ES2668911T3 - Método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada - Google Patents

Método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada Download PDF

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Abstract

Un método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada, que comprende: poner en contacto una muestra archivada que comprende ADN con una proteasa para proveer una cantidad de ADN tratado con proteasa; tratar el ADN con un reactivo de bisulfito sin una etapa previa de extracción de ADN; purificar el ADN tratado con bisulfito.

Description

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DESCRIPCION
Método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada Campo de la invención
La invención se relaciona en general con métodos para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada (por ejemplo, biopsias de tejido embebidas en parafina y/o fijadas, etc.), y para análisis de la misma.
Antecedentes
Las muestras o biopsias son archivadas muchas veces de forma predeterminada en rutinas de diagnóstico. Esto se hace con el fin de conservar el tejido y para prepararlo para exámenes histológicos subsecuentes. Tal conservación es necesaria para asegurar que la biopsia no haya cambiado después de su remoción, y que los hallazgos observados correspondan con la situación del paciente, y para evitar la degradación de las estructuras celulares. De acuerdo con lo anterior, la muestra de tejido es colocada inmediatamente en un fijador por ejemplo formalina después de la remoción. Después de la fijación la muestra es embebida en parafina, lo cual permite un seccionamiento del tejido y un subsecuente examen histológico adicional.
Usando estos procedimientos, las biopsias son tomadas rutinariamente de pacientes para diagnóstico de enfermedades y/o para estudiar el patrón de marcadores asociados con las enfermedades. Durante las últimas décadas millones de biopsias fueron recolectadas, archivadas y almacenadas de esta manera. Estas muestras representan un recurso principal para la detección o análisis de alteraciones asociadas con trastornos o enfermedades. Por lo tanto estas muestras son invaluables, puesto que permiten la evaluación de indicadores de diagnóstico y/o prognosis en recolecciones retrospectivas.
Pero desafortunadamente, este recurso es accesible solamente de manera mínima por los medios biológicos moleculares, en particular por los métodos más prometedores y modernos tales como aquellos para el análisis del patrón de metilación. Esto se debe a las dificultades en obtener cantidades suficientemente grandes de ADN genómico de alta calidad y bajo coste y con mínimo esfuerzo de manipulación.
Estas dificultades se basan en la degradación del ADN y del ARN debido a las condiciones de fijación y almacenamiento de la muestra o biopsia, y en los métodos insuficientes para la preparación del ADN. Para preservar las estructuras morfológicas en la muestra tanto como sea posible, las biopsias se fijan usualmente muy bien. Esto tiene la desventaja de que una alta cantidad de proteínas están enlazadas covalentemente al ADN genómico y también el ADN genómico se entrecruza. Consecuentemente, el ADN genómico tiende a ser de tamaño de fragmento pequeño, tiene una baja integridad, y es contaminado por proteínas, péptidos y/o aminoácidos los cuales están entrecruzados con el ADN e interfieren con el análisis subsecuente.
La mayor parte de los métodos del arte anterior para el aislamiento del ADN de los tejidos embebidos en parafina fijados con formalina se basan en los métodos de aislamiento de ADN a partir de tejido fresco. Se llevan a cabo de la misma forma en que una persona experimentada en la técnica trataría las muestras frescas quizás con una etapa adicional de remoción de parafina. Por ejemplo, Clark et al. (Diagnostic Virology Protocols, volumen 81,2003, páginas 219-240) divulga la extracción de ADN a partir de muestras de portaobjetos emebidas en parafina utilizando una proteinasa K que contiene regulador de lisis. El ADN extraído es entonces bisulfito convertido y purificado. Como es bien sabido, tal procedimiento lleva solamente a rendimientos comparativamente bajos de ADN genómico, teniendo el ADN sólo una pequeña longitud de fragmento. Adicionalmente, el ADN tampoco es adecuado para métodos de análisis más sofisticados, porque todavía hay una cantidad de proteínas, péptidos y/o aminoácidos interferentes enlazados al ADN.
