예를 들면, 본원에서 논의된 소모품 챔버의 "표면"의 언급은 임의적으로 2개 이상의 표면의 조합 등을 포함한다.

달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위한 실시에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 본 발명을 기술하고 청구함에 있어서, 하기 용어는 하기 정의에 따라 사용된다.

"증폭 프라이머"는 주형 의존적 증폭 반응에서 연장될 수 있는 모이어티(예를 들면, 분자)이다. 가장 전형적으로, 상기 프라이머는 증폭 조건 하에서 주형에 결합하는 핵산을 포함하거나 상기 핵산일 것이다. 전형적으로, 상기 프라이머는 중합효소에 의해(예를 들면, 중합효소 연쇄 반응에서 열안정성 중합효소에 의해), 또는 연결효소에 의해(예를 들면, 연결효소 연쇄 반응에서) 연장될 수 있는 말단을 포함할 것이다.

"검출 챔버"는 샘플이 분석되거나 표적 핵산이 검출되는, 부분적으로 또는 전체적으로 밀폐된 구조물이다. 상기 챔버는 전체적으로 폐쇄될 수 있거나, 예를 들면, 시약 또는 반응물을 전달하기 위한, 챔버에 유체 커플링된 포트 또는 채널을 포함할 수 있다. 챔버의 형태는 예를 들면, 적용 및 이용가능한 시스템 장치에 따라 달라질 수 있다. 챔버는 예를 들면, 어레이 근처에서 좁은 치수(예를 들면, 챔버 깊이)를 포함함으로써(그 결과, 어레이 근처의 용액-발생된 신호의 양을 감소시킴) 신호 배경을 감소시키도록 치수적으로 형상화될 때, 또는 예를 들면, 코팅(예를 들면, 광학 코팅) 또는 구조물(예를 들면, 격벽(baffle) 또는 어레이 근처의 다른 형태의 구조물)의 사용에 의해 배경을 감소시키도록 달리 구성되어 있을 때 "어레이 근처의 신호 배경을 감소시키도록 구성"되어 있다. 전형적으로, 용액 중의 신호가 어레이에서의 신호 차이를 검출할 수 있을 정도로 충분히 낮도록, 상기 챔버는 어레이 근처에서 일정한 치수(예를 들면, 깊이)를 갖도록 구성된다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 상기 챔버는 어레이 위에서 약 1 mm 미만의 깊이를 갖고, 바람직하게는 상기 챔버는 약 500 ㎛ 미만의 깊이를 갖는다. 전형적으로, 상기 챔버는 어레이 위쪽 약 400 ㎛ 미만, 약 300 ㎛ 미만, 약 200 미만 또는 약 150 ㎛ 미만의 깊이를 갖는다. 본원에서 제공된 일례에서, 상기 챔버는 약 142 ㎛의 깊이를 갖는다.

"고효율 핵산 어레이"는 혼성화 조건 하에서 프로브 또는 프로브 단편에 효율적으로 혼성화되는 포획 핵산의 어레이이다. 전형적인 실시양태에서, 상기 어레이는 반응/검출 챔버의 내면 상에서 포맷팅되어 있다. 어레이는 임의의 통상적인 어레이 기술(스폿팅부터 표면 상에서의 화학적 또는 광화학적 합성까지)에 의해 형성될 수 있다. 고효율은 프로브 또는 단편을 인식하는 포획 프로브의 영역의 길이를 조절함으로써 달성되고(보다 짧은(혼성화 조건을 위한 최소한의 혼성화 길이까지 짧아진) 프로브는 긴 프로브보다 더 효율적으로 혼성화됨), 각각의 어레이 영역에서 포획 핵산의 수를 조절함으로써도 달성된다. 포획 부위는 이 포획 부위와 표면 사이에 연결 서열 또는 구조물을 포함시킴으로써(그 결과, 선택된 거리만큼 표면으로부터 떨어져 있는 위치에서 포획 부위를 포맷팅함으로써(이것은 혼성화 시 표면 효과를 감소시킬 수 있음)) 혼성화를 위해 보다 효율적인/이용가능한 상태로 만들어질 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커(또는 둘다)가 사용될 수 있다. 각각의 어레이 영역에서 포획 핵산의 수는 전형적인 증폭 반응의 결과로서 생성된 주어진 프로브 또는 단편에 대한 혼성화에 이용될 수 있는 부위의 수가 비율 제한적이지 않도록 분포된다. 전술된 바와 같이, 이것은 증폭 반응 동안 생성된 표지된 프로브 단편과의 결합에 이용될 수 있는 부위의 수가 증폭 반응 후 반응 혼합물 중의 프로브 단편의 농도에 의해 포화될 부위의 수를 초과한다는 것, 바람직하게는 실질적으로 초과한다는 것을 의미한다.

