JP2015198581A - Il28b遺伝子における多型検出用プローブ、当該多型検出用プローブを有するdnaチップ、当該多型検出用プローブを用いたc型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法 - Google Patents
Il28b遺伝子における多型検出用プローブ、当該多型検出用プローブを有するdnaチップ、当該多型検出用プローブを用いたc型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】IL28B遺伝子におけるrs8113007の遺伝子型を簡便且つ高精度に検出する。【解決手段】配列:ACCTCCTGGWGGTAAAT(配列番号1、WはA又はT)若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の一端両端に1〜4の塩基が付加した配列からなる、全体が17〜25の塩基長であるオリゴヌクレオチド。【選択図】図1
Description
本発明は、IL28B遺伝子におけるrs8113007で特定される多型について遺伝子型を判定するための多型検出用プローブ、当該多型検出用プローブを有するDNAチップ、当該多型検出用プローブを用いたC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法に関する。
現在、C型慢性肝炎に対する有効性の高い治療法として、ペグインターフェロン(PEG-IFN)とリバビリン(RBV)の併用療法(以下「PEG-IFN/RBV併用療法」と称する)が知られている。しかし、PEG-IFN/RBV併用療法の有効性は、最大50%程度にとどまっている。
非特許文献1には、IL28B遺伝子の3018塩基上流に存在するrs12979860をPEG-IFN/RBV併用療法における最も有意な予測因子の一塩基多型(SNP)として報告されている。また、非特許文献2には、PEG-IFN/RBV併用療法における有意な予測因子としてIL28B遺伝子の7396塩基上流に存在するrs8099917が報告されている。さらに、非特許文献3及び4にも、C型慢性肝炎患者に対するPEG-IFN/RBV併用療法の効果予測に重要なIL28B遺伝子の近傍のSNPが報告されている。
また、特許文献1には、rs8099917の約60塩基上流に存在するSNPであるrs8113007もC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのマーカーとして報告されている。特許文献1には、PCR-RFLP法によりrs8113007の遺伝子型を判定する手法が開示されている。すなわち、rs8113007がアデニンである場合にBpmI認識配列となるため、rs8113007を含む増幅断片をBpmIで処理した後に断片長を確認することで、rs8113007の遺伝子型を判定している
Ge et al., Nature, 461, 399-401, 2009
Tanaka et al., Nature Genetics, 41, 1105-1109, 2009
Thomas et al., Nature, 461, 798-801, 2009
Suppiah et al., Nature Genetics, 41, 1100-1104, 2009
しかしながら、特許文献1に開示されるように、IL28B遺伝子におけるrs8113007の遺伝子型をPCR-RFLP法により判定する場合、制限酵素処理及びその後の電気泳動といった煩雑な処理が必要となり、簡便な方法とは言えなかった。そこで、本発明は、IL28B遺伝子におけるrs8113007の遺伝子型を簡便且つ高精度に検出することができる多型検出用プローブ、当該多型検出用プローブを有するDNAチップ、当該多型検出用プローブを用いたC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、IL28B遺伝子におけるrs8113007の遺伝子型を検出することができる適切な塩基配列を見いだし、本発明を完成するに至った。なお、多型の遺伝子型を判定するためのプローブは、遺伝子多型の場所さえ解明すれば任意に製造できるものではなく、当該多型の変異ごとに適当な塩基配列を有するプローブを見出す必要がある。
(1)配列:ACCTCCTGGWGGTAAAT(配列番号1、WはA又はT)若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の一端両端に1〜4の塩基が付加した配列からなる、全体が17〜25の塩基長であるオリゴヌクレオチドである、IL28B遺伝子におけるrs8113007の遺伝子型を検出するための多型検出用プローブ。
(2)上記オリゴヌクレオチドが17〜23塩基長であることを特徴とする(1)記載の多型検出用プローブ。
(3)上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、TTCACCTCCTGGWGGTAAATATT(配列番号2、WはA又はT)、TCACCTCCTGGWGGTAAATAT(配列番号3、WはA又はT)又はCACCTCCTGGWGGTAAATA(配列番号4、WはA又はT)であることを特徴とする(1)記載の多型検出用プローブ。
(4)上記(1)乃至(3)いずれか記載の多型検出用プローブを有するマイクロアレイ。
(2)上記オリゴヌクレオチドが17〜23塩基長であることを特徴とする(1)記載の多型検出用プローブ。
(3)上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、TTCACCTCCTGGWGGTAAATATT(配列番号2、WはA又はT)、TCACCTCCTGGWGGTAAATAT(配列番号3、WはA又はT)又はCACCTCCTGGWGGTAAATA(配列番号4、WはA又はT)であることを特徴とする(1)記載の多型検出用プローブ。