Se conocen métodos "mejorados" particulares en el arte. Por ejemplo la US 6,248,535 enseña un método para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina. De acuerdo con este método, la muestra se desparafiniza, homogenizada antes de ser calentada en una solución caotrópico. Después de mezclar con cloroformo, después de la centrifugación, la solución tiene tres fases. La interfase contiene el ADN genómico.
Se describe un método diferente en GB 2369822. De acuerdo con esta, se colocan secciones de una muestra embebida en parafina fijada con formalina en un tubo. Se agrega un detergente, una cera y una enzima digestora de tejido, antes de que el tubo sea calentado hasta aproximadamente 60°C durante aproximadamente 30 minutos. Después de esto la enzima es inactivada por un incremento de temperatura hasta 96°C. Una etapa de centrifugación subsecuente lleva a una formación de capas dentro del tubo, conteniendo la capa media el ADN genómico así como el ARN.
Tales métodos llevan usualmente a grandes cantidades de ADN genómico con una cantidad importante de ARN y proteína de contaminantes. Además, los contaminantes no pueden ser removidos fácilmente porque están entrecruzados con el ADN genómico por el fijador. Además, en principio, puede ser posible también aislar fragmentos de ácido nucleico más largos con esta clase de métodos, pero la porción de fragmentos largos es muy pequeña.
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Se han hecho varias propuestas para obtener fragmentos más largos: Bonin et al., enseña una exposición de una escisión de cadena sencilla después del aislamiento del ADN y una etapa de desnaturalización antes de la amplificación por PCR (Bonin S., Petrera, F., Niccolini, B., Stanta, G. (2003) J. Clin Pathol:. Mol. Pathol. 56, 184-186). De acuerdo con este método son amplificables fragmentos de hasta 300 bp. Inadome et al., sugiere el aislamiento de la porción de fragmentos de ADN más largos por HPLC (Inadome, Y., Noguchi, M. (2003) Diagn. Mol. Pathol 12, 231236). Este procedimiento lleva sólo a rendimientos muy bajos de ADN.
Para agrandar la cantidad de fragmentos de ADN largos aislada a partir de tejidos embebidos en parafina, fijados con formalina, Tie et al. y Siwoski et al., sugirieron una amplificación de genoma completo, (Tie, J., Serizawa, Y., Oshida, S., Usami, R., Yoshida Y. (2005) Pathol. Int. 55, 343-347; Siwoski, A., Ishkanian, A., Garnis, C., Zhang, L., Rosin, M., Lam, W.L. (2002) Mod. Pathol. 15, 889-892.). Esta solución tiene la desventaja de una baja reproducibilidad y no es aplicable cuando el ADN va a ser analizado para metilación puesto que la amplificación borra las señales de metilación.
Consecuentemente, el ADN genómico aislado de acuerdo con métodos de la técnica anterior no es adecuado para el análisis del patrón de metilación como se explica en detalle a continuación.
La importancia del análisis del patrón de metilación de ADN ha sido revelada en años recientes. Muchas enfermedades, en particular enfermedades cancerosas, están acompañadas por expresión genética modificada. Esta puede ser una mutación de los genes en sí mismos, la cual lleva a una expresión de proteínas modificadas o a una inhibición o sobreexpresión de las proteínas o enzimas. Una modulación de la expresión sin embargo puede presentarse por modificaciones epigenéticas, en particular, por cambios en el patrón de metilación de ADN. Tales modificaciones epigenéticas no afectan la secuencia de codificación real del ADN. Se ha encontrado que los procesos de metilación de ADN tienen implicaciones sustanciales para la salud, y parece ser claro que el conocimiento acerca de los procesos de metilación y modificaciones del metabolismo de metilo y metilación de ADN son esenciales para el entendimiento de las enfermedades, para la profilaxis, diagnóstico y terapia de las enfermedades.