"표지된 프로브"는 증폭 조건 하에서 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되고 검출가능한 또는 검출가능하게 만들어질 수 있는 모이어티를 포함하는 분자 또는 화합물이다. 가장 전형적으로, 표지된 프로브는 광학 표지, 예컨대, 형광단, 염료, 발광단(lumophore), 양자점 등을 포함하는 핵산이다. 표지는 직접적으로 검출될 수 있거나, 예를 들면, 프로브가 소광제 모이어티를 포함하는 경우 소광된 상태로 존재할 수 있다. 본원의 많은 실시양태에서, 표지된 프로브는 표적 핵산 증폭 동안 절단되어 검출가능한 표지를 포함하는 프로브 단편을 방출한다. 예를 들면, 표지된 프로브는 예를 들면, 증폭 반응이 상기 프로브의 절단을 야기하여 표지된 프로브 단편을 방출하는 경우 형광단 및 소광제를 포함할 수 있다. 가장 전형적으로, 상기 프로브는 "플랩" 영역을 포함할 것이다. 이 플랩 영역은 혼성화 동안 표적과 염기쌍을 형성하지 않고 핵산분해효소(예를 들면, 중합효소의 핵산분해효소 활성)에 의해 상기 프로브의 나머지 부분으로부터 절단되어 프로브 단편을 형성한다.

실시예

하기 실시예는 청구된 발명을 한정하기 위해 제공되는 것이 아니라 청구된 발명을 예시하기 위해 제공된다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시하기 위한 것이고, 이에 비추어 볼 때 다양한 변경 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이고 본원의 사상 및 범위, 및 첨부된 특허청구범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다.

예시적 검출 시스템

본 실시예의 검출 시스템은 표적 핵산의 단일 챔버 다중화된 실시간 PCR 검출을 가능하게 한다. 상기 시스템은 전통적인 스펙트럼 구별로부터 어레이-기반 공간적 구별로 이동시켜 증폭되는 각각의 표적에 대해 특이적인 실시간 정보를 발생시킴으로써 실시간 PCR의 다중화 성능을 확장시킨다.

전통적으로, 단일 웰 다중화는 각각의 앰플리콘에 대해 특이적이고 상이한 파장의 형광단으로 표지된 PCR 프로브, 예컨대, 택만™ 프로브를 사용함으로써 달성된다. 이 방법은 염료 방출 스펙트럼 및 스펙트럼 윈도우에 대한 제한으로 인해 단일 반응 다중화 성능을 최대 약 5종의 표적으로 제한한다.

본 실시예에 기재된 방법은 공정 동안 증폭의 진행에 대한 정보를 표면 결합된 어레이로 전달하기 위해 앰플리콘에 대한 대용물로서 작용하는 표지된 PCR 프로브를 사용한다. 주기 수 역치화(thresholding) 방법을 기초로 검출 및 정량 정보 둘다를 수득할 수 있게 하는, 증폭의 반응속도에 대한 정보가 보존된다.

PCR 주기에서 연장 단계 동안, Taq 중합효소의 5'-3'핵산분해효소 활성은 PCR 프로브를 절단하여, 어레이 표면 상의 포획 프로브에 우선적으로 혼성화될 수 있는 플랩 핵산을 방출한다. 각각의 플랩 및 상응하는 포획 프로브는 시험 패널 내의 잠재적 표적에 대해 특이적이다.

반응 챔버 깊이

주어진 어레이에 대해 챔버 두께와 신호 대 배경 노이즈 비의 관계를 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 다양한 깊이의 챔버를 갖도록 기재를 기계가공하고 작용기화된 중합체로 코팅하였다. 챔버의 실제 깊이를 측정하였다. 그 다음, 상기 기재를 포획 프로브로 스폿팅하고 UV 경화된 에폭시를 사용하여 밀폐된 반응 챔버로 조립하였다. 어레이 상의 각각의 포획 프로브에 상보적인 표지된 프로브 단편의 45 nM 합성 모방체, 및 255 nM의 상응하는 온전한 프로브를 함유하는 용액(15% 절단을 모방하기 위한 것임)을 각각의 밀폐된 반응 챔버 내에 피펫팅하였고, 30℃에서 3분 동안 혼성화시킨 후에 신호 대 배경 신호를 측정하였다. 어세이들 중 하나에 대한 결과는 도 13에 제시되어 있다. 볼 수 있는 바와 같이, 600 ㎛에서 200 ㎛ 미만으로의 반응 챔버 두께의 감소는 신호 대 배경 노이즈 비의 급격한 증가를 보였고, 이때 최적 비는 300 ㎛ 미만, 바람직하게는 200 ㎛ 미만의 두께에서 수득되었다.