(4)上記(1)乃至(3)いずれか記載の多型検出用プローブを有するマイクロアレイ。
(5)被験者由来のゲノムを鋳型としてIL28B遺伝子におけるrs8113007多型を含む核酸断片を増幅する工程と、得られた核酸断片と上記(1)乃至(3)いずれか記載の多型検出用プローブとを接触させる工程と、得られた核酸断片と上記多型検出用プローブとのハイブリダイズを検出する工程とを含み、rs8113007の遺伝子型がA/A(アデニンのホモ接合型)である場合に上記被験者についてペグインターフェロン(PEG-IFN)及び/又はインターフェロン(IFN)を用いた治療の有効性があると判定し、rs8113007の遺伝子型がT/T(チミンのホモ接合型)又はA/T(アデニンとチミンのヘテロ接合型)である場合に当該治療の有効性がないと判定する、C型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
(6)上記(4)記載のマイクロアレイを使用することを特徴とする(5)記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
(7)上記核酸断片を増幅する工程で得られた核酸断片は蛍光標識を有し、上記ハイブリダイズを検出する工程では当該蛍光標識の蛍光強度値を測定することを特徴とする(5)記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
(8)上記治療はペグインターフェロン(PEG-IFN)/リバビリン(RBV)の併用療法であることを特徴とする(5)記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
(6)上記(4)記載のマイクロアレイを使用することを特徴とする(5)記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
(7)上記核酸断片を増幅する工程で得られた核酸断片は蛍光標識を有し、上記ハイブリダイズを検出する工程では当該蛍光標識の蛍光強度値を測定することを特徴とする(5)記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
(8)上記治療はペグインターフェロン(PEG-IFN)/リバビリン(RBV)の併用療法であることを特徴とする(5)記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
本発明に係る多型検出用プローブは、rs8113007を含む領域を増幅した核酸断片に対して、rs8113007の遺伝子型に応じて特異的にハイブリダイズすることができる。したがって、本発明に係る多型検出用プローブを利用することによって、rs8113007の遺伝子型をハイブリダイズといった簡便な処理によって高精度に判定することができる。
また、本発明に係るDNAチップは、上記多型検出用プローブを備えるため、rs8113007の遺伝子型を判定する際に利用することができる。すなわち、本発明に係るDNAチップを利用することで、rs8113007の遺伝子型を簡便な処理によって高精度に判定することができる。
さらに、本発明に係るC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法は、上記多型検出用プローブを利用し、被験者のゲノムにおけるrs8113007の遺伝子型を簡便に且つ高精度に判定した結果を利用している。したがって、本発明に係るC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法によれば、簡便な処理によって当該データを得ることができる。
本発明に係る多型検出用プローブは、rs8113007で特定される一塩基多型を含む所定の領域に対応する配列:ACCTCCTGGWGGTAAAT(配列番号1、WはA又はT)若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の一端両端に1〜4の塩基が付加した配列からなる、全体が17〜25の塩基長であるオリゴヌクレオチドである。
言い換えると、本発明に係る多型検出用プローブは、配列:ACCTCCTGGWGGTAAATからなるオリゴヌクレオチドであっても良いし、配列:ACCTCCTGGWGGTAAATの3’末端及び/又は5’末端に1〜4の塩基が付加した配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良い。ここで、5’末端に付加してもよい1〜4の塩基とは、具体的にC、TC、TTC又はTTTCである。また、3’末端に付加してもよい1〜4の塩基とは、具体的にA、AT、ATT又はATTTである。
或いは、本発明に係る多型検出用プローブは、配列:ACCTCCTGGWGGTAAATの相補的配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良いし、配列:ACCTCCTGGWGGTAAATの相補的配列の3’末端及び/又は5’末端に1〜4の塩基が付加した配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良い。ここで、5’末端に付加してもよい1〜4の塩基とは、具体的にT、TA、TAA又はTAAAである。また、3’末端に付加してもよい1〜4の塩基とは、具体的にG、GA、GAA又はGAAAである。
