MX2014005912A - Deteccion cuantitativa, altamente multiplexada de acidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona métodos de detección y cuantificación de ácidos nucleicos blanco de muestras en reacciones en una sola cámara multiplexada. Se proporcionan cámaras que incorporan consumibles optimizadas para reducir la señal de fondo próxima a matrices de alta eficiencia, así como métodos de uso. Dispositivos y sistemas configurados para utilizar los consumibles para la práctica de los métodos son una característica de la invención.

Description

DETECCIÓN CUANTITATIVA, ALTAMENTE MULTIPLEXADA DE ÁCIDOS NUCLEICOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud de Patente de los E.U.A. Número de Serie 13/399,872, presentada en febrero 17, 2012, y la Solicitud de Patente Internacional Número PCT/US2012/025699 , presentada en febrero 17, 2012, ambas de las cuales reclaman prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. Número de Serie 61/463,580, presentada en febrero 18, 2011, y la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. Número de Serie 61/561,198, presentada en noviembre 17, 2011, todas las descripciones de cada una de las cuales aquí se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

DECLARACIÓN EN CUANTO A DERECHOS A INVENCIONES REALIZADAS BAJO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO AUSPICIADOS FEDERALMENTE Esta invención se hizo con soporte de una concesión del Departamento de los E.U.A. de Seguridad Nacional, Número de Contrato HSHQDC-10-C-00053. El gobierno puede tener ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de amplificación, detección y cuantificación de DNA en tiempo real, así como consumibles, dispositivos y sistemas asociados incluyendo matrices .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN PCR en tiempo real se emplea rutinariamente para detectar ácidos nucleicos de interés en una muestra biológica. Para una revisión de PCR en tiempo real ver por ejemplo, M Tevfik Dorak (Editor) (2006) Real-time PCR (Advanced Methods) Taylor & Francis, lst edition ISBN- 10: 041537734X ISBN- 13: 978-0415377348, and Logan et al. (eds.) (2009) Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Caister Academic Press, lst edition ISBN- 10: 1904455395, ISBN-13: 978-1904455394. Para detalles adicionales, ver también, por ejemplo, Gelfand et al. "Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity of A Nucleic Acid Polymerase" USP 5,210,015; Leone et al. (1995) "Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA" . Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; and Tyagi and Kramer (1996) "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization" Nature Biotechnology 14:303-308. Tradicionalmente , multiplejado en un solo pozo, empleado para detectar más de un ácido nucleico objetivo por muestra en un solo recipiente de reacción (por ejemplo, en pozo de placa con múltiples pozos) , se logra utilizando sondas PCR de autoextinción tal como TAQMAN™ o sondas de Balizas Moleculares que son específicas para cada amplicón. Al ligar al amplicón en solución, o al degradar las sondas durante PCR, las sondas se desactivan en extinción, produciendo una señal detectable. Las sondas se etiquetan con fluoróforos de diferentes longitudes de onda, permitiendo una capacidad de múltiplejado de hasta aproximadamente 5 blancos en una reacción de un solo "recipiente" . Más de aproximadamente 5 sondas por reacción es difícil de lograr, debido al intervalo espectral práctico y limitaciones de emisión de etiqueta. Esto limita severamente múltiplejado de una sola reacción, que a su vez limita significativamente qué tantos blancos u objetivos pueden cribarse por muestra y aumenta el costo de reactivos y complejidad de instrumentos para detectar múltiples blancos de interés .

Matrices de ácidos nucleicos representan otro enfogue al múltiplejado para detectar los productos de amplificación. En forma más típica, se realizan reacciones de amplificación en una muestra, y los amplicones se detectan por separado en una matriz de ácido nucleico. Por ejemplo, Sorge en "Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probé Comprising Secondary Structure" Patente de los E.U.A. Número 6,350,580 propone la captura de una sonda que se libera ante amplificación por purificación de la sonda de la mezcla de amplificación y después detectarla. Este enfoque de múltiples etapas para producir y detectar amplicones hace impráctico al análisis en tiempo real de la mezcla de amplificación .

Diversos enfoques que amplifican los reactivos en la presencia de los ácidos nucleicos de captura también se han propuesto. Por ejemplo, Kleiber et al. "Integrated Method and System for Amplifying and Detecting Nucleic Acids" , Patente de los E.U.A. 6,270,965, propone detección de un amplicón por fluorescencia inducida por evanescencia. Similarmente, Alexandre et al "Identification and Quantification of a Plurality of Biological (Micro) Organisms or Their Componente" , Patente de los E.U.A. Número 7,829,313, propone detección de amplicones en matrices. En otro ejemplo, polinucleótidos blancos se detectan al detectar un fragmento de sonda que se produce como resultado de amplificación, por ejemplo al ligar a un electrodo, seguido por detección electroquímica. Ver, por ejemplo, Aivazachvilli et al. "Detection of Nucleic Acid Amplification" Patente de los E.U.A. Número 2007/0099211; Aivazachvilli et al. "Systems and Methods for Detecting Nucleic Acids" Patente de los E.U.A. Número 2008/0193940, y Scaboo et al. "Methods And Systems for Detecting Nucleic Acids" Patente de los E.U.A. Número 2008/0241838.

Estos métodos todos sufren de limitaciones prácticas que limitan su uso para múltiplejar detección de ácido nucleico blanco. Por ejemplo, Kleiber (Patente de los E.U.A. Número 6270,965) se basa en fluorescencia inducida por evanescencia para detectar fluorescencia de amplicones en la superficie de la matriz, y requiere complejos y costosos componentes ópticos y matrices. Alexandre (7,829,313) propone detección de amplicones en una matriz; como en Kleiber esto aumenta el costo de la matriz significativamente, debido a que cada matriz debe ser diseñada a la medida para detectar cada amplicón. En la práctica puede ser difícil lograr cinéticas de hibridización similares para diferentes amplicones en una matriz, particularmente cuando los amplicones son relativamente grandes como en Alexandre. Además, esta técnica proporciona poca guía respecto a cómo detectar la señal en una matriz cuando hay una fase de solución acompañante que también comprende altos niveles de fondo de señal, o de matrices que permanecen estables a través de ciclado térmico in situ.

La presente invención supera estos y otros problemas en la técnica. Una comprensión más completa de la invención se obtendrá ante una revisión completa de lo siguiente .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos y dispositivos, sistemas y consumibles asociados que permiten detección altamente muítiplejada de ácidos nucleicos de interés, por ejemplo para la detección de virus, bacterias, plasmodio, hongos u otros patógenos en una muestra biológica. Los consumibles comprenden una cámara de señal optimizada que tiene una matriz de detección de ácido nucleico termoestable de alta eficiencia en una superficie interior de la cámara. La matriz se configura para detectar hasta aproximadamente 100 o más diferentes sondas etiquetadas universales. Los métodos generan las sondas universales etiquetadas (como "fragmentos de sonda") durante amplificación de una porción de un ácido nucleico de interés, con la reacción de amplificación que se realiza en la cámara. Las sondas universales se hibridizan en la matriz después de unos cuantos ciclos de amplificación, y subsecuente a ciclos de amplificación selectos posteriores, permitiendo tanto detección como cuantificación de uno o más ácidos nucleicos de interés en la muestra, en tiempo real.

De acuerdo con un primer aspecto, se proporcionan métodos para detectar un ácido nucleico objetivo. Esto incluye proporcionar una cámara de detección que tiene cuando menos una matriz de detección de ácido nucleico de alta eficiencia en al menos una superficie de la cámara. La matriz de alta eficiencia típicamente tiene un número que no es limitante de la velocidad de ácidos nucleicos de captura que permiten una velocidad de captura incrementada de fragmentos de sonda detectables que se producen por una reacción en la cámara, y los ácidos nucleicos de captura se configuran para capturar ácidos nucleicos sonda relativamente pequeños, que también aumentan la eficiencia de la matriz. Detección de enlace de las ondas a la matriz de preferencia se lleva a cabo bajo condiciones que se eligen o configuran para reducir niveles de señal de fondo próximos a la matriz, por ejemplo que resulta de sonda libre no ligada. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la propia cámara se configura para reducir fondo de señal próximo a la matriz, por ejemplo al conformar la cámara para reducido fondo (por ejemplo al hacer la cámara relativamente delgada próxima a la matriz, por ejemplo la cámara típicamente tiene aproximadamente 500 µp? o menos profundo sobre la matriz) . Cámaras más delgadas también tienen menos masa térmica y pueden ser cicladas en temperatura en forma más rápida y más eficiente que cámaras más gruesas. Otras formas en las que los sistemas y métodos se configuran para reducir el nivel de señal de fondo se describen con más detalle a continuación.

Una muestra que tiene una o más copias del ácido nucleico blanco a detectar se carga en la cámara de detección. Un cebador de amplificación y una sonda etiquetada se hibridizan a la una o más copias de ácido nucleico objetivo. Al menos una porción de una o más copias de ácido nucleico objetivo se amplifican en una reacción de amplificación dependiente de cebador de amplificación. La reacción de amplificación resulta en disociación de la sonda etiquetada, por ejemplo debido a actividad de nucleasa de la enzima de amplificación. Esto resulta en liberación de un fragmento de sonda de etiquetado, que se va a detectar por la matriz. Fragmento de sonda de etiquetado se hibridiza a la matriz de alta eficiencia (típicamente después de unos cuantos ciclos de amplificación se ejecutan para amplificar la cantidad de fragmento de sonda liberado en la cámara) . Una señal de etiqueta producida al ligar el fragmento de sonda etiquetado a la matriz después se detecta, de esta manera detectando el ácido nucleico blanco u objetivo.

La configuración precisa de la cámara de detección puede variar. La configuración se selecciona para reducir fondo de señal en la cámara próximo a la matriz. En general, al menos 1%, y a menudo aproximadamente 5% o más de la señal en la cámara se concentra en la matriz (por ejemplo, aproximadamente 6%, 8%, o incluso 10% o más) en la región de la matriz. Fondo de 99% o menos de señal total puede normalizarse por el sistema, aunque menores niveles a menudo son convenientes. En modalidades típicas aquí descritas, niveles de 95% o menos de fondo total se logran al optimizar la configuración de la cámara próxima a la matriz. Esta optimización de configuración se logra al mantener la profundidad de la cámara sobre la matriz a un mínimo. En modalidades típicas, la cámara tiene menos de aproximadamente 1 mm en profundidad u otra dimensión próxima a la matriz, en forma más típica aproximadamente 500 µt? o menos en cuando menos una dimensión próxima a la matriz, de preferencia menos de aproximadamente 250 ym o menos, por ejemplo entre aproximadamente 10 µ??? y aproximadamente 200 µp? y en algunas modalidades, la cámara tiene aproximadamente 150 µ?? en una dimensión próxima a la matriz. Aquí en un ejemplo, la cámara tiene aproximadamente 142 µt? de profundidad sobre la matriz. En otro ejemplo, aquí, la cámara tiene aproximadamente 100 µp? de profundidad. La dimensión de cámara relevante depende de la ruta de detección de señal del sistema de detección, por ejemplo cuando la señal se genera al pasar luz en la matriz, en donde algo de la luz se escapa a través de la matriz y hacia el fluido sobre la matriz, la dimensión relevante es la profundidad de la cámara sobre la matriz. Además, para reducir el nivel de señal de fondo detectada reducir el espesor de la cámara también tiene beneficio en reducir la contribución de los componentes de interferencia de fondo, por ejemplo respuestas de detector no relacionadas a la detección específica de la señal punto de matriz y señal de fondo del fluido de reacción. En particular, un contribuyente principal de interferencia es la interferencia de tiro de los detectores empleados, que generan aumentos con la raíz cuadrada de la cantidad total de la señal detectada, que a su vez aumenta en escala con el espesor de la cámara de reacción. De acuerdo con esto, el proporcionar espesor reducido en la cámara de reacción, se reduce la interferencia de fondo, y consecuentemente se aumenta la proporción de señal a interferencia de fondo (SNR = Signal to background Noise Ratio) del sistema total . Otros contribuyentes de interferencia potencial incluyen detección de luz en exceso, por ejemplo luz de excitación no filtrada, luz ambiente no pretendida, florescencia dispersa, autoflorescencia de componentes del sistema o semejantes. Una cantidad de estos contribuyentes de interferencia puede ser mitigada a través de los enfoques convencionales, tales como a través del uso de filtros ópticos apropiados, por ejemplo para eliminar o reducir el exceso de luz de excitación, sistemas ópticos sellados que reducen o evitan la luz ambiente al detector, y a través de la configuración del tamaño de punto de matriz y espaciamiento para reducir o eliminar la diafonia de señal en el detector. En aspectos preferidos particularmente, la SNR para los métodos de ensayo y sistemas de la invención típicamente será 2.5 o mayor, de preferencia mayor que 3, mayor que 4, mayor que 5, mayor que 10, y en algunos casos mayor que 20 o más.

Enfoques alternos o adicionales para configurar el sistema y métodos de la invención para reducir señal de fondo también pueden emplearse en conjunto con los dispositivos y métodos de la invención. Por ejemplo, los dispositivos y sistemas de la invención pueden ser configurados para proporcionar iluminación de excitación a la matriz de captura utilizando una configuración de microscopio de florescencia con reflexión interna total ( "TIRF = Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy" ) en donde la luz de excitación se dirige al sustrato subyacente a la matriz de captura de manera tal que se refleje totalmente en forma interna (ver, M. Tokunaga et al., Biochem. and Biophys . Res. Comm. 235, 47 (1997) y P. Ambrose, Cytometry, 36, 244 (1999) ) . No obstante esto, una onda evanescente se genera en la interface del sustrato-fluido de la matriz que se deteriora exponencialmente de la superficie, resultando en iluminación efectiva adyacente a la superficie, por ejemplo a una profundidad de 100 nm, sin excitar fluoróforos en el resto de la solución.

En todavía otro enfoque alterno o adicional, los reactivos empleados en los métodos analíticos de la invención se configuran para reducir señal de fondo respecto a la señal de enlace de matriz/sonda actual. Por ejemplo, la señal de fondo puede reducirse a través del uso de fluoróforos cooperantes tanto en las sondas de matriz de captura como el fragmento de sonda etiquetado, por ejemplo en una construcción FRET. En particular, un fluoróforo donador, que tiene un primer espectro de excitación y un primer espectro de emisión puede acoplarse a uno de la sonda de captura o el fragmento de sonda etiquetada. Un fluoróforo aceptor que tiene un espectro de excitación que se superpone al espectro de emisión del donador, y que es diferente del espectro de excitación del donador, se acopla a la otra sonda. Cuando la sonda de captura y el fragmento de sonda etiquetado se hibridizan, el donador y aceptor se llevan a proximidad suficiente para transferencia de energía, dando por resultado una señal fluorescente distintiva que corresponde al espectro de medición del fluoróforo aceptor. Al configurar el sistema óptico para excitar solo con el espectro de excitación del donador, y filtrar el espectro de emisión del donador, se puede detectar en forma selectiva la señal que surge de la señal de transferencia de energía del aceptor, ante hibridización. Una amplia variedad de pares de etiquetas FRET se han descrito previamente (ver, por ejemplo Patente de los E.U.A. Número 6,008,373, otorgada a Waggoner, y Patente de los E.U.A. Número 7,449,298, otorgada a Lee et al.).

En una configuración alterna, grupos de etiquetado interactivos se emplean para reducir adicionalmente el potencial para señales de fondo. En particular, en un aspecto de la invención, la sonda de captura se etiqueta con un fluoróforo tal que la señal que produce la etiqueta se ancla en la superficie de la matriz. En este contexto, la sonda etiquetada y el fragmento de sonda etiquetada transportan un grupo de extinción complementario al fluoróforo, es decir capaz de extinguir la fluorescencia de la etiqueta de sonda de captura. El agente de extinción se proporciona en una posición del fragmento de sonda etiquetado tal que cuando se hibridiza a la sonda de captura, estará suficientemente próximo al fluoruro en la sonda de captura para extinguir la señal fluorescente. Por ejemplo, cuando el fragmento de sonda fluorescente se etiqueta con un agente de extinción en su extremo 5 ' , la sonda de captura llevará el fluoróforo a una posición 3' u otra complementaria. En el contexto de los ensayos de la invención, amplificación de la secuencia blanco u objetivo resulta en producción de fragmentos de sonda etiquetada que extinguen las señales fluorescentes de la matriz cuando hibridizan con la sonda de captura etiquetada, resultando en un evento de señal negativa como se indica por la presencia de la señal objetivo. En particular, las sondas de captura en la matriz producen señal en el estado no hibridizado. Ante amplificación de la secuencia objetivo, la sonda que transporta el agente de extinción se libera para hibridizar la sonda de captura complementaria en la matriz, extinguiendo la señal en su fluoróforo asociado, y resultando en un sitio oscuro en la matriz, en comparación con sitios de matriz no hibridizados . El proporcionar un grupo de extinción que no produce una señal fluorescente bajo condiciones de detección para el ensayo, se elimina cualquier fluorescencia de fondo de la sonda no disociada o el fragmento de sonda etiquetada no ligado .