PCR 챔버 및 어레이

대다수의 실험들에서 사용된 PCR 챔버는 도 2에 제시되어 있다. 도시된 바와 같이, 상기 챔버는 PCR 프로브의 플랩 서열에 상보적인 포획 올리고의 어레이를 함유하는 하면으로 구성된다. 포획 프로브는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스 인코포레이티드(Integrated DNA Technologies Inc.)(미국 아이오와주 코랄빌 소재)에 의해 합성되었고, 부착 화학물질과 올리고 서열 사이의 폴리에틸렌 글리콜 링커와 함께, PCR 챔버의 하면을 형성하는 기재에의 공유 부착을 위한 5' 말단 아민기를 갖는다. 서열의 길이는 상응하는 PCR 프로브 플랩과 동일하다. PCR 챔버의 하면은 상업적으로 입수가능한 슬라이드로부터 형성되었다. 이 슬라이드는 포획 프로브의 후속 부착을 위한 활성 NHS 에스테르를 함유하는 중합체성 코팅을 가졌다. 슬라이드는 상기 중합체성 코팅물로 코팅된 유리 및 플라스틱 기재 둘다를 포함하였다. 상기 두 종류의 슬라이드는 유사한 실험 데이터를 발생시켰다. 표준 어레이 프로토콜에 따라 스폿보트(SPOTBOT)™(어레이잇 테크놀로지스(Arrayit Technologies), 미국 캘리포니아주 선니베일 소재)를 이용하여 포획 프로브를 스폿팅하였다. 포획 프로브 스폿의 직경은 전형적으로 100 ㎛이었고 스폿 사이의 중심 대 중심 간격은 200 ㎛이었다.

포획 프로브의 스폿팅 및 세척 후, 도 2에 도시된 바와 같이, 압력-민감성 접착제(PSA), 및 입구 및 출구를 갖는 폴리카보네이트 상부 조각을 사용하여 PCR 챔버를 조립하였다. 상기 챔버는 142 ㎛의 최종 깊이/두께(또는 높이) 및 15 mm의 직경을 가졌다. 상기 챔버는 대략 45 ㎕ 부피의 PCR 시약을 보유하였다.

열순환기 및 광학소자 브레드보드(Breadboard)

열순환 및 광학 검출 시스템은 (1) 여기 광원(예를 들면, 수은 아크 램프 또는 LED), (2) 형광단의 특정 조합, 예컨대, Cy3, Cy5 등이 검출되도록 여기 광 및 방출 광을 위해 사용되는 간섭 광학 필터, 및 (3) CCD 또는 CMOS 카메라인 광검출기를 포함하는 에피형광 단일 채널 검출 시스템을 포함하였다.

상기 시스템은 밀폐된 소모품(예를 들면, 전술된 어레이 및 챔버)을 원하는 온도까지 원하는 시간 동안 급속히 열순환시키는 데에 이용되는 열순환 부품, 예컨대, 한 쌍의 열전기 모듈, 금속 플레이트, 방열재 및 강력한 냉각 팬도 포함하였다. 상기 소모품 근처의 써미스터(thermistor)를 제어 시스템에 대한 피드백으로서 이용하는 피드백 가능한 제어 시스템을 이용하여 열전기 모듈을 특정 시간 동안 특정 온도까지 제어하였다.

목표 온도 및 시간을 발생시키고 영상이 광검출기에 의해 촬영될 때를 특정하기 위한 입력정보로서 스크립 파일을 사용하는 컴퓨터를 이용하여 시스템 제어를 수행하였다. 열적 반응 동안 상이한 시간에서 촬영된 영상을 컴퓨터로 분석하여 강도 곡선을 시간의 함수로서 발생시켜 표적의 농도를 유추하였다.

단일 채널 형광 영상을 열적 반응의 진행 동안 다양한 시간 및 온도에서 소모품으로부터 포착하였다. 그 다음, 이들 형광 영상을 분석하여 출발 표적 핵산 농도를 정량하였다. 평균 그레이 강도 측정, 배경 보정 및 기준 조절을 병용하여 형광 영상을 분석하였다. 어레이에서 각각의 스폿에 대한 배경을 국소적으로 측정하였다. 관심 있는 스폿을 둘러싸는 용액의 동심원의 형광 강도를 측정하여 배경을 계산하였다. 그 다음, 각각의 스폿으로부터의 신호를 보정하여 국소 배경 문제를 처리하였다. 각각의 스폿으로부터의 보정된 신호를 더 표준화하여, 스폿팅에서의 가변성 및 시야의 불균일한 조명 문제를 처리하였다. 그 다음, 처음 수회 주기, 전형적으로 5회 내지 15회 주기로부터 수득된 보정된 강도 측정치의 평균을 이용하여 기준을 조절하고 각각의 스폿으로부터의 측정치를 표준화하였다.

실시예 1: 3 단계 증폭 반응

증폭 시약 믹스는 증폭될 각각의 표적에 대해 특이적인 2종의 PCR 증폭 프라이머뿐만 아니라 증폭될 각각의 표적에 대해 특이적인 PCR 프로브를 포함하는 표준 PCR 시약을 함유하였다. 전형적인 프로브의 구조는 도 1a에 개략적으로 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 도 1a 프로브 영역(A)은 전통적인 실시간 PCR 프로브(예를 들면, 택만™ 프로브)에 대해 전형적인 규칙과 동일한 규칙을 이용하여 디자인한, 표적 앰플리콘에 상보적인 프로브의 핵산 영역을 나타낸다. 프로브 영역(B)은 상응하는 포획 프로브(하기에 논의되어 있음)에 상보적이지만 표적 핵산에는 상보적이지 않는 오르토고날 핵산 "플랩"을 나타낸다. 예시 목적으로, 이 서열은 일례에서 40℃ 내지 46℃의 T_m을 갖도록 디자인되지만, 다른 프로브 디자인이 대신 이용될 수 있다. 일례에서, 서열 길이는 약 13개 또는 14개 염기이다. 프로브 영역(C)은 핵산 영역(B)의 서열의 일부에 상보적인 서열을 갖는 핵산을 나타낸다. 이 서열은 예를 들면, 47℃ 내지 51℃의 T_m을 갖는 전장 프로브의 이차 구조의 형성을 용이하게 하도록 디자인된다. 소광제(D)는 임의적 소광제 분자를 나타낸다. 표지(E)는 형광단 또는 다른 광학적으로 검출가능한 표지를 나타낸다. 형광단 Cy3은 하기 제시된 데이터를 위해 사용되었다.