El control preciso de los genes, el cual representa una pequeña parte solamente del genoma completo de los mamíferos, involucra la regulación en consideración del hecho de que la parte principal del ADN en el genoma no es codificante. La presencia de tales intrones que contienen ADN “troncal”, elementos repetitivos y potencialmente elementos activamente transponibles, requiere mecanismos efectivos para su supresión durable (silenciamiento). Aparentemente, la metilación de citosina por ADN metil transferasas dependientes de S-adenosilmetionina (SAM), las cuales forman 5-metilcitosina, representa un mecanismo tal para la modificación de interacciones ADN-proteína. Los genes pueden ser transcritos por promotores libres de metilación, incluso cuando regiones adyacentes transcritas o no transcritas son ampliamente metiladas. Esto permite el uso y regulación de promotores de genes funcionales, mientras que se ha suprimido el ADN troncal incluyendo los elementos transponibles. La metilación también tiene lugar cabo para la supresión a largo plazo de genes enlazados X y puede llevar bien sea a una reducción o a un incremento del grado de transcripción dependiendo de donde ocurra la metilación en las unidades de transcripción.
Casi la metilación de ADN natural completa en mamíferos está restringida a las secuencias palindrómicas de nucleótido citosina-guanosina (CpG), las cuales son controladas por ADN metil transferasas. Los dinucleótidos CpG son aproximadamente 1 a 2% de todos los dinucleótidos y están concentrados en islas CpG. De acuerdo con una definición reconocida en el arte, una región se considera como una isla CpG cuando el contenido de C+G por encima de 200 bp es al menos 50% y el porcentaje de los dinucleótidos CG observados en comparación con los dinucleótidos CG esperados es mayor de 0.6 (Gardiner-Garden, M., Frommer, M. (1987) J. Mol. Biol. 196, 261-282). Típicamente, las islas CpG tienen al menos 4 dinucleótidos CpG en una secuencia de una longitud de 100 bp.
Las islas CpG localizadas en las regiones promotoras tienen frecuentemente una función reguladora para la expresión del gen correspondiente. Por ejemplo, en el caso de que la isla CpG sea hipometilada, el gen puede ser expresado. Por otro lado, la hipermetilación frecuentemente lleva a una supresión de la expresión. Normalmente los genes supresores de tumores son hipometilados. Pero si se hacen hipermetilados, su expresión se suprime. Esto se observa muchas veces en tejidos tumorales. En contraste, los oncogenes son hipermetilados en tejidos saludables, mientras que son hipometilados muchas veces en tejidos tumorales.
La metilación de la citosina tiene el efecto de que el enlazamiento de la proteína es prohibido normalmente lo cual regula la transcripción de los genes. Esto lleva a una alteración de la expresión del gen. Con respecto al cáncer, la expresión de los genes que regulan la división celular son alteradas por lo tanto, por ejemplo, la expresión de un gen apoptópico es subregulada, mientras que la expresión de un oncógeno es sobrerregulada. Adicionalmente, la hipermetilación puede tener una influencia a largo plazo en la regulación. Las proteínas, las cuales desacetilan las histonas, son capaces de enlazarse a través de su dominio de enlace 5-metilcitosina al ADN cuando las citosinas se metilan. Esto da como resultado una desacetilación de las histonas, lo cual lleva pos sí mismo a un empaquetamiento más apretado del ADN. Debido a esto, las proteínas reguladoras no son precluidas del enlazamiento al aDn.
Necesidad pronunciada en la técnica. La detección eficiente de patrones de metilación de ADN consecuentemente es una herramienta importante para desarrollar nuevas metodologías para entender las enfermedades, para la prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades y para la selección de los objetivos asociados con las enfermedades. Pero por otro lado, los métodos para una detección eficiente de la metilación del ADN requieren estándares de alta calidad con respecto al material de partida del ADN genómico. Preferiblemente, los estándares
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son: i) el rango de fragmento de ADN está entre 150 a 1200 bp; y ii) el ADN está libre de proteínas, péptidos, aminoácidos, ARN, así como nucleótidos o bases asociados o entrecruzados, que no son parte del esqueleto del ADN.
