CN1253582C - 复杂dna甲基化指纹的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于组织和细胞型的表征、分类和鉴别，对组织和细胞群行为的预测，并用于对具有改变表达的基因的鉴定的方法。该方法，其特征在于：在从任何组织样品中获取的基因组DNA中，碱基胞嘧啶(而不是5-甲基胞嘧啶)经亚硫酸氢盐溶液处理转化为尿嘧啶。利用极短的或简并寡核苷酸扩增这样处理的基因组DNA的部分。通过杂交或聚合酶反应检测扩增片段的剩余胞嘧啶。该分析所产生的、可自动适用于处理算法的数据的量可用于得出关于所分析细胞物质的表型的结论。

Description

复杂DNA甲基化指纹的制备方法
1.发明领域
此处申请专利的方法提供一种区别诊断癌症疾病的新的可能性。它导致对癌发生和多基因遗传性疾病发病机理的更深入了解。此外，该方法也涉及对参与疾病发展的所有基因的鉴定。过去，细胞分化和高等生物的分化仍基本上未被了解。现在，该方法大大增进了这方面的了解。
近年来，通过分子生物学方法学发展所很好研究的观察水平包括基因本身、RNA的基因翻译和产生的蛋白质。在个体发育过程中，基因开启，特定细胞和组织中某些基因的激活和抑制如何受控制可能与该基因或基因组甲基化的特性和程度高度有关。就此而言，假定用个别基因或基因组的改良甲基化模式表达致病情况是合理的。
现有技术是一种能研究个体基因甲基化模式的方法。该方法的其它最新发展也使对极少量原材料的分析成为可能，然而，测定点的总数仍至多为两位数字，理论值范围为至少107个测定点。利用申请专利保护的方法，现在第一次有可能用任一希望数量的测定点检查基因组的任何希望的部分。因此，该方法允许对用其它任何方法都不能确定的所有类型遗传性疾病的病因鉴定，并且允许新治疗策略的发展和新药靶蛋白的鉴定。
2.现有技术
2.1细胞表型分子分析的现有技术
基因表达的研究可以是RNA水平或蛋白质水平的。这两种水平基本上反映了重要的表型参数。利用二维凝胶的蛋白质测定(McFarrel法)已知有大约15年。利用这些测定法，能详细描述对数千种蛋白质层析位置的分析。很早之前，已经用数据处理方法处理或估计这些电泳图谱。原则上，该方法的有效性较高，然而，它在两方面逊色于基于RNA分析的现代基因表达方法。
特别是，无法从少量细胞中检测具有调节重要性的蛋白质，这是由于所用方法的灵敏度太低的事实。实际上，与核酸不同，蛋白质不能扩增。另外，该方法极其复杂，不适于自动化，并且非常昂贵。相反，RNA分析具有相当多的优点，并且由于PCR的应用，其更加灵敏。尤其是，根据序列能立即鉴定出认为重要的每一RNA种。
具有已知序列的个体RNA的超量表达或欠量表达通常可轻易检测；然而，在此处所述的申请中，这只在例外情况中才有效。“差示展示”法最多能对表达进行半定量研究。PCR扩增的表达产物通过凝胶电泳分离。由于凝胶电泳的分辨率，其有效性受到限制。另外，该方法对于常规诊断的应用来说不够灵敏和稳定(Liang，P.和Pardee，A.B.，科学(Science)257，967-971)。
较高超量表达或欠量表达的基因常常通过减数(subtractive)技术鉴定。平板接种待检细胞或组织种的cDNA克隆。cDNA作为比较物与克隆杂交。利用该技术不能可靠地制备表达模式。
美国“人类基因组计划”的一个活动是对表达基因的系统测序。由此获得的数据能用来建立表达芯片，这使得能在一次实验中研究一种细胞或组织类型的几乎全部表达序列。
2.2癌症疾病分析的技术现状
基因突变总是引发癌症疾病[sic]，即，细胞变性。这些突变的原因可能是外源影响，或是细胞内事件。在少数例外中，常常影响基因组较大区域的个体突变(易位、缺失)导致细胞变性；但在大多数情况中，涉及不同基因的一系列突变，并且只是其联合作用才引起恶性疾病。这些DNA水平上的结果也反映于RNA及蛋白质水平上。就此而言，非常可能发生增殖，因为在许多情况中显然一种RNA的量和类型影响其它几种RNA种的合成程度。这导致相应蛋白质合成率的改变，随后，又能引起去调节代谢，从而启动调节和反调节机制。结果是所述细胞的基因表达模式，其已经以非常特异(但基本上不可确定)的方式修改，特异性是对于某些癌、癌的阶段和癌的恶性程度。迄今为止，这种现象已经超出自然科学的研究领域。实际上，完全地检查基因表达或细胞的代谢是不可能的。芯片技术第一次提供了这种可能性(Schena，M.等人，科学270，467-470)。
如果希望在分子水平上解决肿瘤早期诊断的诊断问题，今天，人们除了极少数例外地将面临难以克服的困难：因为，对于大多数肿瘤，对分子事件即不同突变的了解只是片面的，研究人员不知道应在医学检查材料中寻找什么。这意味着利用聚合酶链反应的显著敏感性和特异性是绝对不可能的。例如某些肠道肿瘤、尤因肉瘤和某些形式的白血病，实际上每一种都被界定为单一的、精确描述的突变。在这些情况中，从数百万正常细胞中鉴定变性细胞是可能的。然而，甚至在这些似乎明确定义的肿瘤群中，存在行为的差异，以致必定得出以下结论：其它未知的遗传参数(例如个体的遗传背景)起重要作用。除了其它常规诊断参数之外，免疫学肿瘤标记是有用的辅助参数，但它们目前只是起一定的作用。然而，它们能用于预先筛选可疑细胞的用途。
组织学在变性组织的鉴定中起重要且不可缺少的作用，但在早期诊断中不精确。
由于大多数肿瘤没有为了诊断目的在分子水平上充分表征，因此，通常不存在再分为阶段抑或根据危险程度再分的可能性。然而，这种再分是改进治疗的选择性、尤其是有效新药和基因治疗发展的绝对必要条件。
2.3对高等生物细胞可能稳定状态的数量、类型和性质的研究的技术现状
现时，有增多的迹象表明，复杂调节系统(一种极好的例子是细胞调节)当单独时能以有限数量的稳定状态存在，高于临界最低复杂性，低于(与任一给定成分连接的成分平均数的)临界最大连接性(Kauffman，S.A.，《秩序的起源》(Origins of Order)，OxfordUniversity Press，1993)。就此而言，术语状态应当理解为普遍现象选择的概念。关于作为生物调节系统的细胞，也能谈及分化状态或细胞型。尽管尚未证明这种联系一甚至尚未证明生物系统可能状态的限制一但实际含义应当是非常重要的。关于生物细胞的固定信息内容(事实上，这种恒定性基本上只存在于一个种群内)，如果只存在有限数量的稳定状态，那么变性细胞可能也只是处于这些状态之一或可能的状态之间的过渡态。此时，在分子基础上定义这些状态是不可能的。根据现有技术水平，几乎不可能实现个体状态与细胞行为之间的相关。然而，这种分析明确地有助于疾病的诊断和预后。甚至有可能在疾病细胞的可能状态和最适合的疗法之间建立相关性。此外，或许这种方法也能在治疗时间的选择中具有决定性的影响。例如，如果想发现肿瘤细胞处于可能状态之间的过渡态，则可以假定这种细胞群更可能受到治疗引起的选择压力，从而能更轻易地逃脱。在这种情况中，此过渡态的细胞群体具有大大增强的灵活性，并且可轻易地达到可能的稳定状态，其中选择压力将消除，因而治疗无效。能根据状态将细胞和细胞组分类的方法也将有利于认识、理解并可能解决这些问题。然而，根据现有技术水平，不可能确定是否只存在有限数量的细胞状态。从而不可能根据关于状态的抽象标准区别细胞组，并用某些细胞行为预测这些状态。
2.4遗传性疾病
今天，人类基因组的基因图谱包括2500个所谓的微卫星。这些工具用来通过连锁分析定位大量基因，通常是其缺陷引起遗传性疾病的基因，然后鉴定它们。这样从遗传学家法则的观点阐明由单个缺陷基因引起的常见遗传性疾病，多基因疾病也能用此方式理解。许多多基因疾病是很常见的，包括于所谓的广泛传播的疾病中。哮喘和糖尿病是其实例。也包括许多癌的类型。上述连锁分析策略的应用最初也得到巨大成功。在许多情况中，发现了重要多基因疾病如糖尿病、精神分裂症、动脉粥样硬化和肥胖症的大量致病基因。除了适当的分子生物学实验室技术的可用性之外，每种疾病所影响的相对大量患者和其亲属的存在是遗传学阐明的重要前提条件。在过去两年中，显然最初用于多基因疾病连锁分析的数百名患者的数量极可能低了一个数量级。在任何情况中，这适用于完整致病基因谱将要得到阐明的情况。因为这种连锁分析所需的手工工作的水平易乎寻常得高，所以在多基因疾病的分析中只能预期极缓慢的进展。正在寻求备择策略，因为正是这些疾病具有巨大的社会和经济重要性。
2.5DNA芯片的技术现状