본 실시예의 데이터를 위해, 하기 시약 제제를 사용하여 PCR을 수행하였다: 200 nM 프라이머, 1X 패스트 스타트(FAST START)™ PCR 완충제(로슈(Roche)로부터 입수가능함), 2 mM 내지 6 mM MgCl₂, 0.5 mg/㎖ BSA, 0.2 유닛/㎕ 패스트 스타트™ Taq 중합효소(로슈), 및 150 nM의 PCR 프로브.

상기 제제를 사용하여 100 ㎕ PCR 반응액을 제조하였다. 본 실시예에서 사용된 PCR 프로브 서열은 다음과 같았다:

5' 플랩 및 3' 플랩은 밑줄/이중밑줄로 표시되어 있고, 전통적인 택만 서열은 굵은 글자체로 표시되어 있다. 이중밑줄로 표시된 서열은 이차 구조를 형성하도록 디자인된 상동성 영역을 표시한다. 이차 구조의 예측된 용융 온도는 PCR 완충제 조건을 이용하는 mFold(idtdna.com)에 의해 측정되었을 때 51℃이었다. PCR 프로브를 5' Cy3 형광단 및 3' 말단 상의 블랙 홀(Black Hole) 소광제 2 모이어티로 표지하였다.

PCR 챔버의 하면 기재에 부착된 포획 프로브 서열은 PCR 완충제 조건을 이용하였을 때 42℃의 T_m을 갖는 NNN NNN NNN NNN N(서열번호 2)이었다.

표적 서열을 포함하는 DNA 플라스미드를 10⁶개, 10⁴개 및 10²개 카피/㎕의 농도로 각각의 PCR 반응액에 첨가하였다. 그 다음, 용액을 95℃까지 가열하여 탈기시켰다. 탈기 후, 중합효소를 첨가하였고, 피펫을 이용하여 반응액을 PCR 챔버 내로 로딩하였다. 남은 용액을 병행 분석을 위해 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 7500 상에 로딩하였다.

어레이-기반 PCR에 대한 순환 조건은 다음과 같았다:

온도 시간 목적

95℃ 120초 빠른 출발 효소 활성화

95℃ 15초 변성

60℃ 60초 중합효소 연장

30℃ 120초 플랩 혼성화 및 광학 판독

(변성 및 연장을 5회 주기 동안 수행한 후, 변성/연장/플랩 혼성화 및 광학 판독을 8회 주기 동안 반복하였다).

ABI 7500에 대한 순환 조건은 다음과 같았다:

온도 시간 목적

95℃ 120초 빠른 출발 효소 활성화

95℃ 15초 변성

60℃ 60초 중합효소 연장 및 광학 판독

변성/연장 및 판독을 40회 주기 동안 수행하였다.

카피 수 적정에 대한 결과는 어레이-기반 PCR의 경우 도 3에 제시되어 있고 용액상 PCR의 경우 도 4에 제시되어 있다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 결과는 상기 적정에 대한 유사한 거동을 제공하면서 필적할만하다.

실시예 2: 2 단계 증폭 반응

상기 실시예 1과 마찬가지로, 증폭 시약 믹스는 증폭될 각각의 표적에 상보적인 2종의 PCR 프라이머(200 nM)뿐만 아니라 증폭될 각각의 표적에 상보적인 서열을 갖는 PCR 프로브(300 nM)를 포함하는 표준 PCR 시약을 함유하였다. 전형적인 프로브의 구조는 도 1b에 제시되어 있다. 도시된 바와 같이, 표지된 프로브는 전통적인 실시간 PCR 프로브(즉, 택만™)에 대해 전형적인 규칙과 동일한 규칙을 이용하여 디자인한, 표적 앰플리콘에 상보적인 핵산 단편(A)을 포함한다. 포획 어레이 상의 상응하는 포획 프로브에 상보적인 오르토고날 핵산 "플랩" 서열(B)도 포함된다. 상기 프로브는 플랩 부분(B)에 커플링된 형광 표지(C) 및 표적 특이적 부분(A)에 커플링된 소광제 모이어티(D)도 포함한다.