Adicionalmente, también hay requerimientos con respecto a los métodos de acuerdo con los cuales se aísla el ADN. La razón para esto es que una buena cantidad de muestras son analizadas típicamente para el desarrollo de nuevas metodologías para la prevención, diagnóstico y tratamiento de una enfermedad y para la selección de objetivos asociados con la enfermedad. Preferiblemente, los requerimientos son: i) aislamiento de ADN de alta calidad (como se especificó anteriormente); ii) alta reproducibilidad; iii) alta confiabilidad, iv) facilidad de manipulación; v) bajo esfuerzo de manipulación; y vi) bajos costes.
Adicionalmente, puesto que en general la cantidad de muestra de tejido o biopsia es muy pequeña, es necesario que los métodos de preparación de ADN den como resultado altos rendimientos de ADN.
Debido a todos estos requerimientos, y debido a los métodos de la técnica anterior, las muestras archivadas, a pesar de ser un recurso principal en la ciencia médica, pueden ser usadas solo mínimamente para el análisis eficiente de la metilación de ADN. Así existe una necesidad técnica principal para hacer que las muestras archivadas (por ejemplo, tejidos embebidos en parafina fijados con formalina) sean eficientemente disponibles para el análisis de, por ejemplo, los patrones de metilación de ADN.
Hasta ahora, los solicitantes están al tanto de solamente un intento de resolver este problema. La WO03/083107 enseña un método para el aislamiento de ADN genómico a partir de embebidos en parafina adecuado para análisis subsecuente de metilación de ADN por PCR específico para metilación (MSP). En principio la muestra desparafinada fijada en formalina es sometida a ebullición en un regulador de citrato pH 6.0, el cual recupera parte de las citosinas que lo hacen más accesible para el tratamiento y análisis subsecuentes. Sin embargo este método es conflictivo con respecto al objetivo de proveer tantos fragmentos de ADN como sea posible. De acuerdo con este método el ADN es puesto en contacto con un regulador de pH ácido. Tal como es bien conocido en la técnica relevante, tal tratamiento reduce la integridad del ADN resultante en una ruptura aleatoria de la cadena de ADN y por lo tanto en la longitud de los fragmentos de ADN.
Resumen de aspectos de la invención
Los aspectos de la presente invención se refieren a métodos para proveer fragmentos de ADN a partir de una muestra archivada. Los aspectos particulares proporcionan métodos para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada, en donde el rendimiento de ADN antes, por ejemplo, una etapa de amplificación es al menos del 20%, y amplicones hasta una longitud de aproximadamente 1.000 pares de bases son amplificables.
Aspectos adicionales proporcionan un método para la preparación de ADN genómico a partir de muestras de tejido fijadas en formalina, embebidas en parafina, archivadas, por lo que se aíslan altos rendimientos de ADN, así como una porción sustancial del ADN consiste en fragmentos largos de ADN. En aspectos particulares, el ADN genómico aislado está libre de contaminantes asociados o entrecruzados como proteínas, péptidos, aminoácidos o ARN. En aspectos particulares, los métodos se caracterizan por una alta reproducibilidad y alta fiabilidad. En aspectos específicos, los métodos son fáciles de manejar, tienen un bajo esfuerzo de manejo y son rentables.
Las realizaciones particularmente preferidas proporcionan métodos caracterizados además en que Ól
i) el rendimiento de ADN después de una etapa de tratamiento con bisulfito y una etapa de purificación subsecuente y antes de una etapa de amplificación es del 30-50%;
ii) los amplicones de hasta una longitud de 600 pares de bases son amplificables después del tratamiento con bisulfito y la subsecuente purificación; y
iii) en promedio, al menos el 10% de los fragmentos de ADN son amplificables después del tratamiento con bisulfito y la subsecuente purificación en una reacción de PCR que da como resultado fragmentos de al menos 110 pb de longitud.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, las posiciones de muestras de ADN y placas de PCR sobre una estación de trabajo TECAN.