Affimetrix的原理已经进展到所有发展的最大限度(例如，美国专利号5,593,839、5,999,695或5,631,734)。然而，许多其它公司和研究项目组已经生产了具有不同特性、用于特殊用途的DNA芯片(例如，美国专利号5,667,667、5,525,464或5,492,806或，例如，Goffeau，A.，自然(Nature)385，202-203；Weiler，J.和Hoheisel，J.，分析生物化学(Anal.Biochem.)243，218-227；Chee，M.等人，科学274，610-614)。最近的文献已经报道了可商业获得的HIV芯片，其允许对完整HIV基因组的检查。待检样品的荧光标记的PCR产物可与高达400,000个寡核苷酸杂交。借助于CCD照相机进行信号的评价。这些系统用于等位基因特异杂交的已知能力已经长时间利用。这意味着只有在样品与固定寡核苷酸绝对互补处，信号才能保持到杂交和洗涤步骤的最后。为了检测突变对已知基因序列的检查已获得成功，因为完整序列的每一部分区域以寡核苷酸序列的形式存在于基质上，并且这些寡核苷酸序列可认为是正常序列的每一可能的偏差。芯片法的效率一部分归因于大量基因或基因座位的序列信息是通过两个简单工作步骤(即杂交和洗涤)而获得的这一事实。
2.6长度测定的分析方法
根据本发明的方法的几种实施方案变体在方法最后需要极快速和精确的重量测定。由于必须对上万个数据点进行片段长度的测定，所以需要非常有效的测定系统。根据现有技术水平，可能的系统包括自动测序装置(美国专利4,811,218)、毛细管电泳(例如，Woolley，A.T.，等人，分析化学(Anal.Chem.)68，4081-4086)、MALDI-TOF(Siegert，C.W.，等人，分析生物化学253，55-65)和通过化学标记的分离(WO95/04160)。现有技术使这些方法能有效实施，虽然需要对根据本发明的方法的新逻辑进行相当大的修改和引入。
2.6.1质谱分析法
用MALDI-TOF质谱分析仪能精确测定短DNA序列的重量。此外，现有技术中存在将这些分析方法与引物延伸反应相结合的方法。在该方法中，例如，一种具有特异序列的寡核苷酸与一种DNA样品杂交，每次反应中只加入四种核苷酸之一。已知在杂交后通过聚合酶向寡核苷酸3’端添加了哪一种核苷酸，使得能测定该寡核苷酸3’端之后碱基的同一性。该方法的变型包括一种允许对只含有四种可能碱基之两种的重复序列长度进行测定的方法。在该方法中，加入与存在的碱基互补的天然核苷酸，和一种或两种其它如此修饰的核苷酸，作为聚合反应的终止剂，使得反应在重复序列之后终止。终止剂通常为ddNTP。从长度测定中能得出重复序列的长度。
2.7甲基化分析的技术现状
基因组碱基胞嘧啶修饰为5’-甲基胞嘧啶代表外遗传参数，迄今为止它是最重要的一种参数，并且已得到充分检查。然而，现在存在测定细胞和个体全面基因型的方法，但迄今尚不存在大规模产生和评估外基因型信息的相当的方法。
原则上，存在三种用于测定序列中胞嘧啶5-甲基状态的原理上不同的方法。
第一种方法在原理上基于“甲基化敏感的”限制性内切核酸酶(RE)的应用。RE的特征在于它们在DNA中在某些DNA序列处(通常4-8个碱基长度)产生缺刻。这些缺刻的位置可通过凝胶电泳检测，转移到膜上并杂交。甲基化敏感的意思是，为了该步骤的发生，识别序列内的某些碱基必须是非甲基化的。因而限制性酶切和凝胶电泳后的带型随DNA的甲基化模式而变。然而，能被甲基化的大多数CpG都位于RE的识别序列之外，因此无法检测。
该方法的灵敏度极低(Bird，A.P.，Southern，E.M.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)118，27-47)。一种变型将PCR与该方法相结合；只有在识别序列为甲基化形式时，才在缺刻之后通过位于识别序列两侧的两条引物进行扩增。在此情况中，灵敏度理论上可增大到靶序列的一个分子；然而，只有个别位置才能以较大成本被检测到(Shemer，R.等人，PNAS 93，6371-6376)。
第二种变型基于利用Maxam-Gilbeft测序反应模型对整个DNA的部分化学切割，连接体与这样产生的末端连接，应用通用引物的扩增，和通过凝胶电泳的分离。利用该方法，能检测大小低于数千个碱基对的指定区域。但是，该方法太复杂且不可靠，实际上已不再使用(Ward，C，等人，生物化学杂志265，3030-3033)。
用于DNA检测来测定5-甲基胞嘧啶存在的一种新方法基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应。后者在适当条件下转化为尿嘧啶，就涉及到碱基配对而言，它相当于胸腺嘧啶，也对应于另一种碱基。5-甲基胞嘧啶未被修饰。结果，原始DNA这样转化，使得最初根据杂交行为不能与胞嘧啶相区别的甲基胞嘧啶现在能通过“普通的”分子生物学技术检测。所有这些技术都基于碱基配对，现在能完全利用。只要涉及到敏感性，现有技术限定为一种方法，它在琼脂糖基质中含有待检DNA，用于防止DNA的扩散和复性(亚硫酸氢盐只与单链DNA反应)，并用快速透析代替所有沉淀和纯化步骤(Olek，A.等人，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)24，5064-5066)。利用该方法，能检测个体细胞，这说明了该方法的潜能。然而，迄今为止只检测到长度可达大约3000个碱基对的个别区域，而鉴定上千个可能的甲基化事件的细胞全面检测是不可能的。但是，该方法不能从较小的样品量中可靠地分析微小片段。尽管有对扩散的保护，但这些样品仍在通过基质时丢失。
2.8亚硫酸氢盐技术应用的技术现状
迄今为止，除极少数例外之外，(例如，Zeschnigk，M.，欧洲人类遗传学杂志(Eur.J.Hum.Gen.)5，94-98；Kubota，T.等人，自然杂志遗传学分册(Nat.Genet.)16，16-17)，亚硫酸氢盐技术只用于研究。然而，亚硫酸氢盐处理后的已知基因的特定短片段可以常规扩增，或者完全测序(Olek，A.和Walter，J.，自然杂志遗传学分册17，275-276)，或者通过“引物延伸反应”(Gonzalgo，M.L.和Jones，P.A.，核酸研究25，2529-2531)或酶切(Xiong，Z.和Laird，P.W.，核酸研究25，2532-2534)检测个别胞嘧啶位置的存在。所有这些参考文献都来自于1997年。利用复杂甲基化模式一更少地通过评估算法如神经网络-与适用于复杂遗传性疾病的表型数据相关联的概念现今在文献中已不再提及；此外，不能根据现有技术的方法学来进行。
3.本发明的问题与问题的解决
总之，现有技术具有弱点，这可通过根据本发明的方法来解决。
问题可由一种方法来解决，其用于组织和细胞型的表征、分类和区别，用于组织和细胞组行为的预测，并用于具有改变表达的基因的鉴定，其特征在于：
在从任一组织样品中获得的基因组DNA中，其可能已经受处理、经受剪切或通过限制性内切核酸酶以自知的方式切割，其中碱基胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶经亚硫酸氢盐溶液处理以本来已知的方式转化为尿嘧啶，
利用极短或简并寡核苷酸或互补于连接体寡核苷酸的寡核苷酸，扩增这样处理的基因组DNA的部分，这些连接体寡核苷酸在亚硫酸氢盐处理之前已与切割的DNA的末端连接，
总体上，富含鸟嘌呤DNA链上剩余胞嘧啶和/或得自扩增部分的富含胞嘧啶DNA链上的鸟嘌呤的量通过杂交或聚合酶反应检测，该量应使得该分析所产生的、可自动适用于处理算法的数据，有可能得出关于所分析细胞物质的表型的结论。
根据本发明，这有利于：
从对来源于表型相同或相似细胞或组织的DNA样品几次或多次这类试验分析中所获得的数据，在训练阶段利用神经网络或其它评估算法与DNA得到检测的细胞的表型相关联，
利用表型与甲基化状态之间的联系，将在该训练阶段中在评估模式中所采纳的数据，用于通过未知来源的DNA样品甲基化状态的产生，得出DNA得到检测的细胞的表型，或者
利用对已知细胞型DNA的甲基化状态，将在训练阶段中在评估模式中所采纳的数据，用于鉴定在所检DNA中不同于训练阶段中所测定的甲基化状态的胞嘧啶位置。
此外，.根据本发明，在亚硫酸氢盐处理之前用限制性内切核酸酶切割在其识别序列中含有5’-CpG-3’胞嘧啶的DNA是有利的，只在其中5’-CpG-3’中的胞嘧啶在5’位置为非甲基化形式的识别序列处切割DNA也是有利的。
此外，根据本发明，下列情况也是有利的：
在以本来已知的方式用亚硫酸氢盐溶液修饰基因组DNA之前，用限制性内切核酸酶切割基因组DNA，