2 단계 증폭을 위해, 오르토고날 플랩(B)은 포획 어레이 상의 그의 상보체에 대해 70℃의 T_m을 갖도록 디자인된 서열을 포함한다. 전형적으로, 서열 길이는 25개 내지 27개 염기이다. 상기 실시예 1과 마찬가지로, 가장 안정한 이차 구조가 PCR에 사용된 완충제 조건에서 연장 및 측정 온도보다 10℃ 이하만큼 낮은 T_m을 갖도록 전체 프로브를 디자인한다. 웹사이트(www.idtdna.com)에서 입수가능한 unaflod 소프트웨어를 이용하여 올리고를 디자인하였다. 하기 PCR 프로브 서열을 본 실시예에서 사용하였다:

이중밑줄로 표시된 서열이 오르토고날 플랩을 구성하는 경우, 밑줄로 표시되지 않은 서열은 앰플리콘에 대해 상동성을 나타낸다. 프로브의 가장 안정한 이차 구조는 45℃의 용융 온도를 갖는다. 오르토고날 플랩의 T_m은 71℃이다. PCR 프로브를 내부 Cy3 형광단(C)(지이 헬쓰케어 바이오사이언시스(GE Healthcare Biosciences)로부터 입수가능함, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 및 3' 말단 상의 블랙 홀 소광제 2 모이어티(D)(바이오서치 인코포레이티드(Biosearch, Inc.)로부터 입수가능함, 미국 캘리포니아주 노바토 소재)로 표지하였다.

PCR 프로브의 플랩 부분에 대해 상동성을 나타내는 포획 프로브를 스폿팅하였다. 하기 순환 조건을 이용하였다는 점을 제외하고 PCR을 전술된 바와 같이 수행하였다:

온도 시간 목적

95℃ 60초 빠른 출발 효소 활성화

95℃ 15초 변성

55℃ 60초 중합효소 연장, 플랩 혼성화 및 광학 판독

각각의 연장 단계의 말기에서 형광 신호를 측정하면서 40회의 주기를 수행하였다. 도 12는 2종의 표적에 대한 어레이-기반 PCR에 대한 카피 수 적정을 보여주는데, 이때 제1 표적은 처음에 10⁴개 카피의 표적 DNA 플라스미드로 제공되었지만, 제2 표적은 10⁶개 카피로 제공되었다.

실시예 3: 비소광된 PCR 프로브를 사용한 어레이-기반 PCR 곡선

하기 사항을 제외하고 실시예 1과 동일한 프로토콜을 이용하였다. 사용된 PCR 프로브 서열은 다음과 같다:

이 서열은 5' Cy3 형광단으로 표지되었으나, 3' 소광제를 포함하지 않았다. 10⁶개 카피의 표적을 첨가하였고 PCR을 수행하였다. 실시간 데이터는 도 5에 제시되어 있다.

실시예 4: 다중화된 어레이-기반 증폭

본 실험은 동일한 PCR 챔버 내에서 다수의 표적에 대한 정보를 얻고 이를 증폭하는 능력을 확립한다. PCR 조건은 하기 예외를 제외하고 실시예 1에서 제시된 PCR 조건과 동일하다: 첫째, 5개의 프라이머 세트 및 5개의 별도의 PCR 프로브를 조사될 각각의 표적에 대해 특이적인 PCR 반응액에 첨가한다. 둘째, 상기 5개의 PCR 프로브 각각의 5' 플랩 서열에 상응하는 5개의 독특한 포획 프로브를 PCR 챔버의 하면 기재 상에 침착시킨다. 셋째, 10번째 PCR 주기 후, 실시예 1에서 같이 5회 주기마다 온도를 하강시키는 대신에 2회 주기마다 온도를 30℃의 표면 혼성화 온도까지 하강시켰다. 이것은 PCR 증폭 동안 보다 높은 빈도의 광학적 정보전송을 가능하게 한다.

PCR 프로브 및 포획 프로브 서열은 하기에 제시되어 있다:

PCR 프로브:

포획 프로브

FluA: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 8)(46℃의 T_m)

A/H1: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 9)(45℃의 T_m)

A/H3: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 10)(42℃의 T_m)

FluB: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 11)(46℃의 T_m)

phiMS2: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 12)(43℃의 T_m)

상기 프라이머 및 PCR 프로브에 대해 특이적인 서열을 포함하는 5개의 표적 플라스미드를 100 ㎕ PCR 반응액에 첨가하였고, 용액을 전술된 바와 같이 제조하여 로딩하였다. 수득된 실시간 어레이-기반 PCR 데이터는 도 6에 제시되어 있다.

실시예 5: 고수준 다중화

본 실시예는 본 실시예의 패널에 포함된 10개의 잠재적 표적 중 임의의 표적일 수 있는 다수의 표적의 검출을 위한 단일 챔버 다중화를 입증한다. 이 수준의 다중화(5개 초과의 잠재적 표적의 패널)는 전통적인 용액상 PCR에서 달성될 수 없다.