Como se apreciará, una cantidad de métodos pueden emplearse en el contexto de la invención para reducir la contribución de señal de la sonda etiquetada intacta sin enlazar en la solución de reacción, o señal de fondo, respecto a la señal detectada del fragmento de sonda etiquetada ligado, incluyendo por ejemplo, configurar la cámara de reacción para concentrar la señal dentro del plano focal del detector, empleando técnicas de etiquetado interactivo que ya presentan diferentes espectros de emisión cuando se ligan o enlazan a la matriz contra cuando no se ligan en solución, o sondas de auto-extinción que tienen reducida fluorescencia cuando están presentes en la misma sonda intacta, contra cuando están separadas en un fragmento de sonda disociado.

Como se anotó, la matriz típicamente incluye un número que no es limitante de la velocidad de ácidos nucleicos de captura que hibridizan al fragmento de sonda etiquetado. Esto significa que la reacción de amplificación produce una cantidad de fragmentos de sonda durante amplificación que resultan en una concentración de fragmento de sonda en la mezcla de reacción que no satura para el número de sitios en la matriz (por ejemplo, ácidos nucleicos de captura complementarios accesibles) disponibles para ligar los fragmentos de sonda. Dicho de otra forma, el número de sitios de enlace en la matriz se mantiene en exceso, y de preferencia con bastante exceso, de lo que sería saturado a la concentración de los fragmentos de sonda que se producen en una reacción de amplificación. Debido a que el número de sitios en la matriz no es limitante de la velocidad, la proporción de fragmentos de sonda en la matriz a fragmentos de sonda de fondo en solución se optimiza. Densidades de matriz típicas están entre aproximadamente 350 fmoles/cm2 o mayores, por ejemplo aproximadamente 2,000 fmoles/cm2 o mayores, 2,500 fmoles/cm2 o mayores, 3,000 fmoles/cm2 o mayores, 4,000 fmoles/cm2 o mayores, 4,500 fmoles/cm2 o mayores, o 5,000 fmoles/cm2 o mayores. En algunas modalidades, el número de sitios que ligan sonda en la matriz es al menos IX el número de sitios que se saturan por la concentración de fragmentos de sonda que se producen durante amplificación, y opcionalmente 5X, 10X, 5 OX o más. La proporción variará con el número de ciclos de amplificación y la cantidad de sonda producida. La eficiencia de la matriz también es una función de la longitud del fragmento de sonda a capturar. Fragmentos más cortos típicamente exhiben hibridización más eficiente, aunque las sondas tienen que ser suficientemente largas para ligar a una Tm durante hibridización. Fragmentos de sonda típicos a capturar por la matriz tienen aproximadamente 50 nucleótidos de longitud o menos; las matrices comprenden sitios que tienen secuencias de ácidos nucleicos de captura complementarios correspondientes (los ácido nucleicos de captura pueden opcionalmente también incluir secuencias adicionales, por ejemplo para espaciar el sitio complementario sobre la superficie, por ejemplo para reducir efectos de superficie) . En forma más típica, las sondas y secuencias de captura tienen aproximadamente 40 nucleótidos o menos de longitud, por ejemplo aproximadamente 30, aproximadamente 20 o aproximadamente 15 nucleótidos o más cortos de longitud.

En algunos casos, las sondas de matriz de captura y los fragmentos de sonda etiquetada complementarios empleados en un análisis determinado se eligen tal que proporcionan un intervalo estrecho de Tm sobre todos los miembros de la matriz. En particular, para asegurar hibridización óptima y consistente a la matriz de captura, las sondas de captura en una matriz determinada cada una tendrán una Tm dentro de aproximadamente 10 grados C de los demás miembros de la matriz, y de preferencia dentro de aproximadamente 7 grados C, 5 grados C, o 3 grados C de todas las demás otras sondas en la matriz. Este intervalo de Tm estrecho permite consistente hibridización y generación de señal resultante a través de todos los miembros de la matriz .

En modalidades típicas, la temperatura de hibridización es menor que la temperatura de la reacción de amplificación, de manera tal que Tm del fragmento de sonda para el ácido nucleico de captura puede ser menor que una Tm intra-molecular de la sonda (por ejemplo, cuando la sonda comprende un agente de extinción para reducir el fondo) , y/o menor que la Tm de la sonda para el ácido nucleico objetivo. Esto es, en modalidades de termociclado típicas, se realizan reacciones de amplificación a superiores temperaturas que las etapas de hibridización; de acuerdo con esto, la sonda típicamente tendrá una superior Tm para el ácido nucleico objetivo que el fragmento de sonda para la matriz. La sonda etiquetada típicamente comprende una primera aleta ortogonal que no es complementaria con el ácido nucleico objetivo; esta aleta se disocia de la sonda etiquetada para producir el fragmento de sonda etiquetada. La sonda etiquetada opcionalmente comprende una segunda aleta ortogonal, por ejemplo, acoplada a una porción de extinción, que es al menos parcialmente complementaria a la primera aleta (por ejemplo, para proporcionar extinción basada en proximidad de una etiqueta en la primera aleta) . El fondo se reduce cuando la segunda aleta tiene una superior Tm para ligar a la primera aleta que la primera aleta tiene para ligar a la matriz. En esta configuración, la reacción de extinción ocurre a una primera temperatura, es decir por debajo de la Tm de la sonda intacta para el ácido nucleico blanco, pero sobre ambas la Tm intra-molecular de la sonda intacta, y la Tm del fragmento de sonda para la sonda de captura en la matriz) . Después de extensión, conforme la temperatura de reacción se reduce, cruza por debajo de la Tm intra-molecular de la sonda, permitiendo la formación de la estructura segundaria de la sonda, y resultando en extinción de fluoróforo. Mayor enfriamiento por debajo de Tm del fragmento de sonda a la sonda de captura permite hibridización del fragmento de sonda a la matriz y detección de su fluoróforo asociado. Debido a que la sonda intacta previamente se ha formado en su estructura secundaria, tanto es menos probable que ligue a la sonda de captura, y se extinga, reduciendo de esta manera tanto captura no pretendida de la sonda intacta, y señal de fondo de los fluoróforos presentes en la sonda intacta en solución (o que pueden ligarse a la matriz de sonda de captura. Aunque en ciertos aspectos, agentes de extinción se emplean en las sondas intactas de la invención, en ciertas modalidades, se ha determinado sorprendentemente que los agentes de extinción no se requieren en la sonda, debido al diseño de cámara optimizado y matriz de alta eficiencia logran discriminación de la señal de matriz del fondo, aún cuando el fondo se incrementan al omitir un agente de extinción de la sonda.

En otras modalidades, el fragmento de sonda etiquetado y su ácido nucleico de captura complementario se diseñan o seleccionan para tener una Tm que es superior a la temperatura de reacción de extensión, por ejemplo 10 o más grados superior. De esta manera, cuando la reacción de extensión se lleva a cabo, por ejemplo entre 55 grados y 60 grados C, la T, del fragmento de sonda etiquetado y el acido nucleico de captura típicamente será de 71 grados C. En estos casos, la hibridización del fragmento de sonda etiquetado al ácido nucleico de captura en la matriz ocurre a la misma temperatura que la reacción de extensión, obviando la necesidad para reducir adicionalmente la temperatura a fin de hibridizar a la matriz y detectar la señal resultante. Como resultado, puede emplearse un perfil de temperatura de dos etapas en vez de un perfil de tres etapas .

En el contexto de la sonda etiquetada intacta, la orientación del fragmento de sonda etiquetada ortogonal respecto a la porción de sonda que liga a la secuencia blanco, puede ser variada. En particular, un fragmento de sonda etiquetado liberado puede hibridizar a una sonda de captura en la matriz en una orientación en donde el extremo disociado de la porción específica blanco de la sonda ya está próximo o distante al punto en donde la sonda de captura se acopla a la superficie de matriz. En algunos casos, por ejemplo al asegurar que cualquier sonda intacta solo ligue a la sonda de captura en una orientación que proyecta la porción específica blanco de la sonda hacia la superficie de la matriz, se puede entonces aprovechar la interferencia de superficie potencial con ese enlace, para reducir adicionalmente el potencial para captura no deseado de la sonda intacta por la matriz. Estos métodos son particularmente útiles en el caso de superficies sólidas en las matrices, por ejemplo substratos de sílice, y semejantes.

La muestra puede cargarse en la cámara por cualquiera de una variedad de mecanismos, dependiendo de la configuración precisa del consumible. En una aplicación conveniente, la muestra se carga a través de al menos un puerto o canal fluídico en comunicación operable con la cámara. Por ejemplo, pueden fabricarse puertos en una superficie superior del consumible, con los puertos que dirigen a la cámara. Esto proporciona una carga simplificada, por ejemplo mediante pipeta u otro dispositivo de suministro de fluido. En forma alterna, canales fluídicos o microfluídicos , capilares, o semejantes pueden emplearse para suministro de muestra.

Los métodos pueden emplearse para detección de un ácido nucleico de interés en una muestra y/o cuantificación del ácido nucleico, por ejemplo en tiempo real. De esta manera, en un aspecto, el ácido nucleico blanco se amplifica opcionalmente en una pluralidad de ciclos de amplificación antes de la señal de detección, con la porción de ácido nucleico blanco adicionalmente que se amplifica después de detección de señal, es decir en la presencia de copias adicionales de la sonda etiquetada. Fragmentos de sonda etiquetada liberada resultantes subsecuentemente hibridizados a la matriz y detectados, con la intensidad de señal detectada que se correlaciona con la presencia y/o cantidad del ácido nucleico blanco presente en la muestra. Típicamente, la muestra se amplifica por más de 1 ciclo antes de detección inicial, para incrementar el nivel de señal al aumentar el número de fragmentos de sonda liberados por la amplificación. Por ejemplo, el ácido nucleico blanco puede amplificarse opcionalmente por al menos por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más ciclos de amplificación antes de detectar la señal de la matriz .

La sonda etiquetada típicamente comprende una etiqueta fluorescente o luminiscente, aunque también pueden emplearse otras etiquetas tales como puntos de cuanta. En una modalidad preferida, la etiqueta es un colorante fluorescente. La señal producida por el fragmento de sonda típicamente es una señal óptica. La sonda etiquetada opcionalmente comprende una etiqueta y un agente de extinción de etiqueta; la disociación de la sonda etiquetada resulta en separación de la etiqueta y el agente de extinción, de esta manera liberando la extinción de la etiqueta. Sin embargo, como se anotó anteriormente, los agentes de extinción no se requieren en la práctica de la invención.

La señal típicamente se percibe al detectar una o más longitudes de onda de señal óptica que corresponden a etiquetas ópticas en las sondas o fragmentos de la sonda. Debido a que la posición de los fragmentos de sonda en la matriz puede utilizarse para discriminar entre diferentes sondas, no es necesario utilizar diferentes etiquetas en las diferentes sondas para distinguir las sondas en una reacción de amplificación múltiplejada (una reacción de amplificación diseñada para amplificar múltiples ácidos nucleicos blanco, si más de uno de los blancos está presente en la muestra) . Sin embargo, etiquetas de sondas múltiples pueden emplearse para mejorar las capacidades de múltiplejado . Cuando se emplean múltiples sondas, la detección de señal puede incluir detectar una pluralidad de longitudes de onda de señal óptica de una pluralidad de señales generadas por una pluralidad de diferentes etiquetas (por ejemplo, diferentes porciones de colorante fluorescente en diferentes sondas) .

Aunque se describe generalmente en términos de grupos de etiqueta que se ligan al fragmento de sonda que enlaza a la matriz, por ejemplo el fragmento de sonda etiquetado, se apreciará que otros esquemas de detección pueden ser empleados que no requieren el uso de sondas previamente etiquetadas. Por ejemplo, en algunas modalidades, colorantes de intercalado pueden emplearse . Colorantes de intercalado típicamente proporcionan un evento de señal detectable ante incorporación o intercalado, en ácidos nucleicos de doble hebra. En el contexto de la invención, la hibridización del fragmento de sonda disociado de la sonda complementaria en la matriz crea un dúplex de doble hebra en la superficie de matriz que puede incorporar un colorante intercalado, y proporcionar una señal única indicativa de esa hibridización. Los colorantes de intercalado son bien conocidos en la técnica e incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, Gudnason et al., Nucleic Acid Research, (2007) Vol. 35, No. 19, el27, que se incorpora aquí por referencia para todos los propósitos. De manera similar, aunque métodos de detección de señal óptica se prefieren particularmente, las configuraciones de sonda y métodos de ensayo también pueden en general practicarse utilizando métodos de detección y/o etiquetado no ópticos, por ejemplo, utilizando métodos de detección electroquímica, por ejemplo, ChemFETS, ISFETS, etc., opcionalmente en conjunto con grupos de etiquetado electroquímico, por ejemplo, que poseen grandes grupos cargados para amplificar la detección de hibridización del fragmento de sonda a una sonda de matriz sonda n o cerca de una superficie de detector.

El fondo local puede detectarse para una o más regiones de la matriz, con mediciones de intensidad de señal que se normalizan al corregir el fondo. Típicamente, la intensidad de señal normalizada es menor que aproximadamente 10% de la señal total, por ejemplo entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10% de la señal total. En una clase ejemplar de modalidades, la intensidad de señal normalizada está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7% del total de señal. Típicamente, cuando aproximadamente 1% o más de la señal se localiza en la matriz, por ejemplo cuando aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% o más de la señal se localiza en la matriz para una región de la cámara, es posible discriminar la señal de matriz del fondo. Es posible discriminar incluso niveles menores de señal a fondo, pero esto en general no se prefiere. Los métodos también pueden incluir intensidad de señal normalizada por corrección de variabilidad en la aplicación por puntos de ácido nucleico de captura de matriz (por ejemplo, al corregir tamaño de punto, densidad de punto, o ambos) , o al corregir un campo de vista no uniforme de diferentes regiones de la matriz.

La capacidad para detectar simultáneamente múltiples ácidos nucleicos blanco en una muestra representa un aspecto preferido de la invención. La muestra puede tener uno o una pluralidad de ácidos nucleicos objetivo o blanco, con la matriz que comprende una pluralidad de tipos de ácidos nucleicos de captura que son capaces de detectar más de un blanco por muestra. Los tipos de ácido nucleico de captura se separan espacialmente en la matriz, eliminando la necesidad de utilizar etiquetas múltiples (aunque, como se notó pueden emplearse etiquetas múltiples) . En enfoque de múltiplej ado, una pluralidad de sondas de amplificación, cada una específica para un blanco de ácido nucleico diferente, se incuba con la muestra, que puede incluir uno o más ácidos nucleicos blanco. Por ejemplo, puede haber entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 o más tipos de ácidos nucleicos de captura. Cada blanco potencial a detectar utilizaran una sonda diferente por igual, por ejemplo hay opcionalmente entre 5 aproximadamente y 100 aproximadamente o más tipos de sondas etiquetadas en la reacción de amplificación, cada uno específico para un blanco de interés potencial . La matriz incluye ácidos nucleicos de captura correspondientes, por ejemplo entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 o más tipos de ácido nucleico de captura. Esto permite que una cantidad de señales correspondientes sean detectadas y procesadas por la matriz. Por ejemplo, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 o más diferentes señales pueden ser detectadas con base en ubicación de las señales en la matriz después de hibridización de los fragmentos de sonda en la matriz. Como se apreciará, el número de tipos de sonda de captura en una matriz en general estará dictado por el número de reacciones de amplificación distintas que pueden ser multiplexadas dentro de un solo volumen de reacción. Sin embargo, matrices de captura que tienen grandes números de diferentes sondas de captura, por ejemplo, mayores a 100, mayores a 1000, 10,000 o más tipos de sondas de captura, también pueden emplearse en ciertas circunstancias, por ejemplo cuando las reacciones de amplificación se acumulan para interrogación por la matriz o semejantes.

Una ventaja de la presente invención es que una configuración de matriz de captura puede emplearse para múltiples paneles de secuencia de ácido nucleico blanco diferentes. En particular, una sonda ajustada para un primer panel incluirá sondas que tienen primeras porciones especificas blanco, específicas para los blancos en el panel, y segundas porciones de captura complementarias a sondas individuales en la matriz de captura. Una sonda ajustada para un segundo panel diferente (ya sea de súper posición parcial o completamente diferente) incluirá porciones específicas blanco para ese panel, mientras que las porciones de captura serán las mismas que para la primera sonda de panel ajustada. Dicho de otra forma, para cualquiera panel de blancos, el ajuste de sonda incluirá una porción semi-fija de las sondas empleadas para esté panel, lo que siempre será complementario para un miembro de la matriz de captura. Las sondas también incluirán porciones variables que se eligen para el panel específico de ácidos nucleicos blanco. Por ejemplo, en un proceso analítico, un primer conjunto de sondas se emplea en donde cada sonda en el primer conjunto tiene una primera porción fija que corresponde a una sonda de captura diferente en la matriz de sonda de captura. Cada sonda también incluye una porción específica de blanco que es complementaria para una secuencia de blanco determinada en el primer panel. Para un segundo panel, un segundo juego de sondas se emplea en donde cada sonda en el juego incluye la misma primera porción fija, pero tiene una segunda porción específica blanco, que es específica para los blancos específicos en ese panel.