La figura 2 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, resultados de una cuantificación por PCR en tiempo real de ADN bisulfito reunido derivado de diferentes especímenes embebidos en parafina fijados con formalina - Influencia de la concentración de dNTP sobre el rendimiento de PCR (Ejemplo 11).
La figura 3 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, resultados de la cuantificación de PCR en tiempo real de ADN bisulfito reunido derivado de diferentes especímenes embebidos en parafina fijados con formalina - Influencia del tiempo de extensión sobre el rendimiento de pCr (Ejemplo 11).
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La figura 4 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, resultados de cuantificación por PCR en tiempo real de ADN bisulfito reunido derivado de diferentes especímenes embebidos en parafina fijados con formalina - Influencia de la cantidad de polimerasa sobre el rendimiento de PCR (Ejemplo 11).
La figura 5 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, rendimiento de ADN tratado con bisulfito después de la purificación derivado de biopsias de próstata embebidas en parafina fijadas con formalina (Ejemplo 12).
La figura 6 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el contenido de ADN amplificable después del tratamiento con bisulfito y subsecuente purificación (El contenido está definido por la relación de ADN amplificable determinada de acuerdo con el ejemplo 10c y el valor UV determinado de acuerdo con el ejemplo 10a el cual refleja la cantidad total de ADN presente en la muestra; Ejemplo 12).
La figura 7 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, la amplificación por PCR de amplicones específicos de bisulfito que varían de 185 bp hasta 711 bp. A: ADN de plantilla HMW (control positivo). B: AdN de plantilla tratada con bisulfito y purificada subsecuentemente derivada de tejido embebido en parafina tratado con formalina. Se usaron 30 ng de aDn de plantilla y 1 U de Taq polimerasa en un volumen total de 25 pl. C: ADN de plantilla tratado con bisulfito y purificado subsecuentemente derivado de tejido embebido en parafina y fijado con formalina. Se usaron 30 ng de aDN de plantilla y 3 U de Taq polimerasa en un volumen total de 25 pl (Ejemplo 13).
La Figura 8 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el ADN total en lisados cuantificado de acuerdo con el ejemplo 10d (ensayo CFF1; datos escalados logarítmicamente). Todos los datos son medias de cuatro muestras procesadas independientemente por espécimen incluyendo la desviación estándar (Ejemplo 14).
La figura 9 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el ADN total en extractos cuantificado de acuerdo con el ejemplo 10d (ensayo CFF1; datos escalados logarítmicamente). Todos los datos son medias de cuatro muestras procesadas independientemente por espécimen incluyendo la desviación estándar (Ejemplo 14).
La figura 10 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el rendimiento de ADN después de la extracción (relación de ADN en extracto y ADN en lisado). Todos los datos son medias de cuatro muestras procesadas independientemente por espécimen incluyendo la desviación estándar (Ejemplo 14).
La figura 11 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, la cantidad total de ADN físicamente presente según se determina mediante espectrofotometría UV (Este ADN contiene ADN tanto amplificable como no amplificable).
Todos los datos son medias de cuatro muestras procesadas independientemente por espécimen incluyendo la desviación estándar (Ejemplo 14).
La figura 12 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el contenido de ADN amplificable en extractos. El contenido es determinado por la relación de ADN cuantificable de acuerdo con el ejemplo 10d (ensayo CFF1) y de ADN cuantificado de acuerdo con el Ejemplo 10a (valor UV a partir del cual se calcula la cantidad total de ADN físicamente presente)]. Todos los datos son medias de cuatro muestras procesadas independientemente por espécimen incluyendo la desviación estándar (Ejemplo 14).