また、本発明に係る多型検出用プローブは、全体が17〜23塩基長のオリゴヌクレオチドからなることがより好ましく、21〜23塩基長のオリゴヌクレオチドからなることが最も好ましい。例えば、本発明に係る多型検出用プローブとしては、TTCACCTCCTGGWGGTAAATATT(配列番号2、WはA又はT)、TCACCTCCTGGWGGTAAATAT(配列番号3、WはA又はT)又はCACCTCCTGGWGGTAAATA(配列番号4、WはA又はT)とすることができる。
rs8113007は、特開2012-105634号公報にて開示されるように、IL28B遺伝子の近傍にある一塩基多型である。IL28B遺伝子はヒト第19番遺伝子上に存在する。C型慢性肝炎の治療における効果予測因子のSNPとして、rs12979860とrs8099917が公知である。rs12979860は、IL28B遺伝子の3018塩基上流に存在し、rs8099917はIL28B遺伝子の7396塩基上流に存在する。本発明に係る多型検出用プローブにて遺伝子型を判定する対象のrs8113007は、rs8099917の約60塩基上流に存在するSNPである。
rs8113007における遺伝子型が、A/A(アデニンのホモ接合型)である場合をメジャーとし、T/T(チミンのホモ接合型)である場合をマイナー、A/T(アデニンとチミンのヘテロ接合型)である場合をヘテロと定義する。rs8113007の遺伝子型がメジャーである場合は、C型慢性肝炎の治療に感受性を有し(すなわち治療有効性を有し)、マイナー及びヘテロの場合はC型慢性肝炎の治療に感受性を有さないとする。
ここで、C型慢性肝炎の治療とは、インターフェロン(IFN)及び/又はペグインターフェロン(PEG-IFN)を用いた治療を意味する。すなわち、C型慢性肝炎の治療とは、IFN単独療法、PEG-IFN単独療法、PEG-IFN/リバビリン(RBV)(2剤併用)療法、PEG-IFN/RBV/その他の薬剤(3剤又は4剤併用)療法等を挙げることができる。なかでも、C型慢性肝炎の治療としては、少なくとも2剤併用療法であることが好ましく、特に、PEG-IFN/RBV療法であることがより好ましい。
なお、本発明に係る多型検出用プローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNAである。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、本発明に係る多型検出用プローブは好ましくは一本鎖DNAである。
本発明に係る多型検出用プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
本発明に係る多型検出用プローブは、その5'末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイ(例えばDNAチップ)の形態で用いるのが好ましい。このとき、マイクロアレイは、rs8113007における遺伝子型のうち野生型であるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドと、変異型であるチミンに対応する配列のオリゴヌクレオチドとからなる一対の多型検出用プローブを有することが好ましい。野生型と変異型に対応する一対の多型検出用プローブを利用することによって、rs8113007がアデニンのホモ接合型であるか、チミンのホモ接合型であるか、アデニンとチミンのヘテロ接合型であるかを正確に同定することができる。
また、マイクロアレイは、rs8113007における遺伝子型のうち変異型であるチミンに対応する配列のオリゴヌクレオチドのみを多型検出用プローブとして有するものであってもよい。rs8113007の少なくとも一方のアレルがTであるとき、すなわちrs8113007の遺伝子型がT/T(チミンのホモ接合型)又はA/T(アデニンとチミンのヘテロ接合型)である場合、C型慢性肝炎の治療に感受性を有さないと判断できるためである。
担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カーボンファイバーに代表される炭素などの導電体材料;単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI(シリコン・オン・インシュレータ)などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材;ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料;ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
本発明に係るマイクロアレイにおいては、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1〜75mm四方のもの、好ましくは1〜10mm四方のもの、より好ましくは3〜5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや(モザイク結晶と称される場合もある)、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド(例えば、ダイヤモンドライクカーボン)、アモルファスカーボン、炭素系物質(例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ)のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン(DLC:Diamond Like Carbon)等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収がないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD(Chemical