Con referencia a la Figura 1A, la porción A de la sonda etiquetada corresponde a la porción variable, mientras que la porción B corresponderá a la porción fija que será complementaria a las sondas en la matriz. El uso de una matriz de captura común o universal y conjunto de sondas de captura permite una fabricación más eficiente y a menor costo de los consumibles utilizados en la invención.

De esta manera, en una modalidad en la que la muestra comprende múltiples ácidos nucleicos blanco, el método incluye incubar una pluralidad de sondas etiquetadas, cada una específica para un ácido nucleico blanco diferente, con los ácidos nucleicos blanco. Amplificación de al menos una porción de los ácidos nucleicos blanco en la reacción de amplificación dependiente de cebador de amplificación, resulta en disociación de una pluralidad de tipos de sondas etiquetadas y liberación resultante de una pluralidad de tipos de fragmentos de sonda etiquetada. La pluralidad de tipos de fragmentos de sonda se hibridiza a la matriz. Cada uno de los diferentes tipos de fragmentos de sondas hibridiza a un tipo de ácido nucleico de captura espacialmente discreto. Detectar la señal de etiqueta incluye detectar una pluralidad de señales de etiqueta de una pluralidad de regiones espacialmente discretas que corresponden a los ácidos nucleicos de captura espacialmente discretos en la matriz. Opcionalmente, y en varias modalidades preferidas, los tipos de sonda etiquetados comprenden la misma porción de etiqueta, pero adicional múltiplejado y/o uso de controles diferenciales o sondas de registro pueden incluir utilizar una pluralidad de diferentes porciones de etiqueta. Típicamente, los tipos de sonda etiquetada pueden incluir una o más diferentes porciones de etiqueta, con el número de diferentes porciones que es menor que el número de tipos de sonda etiquetados .

Dispositivos y sistemas para realizar los métodos son una característica de la invención. Los dispositivos o sistemas pueden incluir una cámara de detección que comprende cuando menos una matriz de detección de ácido nucleico de alta eficiencia en al menos una superficie de la cámara. Como se ha noto con referencia a los métodos, la cámara se configura para reducir el fondo de señal para señales detectadas de la matriz. El dispositivo o sistema típicamente incluye un módulo termo regulatorio acoplado operativamente a la cámara de detección, que regula temperatura dentro de la cámara durante operación del dispositivo. Un tren óptico detecta una o varias señales producidas en la matriz durante operación del dispositivo.

Todas las características dimensionales de la cámara para reducir el fondo anotado con referencia a los métodos opcionalmente aplican al dispositivo. Por ejemplo, el dispositivo puede ser menos de aproximadamente 500 µp? en profundidad en cucando menos una dimensión proximal a la matriz, por ejemplo entre aproximadamente 10 µt? y aproximadamente 200 pm en profundidad al menos en una dimensión próxima a la matriz. La superficie de cámara en la que la matriz se forma puede estar compuesta de cualquier material conveniente, por ejemplo una cerámica, vidrio, cuarzo o un polímero. En varias modalidades, por ejemplo aquellas que utilizan epi-fluorescencia, la superficie será al menos parcialmente transparente .

Como se notó con referencia a los métodos, los ácidos nucleicos de captura en la matriz típicamente están presentes en una densidad no limitante de la velocidad durante operación del dispositivo. La matriz opcionalmente incluye una pluralidad de tipos de ácidos nucleicos de captura, por ejemplo localizados en regiones espacialmente distintas en la matriz. Por ejemplo, 5 o más tipos de ácidos nucleicos de captura diferentes pueden estar presentes en la matriz, por ejemplo hasta aproximadamente 100 o más diferentes tipos. Loa ácidos nucleicos de captura se acoplan opcionalmente a un revestimiento termoestable en la superficie de la cámara, facilitando termo ciclado de la matriz. Revestimiento ejemplar puede incluir opcionalmente: un grupo químicamente reactivo, un grupo electrofxlico, un NHS éster, un tetra- o pentafluorofenil éster, un mono- o dinitrofenil éster, un tioéster, un isocianato, un isotiocianato, una acil azida, un epóxido, una aziridina, un aldehido, una cetona a, ß-insaturada o amida que comprende una vinil cetona o una maleimida, un haluro de acilo, un haluro de sulfonilo, un imidato, un anhídrido de ácido cíclico, un grupo activo en una reacción de ciclo adición, un alqueno, un dieno, un alquino, una azida o una combinación de los mismos.

El módulo termo-regulatorio opcionalmente incluye características que facilitan el termo ciclado, tal como un módulo termoeléctrico, un dispositivo Peltier, un ventilador de enfriamiento, un colector térmico, una placa de metal configurada para acoplar con una porción de una superficie exterior de la cámara, etc. Típicamente, el módulo termo regulador tiene un sistema de control habilitado por retro alimentación acoplado operativamente a una computadora que controla o es parte del módulo.

El tren óptico puede incluir o ser acoplado operativamente con un sistema de detección epifluorescente . Componentes de tren óptico típicos incluyen cualquiera de: una fuente de luz de excitación, una lámpara de arco, una lámpara de arco de mercurio, un LED, un lente, un filtro óptico, un prisma, una cámara, un foto detector, una cámara CMOS y/o una matriz CCD. El dispositivo también puede incluir o ser acoplado a un módulo lector de matriz, que se correlaciona con una posición de la señal en la matriz a un ácido nucleico a detectar.

El dispositivo o sistema puede incluir o ser acoplado operativamente con instrucciones del sistema, por ejemplo incorporado en una computadora o medio legible por computadora. Las instrucciones pueden controlar cualquier aspecto del dispositivo o sistema, por ejemplo para correlacionar uno o más medidas de intensidad de señal y una cantidad de ciclos de amplificación realizados por el módulo termo-regulatorio para determinar una concentración del ácido nucleico blanco detectado por el dispositivo.

Un sistema puede incluir el dispositivo, por ejemplo, acoplado operativamente a una computadora. La computadora puede incluir por ejemplo instrucciones que controlan el termo ciclado por el módulo termo-regulador y/o que especifican cuando se toman imágenes o ven por el tren óptico, y/o pueden convertir información de imagen en curvas de intensidad de señal como una función del tiempo, determinar concentración de un ácido nucleico blanco analizado por el dispositivo y/o semejantes. La computadora puede incluir instrucciones para normalizar intensidad de señal para tomar en cuenta el fondo, por ejemplo para detectar fondo local para una o más regiones de la matriz, y para normalizar mediciones de intensidad de señal de matriz al corregir por el fondo. De manera similar, la computadora puede incluir instrucciones para normalizar intensidad de señal al corregir variabilidad en la aplicación por puntos de ácido nucleico de captura de la matriz, campo de vista no uniforme de diferentes regiones en la matriz o semejantes.

La invención incluye, en un aspecto, un consumible para detección de ácido nucleico, por ejemplo para utilizar con los dispositivos y sistemas de la invención, por ejemplo para practicar los métodos de la invención. El consumible puede incluir, por ejemplo una cámara delgada con menos de aproximadamente 500 µp? en profundidad, en donde la cámara incluye una ventana ópticamente transparente que tiene una matriz de ácidos nucleicos de captura de alta eficiencia en una superficie interior de la ventana. El consumible también puede incluir cuando menos un puerto de suministro de reactivo, por ejemplo acoplado en forma fluida con la cámara. Típicamente, el consumible se configura para permitir el termo ciclado de fluido dentro de la cámara.

Todas las características anteriormente anotadas con referencia a la matriz y cámara en el contexto de los dispositivos, sistemas y métodos de la invención aplican al consumible por igual (y vice- ersa) . Por ejemplo, la matriz de ácido nucleico puede incluir una pluralidad de diferentes tipos de ácido nucleicos de captura, estos tipos se localizan en regiones espacialmente distintas de la matriz. La densidad de los ácidos nucleicos de captura puede ser de aproximadamente, por ejemplo 2,000 fmol/cm2 o mayor, 2,500 fmol/cm2 o mayor, 3,000 fmol/cm2 o mayor, 4,000 fmol/cm2 o mayor, 4,500 fmol/cm2 o mayor, o 5,000 fmol/cm2 o mayor.

Similarmente, la cámara puede incluir una primera superficie superior que comprende el puerto de suministro de reactivo y una superficie transparente inferior que comprende la ventana, por ejemplo, en donde las superficies superior e inferior se unen por paredes laterales formadas por un material adhesivo sensible a presión. Otras estructuras para unir la superficie superior e inferior para formar la cámara también pueden emplearse. Por ejemplo, las superficies superior e inferior pueden unirse en conjunto por un empaque o característica conformada en las superficies superior o inferior o ambas. El empaque o característica opcionalmente se fusiona o adhiere a una región correspondiente de las superficies superior o inferior, o a ambas. En algunas modalidades, el empaque o característica dirige flujo de un adhesivo curable con UV, este adhesivo se hace circular entre las superficies superior e inferior y se expone a luz UV, de esta manera uniendo las superficies superior e inferior. En otras modalidades, las superficies superior e inferior pueden ser fusionadas en forma ultrasónica en conjunto, con las regiones que delimitan el empaque o características que se fusionan. En otro ejemplo, la característica es una región transparente en cualquiera de las superficies superior o inferior y una región sombreada correspondiente en una superficie superior o inferior cognada. En esta modalidad, las superficies superior e inferior pueden ser soldadas con láser juntas al dirigir luz láser a través de la región transparente y sobre la región sombreada.

La matriz de ácido nucleico de captura típicamente se acopla a un revestimiento térmicamente degradable en la ventana. Por ejemplo, el revestimiento puede incluir un grupo químicamente reactivo, un grupo electrofílico, un NHS éster, un tetra - o pentafluorofenil éster, un mono-o dinitrofenil éster, un tioéster, un isocianato, un isotiocianato, una acil azida, un epóxido, una aziridina, un aldehido, un cetona a, ß-insaturada o amida que comprende una vinil cetona o maleimida, un haluro de acilo, un haluro de sulfonilo, un imidato, un anhídrido de ácido cíclico, un grupo activo en una reacción de cicloadición, un alqueno, un dieno, un alquino, una azida, o una combinación de los mismos. La propia ventana puede incluir por ejemplo vidrio, cuarzo, una cerámica, un polímero u otro material transparente.

Todas las características anteriormente notadas con respecto a los métodos, sistemas y dispositivos aplican con respecto a la configuración de la cámara en el consumible. Por ejemplo, la cámara puede tener de entre aproximadamente 10 µp? y aproximadamente 200 im en profundidad, por ejemplo, aproximadamente 140 µp? de profundidad. La cámara puede ser significativamente más amplia en otras dimensiones, por ejemplo, entre aproximadamente 1 mm y aproximadamente 50 mm en diámetro promedio. En una modalidad específica, la cámara tiene aproximadamente 10 mm y aproximadamente 20 mm en diámetro promedio.

La invención incluye equipos, por ejemplo que comprenden el consumible de la invención. Los equipos también pueden incluir materiales de empaque, instrucciones para practicar los métodos, reactivos de control (por ejemplo, plantillas de control, sondas o cebadores, por ejemplo, que ligan a sitios de control en una matriz del consumible) .

Los métodos, sistemas, dispositivos, consumibles y equipos pueden emplearse en combinación, por ejemplo con el equipo que proporciona el consumible para utilizar en un sistema o dispositivo de la invención, por ejemplo para practicar los métodos de la invención. A menos que se establezca de otra forma, etapas de los métodos opcionalmente tienen características estructurales correspondientes en los sistemas, dispositivos, consumibles o equipos, y vice versa .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y IB son ilustraciones esquemáticas de sondas de PCR de la invención.

La Figura 2 es un esquemático de una cámara PCR de la invención.

La Figura 3 es una gráfica que muestra curvas de PCR en tiempo real basadas en matriz para titulación de número de copias para una reacción de amplificación de tres etapas .

La Figura 4 es una gráfica que muestra curvas PCR en tiempo real basadas en solución generadas a partir de alícuotas de soluciones.

La Figura 5 es una gráfica que muestra una curva PCR en tiempo real basada en matriz generada con una sonda sin extinción.

La Figura 6 es una gráfica que muestra curvas PCR en tiempo real para una amplificación multiplejada.

La Figura 7 es una gráfica que muestra curvas PCR en tiempo real basadas en matriz para una reacción de 10 -Plex sin blanco agregado.

La Figura 8 es una gráfica que muestra curvas PCR en tiempo real basadas en matriz con un panel 10 -plex y 3 blancos presentes a 104 copias cada una.

La Figura 9 es una gráfica que muestra cinéticas en tiempo real de hibridación de un mímico de aleta 51.

Las Figuras 10A y 10B muestran esquemáticos de aspectos de la invención.

La Figura 11 es una ilustración esquemática del sistema.

La Figura 12 es una gráfica que muestra curvas PCR en tiempo real basadas en matriz para titulación de número de copia para una reacción de amplificación de dos etapas.

La Figura 13 es un trazo que muestra la relación de espesor de cámara de reacción a la proporción de señal a fondo .

La Figura 14 es una ilustración esquemática de un sistema de detección total para modalidades del sustrato móvil de la invención.

La Figura 15 es un trazo de PCR en tiempo real utilizando sondas que contienen agente de extinción, con señal fluorescente decreciente sobre el progreso de la reacción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Métodos para realizar amplificación, detección y cuantificación en tiempo real de ácido nucleico blanco son una característica de la invención. En los métodos, amplificación del ácido nucleico objetivo o blanco libera un fragmento de sonda etiquetada especifica de blanco que hibridiza a una matriz; la matriz se distribuye en la cámara en donde se lleva a cabo la amplificación. La señal se detecta de la matriz, proporcionando tanto detección como cuantificación en tiempo real del ácido nucleico blanco.

La invención también proporciona cámaras de reacción, típicamente formateadas como consumibles que comprenden matrices de detección de ácido nucleico dentro de la cámara, así como dispositivos y sistemas que interactúan con los consumibles .

MÉTODOS La invención proporciona métodos para detectar y cuantificar uno o más ácidos nucleicos blanco en una muestra, en tiempo real. Los métodos son altamente susceptibles a multiplejado, permitiendo detección y cuantificación específicas de una gran cantidad de diferentes ácidos nucleicos blanco, utilizando una reacción y detección de cámara que pueden lograrse utilizando métodos de detección con ácido nucleico en tiempo real basados en solución. Esto es debido a que la invención utiliza detección basada en matriz de analitos (con la matriz que está en contacto con los analitos) , en vez de detección espectral en fase solución. Una matriz de detección de ácido nucleico tiene significativamente mayor habilidad para resolver analitos mediante discriminación de posición de matriz en comparación con discriminación por ejemplo de diferentes etiquetas de colorante en solución. A manera de comparación, es posible construir matrices que detectan simultáneamente miles de diferentes analitos, mientras que típicamente no es posible detectar más de 5 fluoróforos etiquetados en forma diferente en solución.

La Figura 10A proporciona una generalidad parcial del método. Como se muestra, un cebador 102 se hibridiza en una plantilla o secuencia blanco 100, junto con una sonda etiquetada 104. La sonda 104 comprende una porción 104a que es complementaria a la secuencia plantilla o blanco 100, y una secuencia ortogonal 104b que no es complementaria a la plantilla (una "aleta"), acoplada a una porción de etiqueta 106. La secuencia ortogonal 104b o fragmento de sonda se disocia durante una reacción de amplificación (por ejemplo, un ciclo de amplificación PCR) . En un enfoque conveniente, la actividad de nucleasa natural de una polimerasa se utiliza para disociar la aleta - en este enfoque, la extensión de cebador por la polimerasa resulta en disociación de la aleta 104b por acción de nucleasa de la polimerasa conforme encuentra la unión entre la aleta 104b y la plantilla 100. Esto libera la aleta 104b como un fragmento de sonda etiquetado que después hibridiza la matriz 110 que lleva sondas de captura 112 que son complementarias al fragmento de sonda liberado 104b, por ejemplo al ajustar la temperatura a condiciones que permiten hibridación específica. Detección de la etiqueta en la matriz permite detección y cuantificación de la plantilla, en tiempo real.

En general, una muestra que se va a probar por la presencia (o ausencia) de uno o más ácidos nucleicos blanco se somete a una reacción de amplificación. La reacción puede ser múltiplejada fácilmente para amplificar, detectar y cuantificar entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 o más diferentes ácidos nucleicos, en una sola cámara de reacción. Por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, o aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos pueden ser detectados en una sola cámara de amplificación/detección. Un ejemplo de trabajo aquí demuestra simultáneas amplificación, detección y cuantificación de 10 diferentes ácidos nucleicos blanco en una cámara de reacción/detección, se muestra a continuación. Este ejemplo, y las capacidades del método aquí, exceden las capacidades de la detección múltiple basada en solución limitada en forma espectral .