通过连接反应，为产生的末端提供已知的、取链短DNA序列，该DNA序列也称为连接体，
互补于已用亚硫酸氢盐处理的连接体的寡核苷酸，用于在亚硫酸氢盐处理后从这样产生的全部片段中扩增所有DNA片段或亚群。
就此而言，为了使胞嘧啶转化为尿嘧啶，在0-100℃反应温度的周期变化下，进行基因组DNA探针与亚硫酸氢盐溶液的反应，而同时保持甲基胞嘧啶是有利的。
在亚硫酸氢盐处理前，将DNA切割后加入只可透过小分子的可加热多孔毛细管中也是优选的，其中通过透析加入试剂和去除试剂进行亚硫酸氢盐处理的后面的反应步骤。
此外，根据本发明，在亚硫酸氢盐处理前，将样品转移到不可透过小分子的可加热毛细管中是有利的，其中可通过经连接的毛细管供应试剂加入和去除试剂来进行亚硫酸氢盐处理的后面的反应步骤。
此外，根据本发明，在与亚硫酸氢盐处理相同的毛细管中或在与该毛细管相连的毛细管中，或在与该毛细管相连的容器中进行亚硫酸氢盐处理之后的聚合酶反应是有利的。
在用亚硫酸氢盐处理的DNA样品进行聚合酶反应的毛细管中，根据所产生片段群的长度进行分离也是有利的。
此外，优选地通过亚硫酸氢盐沉淀从中分离出处理的DNA。
此外，根据本发明，优选地，对于用亚硫酸氢盐处理的基因组DNA样品的扩增，结合两类寡核苷酸，其中一类寡核苷酸在不含有碱基胞嘧啶或其类似物，或者只是在5’-CpG-3’中极小程度地含有，或者只在对于扩增非必需的寡核苷酸区域中含有，而另一类寡核苷酸不含有碱基鸟嘌呤或其类似物，或者只是在5’-CpG-3’内极小程度地含有，或只在对于扩增非必需的寡核苷酸区域如5’区中含有，其中这两类寡核苷酸
a)应如此短，以致在每次只含有两类中的一种代表的扩增中，超过100个不同片段得到扩增，或者
b)这些寡核苷酸含有如此多所谓的简并位置，使得在只有两类中每一类的一种代表的扩增中，超过100个不同片段得到扩增，或者
c)在扩增中使用如此多的两类寡核苷酸的多种代表，使得超过100个不同片段得到扩增。
认为在用于聚合酶反应的分离制剂中，将处理并扩增的DNA与每一反应中的不同寡核苷酸混合是最理想的，这些寡核苷酸
在5’端与连接体互补，或者一般为了用亚硫酸氢盐处理的寡核苷酸的扩增而互补，并且
在每一反应中在其3’端不同，并且
其可变3’端开始于已知连接体序列或寡核苷酸序列的下游，
并且其可变3’端经2-12个核苷酸之间的已知连接体序列延伸到未知模板DNA序列中。
在这方面，又特别优选的是，这些反应，其中用寡核苷酸开始聚合酶反应，该寡核苷酸互补于用亚硫酸氢盐处理的DNA，除了三种核苷酸dATP、dTTP和dCTP或这三种核苷酸的类似物之外，还含有：
一种核苷酸类似物，其互补于碱基胞嘧啶，并且在通过聚合酶掺入后阻断了该链的任何进一步的延伸，或者
不含与碱基胞嘧啶互补的核苷酸或核苷酸类似物。
此外，根据本发明，在此优选的是，这些反应，其中用互补于亚硫酸氢盐处理的DNA的寡核苷酸开始聚合酶反应，除了三种核苷酸dATP、dTTP和dGTP或这三种核苷酸的类似物之外，还含有：
一种核苷酸类似物，其互补于碱基鸟嘌呤，并且在通过聚合酶掺入后阻断了该链的任何进一步的延伸，或者
不含与碱基鸟嘌呤互补的核苷酸或核苷酸类似物。
在这点上特别优选的是，利用终止剂在早先在DNA样品中含有甲基胞嘧啶的位置处发生聚合酶反应的终止，该终止剂本身以一种方式修饰，使得其允许对特异终止的聚合酶反应产物进行检测。
此外，根据本发明，将由适当组合产生的各个反应制品的不同片段混合物涂抹于MALDI-TOF或另一种质谱分析仪的离子源的各个点，并通过测定所有DNA片段的重量来测定各个反应的片段组成。
此外，优选地，将由适当组合产生的各个反应制品的不同片段混合物在凝胶电泳中加于各个泳道中，并通过测定所有DNA片段的长度来测定各个反应的片段组成。
此外，用其开始聚合酶反应的根据本发明所述的寡核苷酸，根据寡核苷酸序列的不同而与不同的化学标记偶联，其化学和/或物理性质使得能通过标准层析或质谱分析法对不同标记进行检测和区别。
在这方面，特别有利的是：
在第一个扩增步骤中制备的已用亚硫酸氢盐处理的待检DNA的片段部分与两种或多种不同化学标记的寡核苷酸同时混合，
这些寡核苷酸在反应制品中用作聚合酶反应的引物，
得到的片段的复杂混合物在第一个分析步骤中进行根据长度的电泳分离，并且
对电泳产生的片段混合物的各个长度部分进行层析或质谱分析，其在每一长度部分中检测表征寡核苷酸的化学标记的存在与否。
此外，根据本发明，向一个表面上施加如下的寡核苷酸：
不含有碱基胞嘧啶或其类似物，或者只是在5’-CpG-3’中，或者只是在对于与样品DNA杂交非必需的区域中含有，
或者不含有碱基鸟嘌呤，或者只在5’-CpG-3’中或在对于与样品DNA杂交非必需的区域中含有。
在这方面，根据本发明优选地，用亚硫酸氢盐处理并扩增的DNA样品
与以公知方式固定于一种表面上的寡核苷酸杂交，使得对于该表面的每一点来说，都已知在该点上存在哪种寡核苷酸序列，仅在寡核苷酸和样品DNA在杂交所必需的区域中完全互补时，才发生扩增样品DNA与固定寡核苷酸的杂交，或者只在适当洗涤步骤后保持。
本发明的另一目的是一种试剂盒，其特征在于至少结合上述两种成分(例如，用于扩增已用亚硫酸氢盐处理的DNA扩增的寡核苷酸与为了检测而固定于基质上的寡核苷酸的组合)，用于用亚硫酸氢盐对DNA的处理，如此处理DNA的扩增，和在反应中对哺乳动物基因组超过100个CpG二核苷酸的甲基化状态的检测，使得能进行癌症疾病的临床相关诊断。
该方法解决了极大量的对于细胞行为有诊断性的参数的确定问题。为此，必须阐述一种全新的细胞分析概念，必须将一种全新的评估机制与该分析相结合，而且，数据产生的技术基础必须可以利用。该方法第一次利用胞嘧啶甲基化的信息内容，因此使该目的所需的分析方法和相关评价算法可以利用。根据本发明的方法因此可用于在受遗传缺陷所影响的细胞中发现次要相关基因座位之用途，利用根据现有技术的方法，这些基因座位或者在理论上不能测定，或者具有极大的困难：该方法显示遗传修饰的座位，其(可能的外)遗传改变不含有碱基序列中的任何实际改变。这样，根据本发明的方法使得新治疗策略的靶点可以获得。而且该方法还以这种方式解决变性细胞的分类问题，使得在(外)基因型与表型之间建立比现有技术大大精确或更精确的相关性。另外，根据本发明的方法使得能预测变性细胞可能的未来行为及这些细胞对体内或体外刺激的反应。最后，该方法也有助于为癌症疾病选择最佳治疗方法。而且，该方法使得能对表型相似但基因型不同(到这些差异能通过现有技术检测的程度)的肿瘤细胞的共有遗传和/或生物化学特征进行检测。该方法的权利要求所基于的假设是，最不同的基因型能导致极相似的外基因型，从而导致极相似的表型。因此，所述方法也能够检测肿瘤细胞基因表达中的这些变化，它们不是由碱基序列的改变引起的，或者只是由此间接引起的。
4.根据本发明的方法对特定问题的解决方案详述
所述方法通过现有技术不同方法的组合和改进以一种创新的方式解决了指定的问题。这些方法根据本发明的本来已知的某些修改，用于使之适合于新的需要，这样产生一种全新的总体方法，下面将参照该方法的优选变型描述，并将通过实施例描述该方法。
4.1对于亚硫酸氢盐溶液处理的DNA样品的预处理
以一种本来已知的方式进行基本方法步骤，如组织或细胞的分离和从后者中对DNA的提取。然而，用于进一步分析的DNA提取将在该方法的优选变型中小量进行，通常，象用亚硫酸氢盐本身处理一样，在油层中进行，这防止与环境接触。该方法的目的在于使DNA的损失降低，使得甚至以非常小的起始量仍可保证可重复的结果。从细胞或组织中对DNA的提取也能如下所述直接在毛细管中进行，在其中能进行随后的所有反应。但是，提取体积的限制不是所述方法的一个必要部分。
提取的DNA现在能以未处理的形式经受亚硫酸氢盐处理，经受剪切，或用限制性内切核酸酶特异切割。
在这点上，根据本发明的方法能再分成两种不同的方法变型。一种变型，其中通过用寡核苷酸杂交进行个别甲基胞嘧啶位置的最终检测，在这点上一般不需要另外的DNA预处理。第二种变型，其特征在于经寡核苷酸与互补于连接体的样品进行DNA样品的全基因组扩增，这些连接体连接于DNA末端并用亚硫酸氢盐处理，该变型需要这些连接体与切割的DNA个别片段的连接。连接体是双链短DNA分子，通常显示一种单链投影。该投影互补于切割的DNA样品的末端，使得，在样品DNA片段的两个末端处能利用适当的连接酶连接上这种连接体。为此目的，必须增加连接体的量，使其以相对于片段末端数量而言过量存在。然而，连接体与样品片段的连接原则上也能在无互补单链投影的情况下进行。各个反应基本上在现有技术之内(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A laboratorymanual)，CSHLP，1989)，因此不再另外描述。连接体与亚硫酸氢盐处理及随后全基因组扩增的组合原理上是创新的，未在文献或专利文献中提及。