vapor deposit)法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit)法、ICP(Inductive coupled plasma)法、直流スパッタリング法、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス(メタン)を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス(ベンゼン)を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1〜99体積%と残りメタンガス99〜1体積%からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料(陰極蒸発源)と真空容器(陽極)の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ(パルス発振)光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜100μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm〜1μm、より好ましくは5nm〜500nmである。
カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、オリゴヌクレオチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式:X-R1-COOH(式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10〜12の2価の炭化水素基を表す)で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリル酸、4-クロロ安息香酸;式:HOOC-R2-COOH(式中、R2は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す)で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸;ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸;式:R3-CO-R4-COOH(式中、R3は水素原子または炭素数1〜12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す)で示されるケト酸またはアルデヒド酸;式:X-OC-R5-COOH(式中、Xはハロゲン原子、R5は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す。)で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド;無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素=炭素2重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。
活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド(例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる(特開2001-139532)。
本発明に係る多型検出用プローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、多型検出用プローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
スポッティング後、多型検出用プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常−20〜100℃、好ましくは0〜90℃の温度で、通常0.5〜16時間、好ましくは1〜2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50〜90%の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液(例えば、50mM TBS/0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など)を用いて洗浄を行うことが好ましい。
また、上記多型検出用プローブ又はマイクロアレイを用いることで、被検者における、rs8113007で特定される一塩基多型の遺伝子型を判定することができる。本発明では、被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、rs8113007を含む領域を増幅する工程と、上記多型検出用プローブ又はマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるrs8113007で特定される一塩基多型の遺伝子型を同定する工程とを含む。
被検者は通常ヒトであり、人種等には特に限定されないが、特に、黄色人種、好適には東アジア人種、特に好適には日本人とする。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料(血液、血清、血漿など)、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。
まず、被検者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール/クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。