En los métodos, cada ácido nucleico blanco a detectarse se amplifica específicamente utilizando cuando menos uno y generalmente dos cebadores de amplificación (el uso de dos cebadores agrega especificidad a la reacción, y acelera la velocidad de formación de producto, en comparación con un solo cebador) . Los cebadores típicamente se hibridizan en forma específica a el o los ácidos nucleicos blanco en la muestra y se extienden utilizando una polimerasa, por ejemplo en una reacción de cadena polimerasa estándar (PCR) . El diseño y construcción de los cebadores de amplificación que pueden emplearse para amplificar un ácido nucleico blanco de interés sigue métodos conocidos. Para detalles respecto a diseño de cebador PCR, ver, por ejemplo, Antón Yuryev (Editor) (2007) PCR Primer Design (Methods in Molecular Biology) [Hardcover] Humana Press; lst edition ISBN-10: 158829725X, ISBN-13: 978-1588297259, así como a las referencias anotadas a continuación.

Amplificación PCR utilizando los cebadores en los ácidos nucleico plantilla objetivos o blancos puede realizarse utilizando condiciones de reacción apropiadas, incluyendo el uso de amortiguadores de amplificación estándar, enzimas, temperaturas y tiempos de ciclo. Para una revisión de técnicas PCR, incluyendo condiciones de hibridación, amortiguadores, reactivos, tiempos de ciclo de reacción y semejantes, ver, por ejemplo, Yuryev (above) , van Pelt-Verkuil et al. (2010) Principies and Technical Aspects of PCR Amplification Springer; lst Edition ISBN-10: 9048175798, ISBN-13: 978-9048175796; Bustin (Ed) (2009) The PCR Revolution: Basic Technologies and Applications Cambridge University Press; lst edition ISBN-10: 0521882311, ISBN-13: 978-0521882316; Viljoen et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer, ISBN 1402034032; Kaufman et al. (2003) Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine Second Edition Ceske (ed) CRC Press (Kaufman) ; The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc (Rapley); Chen et al. (ed) PCR Cloning Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, volume 192) Humana Press ; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis). Condiciones de amplificación, diseño de cebador y otros detalles aplicables a métodos PCR basados en tiempo real se describen, por ejemplo en Logan et al. (eds.) (2009) Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Caister Academic Press, lst edition ISBN- 10: 1904455395, ISBN-13: 978-1904455394, y M Tevfik Dorak (Editor) (2006) Real-time PCR (Advanced Methods) Taylor & Francis, lst edition ISBN-10: 041537734X ISBN-13: 978-0415377348.

Una sonda etiquetada específica para cada ácido nucleico objetivo en la muestra se hibridiza junto con el o los cebadores de amplificación a el o los ácidos nucleicos blanco. La reacción de amplificación disocia la sonda etiquetada hibridizada-plantilla para liberar el fragmento de sonda etiquetada. Este fragmento etiquetado hibridiza entonces a la matriz en la cámara de reacción, como se muestra en la Figura 10A.

La Figura 1A ilustra esquemáticamente una sonda útil en el método de la invención. La sonda comprende la región A que es complementaria a un ácido nucleico blanco. La sonda también comprende "aleta" B, que no es complementaria al ácido nucleico blanco. La etiqueta E se conecta a la aleta B. La etiqueta E se muestra en la posición terminal, pero la etiqueta de hecho puede formatearse en cualquier punto sobre la aleta B. Por ejemplo, cualquiera de una variedad de nucleótidos puede ser etiquetado y utilizado en protocolos de síntesis de ácido nucleico estándar o ligeramente modificados para proporcionar una etiqueta en cualquier posición deseada en la sonda.

En la Figura 1A, la región opcional C, que comprende el agente de extinción D, es complementaria a una porción de la aleta B. Bajo condiciones de solución apropiadas, pares base de región C con aleta B, que llevan la etiqueta E y agente de extinción D en proximidad, de esta manera extinguiendo la etiqueta E. Esto reduce el fondo de señal de la fase de solución en la cámara de reacción/detección, pero no se requiere extinción de sonda para la práctica de la invención. Un aspecto sorprendente de la invención es que es posible detectar específicamente fragmentos de sonda ligados a la matriz, incluso cuando hay sonda sin extinción en solución próxima a la matriz. Un ejemplo de trabajo de esta modalidad se describe aquí. En general, el uso de matrices de alta eficiencia en cámaras de reacción/detección que se configuran para reducir fondo de fase en solución, permite discriminación de señal en la matriz del fondo de señal en solución en los métodos, consumibles, dispositivos y sistemas de la invención.

Dependiendo de la configuración del ensayo, una amplia variedad de grupos de etiquetas diferentes puede emplearse para etiquetar la sonda etiquetada. Como se anotó, estas etiquetas típicamente incluyen grupos de etiquetado fluorescente, que pueden incluir fluoróforos individuales o pares o grupos de colorantes interactivos, por ejemplo, pares FRET así como pares de donador/agente de extinción. Un intervalo de diferentes grupos de etiquetado fluorescente adecuado para etiquetar sondas de ácido nucleico, se describe por ejemplo en Molecular Probes Handbook, IIth Edition (Life Technologies, Inc.).

Mientras que gran parte de la presente discusión se dirige a amplificación basada en PCR, pueden sustituirse otras reacciones de amplificación. Por ejemplo, sistemas de múltiples enzimas que involucran reacciones de disociación acopladas con reacciones de amplificación, tales como aquellas que incluyen la disociación de enlaces escindibles (ver, por ejemplo Patentes de los E.U.A. Números 5,011,769; 5,660,988; 5,403,711; 6,251,600) y estructuras de ácido nucleico horquillado (Patente de los E.U.A. Números 7,361,467; 5,422,253; 7,122,364; 6,692,917) pueden emplearse. Amplificación dependiente de helicasa acopla a disociación tipo TaqMan (Tong, Y et al 2008 BioTechniques 45:543-557) también puede emplearse. Amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA = Nucleic Acid Sequence Based Amplification) , o la reacción de cadena ligasa (LCR = Ligase Chain Reaction) pueden emplearse . En enfoques basados en NASBA, la sonda puede ser hibridizada a una plantilla junto con uno o varios cebadores de amplificación, tal como en PCR. La sonda puede disociarse por la acción nucleasa de transcriptasa inversa, o una endonucleasa agregada, liberando el fragmento de sonda en una forma similar a la liberación por una polimerasa en PCR. Una ventaja potencial de NASBA es que no se requiere termociclado . Esto significa los requerimientos totales de dispositivo y sistema. Para una descripción de NASBA, ver, por ejemplo, Compton (1991) , "Nucleic acid sequence-based amplification" , Nature 350 (6313): 91-2. Para uso de NASBA para detectar, por ejemplo ácidos nucleicos patogénicos, ver, por ejemplo, Keightley et al. (2005) "Real-time NASBA detection of SARS-associated coronavirus and comparison with real-time reverse transcription-PCR" Journal of Medical Virology 77 (4): 602-8. Cuando una reacción de estilo LCR se emplea, la sonda puede disociarse utilizando una endonucleasa en vez de recurrir a la actividad de nucleasa de la enzima de amplificación.

En los métodos presentes, se proporciona una cámara de detección que tiene cuando menos una matriz de detección de ácido nucleico de alta eficiencia en al menos una superficie interior de la cámara. La matriz de alta eficiencia típicamente tiene un número de ácidos nucleicos de captura que no limita la velocidad que permite una captura eficiente de fragmentos de sonda producidos por la reacción de amplificación en la cámara. Los ácidos nucleicos de captura se configuran para capturar ácidos nucleicos de sonda relativamente pequeños, que también aumentan la eficiencia de la matriz. La cámara se configura para reducir el fondo de señal próximo a la matriz, por ejemplo al conformar la cámara para reducir el fondo. Por ejemplo, el fondo se reduce al hacer la cámara delgada (poco profunda) próxima a (por ejemplo sobre o por debajo) de la matriz; por ejemplo la cámara típicamente tiene aproximadamente 500 µp? o menos poco profundo sobre o por debajo de la matriz, aunque la detección en cámaras tan profundas como 1 mm o más grande puede funcionar. Mayores detalles respecto a la cámara de reacción y matriz se describen a continuación con referencia al consumible útil en los métodos.

Señales capturadas por la matriz se detectan y se mide la intensidad de señal. La intensidad de señal se correlaciona con la presencia y/o cantidad del ácido nucleico objetivo presente en la muestra. Típicamente, la muestra se amplifica por más de 1 ciclo antes de detección inicial, para incrementar el nivel de señal al aumentar el número de fragmentos de sonda liberados por la amplificación. Por ejemplo, el ácido nucleico blanco puede amplificarse opcionalmente por al menos por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ciclos de amplificación antes de detectar la señal de la matriz.

La Figura 10B proporciona una configuración alterna de los ensayos de la invención. Como se muestra, la sonda específica objetivo de nuevo se proporciona con una porción de aleta ortogonal 104b, como se nota en la Figura 10A anterior. Sin embargo, en vez de estar etiquetada por una porción de etiquetado fluorescente 106 como en la Figura 10A, que produce una señal fluorescente, la aleta 104b contiene un grupo de extinción 116. En contraste, la sonda de captura 112 en la matriz 110 se etiqueta con un grupo fluorescente correspondiente 114, es decir, que es extinguido por el grupo de extinción 116 en la aleta 104b. Cuando la porción de aleta 104b se disocia y libera de la sonda de longitud íntegra 104 ante amplificación de la secuencia blanco 100, la aleta es capaz de hibridizar a la sonda de captura 112 y neutraliza la señal de su fluoróforo asociado 114. Como resultado, la presencia de una secuencia blanco de interés, resulta en amplificación de esa secuencia y disociación de la aleta-grupo de extinción 104b de la sonda 104, que a su vez es capaz de hibridizar a la sonda de captura 112 en la matriz 110, resultando en señal fluorescente reducida o ausente para una ubicación de sonda de captura determinada en la matriz. Al ubicar el grupo de extinción y fluoróforo en porciones complementarias de la aleta o fragmento de sonda y sonda de captura, respectivamente, se puede asegurar que estos grupos estén dentro de proximidad suficiente para transferencia de energía y extinción.

Pares de grupos fluoróforo-agente de extinción que pueden acoplarse a la aleta y sondas de captura son bien conocidos en la técnica, por ejemplo pares de fluoróforo-agente de extinción tal como black hole quencher 2/Cy 3 y Iowa Black RQ/Cy3.

Como se apreciará, la anterior configuración de ensayo de sonda-agente de extinción elimina un componente fluorescente transportado por fluido y consecuentemente cualquier señal fluorescente de fondo que puede emanar del fluido. Por el contrario, el evento de señalización es la pérdida de señal fluorescente debida a extinción de los fluoróforos ligados en superficie.

En una modalidad típica, imágenes fluorescentes u otras ópticas se capturan de la matriz a selectos tiempos, temperaturas e intervalos de ciclo de amplificación, durante las reacciones de amplificación. Estas imágenes se analizan para determinar si el o los ácidos nucleico blanco están presentes en la muestra y para proporcionar cuantificación de las concentraciones de ácido nucleico blanco de partida en la muestra. Las imágenes se analizan utilizando una combinación de mediciones de intensidad de gris promedio, corrección de fondo y ajustes de línea de referencia. El fondo puede medirse localmente por cada punto en la matriz . El fondo se calcula al medir la intensidad de imagen de un anillo concéntrico de la solución que circunda la región de matriz (por ejemplo, punto de matriz) de interés. La señal de cada región después se corrige para tomar en cuenta el fondo local en la región. La señal corregida de cada región puede además ser normalizada para tomar en cuenta la variabilidad en aplicación de puntos así como iluminación no uniforme en el campo de vista. El promedio de las mediciones de intensidad corregida que se obtiene de los primeros pocos ciclos, típicamente entre el ciclo 5 y 15, se emplea para ajustar la línea de referencia y normalizar las mediciones de cada región.

Mayores detalles respecto a métodos para cuantificar ácidos nucleicos con base en mediciones de intensidad de señal después de amplificación, pueden encontrarse por ejemplo en las referencias anotadas en la sección anterior a ésta y en Jang B. Rampal (Editor) (2010) Microarrays: Volume 2, Applications and Data Analysis (Methods in Molecular Biology) Humana Press ; 2nd Edition ISBN- 10: 1617378526, ISBN-13: 978-1617378522; Stephen A. Bustin (Editor) (2004) A-Z of Quantitative PCR (IUL Biotechnology, No. 5) (IUL Biotechnology Series) International University Line; 1er edición ISBN- 10: 0963681788, ISBN-13: 978-0963681782; y en Kamberova and Shah (2002) DNA Array Image Analysis: Nuts & Bolts (Nuts & Bolts series) DNA Press; 2nd edition ISBN-10: 0966402758, ISBN-13: 978-0966402759.

En una configuración alterna, las sondas de captura pueden acoplarse opcionalmente a un sustrato móvil, tales como perlas, resinas, partículas o semejantes (en general referidas de manera intercambiable aquí como "perlas" ) , en vez de un sustrato estático. Por ejemplo, como se anota aquí en otra parte, un sustrato plano puede emplearse para proporcionar sondas de captura dispuestas en matriz que hibridizarán con los fragmentos de sonda disociados que se producen durante la amplificación de la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos blanco dentro del material muestra. La presencia para una secuencia de ácido nucleico blanco determinada se detectan al detectar en que posición de sonda de captura en la matriz se hibridizan los fragmentos de sonda. Debido a que cada fragmento de sonda es específico para una secuencia blanco particular, si ese fragmento de sonda está presente, es indicativo que el blanco estaba presente y amplificado. En un sustrato de fase móvil, cada tipo diferente de sonda de captura en un análisis determinado se acopla a un sustrato móvil diferente que también contiene una etiqueta única. Los sustratos móviles después se pasan a través de un canal de detección para identificar tanto la perla y por implicación, la sonda de captura y si está presente el fragmento de sonda etiquetado. Si la sonda etiquetada se detecta en una perla determinada que corresponde a una sonda de captura particular, es indicativo que la secuencia blanco asociada con ese fragmento de sonda (y sonda de captura complementaria) está presente en la muestra y amplificado. Este aspecto de la invención puede emplearse en una detección de punto extremo, por ejemplo después de completar la reacción de amplificación total, pero también puede emplearse en análisis cuantitativo, por ejemplo, trasegado por sifón de una fracción de las perlas de la mezcla de amplificación después de uno o más ciclos de amplificación y medir la intensidad de señal de fragmento de sonda etiquetado de las perlas .

La concentración de los fragmentos de sonda etiquetada capturados en una perla determinará una proporción suficientemente alta de señal a fondo en el canal de detección de manera tal que la separación de las perlas de la mezcla de reacción no es necesaria. Además, como con los sustratos basados en matriz, la inclusión de una estructura secundaria en la sonda intacta y/o grupos de extinción opcionales permite mayor habilidad para distinguir entre el fragmento de sonda y la señal de fondo de sonda intacta, ya sea en solución o de enlace accidental con el sustrato móvil. En algunos casos, la naturaleza de la estructura secundaria de sonda intacta también se esperará que dé lugar a impedimento estérico al enlazar con las sondas de captura en el sustrato móvil, resultando en ciertos casos en una probabilidad reducida que la sonda intacta ligue a las perlas .

Una variedad de diferentes tipos de perlas puede emplearse en conjunto con este aspecto de la invención. Por ejemplo, partículas de poliestireno, celulósicas, acrílicas, de vinilo, sílice, paramagnéticas u otras inorgánicas o cualquiera de una variedad de otros tipos de perlas pueden emplearse. Como se anotó, las perlas típicamente con etiquetado diferencial con una firma de etiqueta única. De nuevo, una variedad de diferentes tipos de etiquetas puede emplearse, incluyendo etiquetas fluorescentes orgánicas, etiquetas fluorescentes inorgánicas (por ejemplo, puntos de cuanta) , etiquetas luminiscentes, etiquetas electroquímicas, o semejantes. Estas etiquetas están ampliamente disponibles en el comercio y se configuran para acoplarse fácilmente con perlas apropiadamente activadas . En el caso de grupos de etiquetado fluorescente, un gran cantidad de firmas de etiqueta puede proporcionarse al suministrar diferentes combinaciones de 2, 3, 4 o más grupos de etiquetado fluorescente distintos especialmente y diferentes niveles de cada etiqueta, para proporcionar un amplio intervalo de firmas de etiqueta únicas sin tener que utilizar un amplio espectro de radiación de excitación, por ejemplo múltiples láseres .

El método típicamente se realiza utilizando los dispositivos, sistemas, consumibles y equipos presentes. Todas las características de los dispositivos, sistemas y consumibles pueden proporcionarse para practicar los presentes métodos, y los métodos presentes pueden practicarse en combinación con los dispositivos, sistemas, consumibles y equipos .