4.2亚硫酸氢盐法根据本发明的修改
根据本发明的方法的所有变型的基础是用亚硫酸氢盐对单链DANN修饰的方法。但是，为了使根据本发明的方法的某些变型成为可能，需要对亚硫酸氢盐法作某些修改。
该方法的主要变型一方面不仅基于原材料总量应是微小的这一事实(在有限情况中，只有一个细胞或几十个细胞)，而且基于该方法的几种变型实际上需要微小片段的应用这一事实。另外，根据本发明的方法对于临床诊断的常规应用需要所有方法步骤的自动化，这样使得能达到尽可能高的重复性程度。
亚硫酸氢盐法的所有步骤因此应小量地、完全保护不受“外界”影响地进行。包含在琼脂糖基质中的亚硫酸氢盐反应对于片段扩散已取得进步，但是，该反应仍在极大量亚硫酸氢盐水溶液中进行。结果，重要的小DNA片段能扩散到溶液中，因此无法进一步分析。
根据本发明的方法包括不利用任何额外体积的亚硫酸氢盐法的施行。例如，只以1-10mL的体积在油中进行亚硫酸氢盐反应，并能通过机器人将所有成分直接移至油下，它们在此形成单个液滴，在其中进行随后的所有反应步骤。制备依现有技术所需浓度的亚硫酸氢盐溶液的困难，以及利用较低反应时间与较低亚硫酸氢盐浓度的溶液导致对DNA样品的明显损害这一事实的两难处境，可通过根据本发明的方法得以解决。
该方法利用亚硫酸氢盐反应的不同步骤是平衡反应这一事实。对于两个重要反应步骤：胞嘧啶的磺化和随后的脱氨基作用，这些平衡在不同温度下处于正确的(磺化和脱氨基的)一侧。如果考虑到用于建立个体平衡的动力学，那么显然在变化温度的循环条件下进行亚硫酸氢盐反应是有利的。该方法的一个优选变型包括从4℃(10分钟)到50℃(20分钟)的变化。然而，根据本发明的方法应包括其它所有温度和一定温度下的反应时间。例如，在某些条件下，如果调节大大缩短的反应时间是有利的。在脱氨基步骤(高温度下，50℃)与随后的重复磺化步骤之间插入一个在极高温度下使待测DNA再次变性的步骤也是有用的，并且原理上是新颖的。对于高分子量DNA，变性温度通常＞90℃，但也可能低于该温度，但仍处于该方法的保护范围之内。这有两个原因。一方面，存在检测极短DNA片段的方法变型。另一方面，在每一反应循环中，由于发生的胞嘧啶向尿嘧啶的转化，链间的互补性降低。因此，循环反应方案可能有极复杂的表现。例如，在第一循环中，变性温度可能高于90℃，但在以后的循环中，可能调节为较低的值。在所有情况中，多步反应只能通过进行非常相关的试验系列才能优化。因此，所要求的保护通常涉及循环进行的亚硫酸氢盐反应。
现有技术中对上述问题的其它解决方案基于该方法的一个或多个步骤向毛细管中的转移。大体上存在两种变型：毛细管可以是1)不通透的，或者2)对某些溶剂可能是通透的，象极细的透析管。
根据1)的变型表明，通过可加热可冷却的毛细管能向水溶液中从外部加入如以上实施例所述的含有DNA、亚硫酸氢盐和自由基清除剂的液滴。以该方法，能在毛细管内的液相或气相分离该液滴。然后在毛细管内进行所有反应，并能通过进口接头加入其它试剂。因为根据变型1)的该毛细管对外部完全关闭，所以必须为随后的步骤加入基质溶液，这引起上述问题并且需要根据本发明的解决方案。
根据2)的变型表明，首先，只有DNA溶液能通过多孔的毛细管，该毛细管利用根据本发明的方法步骤或其它方法步骤通过相应的预处理法预处理。毛细管本身能从毛细管内反应步骤所需的容器中通过溶液。具体来说，在该变型中，毛细管内的DNA溶液首先通过亚硫酸氢盐溶液，该溶液另外能经受周期温度改变或恒定温度。在另一个步骤中，亚硫酸氢盐反应完成后，毛细管通过一种透析溶液，然后通过一种碱性溶液，最后通过另一种透析溶液。在毛细管中这些亚硫酸氢盐处理步骤后，提供该方法的另一种变型，其中在相同毛细管中进行其它所有PCR和引物延伸步骤。在通过特殊化学修饰标记用于根据本发明的引物延伸的不同引物时，也能直接在所有这些PCR和引物延伸步骤后在相同毛细管的延长部分中进行毛细管电泳。在电泳中，根据长度分离延伸产物，随后的质谱分析法、层析法或光学分析法根据其标记分离收集的大小级分，从而在第二个分析过程中产生结果光谱或结果层析谱。
毛细管对于亚硫酸氢盐和PCR和/或延伸反应的应用也简化了根据本发明的另一种检测变型。实际上，如以下进一步描述的，扩增后能将片段立即导入毛细管中，在其内侧带有对于单个甲基胞嘧啶特异的寡核苷酸作为杂交配偶体。
该方法的另一种变型基于不通过透析而对高分子量亚硫酸氢盐溶液的去除。该变型的优点是消除了迄今所述变型的其它缺点。
琼脂糖中的每一次透析都使该方法的一部分在大量水溶液中发生。结果，由于扩散存在DNA丢失的危险。在毛细管中进行的变型的一个问题是，在微量DNA的情况中，小百分比DNA片段可能是主要的，其能与毛细管的内壁结合，从而丢失无法分析。
因此，提出下列方法：如述在油层下小量进行DNA提取。在该方法的优选变型中，体积为1μL。自然，该方法基本上不随采用较小量或较大量的体积改变。因此，这些方法也处于要求专利保护的范围之内。(如述)变性了DNA。然后通过加入比适当处理所需略高的较大体积的亚硫酸氢盐溶液(例如4μL)增加所需亚硫酸氢盐的浓度，使得所需的终浓度和pH在油下自动确定。随后以所述方式之一进行亚硫酸氢盐反应。
在下一个方法步骤中(在根据本发明的一种优选变型中)，向溶液中加入小摩尔量的盐，例如氢氧化钡，其阳离子与亚硫酸氢盐形成一种不可溶的盐，于是在溶液中沉淀。该溶液的加入也使pH增至能使在第一个反应步骤中磺化并脱氨基化的胞嘧啶发生脱磺酸基的值。在极快速发生的脱磺酸基反应中，沉淀的亚硫酸氢盐能通过短暂离心在样品水溶液中分离。然而，优选的是使用具有下列特性的盐。其阳离子与亚硫酸氢盐形成一种盐，该盐甚至在扩增过程的条件下仍是不可溶的，并且对扩增过程绝无有害作用。另外，不以这种方法在溶液中沉淀的离子中，没有一种离子的量使得存在的离子量妨碍扩增过程。而且，这些盐在扩增过程中的可能的干扰也能通过使用极精细制备、并且也能极精确地移入的盐溶液来阻止。等量盐的使用导致潜在干扰离子的数量减少。补充至随后扩增缓冲液中的亚硫酸氢钾和其它平衡离子的使用也简化了以下对于扩增反应所述的缓冲液改变。
在下一个方法步骤中，向油下加入具有下列特性的另外体积的溶液。盐组分是，在与位于油下的处理DNA溶液混合过程中，能达到允许酶扩增方法的盐浓度和pH值。就此而言，能使用任何来源的所有热稳定聚合酶。所用聚合酶的类型不是关键的，也可能随存在的缓冲液条件而不同，因此对所有这些聚合酶的应用要求专利保护。其次，该溶液含有这种聚合酶、所有核苷酸和所需的寡核苷酸引物。加入该溶液后，能在相同反应容器中直接进行扩增。这样，在所有过程中与“外界”的接触是不可能的；甚至无最小量样品丢失。
4.3亚硫酸氢盐处理的DNA的全基因组通用扩增
每一情况中，对上千到上百万甲基胞嘧啶位置的检测需要样品基因组大百分比的所有可能序列的扩增。如同在“预处理”部分中所做的那样，根据本发明的方法的这一部分应当再分为两个原理不同的变型。
这些方法步骤的第一个变型基于亚硫酸氢盐处理之前连接体与片段DNA的连接。最简单的形式，为此目的使用一种互补于连接体序列并在亚硫酸氢盐处理后出现的寡核苷酸。在该方法中，该寡核苷酸能与连接体序列的任一区域杂交。在具有这些成分的聚合酶反应中，理论上引起在两端具有连接体的所有片段的扩增。例如，这可能是引起限制性内切核酸酶预先切割的所有片段。然而，对于该方法的某些变型，由于一次这样的扩增只产生有限数量的个别片段，所以有必要在小量扩增循环后将该反应再分为不同的部分反应。这些部分反应现在可用寡核苷酸进行，少数这些寡核苷酸从适当的连接体序列即1-4个碱基延伸到不同片段的未知序列中。对不同反应以如下方法选择寡核苷酸，使每一种覆盖所有可能未知序列的一部分，使得不同反应中所有这些寡核苷酸的总体上包括理论上可能位于已知连接体序列之后的所有可能序列。例如，能建立四个反应，其中第一个反应的寡核苷酸在3’端在已知连接体互补序列之后含有碱基腺嘌呤，第二个反应中为胞嘧啶，第三个反应中为鸟嘌呤，第四个反应中为胸腺嘧啶。该原理自然也适用于超过4个的不同反应，其中寡核苷酸3’端的序列包含超过一个的碱基。寡核苷酸3’端的位置也能表示所谓的简并位置。这意味着，在一个位置中，具有相似效率的超过一个的碱基与寡核苷酸相连接，或者两个或多个寡核苷酸与非简并序列混合。因此，能用不是4的幂次方的反应总数覆盖所有可能的序列。