실험 재료 및 절차는 하기 사항을 제외하고 전술된 재료 및 절차와 동일하였다: 첫째, 10개의 프라이머 세트 및 PCR 프로브를 상기 농도와 동일한 농도로 PCR 반응액에 도입하였다. PCR 프로브 및 포획 프로브의 서열은 하기에 제시되어 있다:

PCR 프로브:

포획 프로브

포획 프로브 T_m

FluA: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 26)(46℃의 T_m)

A/H1: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 27)(45℃의 T_m)

A/H3: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 28)(42℃의 T_m)

FluB-v2: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 29)(46℃의 T_m)

phiMS2: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 30)(43℃의 T_m)

MPV: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 31)

PIV1: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 32)

PIV2: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 33)

PIV3: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 34)

RSV: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 35)

RSV-v2: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 36)

OPC1: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 37)

도 7은 표적이 PCR 반응액에 첨가되지 않았을 때(주형 부재 대조군) 수득된 실시간 어레이-기반 PCR 곡선을 보여준다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 표적을 제외하고 모든 PCR 성분을 함유하는 용액으로부터 신호가 수득되지 않았다. 도 8은 10,000개 카피/㎕의 농도로 첨가된 3개의 플라스미드 표적을 사용한 동일한 실험(MPV, OPC-1, PIV2)을 보여준다.

실시예 6: 빠른 혼성화 반응속도의 입증

PCR 챔버를 전술된 바와 같이 구축하였다. 하기 아민 페길화된(pegylated) 포획 프로브 서열을 하면 기재 상에 침착시켰다: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 38).

PCR 프로브의 5' 플랩 부분을 모방하고 5' 말단 상에서 Cy3 형광단으로 표지되어 있고 포획 프로브에 상보적인 하기 올리고 서열(100 nM)을 함유하고 전술된 PCR 완충제를 함유하는 용액을 제조하였다: NNN NNN NNN NNN N(서열번호 39).

상기 용액을 PCR 챔버 내로 로딩하였고, 상기 챔버를 60℃(이중체의 T_m보다 15℃ 더 높음)까지 가열한 후 30℃까지 다시 냉각시켰다. 이것은 PCR 프로토콜의 혼성화 단계 동안의 조건을 모방한다. 2분 동안 20초마다 광학 판독을 수행하였다. 수득된 데이터는 도 9에 제시되어 있다.

데이터의 한 흥미로운 양태는 내부 온도가 30℃에 도달하는 즉시 일어나는 상당한 혼성화가 이미 존재한다는 것을 보여준다.

실시예 7: 다크(dark) 어세이 구성

상기 실시예 1에 기재된 3 단계 증폭 어세이를, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스에서 입수한, 5' 말단에 커플링된 아이오와 블랙 RQ 소광제 기를 포함하는 프로브의 플랩 부분을 이용하여 프로브에 부착된 임의의 다른 표지 또는 소광 기 없이 반복하였다. 어레이 표면 상에 침착된 포획 프로브는 3' 말단에 커플링된 Cy3 형광단을 운반하였다.

모든 프라이머 및 프로브 서열을 IDT에서 주문하여 냉동건조 상태로 받았다. 이후 이들을 물에서 스톡 농도로 (100 uM 내지 200 uM) 재현탁하고 이를 사용하여 PCR 반응을 위한 프라이머/프로브 스톡 용액을 제조하였다. H03 NVS PCR 완충제를, 프라이머 및 프로브와 배합하여 PCR 마스터 믹스를 제조했다.

작용기화된 표면(작용기화된 중합체로 코팅된 COP 기재)를 어레이-잇 스폿보트(Array-It spotbot) 2를 통해 전통적인 마이크로어레이 스폿팅 기법을 사용하여 스폿팅했다. 스폿팅된 슬라이드를 75% 습도에서 8-15 시간 동안 인큐베이팅한 다음 탈이온수로 세정하고 아르곤으로 건조시켰다. 표지된 포획 프로브를 50mM pH 8.5 스폿팅 완충제에서 100 nM 내지 50 uM 범위의 농도로 스폿팅하여, 신호 강도의 범위를 생성하였다.

상기 실시예들에 대해, 칩 기반 반응 챔버를, 양면 압력 민감 접착제 개스킷, 폴리카보네이트 뚜껑 및 광학 투명 시일(seals)을 이용하여 작용기화된, 어레이된 표면의 상부에 제작하였다. 반응 챔버의 총 부피는 150 ㎛ 높이에서 대략 30 uL이다.

공지 농도의 표적 서열을 PCR 마스터 믹스에 첨가하고 생성된 용액을 반응 용기에 로딩한다. 용기를 밀봉하고 상술한 열순환 기기 상에 로딩하였다. 표적 서열을, 플라스미드 스톡으로부터 또는 앰플리콘 스톡을 수반하는 이전 반응에서 나온 결과적인 앰플리콘으로부터 수득하였다. 모든 표적 분자를, 나노드롭(NanoDrop) 기기 상에서 UV-Vis 분광분석을 이용하여 정량하였다.

열순환 조건은 95℃에서 85초간 핫 스타트 단계, 이후 각각 5초 및 20초 동안 용융(melt)(95℃) 및 연장(55℃)의 40회 주기를 포함하였다. 주기 10, 15, 18, 및 이후 매 2 주기에서, 데이터 수집을 위해 상기 주기에 추가 단계를 부가한다. 온도는 연장 후 30℃로 조절되고, 30초간 유지된다. 이들 혼성화 단계의 마지막에 표면 이미지를 수집한다. 각 어세이에 대해 스폿에서 평균 화소 강도를 계산하고 주기 수에 대해 플롯팅하여 실시간 PCR 곡선을 생성한다. 용액 및 표면 프로브 디자인은 어세이 포맷 3에 나타낸 바와 같다. 이중(duplex) PCR 반응을 위해, H3 및 OPCl 어세이를 위해 600 nM 프라이머 및 300 nM 프로브를 첨가한다. 도 15는 플랩 부분과 이들의 회합된 소광제의 Cy3 표지된 포획 프로브로의 혼성화 증가에 기반한 실시한 PCR 반응의 경과를 도시한 도면이다. 형광 신호를 음성 신호의 절대 값으로서 플롯팅하여, 반응이 진행됨에 따른 신호 감소를 보여준다.