次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、rs8113007を含む領域、好ましくはDNAを増幅させる。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン(DIG)やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、増幅領域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸(具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸)、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
増幅反応に用いるプライマーは、rs8113007を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、
プライマー1:5'- AGGAGGAACAGTGACAAATTG -3'(配列番号5)及び
プライマー2:5'- ACATGGAGAGTTAAAGTAAGTCTTG -3'(配列番号6)
からなるプライマーのセットが挙げられる。
プライマー1:5'- AGGAGGAACAGTGACAAATTG -3'(配列番号5)及び
プライマー2:5'- ACATGGAGAGTTAAAGTAAGTCTTG -3'(配列番号6)
からなるプライマーのセットが挙げられる。
また、プライマーにより増幅される核酸断片は、rs8113007を含んでいれば特に限定されず、例えば1 kbp以下が好ましく、800 bp以下がより好ましくは、400 bp以下が更に好ましく、200bp以下が特に好ましい。
上記のようにして得られた増幅核酸と本発明に係る多型検出用プローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、多型検出用プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。また、多型検出用プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.5×SSCのとき、42〜54℃とすることができ、多型検出用プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度を42〜48℃とすることがより好ましく、多型検出用プローブの鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度を46〜54℃とすることがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまでもない。
上記ハイブリダイゼーション反応においては、本発明に係る多型検出用プローブが担体上に固定化されたマイクロアレイを用い、該マイクロアレイに増幅核酸を含む溶液を作用する方法が好ましい。
本発明に係るC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法は、本発明に係る多型検出用プローブにハイブリダイズした上記増幅核酸の量に基づいて、被験者のゲノムにおけるrs8113007の遺伝子型が、メジャーアレルであるか、マイナーアレルであるかヘテロアレルであるか特定する。そして、rs8113007の遺伝子型がメジャーアレル(A/A(アデニンのホモ接合型))である場合に当該被験者について、上述したC型慢性肝炎の治療の有効性があると判定し、rs8113007の遺伝子型がマイナーアレル(T/T(チミンのホモ接合型))又はヘテロアレル(A/T(アデニンとチミンのヘテロ接合型))である場合に上述したC型慢性肝炎の治療の有効性がないと判定する。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
本実施例では、rs8113007の遺伝子型を判別するための一対の多型検出用プローブをそれぞれ2点ずつ有するDNAチップを作製した。DNAチップに搭載した核酸プローブの一覧を表1に示した。
本実施例では、rs8113007の遺伝子型を判別するための一対の多型検出用プローブをそれぞれ2点ずつ有するDNAチップを作製した。DNAチップに搭載した核酸プローブの一覧を表1に示した。
本実施例では、PCR法により、蛍光標識を有する、rs8113007を含む核酸断片を増幅し、得られた核酸断片を以上のように作製したDNAチップに対して作用させ、核酸断片と多型検出用プローブとのハイブリダイズを蛍光強度にて検出した。
蛍光標識プライマーの作製は、5’末端をアミノ基で標識した表2に示すオリゴヌクレオチド(ライフテクノロジーズジャパン製)と、IC5-OSu(同仁化学研究所製)をりん酸緩衝液(pH8.0)中で4℃にて1昼夜反応させた後、MicroSpin G-25 Columns(GEヘルスケア製)を用いて精製することにより作製した。得られた精製物の260nm及び640nmの吸光度を測定することにより、プライマーの濃度及び蛍光色素の濃度を算出した。
得られた蛍光標識プライマーと蛍光未標識プライマー(塩基配列;ACATGGAGAGTTAAAGTAAGTCTTG:配列番号6)を加え、プライマーミックスを調整した。PCRの反応条件を表3に示した。PCRの反応液は表4に示す組成とした。そして、表4に示した組成の反応液に対して、メジャーホモ検体として2ng/μLに調製したHepG2(ヒト培養細胞)由来のゲノムDNAを、マイナーホモ検体として2ng/μLに調製したHLE(ヒト培養細胞)由来のゲノムDNAをそれぞれ加えた。検体を含む反応液を5μLずつ反応チューブに加えた後、サーマルサイクラー(Eppendorf製)を用いてPCRを行った。