La figura 13 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el ADN total en lisados cuantificado de acuerdo con el Ejemplo 10d (ensayo CFF1; datos escalados logarítmicamente) (Ejemplo 15).
La figura 14 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el ADN total en extracto cuantificado de acuerdo con el Ejemplo 10d (ensayo CFF1; datos escalados logarítmicamente) (Ejemplo 15).
La figura 15 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el rendimiento de ADN después de la extracción (relación de ADN en extracto y ADN en lisado) (Ejemplo 15).
La figura 16 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, la cantidad total de ADN presente físicamente como se determina por espectrofotometría UV (Este ADN contiene tanto ADN amplificable como no amplificable) (Ejemplo 15).
La figura 17 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el contenido de ADN amplificable en extractos. El contenido es determinado por la relación de ADN cuantificado de acuerdo con el Ejemplo 10d (ensayo CFF1) y el ADN cuantificado de acuerdo con el Ejemplo 10a (valor UV a partir del cual se calcula la cantidad total de ADN presente físicamente) (Ejemplo 15).
La figura 18 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el rendimiento total de ADN después del tratamiento con bisulfito y subsecuente purificación. La cuantificación fue llevada a cabo de acuerdo con el Ejemplo 10d (ensayo CFF1; datos escalados logarítmicamente). Todos los datos son medias de dos muestras procesadas independientemente por espécimen.
La figura 19 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el rendimiento total de ADN después del tratamiento con bisulfito y purificación subsecuente. La cuantificación fue llevada a cabo de acuerdo con el Ejemplo 10c (ensayo C3; datos escalados logarítmicamente). Todos los datos son medias de dos muestras procesadas de independientemente por espécimen (Ejemplo 16).
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La figura 20 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el rendimiento total de ADN después del tratamiento con bisulfito y purificación subsecuente. La cuantificación fue llevada a cabo de acuerdo con el Ejemplo 10d (ensayo CFF1; datos a escala logarítmica). Todos los datos son medias de cuatro muestras procesadas independientemente por espécimen (Ejemplo 17).
La figura 21 muestra, de acuerdo con aspectos particulares, el rendimiento total de ADN después del tratamiento con bisulfito y purificación subsecuente. La cuantificación fue llevada a cabo de acuerdo con el ejemplo 10c (ensayo C3; datos escalados logarítmicamente). Todos los datos son la media de cuatro muestras procesadas independientemente por espécimen (Ejemplo 17).
Descripción detallada de aspectos de la invención
Para lograr diversos objetos técnicos, aspectos de la invención enseñan métodos para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada, caracterizados porque el rendimiento del ADN antes de una etapa de amplificación es de al menos un 20% y los amplicones de hasta una longitud de 1.000 pares de bases son amplificables. Los aspectos particulares proporcionan métodos para encontrar entre una enorme pluralidad de métodos conocidos para eliminación de parafina, lisis de tejido, tratamiento con bisulfito, purificación de ADN y amplificación de ADN, aquellos métodos que, en principio, se pueden usar para resolver el objeto técnico de la invención. Los aspectos particulares proporcionan combinaciones y ajustes adecuados de estos métodos entre sí de una manera que realmente cumple con los objetivos técnicos.
Ventajas de los aspectos de la invención
En aspectos particulares, el método inventivo de ejemplo tiene las siguientes ventajas: tiene un bajo esfuerzo de manipulación, porque incluye solo una cantidad muy limitada de etapas que deben llevarse a cabo. Adicionalmente, es posible llevar a cabo el método de la invención en una escala de placas. Además, las diferentes etapas también pueden automatizarse y, por lo tanto, también se puede usar la robótica. La ejecución en escala de placas y la adecuabilidad del método para la automatización también conducen a una reducción en los costes. Además, los costes se reducen aún más mediante el uso de dispositivos y soluciones que están disponibles a bajo coste.