CONSUMIBLES Las cámaras de reacción en un recipiente de la invención se configuran para reducir el fondo de señal. Matrices de alta eficiencia se forman en al menos una superficie interior de las cámaras. Las matrices típicamente están en contacto con reactivos y productos de amplificación durante ambas etapas de amplificación e hibridización de matriz de los métodos. Esto permite que un usuario ejecute uno o más ciclos de reacción de amplificación, detecte los resultados al supervisar la señal de la matriz en tiempo real, y después ejecute uno o más ciclos de amplificación adicionales, de nuevo seguido por detección. De esta manera, la intensidad de señal de la matriz se puede emplearse tanto para detectar como cuantificar un ácido nucleico de interés, en tiempo real .

Los consumibles de la invención incluyen una cámara y una matriz de alta eficiencia en una superficie interior de la cámara. La cámara típicamente es delgada (poco profunda), por ejemplo, menos de aproximadamente 1 mm de profundidad. En general, entre más delgada sea la cámara, menos solución sobre la matriz, lo que reduce fondo de señal de las sondas etiquetadas o fragmentos de sonda en la solución. Profundidades de cámaras deseables típicas están en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 500 µp?. Para facilidad de fabricación del consumible, la cámara a menudo está en el intervalo de aproximadamente 10 ym a aproximadamente 250 µp? en profundidad sobre la matriz, por ejemplo, aproximadamente 100 µp? a aproximadamente 150 µp? en profundidad. La cámara puede incluir una superficie que tiene un puerto de suministro de reactivo, por ejemplo, para suministrar una muestra por pipeteador manual o automatizado.

La Figura 2 proporciona un esquemático despiezado de consumibles ejemplares. En este ejemplo, la capa de superficie inferior 1 y la capa de superficie superior 2, se unen por la capa media 3. El corte 4 forma una cámara al ensamblar las capas 1, 2, y 3. El o los puertos 5 constituyen una forma conveniente para suministrar amortiguador y reactivos a la cámara al ensamblar. Una matriz de alta eficiencia puede formarse en la capa superior o inferior en la región que forma la superficie superior o inferior del corte. En una modalidad conveniente, en donde detección epifluorescente se emplea para detección de etiqueta ligada a la matriz, la matriz se fabrica en la superficie inferior, con el consumible que se configura para verse por componentes ópticos de detección situados en los dispositivos y sistemas de la invención por debajo de la superficie inferior. En general, ya sea la superficie superior o inferior (o ambas) incluirán una ventana a través de la cual los componentes ópticos de detección pueden ver la matriz.

La capa media 3 puede tomar cualquiera de una variedad de formas, dependiendo del método de ensamblado consumible a utilizar. En una modalidad conveniente, superficies superior e inferior 1 y 2 se unen por la capa 3 formada de un material adhesivo sensible a presión. Capas de adhesivo sensible a presión (por ejemplo, cinta) son bien conocidas y están ampliamente disponibles. Ver, e.g., Benedek and Feldstein (Editors) (2008) Handbook of Pressure-Sensitive Adhesives and Products: Volumen 1: Fundamentáis of Pressure Sensitivity, Volumen 2 : Technology of Pressure-Sensitive Adhesives and Products, Volumen 3 : Applications of Pressure-Sensitive Products, CRC Press; lst edition ISBN-10: 1420059343, ISBN-13: 978-1420059342.

Otros métodos de fabricación para unir las superficies superior e inferior para formar la cámara también pueden emplearse. Por ejemplo, las superficies superior e inferior pueden unirse por un empaque o característica formada de las superficies superior e inferior o ambas. El empaque o característica opcionalmente se fusiona o adhiere a una región correspondiente de la superficie superior e inferior o ambas. Métodos de fabricación de chip de polímero y silicio pueden aplicarse para formar características en las superficies superior o inferior. Para una introducción a los métodos de fabricación de características, incluyendo fabricación de micro-características, ver, e.g., Franssila (2010) Introduction to Microfabrication Wiley; 2nd edition ISBN-10: 0470749830, ISBN-13: 978-0470749838; Shen and Lin (2009) "Analysis of mold insert fabrication for the processing of microfluidic chip" Polymer Engineering and Science Publisher: Society of Plastics Engineers, Inc. Volume: 49 Issue: 1 Page: 104(11); Abgrall (2009) Nanofluidles ISBN-10: 159693350X, ISBN-13: 978-1596933507; Kaajakari (2009) Practical MEMS: Design of microsystems, accelerometers , gyroscopes, RF MEMS, optical MEMS, and microfluidic systems Small Gear Publishing ISBN-10: 0982299109, ISBN- 13: 978-0982299104; Saliterman (2006) Fundamentáis of BioMEMS and Medical Microdevices SPIE Publications ISBN-10: 0819459771, ISBN-13: 978-0819459770; Madou (2002) Fundamentáis of Microfabrication: The Science of Miniaturization . Second Edition CRC Press ; ISBN-10: 0849308267, ISBN-13: 978-0849308260. Estos métodos de fabricación pueden emplearse para formar esencialmente cualquier característica que se desee en las superficies superior e inferior, eliminando la necesidad por una capa intermedia. Por ejemplo, puede formarse una depresión en las superficies superior o inferior (o ambas) y las dos capas unidas, de esta manera formando la cámara.

En algunas modalidades, el empaque o característica dirige flujo de un adhesivo curable a radiación o UV. Este adhesivo se hace circular entre las superficies superior e inferior y se expone a radiación o luz UV (por ejemplo, haz de electrones, o radiación "EB"), de esta manera uniendo las superficies superior e inferior. Para una descripción de adhesivos disponibles, incluyendo adhesivos curables por radiación y UV, ver por ejemplo Ebnesajjad (2010) Handbook of Adhesives and Surface Preparation: Technology, Applications and Manufacturing William Andrew; lst edition ISBN-10: 1437744613, ISBN-13: 978-1437744613; Drobny (2010) Radiation Technology for Polymers. Second Edition CRC Press; 2 edition ISBN-10: 1420094041, ISBN-13: 978-1420094046.

En otras modalidades, las superficies superior e inferior pueden fundirse juntas de manera ultrasónica, con el empaque o característica o superficie que delimita regiones que se funden y la cámara u otras características estructurales a producirse en el consumible . Soldadura ultrasónica y técnicas relacionadas útiles para fusionar materiales se ilustran por ejemplo, en Astashev and Babitsky (2010) Ultrasonic Processes and Machines: Dynamics, Control and Applications (Foundations of Engineering Mechanics) Springer; lst Edition, edition ISBN-10: 3642091245, ISBN-13: 978-3642091247; y Leaversuch (2002) "How to use those fancy ultrasonic welding controls", Plastics Technology 48(10): 70-76.

En otro ejemplo, la característica es una región transparente ya sea en las superficies superior o inferior y una región sombreada correspondiente en una superficie superior e inferior cognada. En esta modalidad, las superficies superior e inferior pueden ser soldadas con láser juntas al dirigir los láseres a través de la región transparente y sobre la región sombreada. Métodos de soldadura con láser se ilustran por ejemplo en Steen et al. (2010) Láser Material Processing Springer; 4th ed. edition ISBN-10: 1849960615, ISBN-13: 978-1849960618; Kannatey-Asibu (2009) Principies of Láser Materials Processing (Wiley Series on Processing of Engineering Materials) Wiley ISBN-10: 0470177985, ISBN-13: 978-0470177983; y Duley (1998) Láser Welding Wiley- Interscience ISBN-10: 0471246794, ISBN-13: 978-0471246794.

La matriz de ácido nucleico de captura típicamente se acopla al revestimiento térmicamente estable en la ventana. La propia ventana puede incluir por ejemplo, vidrio, cuarzo, una cerámica, un polímero u otro material transparente. Una variedad de revestimientos adecuados para revestir la ventana están disponibles. En general, el revestimiento se dirige con base en compatibilidad con el substrato de matriz (por ejemplo, si la superficie de cámara a la que se conecta la matriz es vidrio o un polímero) , capacidad para ser derivatizado o tratado para incluir grupos reactivos adecuados para conectar miembros de matriz, y compatibilidad con condiciones de proceso (por ejemplo termoestabilidad, fotoestabilidad, etc.) Por ejemplo, el revestimiento puede incluir un grupo químicamente reactivo, un grupo electrofílico, un NHS éster, un tetra- o pentafluorofenil éster, un mono- o dinitrofenil éster, un tioéster, un isocianato, un isotiocianato, una acil azida, un epóxido, una aziridina, un aldehido, una cetona a, ß-insaturada o amida que comprende una vinil cetona o una maleimida, un acil haluro, un sulfonil haluro, un imidato, un anhídrido de ácido cíclico, un grupo activo en una reacción de cicloadición, un alqueno, un dieno, un alquino, una azida, o una combinación de los mismos . Para una descripción de revestimientos de superficie y su uso al agregar biomoléculas a superficies ver por ejemplo, Plackett (Editor) (2011) Biopolymers: New Materials for Sustainable Films and Coatings Wiley ISBN-10: 0470683414, ISBN-13: 978-0470683415; Niemeyer (Editor) (2010) Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods (Methods in Molecular Biology) Humana Press; lst Edition, edition ISBN-10: 1617373540, ISBN-13: 978- 1617373541; Lahann (Editor) (2009) Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science Wiley ISBN- 10: 0470699701, ISBN-13 : 978-0470699706; Hermanson (2008) Bioconjugate Techniques, Second Edition Academic Press; 2nd edition ISBN-10: 0123705010, ISBN-13: 978-0123705013. WutS and Greene (2006) Greene ' s Protective Groups in Organic Synthesis Wiley-Interscience; 4th edition ISBN-10: 0471697540, # ISBN-13: 978-0471697541; Wittmann (Editor) (2006) Immobilisation of DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry) Springer; lst edition ISBN-10: 3540284362, ISBN-13: 978-3540284369; Licari (2003) Coating Materials for Electronic Applications : Polymers, Processing, Reliability, Testing (Materials and Processes for Electronic Applications) William Andrew ISBN-10: 0815514921, ISBN-13: 978-0815514923; Conk (2002) Fabrication Techniques for Micro-Optical Device Arrays Storming Media ISBN-10: 1423509641, ISBN-13: 978-1423509646, and Oil and Colour Chemists' Association (1993) Surface Coatings - Raw materials and their usage. Third Edition Springer; 3rd edition, ISBN-10: 0412552108, ISBN-13: 978-0412552106.

Métodos para producir matrices de ácido nucleico están disponibles y pueden adaptarse a la invención al formar las matrices en una superficie de cámara interior. Técnicas para formar micromatrices de ácido nucleico que pueden emplearse para formar matrices en una superficie de cámara interior se describen por ejemplo en Rampal (Editor) Microarrays: Volume I: Synthesis Methods (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2nd Edition ISBN-10: 1617376639, ISBN-13 : 978-1617376634; Miiller and Nicolau (Editors) (2010) Microarray Technology and Its Applications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering) Springer; lst Edition. ISBN-10 : 3642061826, ISBN-13: 978-3642061820; Xing and Cheng (Eds.) (2010) Biochips : Technology and Applications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering) Springer; lst Edition. ISBN-10: 3642055850, ISBN-13: 978-3642055850; Dill et al. (eds) (2010) Microarrays: Preparation, Microfluidics, Detection Methods, and Biological Applications (Integrated Analytical Systems) Springer ISBN-10: 1441924906, ISBN-13 : 978-1441924902; Whittmann (2010) Immobilisation of DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry) Springer; lst Edition ISBN-10: 3642066666, ISBN-13: 978-3642066665; Rampal (2010) DNA Arrays : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press : lst Edition ISBN-10: 1617372048, ISBN-13: 978-1617372049; Schena (Author, Editor) (2007) DNA Microarrays (Methods Express) Scion Publishing; lst edition, ISBN-10: 1904842151, ISBN-13: 978-1904842156; Appasani (Editor) (2007) Bioarrays : From Basics to Diagnostics Humana Press; lst edition ISBN-10: 1588294765, ISBN-13: 978-1588294760; and Ulrike Nuber (Editor) (2007) DNA Microarrays (Advanced Methods) Taylor & Francis ISBN-10: 0415358663, ISBN-13: 978-0415358668. Técnicas para agregar DNA a una superficie para formar una matriz pueden incluir cualquiera de una variedad de métodos de aplicación por puntos, uso de superficies o revestimientos químicamente reactivos, síntesis dirigida por luz, técnicas de impresión con DNA, y muchos otros métodos disponibles en la técnica.

Métodos para cuantificar densidades de matriz se proporcionan en las referencias anotadas anteriormente y en Gong et al. (2006) "Multi-technique Comparisons of Immobilized and Hybridized Oligonucleotide Surface Density on Commercial Amine-Reactive Microarray Slides" Anal . Chem. 78 :2342-2351.

El consumible puede empacarse en un recipiente o materiales de empaque para formar un equipo. El equipo puede también incluir componentes útiles para utilizar el consumible, por ejemplo reactivos de control (por ejemplo, una plantilla de control, sonda de control, cebadores de control, etc.), amortiguadores, o semejantes.

DISPOSITIVOS Y SISTEMAS Dispositivos y sistemas que utilizan consumible y/o practican los métodos de la invención son una característica de la invención por igual. El dispositivo o sistema puede incluir las características del consumible, por ejemplo, una cámara y matriz de reacción (ya sea formada como un consumible o como una porción dedicada del dispositivo) . En forma más típica, el dispositivo típicamente tendrá un receptor, por ejemplo una etapa que monta el consumible anotado anteriormente, junto con componentes ópticos de detección para supervisar la matriz, módulos para termociclar la cámara, y una computadora con instrucciones del sistema que controlan termociclado, detección y post procesamiento de señal .

Un sistema esquemático ejemplar se ilustra en la Figura 11. Como se muestra, el consumible 10 se monta en una platina 20. El módulo de control ambiental (ECM) 30 (por ejemplo que comprende un dispositivo Peltier, ventiladores de enfriamiento, etc.), proporciona control ambiental (por ejemplo, termociclado de temperatura) . Lámpara de iluminación se proporciona por una fuente 40 (por ejemplo, una lámpara, lámpara de arco, LED, láser o semejantes) . El tren óptico 50 dirige luz desde la fuente de iluminación 40 al consumible 10. Señales del consumible 10 se detectan por el tren óptico y la información de señal se transmite a la computadora 60. La computadora 60 opcionalmente también controla ECM 30. Información de señal puede procesarse por la computadora 60, y la salida al exhibidor para observar por el usuario 70, o a una impresora, o ambos. ECM 30 puede montarse por encima o por debajo del consumible 10 y componentes ópticos para observación adicionales 80 (ubicados sobre o por debajo de la platina 20) pueden incluirse.

La platina/receptor se configura para montar el consumible para termociclado y análisis. La platina puede incluir características de registro y alineamiento tales como brazos de alineamiento, retenes, orificios, clavijas, etc., que acoplan con las características correspondientes del consumible. La platina puede incluir un cásete que recibe y orienta el consumible, colocándolo en articulación operable con otros elementos del dispositivo, aunque esto no es necesario en muchas modalidades, por ejemplo, cuando el consumible se monta directamente en la platina. Elementos de dispositivos se configuran para operar con el consumible y puede incluir un sistema de suministro fluídico, para suministrar amortiguadores y reactivos al consumible, un termociclado u otro control de temperatura o módulo de control ambiental, componentes ópticos de detección, etc. En modalidades en donde la cámara se construye en el dispositivo, en vez de incorporarse al consumible, los elementos de dispositivo típicamente se configuran para operar o están próximos a la cámara.

El suministro de fluido al consumible puede realizarse por el dispositivo o sistema, o puede realizarse antes de cargar el consumible en el dispositivo o sistema. Elementos de manejo de fluido pueden integrarse en el dispositivo o sistema, o pueden formatearse en una estación de procesamiento separada discreta del dispositivo o sistema. Elementos de manejo de fluido pueden incluir pipeteadores (manuales o automatizados) que suministran reactivos o amortiguadores a compuertas en el consumible, o pueden incluir capilares, canales de dispositivo microfabricados, o semejantes. Pipeteadores manuales o automatizados y sistemas de pipeteadores pueden emplearse para cargar el consumible, están disponibles de una variedad de fuentes, incluyendo Thermo Scientific (USA) , Eppendorf (Alemania) , Labtronics (Canadá) y muchos otros. Hablando en general, una variedad de sistemas de manejo fluídico están disponibles y pueden incorporarse en los dispositivos y sistemas de la invención. Ver, por ejemplo, Kirby (2010) Micro- and Nanoscale Fluid Mechanics: Transport in Microfluidic Devices ISBN-10: 0521119030, ISBN-13: 978-0521119030; Bruus (2007) Theoretical Microfluidics (Oxford Master Series in Physics) Oxford University Press, USA ISBN-10: 0199235090, ISBN-13: 978-0199235094; Nguyen (2006) Fundamentáis And Applications of Microfluidics . Second Edition (Integrated Microsystems) ISBN-10: 1580539726, ISBN-13: 978-1580539722; Wells (2003) High Throughput Bioanalytical Sample Preparation: Methods and Automation Strategies (Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis) Elsevier Science; lst edition ISBN-10: 044451029X, ISBN-13: 978-0444510297. El consumible opcionalmente comprende puertos que se configuran para corresponder con el sistema de suministro, por ejemplo puertos de una dimensión apropiada para cargar por una pipeta o dispositivo de suministro capilar.