본원에서 요약된 방법은 종래 방법에서 발견되지 않은 다수의 이점을 갖는다. 본 발명의 시스템은 증폭 공정 동안 실시간으로 용액상 PCR로부터의 정보를 표면-국한된 어레이로 효율적으로 전달함으로써 단일 챔버 고도 다중화된 정량 PCR을 가능하게 한다. 이것은 용액상 실시간 PCR에 대해 축적된 엄청난 지식 체계의 효율 및 영향력을 보존하면서 훨씬 더 높은 수준의 다중화를 가능하게 한다. 이를 달성하기 위해, 시스템의 다수의 신규 양태가 개발되어야 했다.

예를 들면, 본 발명의 한 특징은 용액상과 고체상을 연결하는 앰플리콘 대용물의 사용이다. 어레이-기반 실시간 PCR을 목적으로 하는 종래 기술은 일반적으로 앰플리콘 자체와 고체상 어레이의 혼성화에 의존하였다. 이것은 시스템을 복잡하게 만들고 효율을 저해하고 필요한 정보를 해독하기 위해 보다 비싼 부품을 필요로 한다는 다수의 문제점을 제공한다. 다중화된 PCR 환경에서, 유사한 길이 및 혼성화 효율을 갖는 앰플리콘을 디자인하는 것은 매우 어렵다. 절단가능한 5' 플랩을 갖는 PCR 프로브의 사용은 혼성화 반응속도에 대해 이상적인 매우 짧은 서열을 사용함으로써 정보를 각각의 앰플리콘으로부터 표면으로 전달하는 종을 균질화한다. 또한, 이 방법은 어레이 상의 포획 프로브 서열이 검출될 앰플리콘의 서열과 무관하게 만든다. 이것은 가장 유리한 포획 서열의 선택을 가능하게 하고, 디자인 및 제작 방법을 단순화시키는, 많은 상이한 표적 패널에 사용될 수 있는 보편적인 어레이의 가능성을 제공한다.

본원에서 개시된 바와 같이, PCR 프로브는 프로브-기반 용액상 실시간 PCR에 대해 이미 개발된 디자인 규칙에도 영향을 미친다. 혼성화를 위한 매우 짧은 서열의 사용(예를 들면, 13-14개 염기)은 혼성화의 효율을 매우 높여, 표준 PCR 완충제의 저염 환경에서 어레이 상의 높은 신호를 가능하게 한다. 따라서, 본원의 시스템은 표면 혼성화가 최적 용액상 PCR과 커플링되어야 하는 단일 챔버에서 매우 잘 작동할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 표면-혼성화된 신호를 용액상 배경 형광으로부터 구별한다는 것이다. 본 발명의 이 양태는 어레이로부터 관련 정보를 추출하는 데에 있어서 중요하다. 종래 기술은 이 문제점을 극복하기 위해 복잡하거나 비용이 많이 드는 광학적 방법을 이용한다(예컨대, 표면 신호를 용액 배경으로부터 분리하기 위한 총 내부 반사율 또는 공초점 현미경관찰의 이용). 대조적으로, 본 발명은 구별을 달성하기 위해 광학적 "비법(tricks)"을 필요로 하지 않는 단순한 표준 광학 장치의 사용을 제공한다. 신호를 구별하는 능력은 다수의 공급원들로부터 발생된다. 어레이에서 이용된 표면 화학반응은 매우 높은 포획 프로브 밀도 및 이로 인한 매우 높은 혼성화된 표적 밀도를 제공한다. 표면은 표적 핵산의 100% 포획 효율에 도달할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 높은 포획 밀도 및 효율은 표면/용액상 구별에 있어서 도움을 주는 표면 신호의 농축에 기여한다. 짧은 표적 핵산의 사용은 이 효과를 급격히 상승시키는 데에 기여한다.

신호 구별에 도움을 주는 본 발명의 또 다른 양태는 매우 얇은 PCR 챔버의 사용이다. 용액으로부터의 배경 신호는 어레이 위쪽 용액의 높이에 선형적으로 관련된다. 얇은 챔버의 사용은 이 효과를 이용한다.

본 발명의 또 다른 양태는 용액상 정보가 표면 어레이로 실시간으로 전달되게 하는 빠른 혼성화 반응속도의 이용이다. 이들 실시예에 기재된 시스템은 매우 빠른 고체상 혼성화를 입증한다. 이 현상은 기술을 촉진하고, 짧은 5' 플랩 표적, 최적 고체상 표면 화학반응, 얇은 소모품, 및 열순환 온도 프로그램 동안 생성된 온도 구배를 포함하는 본 발명의 다수의 양태에 기인할 수 있다.