这样，在每一反应中能扩增所有片段的亚群，导致更高的可靠性和个别片段的更高扩增。原则上，反应的逐步细分也是可能的，这样，只用覆盖所有序列的一种寡核苷酸进行第一个扩增循环，随后的反应再分为例如每一反应含有一个特异3’碱基的四个反应，随后是几个另外的扩增循环，再之后是一个或多个细分。此处的一个关键点是所加入的寡核苷酸量的精确测定。理想地，向每一系列扩增循环中加入一定量的寡核苷酸，使其在反应过程中完全或几乎完全耗尽。然后能将每一循环的反应混合物直接或自动地转移到其它步骤。
具有不同原理的备择变型不需要连接体与预切割DNA的预先连接。在现有技术中指定了几种方法，它们不同程度地成功实现了DNA的全基因组扩增。所有这些方法都必须根据本发明的方法而改变。我们测试了三种不同方法的应用。首先，作为一种优选变型，我们应用所述“DOPE”技术的改进方法。与文献中所述方法不同，我们在每一次扩增中使用两种或多种不同的寡核苷酸，这些寡核苷酸能再分为两类。这些类别的特征在于，一类中的碱基鸟嘌呤和另一类中的碱基胞嘧啶不存在、或几乎不存在、或只存在于5’区中。如果这些碱基完全存在于这些寡核苷酸序列中，那么它们通常在5’-CpG-3’序列中。此目的在于，这两类中的每一类寡核苷酸杂交于亚硫酸氢盐处理后出现的两条(富含G的)链上，或利用聚合酶反应从这些链拷贝的(富含C的)相对链上。通过结合这两种序列类别的代表，于是可能实现亚硫酸氢盐处理的DNA的扩增。在大多数情况中，5’-CpG-3’序列之外的胞嘧啶在模板DNA中应当转变为尿嘧啶，使得对于可与亚硫酸氢盐处理链杂交的寡核苷酸的有效扩增不需要鸟嘌呤。在相对链上，这同样适宜于鸟嘌呤。在这几类寡核苷酸中，如果鸟嘌呤或胞嘧啶存在于5’-CpG-3’中，则引起这些寡核苷酸也能与潜在甲基化位置杂交的可能性。对于所述方法，这是无用的。然而，恰好其缺点不多，使得也能以这种方式实行该方法的相当多的部分。因此，保护范围应当也包括这些寡核苷酸。也同样构思5’-CpG-3’之外位置中存在的个别鸟嘌呤，尽管原则上这趋向于不利于该方法的有效实行。在扩增所必需的寡核苷酸与靶DNA的杂交过程中，这通常导致产生未碱基配对的位置，这在大多数情况中降低了扩增效率，因而是不希望的。然而，利用含有一个或少数几个鸟嘌呤碱基的寡核苷酸对该链的扩增是可能的，虽然不是理想的。由于这种扩增仍能完成本发明的主体，所以由于几种鸟嘌呤的应用而严格地不属于该类别的这些寡核苷酸的应用也应在保护范围之内。我们特别使用第二种技术，其需要这一类型的例外。在该技术中，使用原则上其3’区属于所述序列类别之一的寡核苷酸。而在这些寡核苷酸的5’区，连接有一种所谓的“序列标记”，它在随后步骤中用于进一步扩增。在该变型中，在第一循环扩增中，用原则上属于上述类别之一的寡核苷酸的3’区扩增大量片段。在之后的步骤中，至此扩增的每一片段在3’端都具有对应于序列标记的序列。类似于利用互补于连接体的寡核苷酸的扩增，这些序列然后能用作一种用于其它扩增的寡核苷酸的杂交配偶体。自然地，此第一种寡核苷酸的序列标记可能在寡核苷酸的5’区中含有鸟嘌呤，其3’区属于第一类，在5’区中含有胞嘧啶，其属于第二类。
寡核苷酸，或根据其3’区属于两类之一的寡核苷酸，能不同地构建。我们的DOPE法的变型使用两种序列类别的寡核苷酸的组合，其在3’区显示一种预先确定的碱基序列。在根据本发明的方法中，该碱基序列可能具有2-20个碱基的长度。在此序列之前，第一类具有通常5-20个碱基长度的“H”位置部分，而第二类具有“D”位置。这意味着，在寡核苷酸的合成中，在“H”类中向这些位置中掺入三种碱基A、C或T之一，而在“D”类中掺入A、G或T之一(其中不影响本发明主体的上述例外应在保护之内)。在该部分(5’)之前，可能(但不是必定)有具有特异序列的另一部分。如果在与亚硫酸氢盐处理DNA扩增的相应条件下使用这些寡核苷酸，那么能用可重复的方式扩增一小部分完整基因组，它们可能确定为覆盖寡核苷酸的特定区域。在使用序列标记的情况中，寡核苷酸的5’区能具有一种规定的序列，这突破了两种序列类别的定义。如果寡核苷酸在3’区含有“H”和“D”区，或者如果它们含有以任一形式与“H”或“D”类交替的特定碱基位置，那么寡核苷酸也应包括于对总方法的保护范围之内。
此外，保护范围也应当包括用作扩增引物的寡核苷酸，它们在该方法的总概念中使用，并且在其5’端形成“发夹”结构；表现与以上描述中所隐含碱基对行为类似的碱基对行为的分子，例如，基于PNA(蛋白质-核酸)的寡核苷酸、化学修饰的寡核苷酸；以及用天然核苷酸之外的核苷酸合成的修饰或未修饰的寡核苷酸。
4.4CpG二核苷酸甲基化状态的检测
4.4.1在DNA芯片上对甲基化CpG二核苷酸的检测
以其最终形式，根据本发明的方法于DNA芯片的应用。因此，DNA芯片的应用表示该方法的一种优选变型。原则上，该方法的所有所述变型都可能达到亚硫酸氢盐处理的DNA的扩增。在优选变型中，用于实现该方法的芯片具有下列形式：在为此目的提供的一个表面上，以公知的方法原位合成至少一千个、通常超过十万个寡核苷酸，或者应用微量加液器或毫微量加液器(nanopipette)、图章样装置或微观流体(microfluidic)网络。每种寡核苷酸对于一个CpG位置是特异的；这意味着，如果寡核苷酸所含CpG位置被甲基化，或者只有该位置特异地未被甲基化时，它才能与靶DNA杂交。因此，对于每一位置，能应用至少(见下)两种寡核苷酸。不同寡核苷酸的数量没有上限，它甚至能高于基因组中所含CpG二核苷酸的8倍。对于DNA芯片的每一点，精确地知道何种寡核苷酸序列位于此处。
根据本发明的方法导致这种DNA芯片正常占据的必要修饰。在根据现有技术的DNA芯片上，具有与基因组或表达序列互补的寡核苷酸。这意味着所有寡核苷酸平均而言对应于基因组DNA的碱基组成或生物表达序列的碱基组成。对于位于这种DNA芯片上的大多数寡核苷酸，即，全部四种碱基，平均而言，鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的比例符合基因组和/或表达序列的比例。
这种情况在根据本发明的方法中有所不同。原则上，能为寡核苷酸所覆盖的每一序列合成8类寡核苷酸。由于亚硫酸氢盐处理，DNA被修饰，使得最初互补的上链和下链(Watson和Crick链，也称为编码链和模板链)现在不再互补。这意味着能为两条链合成寡核苷酸。这种可能性是存在的，因为能以这种方式用两条链作为彼此的内部控制。由于序列中的部分显著差异，两条不同链与适于每种情况的寡核苷酸的杂交行为是不同的。其结果是，当对两条链达到相同结果时，可认为这已经独立地得到证实。也应当定量所测每一位置处甲基胞嘧啶和胞嘧啶的量。由于对每一个CpG位置的不同杂交事件的评估，两条链的使用使得能对不依赖于寡核苷酸不同杂交参数的数据定量。背景误差因而减至最小。
亚硫酸氢盐处理后，不只两条链不同，因为，在处理后，在每种情况中进行扩增，这在两条链中每一条处实现互补相对链的新的合成。就象亚硫酸氢盐处理后原始链彼此不互补一样，两条相对链彼此也不互补。在扩增中新合成的一条相对链也不与最初不同的链(不能合成相对链的那条)互补。因此，对每一单个CpG位置产生两个不同的杂交靶。这四条链全部含有(在此我们假定对称的甲基化，即两条链上CpG位置都甲基化)相同的信息，但它们与具有不同序列的寡核苷酸杂交。这样，在任一CpG位置上获得的每一条信息都得到四次独立地证实。然而，四种不同寡核苷酸的信号强度不能与一个位置的甲基化程度直接相关(除了利用系统产生的实验值之外)。实际上，情况是，也在酶促扩增中不同效率地扩增不同的片段，因而信号强度不必与甲基化程度相关联，而是应与含有CpG位置的片段的扩增效率相关。因此，在每种情况中，必须对所有四条链分析两种可能的寡核苷酸，一方面是只有当所测CpG位置甲基化时才杂交的寡核苷酸(含有CpG)，另一方面是只有在非甲基化CpG位置时才杂交的寡核苷酸(因而不含有CpG)。DNA链的两种可能的变体，即甲基化和非甲基化变体，能以基本相同的效率扩增，于是可以比较。由于对于全部四条链的互补信息现在都可以获得，所以也能用所有四条链证实总的结果。在根据本发明的方法中，与其它方法区别寡核苷酸的主要标准是，在每种情况中它们只含有四种碱基中的三种。互补于原始DNA链的寡核苷酸只含有碱基C，而不含碱基G。所有这些寡核苷酸中只有一半正好含有一个鸟嘌呤，即恰好在其甲基化状态待测的位置处的CpG中。相反，扩增中产生的、互补于原始DNA相对链的第二类寡核苷酸只在其甲基化状态待测的位置中含有碱基胞嘧啶。那些在待测位置未甲基化时只可与靶DNA杂交的寡核苷酸既不含有胞嘧啶也不含有鸟嘌呤(取决于链)。自然地，在所述方法中，所述的8类寡核苷酸在其它方面也可能是变化的。也能同时使用一类的几个代表，用于可能甲基化的每一单个位置的检测。例如，在每种情况中多少碱基包含于寡核苷酸每一侧的潜在甲基位置的每一侧是不清楚的。能被甲基化的位置不是必须恰好位于寡核苷酸的中间。因此，对于所测的每一位置，多种排列是可能的。