ECM o el módulo termo-regulatorio pueden incluir características que facilitan el termociclado, tal como un módulo termoeléctrico, un dispositivo Peltier, un ventilador de enfriamiento, un conector térmico, una placa de metal configurada para acoplar con una porción de una superficie exterior de la cámara, un baño de fluido, etc. Muchos de estos componentes termo-regulatorios están disponibles para incorporar en los dispositivos y sistemas de la invención. Ver por ejemplo, Kennedy and Oswald (Editors) (2011) PCR Troubleshooting and Optimization; The Essential Guide, Caister Academic Press ISBN-10: 1904455727; ISBN-13: 978-1904455721; Bustin (2009) The PCR Revolution: Basic Technologies and Applications Cambridge University Press; lst edition ISBN-10: 0521882311, ISBN-13: 978-0521882316; Wittwer et al. (eds.) (2004) Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications Springer; 1 edition, ISBN-10: 3540206299, ISBN-13: 978-3540206293; Goldsmid (2009) Introduction to Thermoelectricity (Springer Series in Materials Science) Springer; lst edition, ISBN-10: 3642007155, ISBN-13: 978-3642007156; Rowe (ed.) (2005) Thermoelectries Handbook: Macro to Nano CRC Press; 1 edition, ISBN-10: 0849322642, ISBN-13: 978-0849322648. El módulo termo regulador por ejemplo, puede formatearse en un cásete que recibe el consumible, o puede montarse en la platina en proximidad operable con el consumible .

Típicamente, el ECM o módulo termo regulador tiene un sistema de control habilitado para realimentación acoplado operativamente con una computadora que controla o es parte del módulo. Control habilitado por retroalimentación dirigida por computadora es un enfoque disponible para control de instrumentos. Ver, e.g., Tooley (2005) PC Based Instrumentation and Control Third Edition, ISBN-10: 0750647167, ISBN-13: 978-0750647168; Dix et al. (2003) Human-Computer Interaction (3rd Edition) Prentice Hall, 3rd edition ISBN-10: 0130461091, ISBN-13: 978-0130461094. En general, el control de sistema se realiza por una computadora, que puede utilizar, por ejemplo un archivo de secuencia de comandos, como una alimentación para generar temperaturas objetivo y periodos de tiempo de ciclo así como para especificar cuando se van a ver / tomar imágenes por los componentes ópticos de detección. Foto imágenes típicamente se toman a diferentes tiempos durante una reacción y se analizan por la computadora para generar curvas de intensidad como una función de tiempo y de esta manera derivar la concentración del blanco.

El tren óptico puede incluir cualesquiera componentes de tren óptico típicos, o puede ser acoplado operativamente a estos componentes. El tren óptico dirige iluminación al consumible, por ejemplo, se enfoca en una matriz del consumible, o una región de la matriz. El tren óptico también puede detectar luz (por ejemplo, una señal fluorescente o luminiscente) emitida de la matriz. Para una descripción de componentes ópticos disponibles, Ver, por ejemplo, Kasap et al. (2009) Cambridge Illustrated Handbook of Qptoelectronics y Photonics Cambridge University Press; lst edition ISBN-10: 0521815967, ISBN-13: 978-0521815963; Bass et al. (2009) Handbook de Optics. Third Edition Volume I: Qeometrical y Phisical Optics, Polarized light, Components and Instruments (set) McGraw-Hill Professional ; 3rd edition, ISBN-10: 0071498893, ISBN-13: 978-0071498890; Bass et al. (2009) Handbook de Optics, Third Edition Volume II: Design, Fabrication and Testing, Sources and Detectors, Radiometry y Photometry McGraw-Hill Professional; 3rd edition ISBN-10: 0071498907, ISBN-13: 978-0071498906; Bass et al. (2009) Handbook de Optics, Third Edition Volume III: Vision and Vision Optics McGraw-Hill Professional , ISBN-10: 0071498915, ISBN-13: 978-0071498913; Bass et al. (2009) Handbook of Optics, Third Edition Volume IV: Optic Properties of Materials, Nonlinear Optics, Quantum Optics McGraw-Hill Professional, 3rd edición, ISBN-10: 0071498923, ISBN-13: 978-0071498920; Bass et al. (2009) Handbook de Optics, Third Edition Volume V: Atmospheric Optics, Modulators, Fiber Optics, X-Ray y Neutrón Optics McGraw-Hill Professional; 3rd edition, ISBN-10: 0071633138, ISBN-13: 978-0071633130; y Gupta and Ballato (2006) The Handbook de Photonics, Second Edition, CRC Press, 2nd edition ISBN-10: 0849330955, ISBN-13 : 978-0849330957. Componentes de tren óptico típicos incluyen cualquier de: una fuente de luz de excitación, una lámpara de arco, una lámpara de arco de mercurio, un LED, un lente, un filtro óptico, un prisma, una cámara, un foto detector, una cámara CMOS y/o una matriz CCD. En una modalidad conveniente, se emplea un sistema de detección epifluorescente . El dispositivo también puede incluir o estar acoplado a un módulo de lector de matriz, que correlaciona una posición de una señal en la matriz con un ácido nucleico a detectar.

En el contexto de las modalidades de substrato móvil de la invención, en ciertos aspectos, el recipiente de reacción puede acoplarse directamente a un canal de detección, por ejemplo dentro de un sistema de canal mocrofluídico integrado, o a través de una interfase fluídica apropiada entre la la mezcla de amplificación y el canal de detección. En forma alterna, una interfase fluídica, tal como las presentes en citómetros de flujo convencionales, pueden proporcionarse en el canal de detección a fin de muestrear la mezcla de reacción de amplificación. El canal de detección típicamente se configura para tener una dimensión que permite substancialmente perlas sencillas que recorren el canal en un tiempo determinado. El canal de detección típicamente incluirá una ventana de detección permitiendo excitación de las perlas y recolección de las señales fluorescentes que emanan de las perlas. En muchos casos, un capilar de vidrio o sílice fundida u otro canal microfluídico transparente se emplea como el canal de detección.

Los sistemas de detección óptica de la invención típicamente incluirán una o más fuentes de luz de excitación capaz de suministrar luz de excitación en uno o más longitudes de onda de excitación. También se incluye un tren óptico que está configurado para recolectar la luz que emana del canal de detección, y filtrar la luz de excitación de las señales fluorescentes . El tren óptico también incluye típicamente elementos de separación adicionales para transmitir las señales fluorescentes y para separar el o los componentes de señales fluorescentes que emanan de la perla y el o los componentes de señal que emanan del fragmento de sonda capturado.

La Figura 14 proporciona una ilustración esquemática de un sistema de detección total 1400. Como se muestra, el sistema incluye primeras y segundas fuentes de luz de excitación, tales como láseres 1402 y 1404, que cada uno pueden proporcionar luz de excitación a diferentes longitudes de onda. En forma alterna, una fuente de luz de amplio espectro sencilla o múltiples fuente de luz de amplio espectro pueden emplearse para suministrar luz de excitación al intervalo o intervalos de longitudes de onda apropiados para excitar las etiquetas detectables en la muestra, por ejemplo, aquellas asociadas con las perlas, y aquellas asociadas con los fragmentos de sonda etiquetados .

Haces de excitación, que se ilustran como flechas sólidas, de cada láser se dirigen al canal de detección 1408, por ejemplo, a través del uso de componentes ópticos direccionales, tales como dicroico 1406. Luz que emana de las perlas 1410 en el canal de detección 1408, se recolecta por componentes ópticos de recolección, por ejemplo, lentes objetivo 1412. La luz recolectada después se pasa a través del filtro 1414 que se configura para pasar la fluorescencia emitida, que se ilustra como flechas punteadas, mientras que rechaza la radiación de excitación recolectada. La fluorescencia recolectada incluye fluorescencia emitida de la etiqueta en los fragmentos de sonda capturada a un primer espectro de emisión, así como señales fluorescentes de la firma de etiqueta de perla, en uno o más espectros de emisión diferentes, dependiendo del número de etiquetas empleadas en las perlas. La fluorescencia recolectada después se pasa a través del dicroico 1416 que refleja la fluorescencia de los fragmentos de sonda capturados a un primer detector 1420. La firma fluorescente restante de las perlas después se somete a mayor separación al pasar la señal a través de un segundo dicroico 1418, que refleja un primer componente de señal de perla a un segundo detector 1422, y pasa un segundo componente de señal de perla al tercer detector 1424. Los detectores típicamente están acoplados con un procesador o computadora apropiada para almacenar datos de señal asociados con perlas detectadas, y analizar los datos de señal para determinar la identidad de la perla, y de esta manera la sonda de captura y la secuencia de ácido nucleico blanco asociada. Adicionalmente, el procesador o computadora puede incluir programación para cuantificar datos de señal y número de copia de secuencia blanco de origen, en donde se realizan experimentos en el curso de tiempo, por ejemplo, perlas se muestrean después de uno o más ciclos de amplificación en una reacción de amplificación total.

El dispositivo o sistema puede incluir o ser acoplado operativamente a instrucciones de sistema, por ejemplo, incorporado en una computadora o medio legible por computadora. Las instrucciones pueden controlar cualquier aspecto del dispositivo o sistema, por ejemplo, para correlacionar una o más mediciones de intensidad de señal y un número de ciclos de amplificación realizados por el módulo termo regulatorio para determinar una concentración del ácido nucleico blanco detectado por el dispositivo.

Un sistema puede incluir una computadora acoplada operativamente con los otros componentes de dispositivo, por ejemplo, a través de cableado apropiado, o a través de conexiones inalámbricas. La computadora puede incluir, por ejemplo, instrucciones que controla el termo ciclado por el módulo termo regulador, por ejemplo, utilizando control de retroalimentación como se anotó anteriormente, y/o que especifica cuando las imágenes se toman o ven por el tren óptico. La computadora puede recibir o convertir información de imagen en información digital y/o curvas de intensidad de señal como una función del tiempo, determina concentración de un ácido nucleico blanco analizada por el dispositivo, y/o semejantes. La computadora puede incluir instrucciones para normalizar intensidad de señal para tomar en cuenta el fondo, por ejemplo, para detectar fondo local para una o más regiones de la matriz, y para normalizar mediciones de intensidad de señal de matriz al corregir el fondo. De manera similar, la computadora puede incluir instrucciones para normalizar intensidad de señal al corregir variabilidad en la aplicación por puntos de ácido nucleico de captura de la matriz, campo de vista no uniforme de diferentes regiones de la matriz o semejantes.

DEFINICIONES ADICIONALES Antes de describir la presente invención en detalle, habrá de entenderse que esta invención no se limita a dispositivos o sistemas biológicos particulares, que, por supuesto pueden variar. También habrá de entenderse que la terminología aquí empleada es para el propósito de describir modalidades particulares solamente y no se pretende limitante. Como se emplea en está especificación y las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos de que el contenido claramente lo dicte de otra forma. De esta manera, por ejemplo, referencia a "una superficie" por ejemplo, la cámara de consumible aquí discutida, opcionalmente incluye una combinación de dos o más superficies y semejantes.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado como se comprende comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad a la cual pertenece la invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos pueden emplearse en la práctica para prueba de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen aquí. Para describir y reivindicar la presente invención, se emplea la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones establecidas a continuación.

Un "cebador de amplificación" es una porción (por ejemplo, una molécula) que puede extenderse en una reacción de amplificación dependiente de platillo. En forma más típica, el cebador incluirá o será un ácido nucleico que liga a la plantilla bajo condiciones de amplificación. Típicamente, el cebador comprenderá un extremo que puede extenderse por una polimerasa (por ejemplo, por ejemplo una polimerasa termo estable en una reacción de cadena polimerasa) , o por una ligasa (por ejemplo, como en una reacción de cadena ligasa) .

Una "cámara de detección" es una estructura parcial o totalmente circunscrita en donde una muestra se analiza o se detectan ácidos nucleico blanco. La cámara puede estar totalmente cerrada, o puede incluir puertos o canales acoplados fluidamente con la cámara, por ejemplo, para suministros reactivos o agentes reactivos. La forma de la cámara puede variar, dependiendo, por ejemplo de la aplicación y equipo de sistema disponible. Una cámara se "configura para reducir fondo de señal próximo a la matriz" que se conforma dimensionalmente para reducir el fondo de señal, por ejemplo al incluir una dimensión estrecha (por ejemplo, profundidad de cámara) cerca de la matriz (de esta manera reduciendo la cantidad de señal generada en solución próxima a la matriz) , o cuando la cámara de otra forma se configura para reducir el fondo, por ejemplo, por el uso de revestimientos (por ejemplo, revestimientos ópticos) o estructuras (por ejemplo, deflectores u otras estructuras conformadas próximas a la matriz) . Típicamente, la cámara se configura para tener una dimensión (por ejemplo, profundidad) próxima a la matriz, de manera tal que la señal en solución es suficientemente baja para permitir que se detecten diferencias de señal en la matriz. Por ejemplo, en un modalidad, la cámara tiene menos de aproximadamente 1 mm de profundidad sobre la matriz; convenientemente la cámara tiene menos de aproximadamente 500 µp? de profundidad. En forma típica, la cámara tiene menos de aproximadamente 400 µp?, menos de aproximadamente 300 µtt?, tiene menos de aproximadamente 200 µp?, o menos de aproximadamente 150 µt? de profundidad sobre la matriz. En un ejemplo que aquí e proporciona, la cámara tiene aproximadamente 142 µp? de profundidad.

Una "matriz de ácido nucleico de alta eficiencia" es una matriz de ácidos nucleico de captura que hibridiza eficientemente una sonda o fragmento de sonda bajo condiciones de hibridización. En modalidades típicas, la matriz se formatea en una superficie interior de una cámara de reacción/detección. La matriz puede formarse por cualquier tecnología de matriz convencional, de aplicación por puntos a una síntesis química o fotoquímica en la superficie. Se logra alta eficiencia al controlar la longitud de la región de la sonda de captura que reconoce la sonda o fragmento (más cortas sondas hibridizan más eficientemente que largas sondas, hasta una longitud de hibridización mínima para las condiciones de hibridización) , y al controlar el número de ácidos nucleicos de captura en cada región de una matriz. Sitios de captura pueden hacerse más eficientes/disponibles para hibridización al incluir una secuencia o estructura de enlace entre el sitio de captura y la superficie (de esta manera formateando los sitios de captura a una distancia selecta de la superficie, lo que puede reducir efectos de superficie en hibridización) . Por ejemplo, secuencias de ácido nucleico o enlazadores de polietilen glicol (o ambos) pueden ser empleados . El número de ácidos nucleicos de captura en cada región de una matriz se distribuye de manera tal que el número de sitios disponibles para hibridización para la sonda o fragmento determinados producidos como un resultado de una reacción de amplificación típica no limita la velocidad. Como se anotó previamente, esto significa que el número de sitios disponibles para ligar fragmentos de sonda etiquetados producidos durante la reacción de amplificación es exceso, y de preferencia substancialmente en exceso del número de sitios que estarán saturados por la concentración de los fragmentos de sonda en la mezcla de reacción después de la reacción de amplificación.

Una "sonda etiquetada" es una molécula o compuesto que hibridiza específicamente a un ácido nucleico blanco bajo condiciones de amplificación, y que comprende una porción que es detectable, o que puede hacerse detectable. En forma más típica, la sonda etiquetada es un ácido nucleico que comprende una etiqueta óptica tal como un fluoróforo, colorante, lumóforo, punto cuántico o semejantes. La etiqueta puede ser directamente detectable, o puede estar en un estado de extinción, por ejemplo cuando la sonda comprende una porción de extinción. En muchas modalidades aquí, la sonda etiquetada se disocia durante la amplificación de ácido nucleico blanco para liberar un fragmento de sonda que comprende una etiqueta detectable. Por ejemplo, la sonda etiquetada puede incluir un fluoróforo y un agente de extinción, por ejemplo cuando una reacción de amplificación resulta en disociación de la sonda para liberar el fragmento de sonda etiquetado. En forma más típica, la sonda incluirá una región de "aleta" . Está región de aleta no forma par base con el blanco durante hibridización, y se disocia del resto de la sonda por una nucleasa (por ejemplo, actividad de nucleasa de una polimerasa) , de esta manera formando el fragmento de sonda.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada. Se entiende que los ejemplos y las modalidades aquí descritas son para propósitos ilustrativos solamente y que diversas modificaciones o cambios a la luz de lo cual se sugerirán a personas con destreza en el técnica y se incluirán dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y de las reivindicaciones anexas.

SISTEMA. DE DETECCIÓN EJEMPLAR El sistema de detección de este ejemplo permite detección PCR de tiempo real de una sola cámara, multiplejada, de un ácido nucleico blanco. El sistema extiende la capacidad de múltiplejado de PCR de tiempo real al mover de la discriminación espectral tradicional a una discriminación espacial basada en matriz para generar información en tiempo real específica a cada blanco que se amplifica .