以上のようにして得られた増幅産物をDNAチップにハイブリダイズさせる際には、先ず、規定温度(42、44、46、48、50、52、54℃のいずれか)に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱をあらかじめ十分予熱しておいた。新しいサンプルチューブにハイブリダイズ緩衝液(組成:1.5×くえん酸ナトリウム緩衝液(SSC)/0.3%ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)溶液)を1.5μLと増幅産物を3μL入れ、混合した。この混合液のうち3μLをDNAチップ上に滴下し、カバーをかけ、十分に予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱をチャンバー内に載置した。その後、規定温度で1時間DNAチップと増幅産物を反応させた。
その後、直ちにカバーを外し、0.01×SSC/0.1%SDS溶液に5分間静置した後、検出するまで室温の1×SSC溶液に静置した。ハイブリダイズの検出には、BIOSHOT(東洋鋼鈑製)を使用した。このとき、露光時間を10秒に設定した。また、各スポット径内の画素の数値から、中央値を求めた。同じプローブスポットは中央値の平均を求め、各スポットの出力値とした。
本実施例のうち、ハイブリダイズ温度を変化させて得られた判定値を表5及び図1に示した。
表5及び図1からわかるように、多型検出用プローブの塩基長が短いとハイブリダイズ温度が低いところで特異性(本実施例では判定値が「0.6」以下又は「1.4」以上を特異性ありと判断する。)を有する。しかし、多型検出用プローブの塩基長が短い場合には、ハイブリダイズ温度が高くなると特異性を失う傾向にある。
例えば、メジャーアレル検出プローブ及びマイナーアレル検出プローブからなる一組の17mer多型検出用プローブを使用する場合、ハイブリダイズ温度44℃以下とすることが好ましいことが分かる。また、メジャーアレル検出プローブ及びマイナーアレル検出プローブからなる一組の19mer多型検出用プローブを使用する場合、ハイブリダイズ温度46℃以下とすることが好ましいことが分かる。さらに、メジャーアレル検出プローブ及びマイナーアレル検出プローブからなる一組の21mer多型検出用プローブを使用する場合、ハイブリダイズ温度48℃以下とすることが好ましいことが分かる。
多型検出用プローブの塩基長が23merであるとハイブリダイズ温度に依らず特異性を有することが明らかとなった。したがって、本実施例の結果から、17mer〜23merの多型検出用プローブを判定に用いることができるが、特に23merの多型検出用プローブを使用することが最も優れていることが明らかになった。
Claims (8)
- 配列:ACCTCCTGGWGGTAAAT(配列番号1、WはA又はT)若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の一端及び/又は両端に1〜4の塩基が付加した配列からなる、全体が17〜25の塩基長であるオリゴヌクレオチドである、IL28B遺伝子におけるrs8113007の遺伝子型を検出するための多型検出用プローブ。
- 上記オリゴヌクレオチドが17〜23塩基長であることを特徴とする請求項1記載の多型検出用プローブ。
- 上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、TTCACCTCCTGGWGGTAAATATT(配列番号2、WはA又はT)、TCACCTCCTGGWGGTAAATAT(配列番号3、WはA又はT)又はCACCTCCTGGWGGTAAATA(配列番号4、WはA又はT)であることを特徴とする請求項1記載の多型検出用プローブ。
- 請求項1乃至3いずれか一項記載の多型検出用プローブを有するマイクロアレイ。
- 被験者由来のゲノムを鋳型としてIL28B遺伝子におけるrs8113007多型を含む核酸断片を増幅する工程と、
得られた核酸断片と請求項1乃至3いずれか一項記載の多型検出用プローブとを接触させる工程と、
得られた核酸断片と上記多型検出用プローブとのハイブリダイズを検出する工程とを含み、
rs8113007の遺伝子型がA/A(アデニンのホモ接合型)である場合に上記被験者についてペグインターフェロン(PEG-IFN)及び/又はインターフェロン(IFN)を用いた治療の有効性があると判定し、rs8113007の遺伝子型がT/T(チミンのホモ接合型)又はA/T(アデニンとチミンのヘテロ接合型)である場合に当該治療の有効性がないと判定する、C型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。 - 請求項4記載のマイクロアレイを使用することを特徴とする請求項5記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
- 上記核酸断片を増幅する工程で得られた核酸断片は蛍光標識を有し、上記ハイブリダイズを検出する工程では当該蛍光標識の蛍光強度値を測定することを特徴とする請求項5記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
- 上記治療はペグインターフェロン(PEG-IFN)/リバビリン(RBV)の併用療法であることを特徴とする請求項5記載のC型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法。
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