在极端的例子中，所测位置位于寡核苷酸末端之一，或者(尽管已经是该方法另一变型的组分)甚至3’端后的一个位置，使得胞嘧啶或鸟嘌呤(因而原始样品甲基化)的存在不是通过简单的杂交检测，而是通过引物延伸检测。在该方法变型中，向靶DNA加入对于四种核苷酸的每一种有不同标记的修饰核苷酸三磷酸(这样修饰使得尽管这种核苷酸在引物3’末端的掺入是可能的，但经过该核苷酸的其它延伸是不可能的。通常，在此使用四种核苷酸三磷酸的2’，3’-双脱氧类似物)，然后在芯片上与寡核苷酸杂交。代替直接检测杂交，加入聚合酶，在每一位置处恰好一种核苷酸在寡核苷酸的3’末端合成。与掺入核苷酸3’末端的核苷酸互补的核苷酸恰好对应于位于靶DNA上的核苷酸，该靶DNA可在该寡核苷酸一个5’位置之前与寡核苷酸杂交。在我们的方法中，该位置是原始DNA中的一个位置，它可能被甲基化。因此，当(取决于链)DNA样品中的位置甲基化时，C位于该位置处；于是G被“加入”该寡核苷酸中。如果dGTP(或该核苷酸的类似物)现在被明确标记，并且(这是前提条件)所有位置的寡核苷酸序列都已知，那么在此情况中，能用对鸟嘌呤掺入的检测来检测原始样品中甲基的存在。如果腺嘌呤与相同的寡核苷酸相连接，则对胸腺嘧啶的检测已经成功，并且，出于同样原因，已经证明所检测的位置未甲基化。除了用标记的ddNTP胞嘧啶和胸腺嘧啶之外，在扩增制备的相对链上能进行相同的证明。在该方法变型中，两种序列类别的寡核苷酸既不含有胞嘧啶也不含有鸟嘌呤。然而，在例外情况中(例如，当众所周知一个位置总是甲基化或总是非甲基化时，或者如果该位置的甲基化状态对寡核苷酸的杂交行为无影响)这条规律可被打破。此外，寡核苷酸内的一个或几个“错配位置”能满足该方法的基本需要，尽管事实是它们通常具有有害影响。因此，严格地讲不属于该序列类别但能满足该方法主要部分的寡核苷酸应当包括于专利保护范围之内。另外，寡核苷酸与DNA芯片表面的附着能通过寡核苷酸上的序列标记发生，该标记与附着于表面上的寡核苷酸的通用序列互补。这些寡核苷酸只在适用于与DNA样品杂交的区域中属于一定的序列类别。此外，如果它们具有与以上描述中所隐含的碱基对行为类似的碱基对行为，则在DNA芯片表面上用作杂交配偶体的寡核苷酸也应当包括于保护范围之内，例如，基于PNA(蛋白质-核酸)的寡核苷酸、化学修饰的寡核苷酸和用天然核苷酸之外的核苷酸合成的修饰或未修饰的寡核苷酸。
这自然也适用于该方法的所有变型，它们基于寡核苷酸与所测位置或只与引物延伸上一个碱基的直接杂交：通常，只检测一个位置，而且该位置也包含寡核苷酸的完整胞嘧啶或鸟嘌呤含量。然而，该规律的例外可能在个别情况中无意义，因此它们也是本发明的一个目的。
也能用多种方法实现在DNA芯片上引物延伸反应中对不同标记的核苷酸类似物的检测(它们可能是任何程度地简并的)。一种优选变型是，利用CCD照相机以一种公知的方式检测，CCD照相机记录表明(天然荧光标记的)核苷酸已经与芯片结合的荧光信号。在这点上，在该方法的上述变型中，每一种核苷酸类似物都用不同颜色标记，使得能检测在每一位置掺入了何种核苷酸。
然而，另一个重要变型包括用一种化学分子标记四种核苷酸类似物中的每一种，然后通过暴露于MALDI-TOF的激光照射与核苷酸光化学分离(或者通过产生的热，或类似的方法)，然后直接离子化并测定其分子量。MALDI-TOF装置的激光能精确地导向芯片的每一位置，因此对于芯片上的每一位置也能确定在所述位置发生哪种重量改变。通常(因为在该变型中甲基化和非甲基化的靶DNA可与相同寡核苷酸杂交，并可通过所掺入核苷酸的标记来测定甲基化状态)，在每一位置检测到两种标记(这自然地也适用于荧光标记)，这两种信号必须定量，并且互相比较，来测定甲基化程度。
然而，在当前优选的方法变型中，使用根据荧光的检测。此外，也可直接检测杂交，而不进行引物延伸反应。
4.4.2通过“引物延伸”产物长度的质谱测定对胞嘧啶甲基化状态的检测
发展了该方法的一个变型，其使得能通过用基于MALDI的质谱分析仪对长度的质谱测定，来检测亚硫酸氢盐处理的DNA样品中的极大量胞嘧啶和/或鸟嘌呤。以上已经叙述了为该方法改进的该技术的基础。
在所述方法中，我们使用因为属于上述两种序列类别之一而最大可能性地只与亚硫酸氢盐处理的DNA两条链之一杂交的寡核苷酸。在该方法变型中使用的寡核苷酸，能实现从通过上述任一扩增方法制备的扩增混合物中检测胞嘧啶和/或鸟嘌呤。这意味着，原则上能使用与亚硫酸氢盐处理前与样品片段连接的连接体互补的寡核苷酸，以及在以其它方式扩增的片段上不确定位置处杂交的寡核苷酸。
该方法的优选变型包括连接体与其限制片段连接(然后在亚硫酸氢盐处理后扩增)的DNA样品的使用，或者用在5’区含有固定序列标记的寡核苷酸扩增的DNA样品。为此合成连接体，使得两条链(即，原始亚硫酸氢盐修饰链和扩增中新合成的链)在亚硫酸氢盐处理后，其胞嘧啶或鸟嘌呤含量不同，使得能制备特异识别两条链之一、用于引物延伸反应的寡核苷酸。这意味着，同样在此情况中，能区分寡核苷酸的两种序列类别。所用寡核苷酸具有下列特性，其3’区经过已知连接体序列，经过限制性内切核酸酶所识别的序列，因而经过已知序列，延伸到DNA样品的未知区域。假如在连续细分的分开反应中进行如上所述具有寡核苷酸逐步延伸的通用扩增，那么此处所述的寡核苷酸也延伸到该已知区之外。在这点上，寡核苷酸能延伸到未知区中2-20个碱基。现在再分从第一个或从第一次通用扩增中获得的片段的混合，并与每一(亚)反应的不同寡核苷酸混合。在每一亚反应中，已知加入何种寡核苷酸，亚反应只在必须加入的寡核苷酸的序列方面不同。寡核苷酸序列是否精确确定，或者各个位置是否为上述简并核苷酸位置“H”或“D”所占据，在此都不是关键的。简并位置的应用允许延伸到未知区的更长区域的应用，因而允许对这种反应产生的延伸片段数量与类型进行可能更精确的调节和增加。
利用所有不同的亚反应，进行具有下列成分的聚合酶反应。那些含有可与胞嘧啶缺乏链(对应于亚硫酸氢盐处理的DNA的原始链)杂交的寡核苷酸的反应，含有核苷酸dATP、dCTP、dTTP，和就碱基对行为而言类似于核苷酸dGTP的终止子，如ddGTP或功能相当的核苷酸。具有其它序列类别寡核苷酸的反应含有一种混合物，它由dATP、dGTP、dTTP和在碱基对行为方面类似于核苷酸dGTP的终止剂如ddCTP或功能相当的核苷酸组成。然后用聚合酶反应合成一条新DNA链，其开始于该寡核苷酸，在一条(胞嘧啶缺乏的)链上只可达第一个胞嘧啶，在另一条链上可达第一个鸟嘌呤。
对于质谱分析，用通过化学法以已知方式修饰的核苷酸代替天然存在的核苷酸也是合适的，以利于随后通过质谱法对延伸产物的分析。为此，在我们的变型中，使用天然核苷酸的硫代磷酸(phosphothioate)类似物。它们能在随后的步骤中烷化，这消除了DNA的回加(backloading)，并提高了分析的质量和灵敏度。然而，如果为此目的，其它修改也处于保护范围之内。而且，能改进或修改所用寡核苷酸加样的修改，及其杂交特性。
该方法变型的目的是在各个反应中片段群的制备，它们如此复杂，或者只有如此复杂，才能通过凝胶电泳或更精确地通过根据长度的质谱分析分离。结果，有必要在延伸到未知序列范围中的寡核苷酸部分的长度上调节合成片段的数量及简并程度，这样使得在每一反应中为一个片段到可能高达几千个不同片段。
现今在优选变型中将各个反应分开应用于质谱分析仪离子源的规定座标中。然后用质谱分析法测定各个座标的片段谱。在质谱分析仪离子源上高达几千个座标、每个谱几百个片段的情况中，其每一个都将胞嘧啶或鸟嘌呤位置估计为甲基化指示，估计高达几十万个个别的CpG二核苷酸也是可能的。
以相似的方式，也能对从片段群产生中的片段谱进行检测，该片段群通过上述寡核苷酸引物不经连接体的连接扩增。在该变型的情况中，省略互补于连接体的序列，代之以使用含有几个简并位置的5’区。