Tradicionalmente, múltiplejado de un solo pozo se logra al utilizar sondas PCR tales como sondas TAQMANMR que son específicas a cada amplicón y que se etiquetan con fluoróforos de diferentes longitudes de onda. Este enfoque limita la capacidad de multiplexado de una sola reacción a un máximo de aproximadamente 5 blancos, debido a límites en los espectros de emisión de colorante y la ventana espectral .

El enfoque descrito en este ejemplo utiliza una sonda PCR etiquetada que actúa como un substituto para el amplicón para transferir información respecto al progreso de amplificación a una matriz ligada a superficie durante el proceso. Información respecto a la cinética de amplificación se conserva, permitiendo que tanto información cuantitativa como detección sean obtenidas, con base en un método de formación de umbral de número de ciclo.

Durante la etapa de extensión en el ciclo PCR, la actividad 5' -3' nucleasa de Taq Polimerasa disocia la sonda PCR para liberar ¡Error! Marcador no definido.una aleta de ácido nucleico que puede entonces hibridizar preferencialmente a una sonda de captura en la superficie de la matriz. Cada aleta y sonda de captura correspondiente son únicas a un blanco potencial dentro del panel de prueba.

Profundidad de Cámara de Reacción Un experimento se realizó para evaluar la relación de espesor de cámara con la Proporción de Señal a Interferencia de Fondo para una matriz determinada. Substratos se maquinaron con cámaras de profundidades variantes y revistieron con polímero funcionalizado . Las profundidades actuales de las cámaras se midieron. Los substratos después se aplicaron por puntos con las sondas de captura y ensamblaron en cámara de reacción circunscrita utilizando epoxi curado con UV. Una solución que contiene 45 nM de un mímico sintético de fragmento de sonda etiquetada complementario a cada sonda de captura en la matriz y 255 nM de la sonda intacta correspondiente (para imitar 15% de disociación) se transfirió con pipeta en cada cámara de reacción circunscrita y la señal contra señal de fondo se midió después de hibridización por 3 minutos a 30 grados C. Los resultados para uno de los ensayos se ilustran en la Figura 13. Como puede verse, reducción en el espesor de la cámara de reacción de 600 mieras a menos de 200 mieras mostró un aumento dramático en la proporción de señal a interferencia de fondo, con proporciones óptimas por debajo de 300 mieras y de preferencia inferior a 200 mieras de espesor .

Matriz y Cámara PCR La cámara PCR empleada en la mayoría de los experimentos se ilustra en la Figura 2. Como se muestra, la cámara consiste de una superficie de fondo que contiene una matriz de oligos de captura complementarios a la secuencia de aleta de las sondas PCR. Las sondas de captura se sintetizaron por Integrated DNA Technologies Inc.

(Coralville, Iowa) y tienen un grupo amina 5' terminal para conexión covalente con el substrato que forma el fondo de la cámara PCR, junto con un enlazador de polietilen glicol entre la química de enlace y la secuencia oligo. La longitud de la secuencia es la misma que la aleta de sonda PCR correspondiente . El fondo de la cámara PCR se formó a partir de un porta-objetos comercialmente disponible. Este portaobjetos vino con un revestimiento polimérico que contiene ésteres NHS activos para subsecuente conexión de las sondas de captura. Porta-objetos incluyen tanto substratos de vidrio como de plástico cubiertos con el revestimiento polimérico. Ambos tipos de porta-objetos resultan en datos experimentales similares. Las sondas de captura se aplican por puntos utilizando un SPOTBOT™ (Arrayit Technologies (Sunnyvale, CA) ) de acuerdo con protocolos de matriz estándar. Los puntos de sonda de captura típicamente fueron de 100 µt en diámetro con un paso de 200 µp? de centro a centro entre puntos .

Después de aplicar por puntos y lavar las sondas de captura, la cámara PCR se ensambla utilizando un adhesivo sensible a presión (PSA) y una pieza superior de policarbonato con puertos de entrada y salida como se muestra en la Figura 2. La cámara tuvo una profundidad/espesor final (o altura) de 142 µ? y un diámetro de 15 rara. La cámara mantiene un volumen de aproximadamente 45 uL de reactivos PCR.

Termociclador y Tarjeta Experimental Óptica El sistema de detección óptica y termociclado incluye un sistema de detección de un solo canal epifluorescente, que incluye (1) una fuente de luz de excitación (por ejemplo, una lámpara de arco de mercurio o un LED) , (2) filtros ópticos de interferencia que se emplean para la lámpara de excitación y para luz de emisión de manera tal que la combinación especifica de fluoróforos se detecta, tales como Cy3, Cy5 u otros, y (3) un foto-detector, que es una cámara CCD o CMOS.

El sistema también incluye componentes de termociclado tales como un par de módulos termoeléctricos, placas de metal, colectores térmicos y ventiladores de enfriamiento poderosos que se emplearon para termociclar rápidamente un consumible circunscrito (por ejemplo, la matriz y cámara descritas anteriormente) a las deseadas temperaturas y tiempos deseados. Los módulos termoeléctricos se controlaron a específicas temperaturas por periodos de tiempo específicos por el uso de un sistema de control habilitado por retro-alimentación que utiliza termistores próximos al consumible como la retro-alimentación al sistema de control .

El control de sistema se realizó por una computadora, que utiliza un archivo de secuencia de comandos como alimentación para generar las temperaturas objetivo y periodos de tiempo así como para especificar cuando una imagen se tomará por el foto-detector. Las imágenes resultantes tomadas en diferentes tiempos durante la reacción térmica se analizaron por la computadora para generar curvas de intensidad como una función del tiempo y de esta manera derivar la concentración del blanco.

Imágenes fluorescentes de un solo canal se capturaron del consumible en diversos tiempos y temperaturas durante el progreso de las reacciones térmicas. Estas imágenes fluorescentes después se analizaron para dar por resultado cuantificación de las concentraciones de ácido nucleico blanco iniciales . Las imágenes fluorescentes se analizaron utilizando una combinación de mediciones de intensidad de grises promedio, corrección de fondo y ajustes de línea de referencia. El fondo se midió localmente por cada punto en la matriz . El fondo se calculó al medir la intensidad fluorescente de un anillo concéntrico de la solución que circunda el punto de interés . La señal de cada punto después se corrige para tomar en cuenta el fondo local . La señal corregida de cada punto además se normalizó para tomar en cuenta variabilidad en aplicación por puntos así como iluminación no uniforme en el campo de vista. El promedio de las mediciones de intensidad corregida que se obtiene de los primeros pocos ciclos, típicamente entre ciclos 5 y 15, después se empleó para ajustar la línea de referencia y normalizar mediciones por cada punto.

EJEMPLO 1: REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN DE TRES ETAPAS La mezcla de reactivos de amplificación que contiene PCR estándar incluyendo dos cebadores de amplificación PCR específicos a cada blanco amplificado, así como una sonda PCR específica por cada blanco que se amplifica. La estructura de la sonda típica se muestra esquemáticamente en la Figura 1A. Como se muestra, la región sonda (A) de la Figura 1A representa una región de ácido nucleico de la sonda que es complementaria a un amplicón blanco, diseñada utilizando las mismas reglas como es típico para una sonda PCR de tiempo real tradicional (por ejemplo, como en una sonda TAQMAN™) . La región sonda (B) representa una secuencia de "aleta" de ácido nucleico ortogonal que es complementaria a una sonda de captura correspondiente (discutido a continuación) , pero no el ácido nucleico blanco. Para propósitos de ilustración, esta secuencia se diseña en un ejemplo para que tenga una Tm entre 40 grados y 46 grados C, aunque otros diseños de sonda pueden estar substituidos. En un ejemplo, la longitud de secuencia tiene aproximadamente 13 o 14 bases. La región sonda (C) representa un ácido nucleico con una secuencia que es complementaria a una porción de la secuencia de la región de ácido nucleico (B) . Esta secuencia se diseña para facilitar la formación de una estructura secundaria de la sonda de longitud íntegra, por ejemplo con una Tm entre 47 y 51 grados C. El agente de extinción (D) representa una molécula de extinción opcional. La etiqueta (E) representa un fluoróforo u otra etiqueta detectable en forma óptica. El fluoróforo Cy3 se empleó para los datos presentados a continuación.

Para los datos en este ejemplo, PCR se realizó con la siguiente formulación de reactivos: cebadores de 200 nM, amortiguador PCR IX FAST START^ (disponible de Roche) , MgCl2 2-6 mM, 0.5 mg/mL de BSA, 0.2 unidad/uL de FAST START Taq polymerase (Roche) , y 150 nM de Sondan PCR. 100 uL de reacciones PCR se preparan utilizando la formulación descrita anteriormente.

La secuencia de sonda PCR que se emplea en este ejemplo fue: GAT (SEQ ID N0:1) .

Las aletas 5' y 3' se denotan en subraya/doble subraya y la secuencia TaqMan tradicional se ilustra con negritas . La secuencia de doble subraya denota las regiones homologas designadas para formar estructuras secundarias . La temperatura de fusión pronosticada de la estructura secundaria fue 51 grados C, como se determina por mFold (idtdna.com) utilizando las condiciones de amortiguador PCR. La sonda PCR se etiqueta con un 5 ' Cy3 fluoróforo y una porción Black Hole Quencher 2 en el extremo 31.

La secuencia de sonda de captura agregada al substrato de fondo de la cámara PCR fue: NNN N NNN NNN N con una Tm de 42 grados C utilizando las condiciones de amortiguador PCR.

Plásmidos de DNA que comprenden una secuencia blanco se agregan a cada reacción PCR a una concentración de 106, 104, y 102 copias/uL. La solución después se desgasificó al calentar a 95 grados C. Después de desgasificar, polimerasa se agregó y la reacción se cargó en la cámara PCR utilizando una pipeta. La solución restante se cargó en un Applied Biosystems 7500 para análisis en paralelo.

Las condiciones de ciclado para PCR basada en matriz fueron como sigue: Temp Tiempo Propósito 95 grados C 120 seg Activación de Enzima de Inicio Rápido 95 grados C 15 seg desnaturalización 60 grados C 60 seg Extensión de polimerasa 30 grados C 120 seg Hibridización de aleta y lectura óptica (desnaturalización y extensión se realizan por 5 ciclos, y después desnaturalización/extensión/hibridización de aleta y lectura óptica se repiten por 8 ciclos) .

Las condiciones de ciclado para ABI 7500 fueron como sigue: Temp Tiempo Propósito 95 grados C 120 seg Activación de Enzima de Inicio Rápido 95 grados C 15 seg desnaturalización 60 grados C 60 seg extensión de polimerasa y lectura óptica Desnaturalización/extensión y lectura se realizaron por 40 ciclos .

Resultados para las titulaciones de número de copia se muestran en la Figura 3 para PCR basada en matriz y la Figura 4 para PCR basada en solución. Como puede verse en las figuras, los resultados son comparables, dando comportamiento similar para las titulaciones.

EJEMPLO 2: REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN EN DOS ETAPAS Como con el Ejemplo 1, anterior, la mezcla de reactivo de amplificación que contiene reactivos PCR estándar incluyendo dos cebadores PCR (200 nM) complementarios a cada blanco que se amplifica así como una sonda PCR (300 nM) que tiene una secuencia complementaria a cada blanco se amplifica. La estructura de sonda típica se muestra en la Figura IB. Como se ilustra, la sonda etiquetada de nuevo incluye un fragmento de ácido nucleico (A) que es complementario a un amplicón blanco diseñado utilizando las mismas reglas como es típico para una sonda PCR de tiempo real tradicional (i.e. TaqMan) . También se incluye secuencia de "aleta" de ácido nucleico ortogonal (B) que es complementaria a una sonda de captura correspondiente en la matriz de captura. La sonda también incluye una etiqueta fluorescente (C) acoplada a la porción de aleta B y una porción de extinción (D) acoplada a la porción específica blanco (A) .

Para la amplificación de dos etapas, la aleta ortogonal (B) comprende una secuencia que se diseñó para tener una Tm con su complemento en la matriz de captura de 70 grados C. Típicamente, la longitud de secuencia es 25 a 27 bases. Como con el Ejemplo 1 anterior, la sonda total se diseña de manera tal que estructura secundaria más estable tiene una Tm no superior a 10 grados C por debajo de la temperatura de extensión y medición en las condiciones de amortiguador empleados para PCR. El oligo se diseñó utilizando el soporte lógico unafold disponible en www.idtdna.com. La secuencia de sonda PCR siguiente se emplea en este ejemplo: N N NNN NNN NNN NNN N/Cv3/NN NN NNN ATG GCC GTT AGC TTC AGT CAA TTC AAC AG/BHQ_2/ (SEQ ID NO: 2) En donde la secuencia de doble subrayado constituye la aleta ortogonal y la secuencia sin subraya es homologa al amplicón. La estructura secundaria más estable de la sonda tiene una temperatura de fusión de 45 grados C. La T, de la aleta ortogonal es 71 grados C. La sonda PCR se etiqueta con un fluoróforo Cy3 interno C (disponible de GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ) y una porción D Black Hole Quencher 2 (disponible de Biosearch, Inc., Novato, CA) en el extremo 3 ' .

Una sonda de captura se detecta que fue homologa a la porción de aleta de la Sonda PCR. PCR se realizó como con anterioridad, excepto con las siguientes condiciones de ciclado: Temp Tiempo Propósito 95 grados C 60 seg Activación de Enzima de Arranque Rápido 95 grados C 15 seg desnaturalización 55 grados C 60 seg Extensión de polimerasa, hibridización de aleta y lectura óptica Cuarenta ciclos se llevaron a cabo con la señal fluorescente que se mide al final de cada etapa de extensión. La Figura 12 muestra titulaciones de número de copia para PCR basado en matriz para los dos blancos en donde primero estaba presente al principio a 104 copias de plásmido DNA blanco mientras que el segundo estaba presente a 106 copias.

EJEMPLO 3: CURVA DE PCR BASADA EN MATRIZ UTILIZANDO UNA SONDA PCR SIN EXTENSIÓN.

El mismo protocolo se empleó como en el Ejemplo 1 con las siguientes excepciones .

La secuencia de sonda PCR empleada es como sigue: Esta secuencia se etiquetó con un fluoróforo 51 Cy3 , pero no incluye un agente de extinción 31. 106 copias de blanco se agregaron y se ejecutó PCR. Los datos en tiempo real se muestran en la Figura 5.

EJEMPLO 4: AMPLIFICACIÓN BASADA EN MATRIZ MULTIPLEJADA Este experimento establece la capacidad por interrogar por y amplificar múltiples blancos dentro de la misma cámara PCR. Condiciones PCR son las mismas mostradas en el Ejemplo 1 salvo las siguientes excepciones: primero, 5 juegos de cebadores y 5 sondas PCR separadas se agregan a la reacción PCR específica a cada blanco a interrogar. En segundo, 5 sondas de captura únicas se depositan en el substrato de fondo de la cámara PCR correspondiente a la secuencia de aleta 5· de cada una de las 5 sondas PCR. En tercero, después del ioesimo ciclo PCR, la temperatura se abatió a la temperatura de hibridización de superficie de 30 grados C cada 2 ciclos en lugar de cada 5 ciclos como en el Ejemplo 1. Esto permite una superior frecuencia de interrogación óptica durante la amplificación PCR.

La secuencias de sonda de captura PCR se muestran a continuación : Sondas PCR: Flu A: N NftTCI -S^^ GGAATGTTAT CTCCCTTTTAAGCTTCTONNNNNNN (SEQ ID NO: 4) (Tm de 50.3 grados) A/HI: KTCJNNNNNNN^ GCTATTAGAT TTCCATTTGC CNNNNNNNN (SEQ ID NO: 5) (Tm de 51.2 grados) A/H3 : NNNNNNNNNKTNNNNCCTGTT GCCAATTT CAGAGTGTT TTGCTTAACNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 6) (Tm de 51 grados) FluB: NNNNNNNNNNNNNNTCAAAGC CAATTCGAG CAGCTGAAAC TNNNNNNNN (SEQ ID NO: 7) (Tm de 51 grados) phiMS2: NNNNNNNNNNNNNTCGCTGAA CAAGCAACC GTTACCCN1SINNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 8) (Tm de 52 grados) Sondas de Captura FluA: NNN NNN NNN NNN N (Tm de 46 grados) A/HI: NNN NNN NNN NNN N (Tm de 45 grados) A/H3: NNN NNN NNN NNN N (Tm de 42 grados) FluB: NNN NNN NNN NNN N (Tm de 46 grados) phiMS2: NNN NNN NNN NNN N (Tm de 43 grados) 5 blancos que abarcan las secuencias específicas a los cebadores y sondas PCR anteriores se agregan a 100 µ? de reacción PCR y la solución se preparó y cargó como se describió con anterioridad. Los datos PCR basados en matriz de tiempo real resultantes se ilustran en la Figura 6.