Otra ventaja del método de la invención es que cada etapa puede realizarse fácilmente porque solo se necesita un equipo de laboratorio estándar para su ejecución.
Debido a su simplicidad, su adecuabilidad para la automatización, su bajo esfuerzo de manipulación así como su fácil manejo, el método de la invención tiene una alta fiabilidad y reproducibilidad.
Además, el ADN provisto por este método se caracteriza por su alta calidad, incluso cuando se utilizó una muestra fijada en formalina embebida en parafina como material de partida. Adicionalmene, el ADN proporcionado de acuerdo con este método comprende una fracción notable de fragmentos largos (en promedio, el 10% de los fragmentos tienen al menos una longitud de 110 pb) y los fragmentos sorprendentemente largos son amplificables (hasta 600 pb). El ADN se caracteriza además porque solo proteínas o péptidos contaminantes menores están vinculados a él. Estas contaminaciones son solo tan ligeras que el tratamiento con bisulfito solo se ve levemente alterado en absoluto.
Por otro lado, se pueden obtener rendimientos relativamente altos de ADN de forma fiable a partir de la muestra obtenida con una alta reproducibilidad adicional. Por lo tanto, es posible obtener de muestras muy pequeñas de ADN suficiente para el análisis de metilación.
Método de aspectos de la invención
El método de la invención es un método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada. De acuerdo con el método de la invención, el rendimiento de ADN antes de cualquier amplificación es al menos del 20%. Para la determinación del rendimiento de ADN, se determina el rendimiento de ADN de cada etapa del método de acuerdo con la invención. El rendimiento global se calcula entonces multiplicando los rendimientos de las etapas individuales como conocen los expertos en la técnica. El rendimiento de ADN para cada etapa individual puede llevarse a cabo (determinado) como se describe en detalle en los presentes EJEMPLOS 10, 12 y 14-18, o mediante cualquier otro método adecuado conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo UV 260/280 nm o electroforesis en gel especialmente en combinación con un sistema de detección como un generador de imágenes de fósforo.
Adicionalmente, aspectos particulares del ejemplo de la invención se caracterizan porque los amplicones de hasta una longitud de 1.000 pb son amplificables, independientemente de que se lleve a cabo un tratamiento con bisulfito. Una etapa de tratamiento con bisulfito llevada a cabo de acuerdo con el estado de la técnica reduce la capacidad de amplificación de amplicones si el ADN tratado con bisulfito se usa como plantilla. Sin embargo, las etapas individuales de los métodos inventivos de ejemplo se armonizan de tal manera y la etapa de tratamiento con bisulfito se lleva a cabo de tal manera que la aplicación de un tratamiento con bisulfito casi no tiene influencia sobre la capacidad/eficacia de la amplificación.
En resumen, el método de la invención es un método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada, que se caracteriza porque
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el rendimiento de ADN antes de una etapa de amplificación es al menos del 20%, y amplicones de hasta una longitud de 1,000 pares de bases son amplificables.
En esto, amplificable significa que cualquier amplicón de una longitud deseada puede amplificarse mediante los cebadores correspondientes durante una amplificación por PCR. La amplificación por PCR puede ser PCR estándar o PCR en tiempo real o cualquier amplificación PCR conocida conocida por los expertos en la técnica. Por supuesto, también se pueden usar métodos que conducen a resultados similares, como la reacción en cadena mediada por ligasa (LCR) o la técnica NASBA/TMA. El amplicón se detecta entonces por medio de fluorescencia mediante técnicas estándar, por ejemplo, mediante colorantes intercalados como bromuro de etidio o verde SYBR o etiquetas unidas a los cebadores o nucleótidos usados. Los expertos en la técnica conocen métodos adecuados para la detección.
En una realización adicional, el método de la invención se caracteriza porque
el rendimiento de ADN antes de una etapa de amplificación es 20-60%, y
amplicones de hasta una longitud de 600 pares de bases son amplificables.