在用3’区中含有上述(5’)序列标记的寡核苷酸预扩增亚硫酸氢盐处理的DNA时，如上一节所述，也能用类似于连接体序列的DNA作为与寡核苷酸杂交的恒定区。
4.4.4通过化学修饰寡核苷酸的质谱检测对胞嘧啶甲基化状态的检测
该方法的另一种变型使用一种本来已知的方法，它使得能通过对用于寡核苷酸的化学修饰的检测对某些序列间接进行质谱鉴定。
在上述质谱检测变型中，进行许多不同的引物延伸反应，其中每一个都含有一种或几种寡核苷酸序列。原则上，只有通过再分为许多不同的反应(和MALDI离子源上的座标)，才能达到可分析的不同片段的最大数量。
如果对每一引物序列使用化学修饰，那么，在使用单独MALDI之外的另一种分析技术情况中，能省略该分离。
实践中，这意味着使用的所有不同引物在合成之中或之后都具有这种化学；原则上，这种化学满足两个需要。一方面，根据所产生片段长度的分离不可被阻止。另一方面，在毛细管电泳后的第二个分析步骤中，修饰类型必须能够允许识别根据长度的分离。因此，修饰类型取决于第二步中的分析类型。在优选的实施方案变型中，引物的5’末端具有短肽序列，其能在随后的步骤中通过多种常规分析方法分离。这种变型的最大优点之一是，甚至在第一个非特异扩增步骤中，也必须扩增相当小总量的DNA，因为此数量不再需要分散于其它反应中。在上述变型中通过向各个反应分离而实现的第二维分离，能在该方法的优选变型中通过根据本发明的方法的实施来实现，其中首先通过毛细管电泳进行所产生片段的分离。就此而言，只要还有一种根据长度的分离仍是可能的，那么片段的化学修饰影响或不影响片段的迁移行为对于正确结果都不是关键的。在达到毛细管电泳终点的每一“部分”中，发现许多具有相同电泳迁移行为的片段，它们只在各自5’区(在引物区，其用于延伸反应)的化学修饰方面不同。现在在第二步中对根据电泳迁移行为分离的这些片段群检查化学修饰的存在。该方法的优选变型是毛细管电泳输出体积在高速原子轰击(FAB-MS)、电子喷射电离(ESI-MS)中的直接注射、向MALDI质谱仪或相当的分析装置上的应用。
具体说来，例如，如下进行这种变型。如述从细胞中制备DNA，用限制性内切核酸酶预切割，添加连接体，并通过能渗透小分子的可加热毛细管，在其中通过以透析加入及去除试剂进行亚硫酸氢盐反应的反应步骤。此处总反应的体积是微量的。完成亚硫酸氢盐反应后，毛细管通过与其它入口毛细管交叉连接能获得扩增所需的试剂，然后能在相同的可加热毛细管中进行扩增。然而，不在毛细管中直接进行而在与这些毛细管相连的容器中进行扩增也是可能的。基因组部分的通用扩增后，如述进行第二个线性延伸步骤，该步骤用化学修饰寡核苷酸的混合物进行，因此该寡核苷酸能根据其重量区分，并且互补于亚硫酸氢盐修饰的连接体。下一步是在毛细管另一部分中根据延伸产物长度的分离，以及可能地，对适合于质谱分析的缓冲液如硫酸铵的另一次透析。
将每一单个部分加于质谱分析仪离子源的座标上，然后对每一座标检查化学修饰的存在，这根据其重量区分。在该变型中，为了适合设备，优选地使用具有极大离子源的MALDI-TOF，这使得短时间连续应用极大量的不同座标成为可能。
能获得该方法的其它变型，因为事实是，一般地说所述方法在二维平面上产生所有测定点，如此处所述，这是详细描述测定点数量的必要条件。在MALDI-TOF离子源上对各个“亚反应”分析的所述变型中，这二维测定点在DNA芯片上空间排列。在毛细管电泳变型中，通过以不同标准区分的两种分离方法的连续连接达到二维。这种方法存在其它几种变型，因为它们对应于根据本发明的总概念，所以它们应处于保护之中。对于在根据本发明的方法中在极大量点处进行的测定，知道每一测定点的来源不是绝对必要的。对于该方法的许多应用，足以将大量抽象数据与细胞的表型性质相关联。结果，存在相当多的可能的分析方法。然而，通常毛细管电泳在所有变型中都是必要的，其中通过间接法检测发生的杂交结果(结果本身为分析的一维)。
4.5通用数据的分析
主要的权利要求通常涉及复杂甲基化指纹的制备方法，及利用评估算法与所检细胞表型特征相关联的方法。然而，专利保护应当也适用于所有适合甲基化数据产生的方法，其目的在于根据本发明对这些数据进行评估，因为结合数据的产生和应用是实际上达到发明活动水平的因素。
在上述所有方法步骤的最后，大量测定点是可获得的。能产生三种不同类型的值。位置的纯粹加-减信号(在所有分析的染色体上以甲基化或非甲基化形式存在)，或许不能构成能被甲基化的可检测位置的最大部分。大量位置将产生这类信号，必须用上述方法描述。
原则上，对纯粹加-减信号的分析相当简单。分析策略如下。在大量试验中从已知来源的多种不同DNA样品(例如，通过免疫荧光分离的相同表型的抗体标记细胞)中产生数据，并检测其重复性。用逻辑方法将不产生可重复结果的位置与所有其它所有位置分开，因为，在第一步中不进行评估来确定各个位置的差异是否是生物学显著的。这些试验系列对不同类型的细胞进行。这些试验系列的结果应当是大量的现在仍未知的CpG二核苷酸，与任一对细胞型相比，其产生甲基化状态的可重复差异。不是所有在两种细胞型直接比较中不同的位置在关于其差异的所有对比中都是信息性的。如果现在分析在至少一种细胞型对比中可区分的所有位置，那么对于每种所试细胞型都能建立一种特征模式。这样，未知来源的DNA样品能被指定为一种细胞型。这些模式在所有试验位置中不必都是固定的。此时，不能评价(根据本发明的方法实际上首次为这种评价提供了基础)个体样品细胞型的甲基化模式与特征模式偏离到何种程度。
在理想情况下，每个细胞型和个体产生的模式是固定的，以致不经大量消耗即能鉴定这种组织。然后能将具有指定特征信号座标的预定基质直接将样品指定为一种细胞型。在最复杂的情况中，不是一种细胞型特有的可定义信号模式，而是具有许多这样的模式，它们基本上是特有的，但显然不能这样鉴别。实际上，这可能来源于甲基化分析的现有技术，似乎非常不同的模式具有极相似的功能是可能的。然而，此时不能就其困难程度发表声明，因为本发明的方法实际上首次使评估这种情况的可能性成为可能。因此，情况可能是，利用常规方法，如同“目视检查”，不能将样品指定为一种来源。在此情况中，所述方法包括用试验系列中测定的数据“训练”“神经网络”(NN)的可能性。实践中，这看起来如下：用细胞DNA样品进行极大量试验系列，并注入NN的输入电平。同时，利用样品的甲基化数据，为NN提供关于样品来源的信息。在足够数量的试验后，神经网络能知道，例如，何种模式属于何种细胞型。这样，这些极其复杂且显然不清楚的模式能得以归类，对于人类理解和常规算法而言它们似乎是完全混乱的。
然而，如述，还不能预测产生的模式表面上是如何复杂和明显混乱的。所述的每一种情况都是可能的。因此，为了能够分类未知来源的所用细胞型，在试验系列中对已知来源的细胞型指定复杂甲基化模式的每种方法都是本发明的目的。
在对异常来源细胞的分析中，数据的分析肯定将成为更复杂的。所述方法的目的在于允许对未知疾病细胞型的分类。利用所检样品的甲基化数据，试验系列中所检细胞的表型参数对于NN和/或其它评估系统必须是可利用的，在这方面，首先根本不清楚这些表型数据中的哪些需要与甲基化模式相关联，和哪些可在这种关联中产生合理的数据。在这些情况下，来源于明显混乱的—尽管原则上是可分类的—数据量的困难增多。对于变性细胞，不同外基因型状态可导致相似的表型特征。这些情况可通过NN特别好地识别，于是能导致新的、精确区分的表型的定义，这是所述方法的主要目的之一。因此，在专利保护中明确包括不同神经网络类型在甲基化模式与表型数据相关的甲基化数据分析中的应用是所希望的。然而，较简单的情况也能实现本发明的主体，因此它们也不应被排除于专利保护之外。

Claims (21)

1.组织和细胞型的表征、分类和鉴别方法，用于对组织和细胞群行为的预测，并用于对具有改变表达的基因的鉴定，其特征在于：
在从任一组织样品中获得的、未受处理、经受剪切或通过限制性内切核酸酶切割的基因组DNA中，将碱基胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶经亚硫酸氢盐溶液处理转化为尿嘧啶，
利用极短寡核苷酸或简并性寡核苷酸或互补于连接体寡核苷酸的寡核苷酸，扩增这样处理的基因组DNA的级分，其中极短寡核苷如此短以致于超过100个不同片段得到扩增，其中简并性寡核苷酸含有如此多的简并位置，使得扩增中超过100个不同片段得到扩增，其中连接体寡核苷酸在亚硫酸氢盐处理之前已与切割或剪切的基因组DNA的末端连接，