EJEMPLO 5: MULTIPLEJADO DE ALTO NIVEL Este ejemplo demuestra múltiplejado de una sola cámara para detección de múltiples blancos que puede ser cualquiera de diez blancos potenciales incluidos en el panel de este ejemplo. Este nivel de múltiplejado - un panel de más de cinco blancos potenciales - no puede lograrse en PCR en fase de solución tradicional .

Los materiales y procedimientos experimentales fueron los mismos que los anteriores excepto por lo siguiente: primero, 10 juegos de cebadores y sondas PCR se incorporan en la reacción PCR en las mismas concentraciones anteriores. Las secuencias de las sondas PCR y sondas de captura se dan a continuación: Sondas PCR: FluA: NNN NNKH^ NCCCCATGG AATGTTATCT CCCTTTTAAG CTTCTNNNNNNNN (SEQ ID NO: 13) (Tm de 50.3 grados) A/HI: NNNNNNNNNNNNNNACCTTGGCGCT ATTAGATTTC CATTTGCC N M N (SEQ ID NO: 14) (Tm de 51.2 grados) A/H3: NNIxnSTNIS^ ATTTCAGAG TGTTTTGCT TAACNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 15) (Tra de 51 grados) FluB-v2: NNNNNNNNNNNNNTCAAAGCC AATTCGAGCA GCTGAAAC TNNNNNNNN (SEQ ID NO: 16) (Tm de 51 grados) phiMS2: NNNNNNNNN NNNNTCGCTG AACAAGCAA CCGTTACCC NNNNNNNN (SEQ ID NO: 17) (Tm de 52 grados) MPV: NNNNNNNNNNNNNNATGG CCGTTAGCTT CAGTCAATTC AACAGNNNNNNN (SEQ ID NO: 18) (Tm de 48.4 grados) PIV1: NKNNIJN1SINNNNNNTTGGAATT GTCTCGACA ACAATCTTTG GCCTNNNNNNNNN (SEP ID NO: 19) (Tm de 50.4 grados) PIV2: NNNNNIÑTNNNNNNNCCATTT ACCTAAGTGA TGGAATCAAT CGO^AAAGNNNNNNNN (SEQ ID NO: 20) (Tm de 48.8 grados) PIV3: NNNNNNNNNNNNNNNACATAA GCTTTGATC AACCCTATG CTGC1ACNNNNNNNNN (SEP ID NO: 21) (Tm de 49.9 grados) RSV: NNNNNNNNNN NNNTTCGAAGGCTC CACATACACAG CTGCTGNNNNNNNNN (SEQ ID NP: 22) (Tm de 49.9 grados) RSV-V2: NNNNNNNNNNNNNTCGAAGGC TCCACATACA CAGCTGCTGNNNNNNNN (SEQ ID NP: 23) (Tm de 51 grados) PPC1: NNNNNNNNNNNNNTTCGGCAT TTCCTGGATTGAGT CGGTACTANNNNNNNN (SEQ ID NP: 24) (Tm de 48.7 grados) Sondas de Captura Sonda de Captura T, FluA NNN NNN NNN NNN N (Tm de 46 grados) A/HI NNN NNN NNN NNN N (Tm de 45 grados) ?/? 13 NNN NNN NNN NNN N (Tm de 42 grados) F1UB-V2 NNN NNN NNN NNN N (Tm de 46 grados) phiMS2 N NNN N N NNN N (Tm de 43 grados) MPV NNN NNN NNN NNN N PIV1 NNN NNN NNN NNN N PIV2 NNN NNN NNN NNN N PIV3 NNN NNN NNN NNN N RSV NNN NNN NNN NNN N RSV-V2 NNN NNN NNN NNN N 0PC1 NNN NNN NNN NNN N La Figura 7 muestra las curvas PCR basadas en matriz en tiempo real resultantes cuando no se agrega blanco a las reacciones PCR (Sin Control de Plantilla) . Como puede verse de la figura, no se obtiene señal de una solución que contiene todos los componentes PCR excepto en blanco. La Figura 8 muestra el mismo experimento con 3 blancos plásmido (MPV, OPC-1, PIV2) agregados a 10,000 copias/uL.

EJEMPLO 6: DEMOSTRACIÓN DE CINÉTICAS DE HIBRIDIZACIÓN RÁPIDA Una cámara PCR se construye como se describe anteriormente. La siguiente amina, secuencia de sonda de captura pegilada se deposita en el substrato inferior: NNN NNN NNN NNN N.

Se prepara una solución que contiene el amortiguador PCR descrito anteriormente que contiene la siguiente secuencia oligo (100 nM) que imita la porción 5' aleta de la sonda PCR, etiquetada con un fluoroforo Cy3 en el extremo 5 ' y complementaria con la sonda de captura : NNN NNN N N.

La solución se cargó en la cámara PCR y la cámara se calentó a 60 grados C (15 grados sobre la Tm del dúplex) y después se enfrió de nuevo a 30 grados C. Esto imita las condiciones durante la etapa de hibridización del protocolo PCR. Una lectura óptica se tomó cada 20 segundos por 2 min. Los datos resultantes se ilustran en la Figura 9.

Un aspecto interesante de los datos muestra que ya hay hibridización significante que ocurre en el instante en el que la temperatura interna alcanzó 30 grados C.

EJEMPLO 7: CONFIGURACIÓN DE ENSAYO OSCURO El ensayo de amplificación de tres etapas descrito en el Ejemplo 1 anterior, se repitió utilizando una porción de aleta de la sonda, que incluye un grupo de extinción Iowa Black RQ de Integrated DNA Technologies, acoplado en su extremo 51 , y sin ningunos otros grupos de etiquetado o de extinción agregados a la sonda. Las sondas de captura depositadas sobre la superficie de matriz transportaron un fluoróforo Cy3 acoplado en el extremo 3 ' .

Todas las secuencias de sonda y cebador se ordenaron de IDT y recibieron liofilizadas . Se resuspendieron en agua a concentraciones de materia prima (100 uM a 200 uM) y utilizan para preparar soluciones de materia prima de cebador/sonda para reacciones PCR. Amortiguador H03 VS PCR, se combinó con cebadores y sondas para producir una mezcla maestra PCR.

Superficies funcionalizadas (substratos COP revestidos con polímero funcionalizado) se detectan utilizando técnicas de detección de micromatriz tradicionales mediante un Array-It spotbot 2. Los porta-objetos detectados se incubaron a 75% de humedad por 8-15 horas y después enjuagaron con agua DI y secaron con argón. Las sondas de captura etiquetadas se aplicaron por puntos en concentraciones en el intervalo de 100 nM a 50 uM en 50 mM de amortiguador de aplicación o impresión por puntos de pH 8.5, produciendo un intervalo de intensidades de señal .

Como con los ejemplos anteriores, las cámaras de reacción basadas en chip se construyeron sobre las superficies de matriz funcionalizadas utilizando empaques de adhesivos sensibles a presión en ambos lados, tapas de policarbonato y sellos ópticamente claros. Volumen total de la cámara de reacción es de aproximadamente 30 uL con una altura de 150 um.

Secuencias blanco de una concentración conocida se agregan a una mezcla maestra PCR y la solución resultante se carga en el recipiente de reacción. El recipiente se selló y cargó en un instrumento de termociclado anteriormente descrito. Las secuencias blancos se obtienen de materias primas de plásmido o los amplicones resultantes de reacciones previas que involucran aquellas materias primas de amplicón.

Todas las moléculas blancos se cuantificaron utilizando espectrometría UV-Vis en un instrumento NanoDrop.

Condiciones de termociclado incluyen una etapa de arranque en caliente a 95 grados C por 85s, seguida por 40 ciclos de fusión (95C) y extensión (55C) de 5s y 20s respectivamente. En los ciclos 10, 15, 18 y cada 2 ciclos posteriores, se agrega una etapa adicional al ciclo para recolección de datos. La temperatura se lleva a 30 grados C después de extensión y mantiene por 30s. Imágenes de la superficie se recolectan al final de estas etapas de hibridización. Intensidad de píxel promedio en los puntos por cada ensayo se calcula y traza contra el número de ciclo para generar curvas PCR en tiempo real. Los diseños de sonda de superficie y solución son como se ilustra en el formato de ensayo 3. Para reacciones PCR dúplex: cebadores de 600 nM y sondas 300 nM para los ensayos H3 y OPC1 se agregan. La Figura 15 muestra un trazo de progreso de la reacción PCR en tiempo real con base en la creciente hibridización de las porciones de aleta y sus agentes de extinción asociados a las sondas de captura etiquetadas Cy3. La señal fluorescente se traza como un valor absoluto de la señal negativa, mostrando la disminución en señal conforme avanza la reacción.

Los enfoques aquí establecidos tienen múltiples ventajas que no se encuentran en enfoques previos. Los sistemas de la invención permiten PCR cuantitativa de cámara sencilla, altamente múltiplejada, al transferir eficientemente información de PCR de fase en solución a una matriz confinada en superficie en tiempo real durante el proceso de amplificación. Esto permite un nivel muy superior de múltiplejado mientras que conserva la eficiencia y aprovechando el inmenso cúmulo de conocimientos acumulados para PCR en tiempo real de fase en solución. A fin de lograr esto, tienen que desarrollarse múltiples aspectos novedosos del sistema.

Por ejemplo, una característica de la invención es el uso de un substituto de amplicón para puentear la fase en solución y la fase sólida. Enseñanzas previas dirigidas hacia la meta de PCR en tiempo real basada en matriz, generalmente se han basado en hibridización del propio amplicón a la matriz de fase sólida. Esto presenta múltiples aspectos que complican el sistema, impide la eficiencia y requiere componentes más costosos para elucidar la información requerida. En un ambiente PCR multiplejado, es muy difícil diseñar amplicones de similares longitudes y eficiencias de hibridización. El uso de una sonda PCR con una aleta 5 ' disociable homogeneiza las especies que transfieren la información de cada amplicón a la superficie al emplear una secuencia muy corta que es ideal para cinéticas de hibridización. Este enfoque también hace que las secuencias sonda de captura en la matriz independiente de la secuencia del amplicón sean detectadas. Esto permite selección de las secuencias de captura más ventajosas y la posibilidad de una matriz universal que puede emplearse para muchos paneles blancos diferentes, simplificando el diseño y el enfoque de fabricación.

Como se describe aquí, la sonda PCR también aprovecha las reglas de diseño que ya se han desarrollado para PCR en tiempo real en fase de solución basada en sonda. El uso de una secuencia muy corta para hibridizacion (e.g., 13-14 bases) hace muy eficiente la hibridizacion, permitiendo alta señal en la matriz en el ambiente de baja sal de los amortiguadores PCR estándar. De esta manera, el sistema puede funcionar muy bien en una sola cámara en donde hibridizacion de superficie debe acoplarse con PCR en fase en solución óptima.

Otra característica de la invención es la discriminación de la señal hibridizada en superficie de la fluorescencia de fondo basada en solución. Este aspecto de la invención es importante para extraer información relevante de la matriz. Enseñanzas previas emplean enfoques ópticos complicados o costosos para superar este problema, tal como el uso de reflectancia interna total o microscopía confocal para aislar la señal de superficie del fondo de solución. Por contraste, esta invención proporciona el uso de equipo óptico estándar simple que no requiere "trucos" ópticos para lograr la discriminación. La capacidad para discriminar la señal surge de múltiples fuentes. La química de superficie que se emplea en la matriz proporciona una densidad de sonda de captura muy alta y de esta manera hibridiza la densidad de objetivo. Se ha mostrado que la superficie puede aproximarse al 100% de eficiencia de captura del ácido nucleico blanco. Estas alta densidad de captura y eficiencia sirven para concentrar la señal de superficie, agregando en discriminación de fase de superficie/solución. El uso de un ácido nucleico blanco corto sirve para mejorar dramáticamente este efecto.

Otro aspecto de la invención es el uso de cinéticas de hibridización rápida para permitir transferencia en tiempo real de la información de fase de solución a la matriz de superficie. El sistema descrito en estos ejemplos demuestra hibridización en fase sólida extremadamente rápida. Este fenómeno facilita la tecnología y puede ser atribuido a múltiples aspectos de la invención, incluyendo el blanco de aleta 5' corto, la química de superficie en fase sólida óptima, el delgado consumible y el gradiente de temperatura producido durante el programa de temperatura de termociclado .

Mientras que la invención anterior se ha descrito con cierto detalle para propósitos de claridad y comprensión, será claro para una persona con destreza en la técnica a partir de la lectura de esta descripción que diversos cambios en forma y detalle pueden realizarse sin apartarse del alcance real de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas y aparatos descritos anteriormente pueden emplearse en diversas combinaciones. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes y/u otros documentos citados en esta solicitud se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos en la misma proporción como si cada publicación, patente, solicitud de patente y/u otro documento individual se indicara individualmente incorporado por referencia para todos los propósitos .

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico blanco en una muestra, que comprende: realizar una reacción de amplificación en la muestra con una enzima polimerasa que posee actividad de nucleasa, en la presencia de un reactivo que comprende primeras sondas que comprenden una primera porción complementaria a la secuencia de ácido nucleico blanco y una segunda porción no complementaria a la primera secuencia de ácido nucleico blanco, la segunda porción comprende una primera porción de extinción acoplada a la segunda porción en una primera posición, de manera tal que la segunda porción se disocia de la primera porción como un primer fragmento de sonda, cuando se amplifica la secuencia de ácido nucleico blanco; hibridizar el primer fragmento de sonda para capturar sondas inmovilizadas sobre un substrato, en donde las sondas de captura comprenden un fluoróforo que al menos es extinguido parcialmente por la primera porción de extinción, el fluoróforo acoplado a una segunda posición en las sondas de captura, de manera tal que al hibridizar los fragmentos de sonda a las sondas de captura, el fluoróforo al menos se extingue parcialmente por la porción de extinción; y detectar la presencia de la secuencia blanco con base en la extinción del fluoróforo en las sondas de captura.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde: el reactivo de amplificación comprende una pluralidad de diferentes sondas que tienen una pluralidad de diferentes primeras porciones complementarias a diferentes secuencias de ácido nucleico blanco, y diferentes segundas porciones no complementarias con la pluralidad de secuencias de ácido nucleico blanco, cada una de las segundas porciones comprende una porción de extinción acoplada a la primer posición, la pluralidad de segundas porciones se disocian como fragmentos de sonda ante amplificación de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico blanco; y en donde el substrato comprende una pluralidad de diferentes regiones sonda de captura dispuestas en matriz en el substrato, cada región de sonda de captura comprende sondas de captura complementarias a una segunda porción diferente de la pluralidad de diferentes sondas, y cada sonda de captura comprende un fluoróforo extinguido por la porción de extinción.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la primera posición comprende el extremo 5' del fragmento de sonda, y la segunda posición comprende el extremo 3' de la sonda de captura.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde cada región de sonda de captura comprende un número no limitante de la velocidad de los ácidos nucleicos de captura que hibridizan al fragmento sonda.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el primer fragmento de sonda que hibridiza a las sondas de captura tiene menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el primer fragmento de sonda que hibridiza a las sondas de captura tiene menos de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el primer fragmento de sonda que hibridiza a las sondas de captura tiene menos de aproximadamente 15 nucleótidos o menos de longitud.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico blanco se amplifica por al menos 5 ciclos de amplificación antes de la detección.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico blanco se amplifica en una pluralidad de ciclos de amplificación antes de la detección, en donde la porción de ácido nucleico blanco se amplifica adicionalmente después de la detección, en la presencia de copias adicionales de la sonda, con resultantes primeros fragmentos de sonda liberados que se hibridizan substancialmente a la matriz y detectan, en donde la intensidad de señal detectada se correlaciona con una cantidad del ácido nucleico blanco presente en la muestra.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la temperatura de hibridización tiene es menor que la temperatura de la reacción de amplificación.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde comprende detectar fondo local para una o más regiones de la matriz y normalizar mediciones de intensidad de señal al corregir el fondo.

12. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde la muestra comprende una pluralidad de ácidos nucleico blancos .

13. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde la pluralidad de diferentes sodas de captura se separa espacialmente en el substrato.

14. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde hay entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 diferentes sondas de captura, y entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 sondas correspondientes en la reacción de amplificación, en donde hasta 5 a 100 diferentes señales pueden ser detectadas con base en la ubicación de las señales en la matriz .

15. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde las sondas de captura se disponen en el substrato a una densidad aproximada entre 350 fmoles/cm2 aproximadamente y 5,000 fmoles/cm2 aproximadamente o mayor.

16. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde las sondas de captura se disponen en matriz en el substrato a una densidad mayor a 2000 fmoles/cm2.

17. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde la pluralidad de diferentes sondas de captura comprende la misma porción de etiqueta y la pluralidad de diferentes fragmentos de sonda comprenden la misma porción de extinción.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la etapa de amplificación y la etapa de hibridización del primer fragmento de sonda al substrato se llevan a cabo a la misma temperatura.