상기 발명은 명료함 및 이해를 목적으로 다소 상세히 기재되어 있지만, 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화를 만들 수 있다는 것이 본 개시내용의 판독으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 예를 들면, 전술된 모든 기법 및 장치는 다양한 조합으로 이용될 수 있다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허, 특허출원 및/또는 다른 문헌은 각각의 개별 공개문헌, 특허, 특허출원 및/또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참고로 도입되는 것으로 개별적으로 표시되어 있는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 도입된다.

Claims

샘플에서 표적 핵산 서열을 검출하는 방법으로서,
표적 핵산 서열에 상보적인 제1 부분, 및 제1 표적 핵산 서열에 상보적이지 않고 제1 위치에서 커플링된 제1 소광제 모이어티를 포함하는 제2 부분을 포함하는 제1 프로브를 포함하는 시약(reagent)의 존재하에, 표적 핵산 서열이 증폭될 때 제2 부분이 제1 프로브 단편으로서 제1 부분으로부터 절단되도록, 핵산분해효소(nuclease) 활성을 가진 중합효소를 이용하여 샘플 상에서 증폭 반응을 실시하는 단계;
제1 프로브 단편을 기재 상에 고정화된 포획 프로브에 혼성화하는 단계로서, 포획 프로브가 제1 소광제 모이어티에 의해 적어도 부분적으로 소광되는 형광단을 포함하고, 형광단은, 상기 프로브 단편의 포획 프로브로의 혼성화시 형광단이 소광제에 의해 적어도 부분적으로 소광되도록, 포획 프로브 상의 제2 위치에 커플링되는 것인 단계; 및
포획 프로브 상의 형광단의 소광에 기초하여 표적 서열의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
증폭 시약은 상이한 표적 핵산 서열에 상보적인 다수의 상이한 제1 부분과 다수의 표적 핵산 서열에 상보적이지 않은 상이한 제2 부분을 가진 다수의 상이한 프로브를 포함하고, 제2 부분은 각각 제1 위치에 커플링된 소광제 모이어티를 포함하고, 다수의 제2 부분은 다수의 표적 핵산 서열의 증폭시 프로브 단편으로서 절단되며;
기재는 기재 상에 배열된 다수의 상이한 포획 프로브 영역을 포함하고, 각각의 포획 프로브 영역은 다수의 상이한 프로브의 상이한 제2 부분에 상보적인 포획 프로브를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 소광제 모이어티에 의해 소광되는 형광단을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 제1 위치는 프로브 단편의 5' 말단을 포함하고, 제2 위치는 포획 프로브의 3' 말단을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 각각의 포획 프로브 영역은 프로브 단편에 혼성화하는 비-비율 제한 수(non-rate limiting number)의 포획 핵산을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 포획 프로브에 혼성화하는 제1 프로브 단편은 길이가 약 30개 뉴클레오티드 미만인 방법.
제1항에 있어서, 포획 프로브에 혼성화하는 제1 프로브 단편은 길이가 약 20개 뉴클레오티드 미만인 방법.
제1항에 있어서, 포획 프로브에 혼성화하는 제1 프로브 단편은 길이가 약 15개 뉴클레오티드 이하인 방법.
제1항에 있어서, 표적 핵산이 상기 검출 이전에 5회 이상의 증폭 주기 동안 증폭되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 표적 핵산이 상기 검출 이전에 다수회 증폭 주기에서 증폭되고, 표적 핵산 부분이 상기 검출 후 프로브의 추가 카피의 존재하에 추가적으로 증폭되고, 그 결과 방출된 제1 프로브 단편이 이후에 어레이에 혼성화되어 검출되고, 검출된 신호 강도가 샘플 중에 존재하는 표적 핵산의 양과 상호관련되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 혼성화 온도가 증폭 반응의 온도 미만인 방법.
제1항에 있어서, 어레이의 하나 이상의 영역에 대해 국소 배경(local background)을 검출하는 단계, 및 상기 배경에 대해 보정함으로써 신호 강도 측정치를 표준화하는 단계를 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 샘플이 다수의 표적 핵산을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 다수의 상이한 포획 프로브가 기재 상에서 공간적으로 분리되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 증폭 반응에서 약 5 내지 약 100종의 상이한 포획 프로브, 및 약 5 내지 약 100종의 상응하는 프로브가 존재하고, 어레이에서 신호의 배치(positioning)에 기초하여 최대 5 내지 100종의 상이한 신호가 검출될 수 있는 것인 방법.
제2항에 있어서, 포획 프로브가 약 350 fmoles/㎠ 내지 약 5,000 fmoles/㎠ 또는 그 이상의 밀도로 기재 상에 배열되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 포획 프로브가 2000 fmoles/㎠ 초과의 밀도로 기재 상에 배열되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 다수의 상이한 포획 프로브가 동일한 표지 모이어티를 포함하고, 다수의 상이한 프로브 단편이 동일한 소광제 모이어티를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 증폭 단계 및 제1 프로브 단편의 기재로의 혼성화 단계가 동일한 온도에서 수행되는 것인 방법.