得自扩增级分的富含鸟嘌呤DNA链上剩余的胞嘧啶，和/或得自扩增级分的富含胞嘧啶DNA链上的鸟嘌呤的量通过杂交或聚合酶反应检测，藉此实现其表征、分类和鉴别。
2.组织和细胞型的表征、分类和鉴别方法，用于对组织和细胞群行为的预测，并用于对具有改变表达的基因的鉴定，其特征在于：
在从任一组织样品中获得的、已经受处理、经剪切或通过限制性内切核酸酶切割的基因组DNA中，将碱基胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶经亚硫酸氢盐溶液处理转化为尿嘧啶，
利用极短寡核苷酸或简并性寡核苷酸或互补于连接体寡核苷酸的寡核苷酸，扩增这样处理的基因组DNA的级分，其中极短寡核苷如此短以致于超过100个不同片段得到扩增，其中简并性寡核苷酸含有如此多的简并位置，使得扩增中超过100个不同片段得到扩增，其中连接体寡核苷酸在亚硫酸氢盐处理之前已与切割或剪切的基因组DNA的末端连接，
得自扩增级分的富含鸟嘌呤DNA链上所剩余的胞嘧啶的量，和/或得自扩增级分的富含胞嘧啶的DNA链上的鸟嘌呤的量通过杂交或聚合酶反应检测，且
该分析所产生的数据自动应用于处理算法，由此得出关于所分析细胞物质的表型的结论，且藉此实现其表征、分类和鉴别。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于：
从对来源于表型相同或相似细胞或组织的DNA样品之几次或多种这类试验分析中所获得的数据，在训练阶段利用神经网络或其它评估算法与DNA得到检测的细胞的表型相关联；
利用表型与甲基化状态之间的联系，将在该训练阶段中在评估模式中所采纳的数据，用于通过未知来源的DNA样品甲基化状态的产生，得出DNA得到检测的细胞的表型，或者
利用对已知细胞型DNA甲基化状态，将在训练阶段中在评估模式中所采纳的数据，用于鉴定在训练阶段中所测定的已知细胞型之DNA中胞嘧啶位置的甲基化状态与所检测的DNA中胞嘧啶位置的甲基化状态之间的差异。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于在用亚硫酸氢盐处理之前用限制性内切核酸酶切割DNA，该内切核酸酶在识别序列中含有5′-CpG-3′中的胞嘧啶，并且只在这样的识别序列处切割DNA，其中5′-CpG-3′中的胞嘧啶在5′位置为非甲基化形式。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于：
在用亚硫酸氢盐溶液修饰基因组DNA之前，用限制性内切核酸酶切割该基因组DNA，通过连接反应，为产生的末端提供连接体，
互补于已用亚硫酸氢盐处理的连接体的寡核苷酸，用于在亚硫酸氢盐处理后，从这样产生的全部片段中扩增所有DNA片段或亚群。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于：
在用亚硫酸氢盐处理前，将DNA样品转移到只可透过小分子的可加热多孔毛细管中，其中通过透析加入和去除试剂，进行后面的亚硫酸氢盐处理的反应步骤。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于：
在亚硫酸氢盐处理前，将DNA样品转移到不可透过小分子的可加热毛细管中，其中通过经连接的毛细管供应试剂，用于加入和去除试剂，来进行后面的亚硫酸氢盐处理的反应步骤。
8.根据权利要求6或7的方法，其特征在于：在进行亚硫酸氢盐处理的同一毛细管中，或在与该毛细管相连的毛细管中，或在与该毛细管相连的容器中，进行亚硫酸氢盐处理之后的聚合酶反应。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于：在用亚硫酸氢盐处理的DNA样品进行聚合酶反应的毛细管中，再根据所产生片段群的长度进行分离。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于：在亚硫酸氢盐处理后，DNA扩增之前通过沉淀亚硫酸氢盐，从亚硫酸氢盐中分离出亚硫酸氢盐处理的DNA。
11.根据权利要求1的方法，其特征在于：
用于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA样品的扩增之寡核苷酸是两类引物寡核苷酸，其中一类寡核苷酸不含有碱基胞嘧啶，除了在5′-CpG-3′中，或者只是以不影响扩增的量极小程度地含有，或者只在对于扩增非必需的寡核苷酸区域中含有；而另一类寡核苷酸不含有碱基鸟嘌呤，除了在5′-CpG-3′中，或者只是以不影响扩增的量极小程度地含有，或只在对于扩增非必需的寡核苷酸区域中含有，其中这两类引物寡核苷酸
a)应如此短，以致在每次只含有两类中每一类的一种代表的扩增中，超过100个不同片段得到扩增，或者
b)含有如此多所谓的简并位置，使得在只有两类中每一类的一种代表的扩增中，超过100个不同片段得到扩增，或者
c)在一次扩增中使用如此多的两类寡核苷酸的代表，使得超过100个不同片段得到扩增。
12.根据权利要求4或11的方法，其特征在于：
在用于聚合酶反应检测的分离的制剂中，每一反应中将处理并扩增的DNA与不同寡核苷酸混合，这些寡核苷酸在其5′端与连接体互补，或者互补于用于用亚硫酸氢盐处理的核酸扩增的寡核苷酸，
其中所述寡核苷酸在每一反应中在其3′端不同，并且
其可变3′端开始于已知连接体序列或用亚硫酸氢盐处理的寡核苷酸序列的下游，
其可变3′端超过已知连接体序列2-12个核苷酸延伸。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于：
其中用互补于用亚硫酸氢盐处理的DNA的寡核苷酸开始聚合酶反应检测的这些反应中，除了三种核苷酸dATP、dTTP和dCTP之外，还含有：
额外的核苷酸或核苷酸类似物，其互补于碱基胞嘧啶，并且在通过聚合酶掺入后阻断了该链的任何进一步的延伸，或者
不含与碱基胞嘧啶互补的核苷酸或核苷酸类似物。
14.根据权利要求12的方法，其特征在于：
其中用互补于亚硫酸氢盐处理的DNA的寡核苷酸开始聚合酶反应检测的这些反应中，除了三种核苷酸dATP、dTTP和dGTP之外，还含有：
额外的核苷酸或核苷酸类似物，其互补于碱基鸟嘌呤，并且在通过聚合酶掺入后阻断了该链的任何进一步的延伸，或者
不含与碱基鸟嘌呤互补的核苷酸或核苷酸类似物。
15.根据权利要求12的方法，其特征在于：
利用终止剂，在扩增前DNA样品中含有甲基胞嘧啶的位置处终止聚合酶反应检测，所述这些终止剂本身以一种方式被修饰，使得其允许对特异终止的聚合酶反应产物的检测。
16.根据权利要求1的方法，其特征在于：
将各个反应产生的不同片段混合物涂抹于MALDI-TOF或另一种质谱分析仪的离子源的各个点，并通过测定所有DNA片段的重量来测定各个反应的片段组成。
17.根据权利要求1的方法，其特征在于：
将各个反应产生的不同片段混合物在凝胶电泳中加于各个泳道中，并通过测定所有DNA片段的长度来测定各个反应的片段组成。
18.根据权利要求5的方法，其特征在于：利用其开始聚合酶反应检测的寡核苷酸，根据寡核苷酸序列的不同而与不同的化学标记偶联，其中其化学和/或物理性质使得能通过标准层析或质谱分析法对不同标记进行检测和区别。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于：
在第一个扩增步骤中制备的已用亚硫酸氢盐处理的待检DNA的片段部分与两种或多种不同化学标记的寡核苷酸同时混合，这些寡核苷酸在反应制品中用作聚合酶反应检测的引物，由所述聚合酶反应得到的片段的复杂混合物进行根据长度的电泳分离，并且
对电泳产生的片段混合物的各个长度部分进行层析或质谱分析，其在每一长度部分中检测表征寡核苷酸的化学标记的存在与否。
20.根据权利要求1的方法，其特征在于：
在用于检测的杂交中，向一个表面上施加如下的寡核苷酸：
其不含有碱基胞嘧啶，或只在5′-CpG-3′中，或只是在对于与样品DNA杂交非必需的区域中含有，
或者，其不合有碱基鸟嘌呤，或只在5′-CpG-3′中，或在对于与样品DNA杂交非必需的区域中含有。
21.根据权利要求20的方法，其特征在于：
将用亚硫酸氢盐处理并扩增的DNA样品与寡核苷酸杂交，其中该寡核苷酸固定于一种表面上，使所述寡核苷酸可定位于该表面的具体的点，且其中仅在寡核苷酸和样品DNA在杂交所必需的区域中完全互补时，才发生扩增样品DNA与固定的寡核苷酸的杂交。
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