En una realización preferida particular, el método de la invención comprende una etapa de tratamiento con bisulfito. Después de la etapa de purificación de ADN entonces necesaria, el rendimiento total de ADN es al menos del 20%, preferiblemente en el rango de 30-50%. Adicionalmente, el ADN después del tratamiento con bisulfito y la etapa de purificación se caracteriza adicionalmente porque al menos 5 de los fragmentos de ADN son amplificables en una reacción de PCR que da como resultado fragmentos de al menos 110 pb de longitud. En una realización particularmente preferida, este ADN se caracteriza porque el 5-60% de los fragmentos de ADN son amplificables en una reacción de PCR que da como resultado fragmentos de al menos 110 pb de longitud. En una realización especialmente preferida, un promedio del 10% del ADN purificado es amplificable en una reacción de PCR que da como resultado fragmentos de al menos 110 pb de longitud. Estos valores se pueden determinar como se ejemplifica en los ejemplos 10 y 14.
Muestra archivada
De acuerdo con la invención la muestra archivada es una biopsia embebida en parafina y/ o fijada o una sección de tejido embebida en parafina y/o fijada o partes de la misma, por ejemplo muestras microdiseccionadas. Por lo tanto el término "biopsia" se refiere a cualquier clase de biopsia por aguja o cualquier clase de muestra de tejido recolectada durante una cirugía. Además, el término "sección de tejido" se refiere a cualquier parte de una biopsia por ejemplo derivada por seccionamiento por micrótomo de la biopsia.
Como es bien sabido por los experimentados en la técnica, es difícil determinar el peso real de una sección de tejidos. Estas dificultades son causadas aquí porque las sección usualmente frágil, delgada y pegajosa. Adicionalmente, es también importante tener en mente el porcentaje de parafina que rodea el tejido. De acuerdo con la invención, se prefieren las muestras que tienen un porcentaje de parafina de 50% o menos. Típicamente 1-6, en particular tres secciones de 10 pm de espesor con un área de tejido en el rango de 0.7 cm x 0.7 cm a 2.5 cm x 3.5 cm se utilizan como material de partida. Una persona con habilidades normales en la técnica sabrá cómo ajustar el método de acuerdo con la invención para utilizar muestras que tienen un porcentaje de parafina de más de 50% o en el caso de que las secciones usadas tengan un área menor o mayor de tejido. Para muestras obtenidas por biopsia, se escogen diferentes cantidades como material de partida. Típicamente 1-6, son usadas en particular tres secciones de 10 pm de espesor de una muestra de biopsia. La muestra de biopsia comprende 1-6, preferiblemente 3 biopsias embebidas en parafina. Biopsias típicas son cilíndricas teniendo un diámetro de aproximadamente 1 cm, no pudiendo ser estandarizada la longitud. Una persona con habilidades ordinarias en la técnica sabrá cómo seleccionar una cantidad suficiente de material de partida de una muestra de biopsia si la muestra contiene más biopsias. Además también sabría cómo seleccionar una cantidad equivalente de biopsia no seccionada, la cual puede ser usada de acuerdo con la invención. De nuevo, una persona con habilidades normales en la técnica sabrá cómo seleccionar una cantidad apropiada de material de partida. Desde luego, el método de la invención también es aplicable para muestras fijadas con otros fijadores como glutaraldehído, fijador de Bouin, isopentano, o fijadores basados en alcohol como metanol o etanol.
En una realización de la invención, la muestra archivada es una muestra fijada con formalina, típicamente embebida en parafina. Pero también muestras tratadas con formalina que no están embebidas en parafina pueden ser utilizadas como material de partida. Desde luego las muestras frescas o congeladas frescas también pueden ser sujeto del método de acuerdo con la invención el cual puede entonces empezar directamente con la etapa de lisis.
En una realización de la invención la muestra archivada es una biopsia de tejido embebido en parafina y/o fijada o una sección de tejido embebida en parafina y/o fijada.
Etapas del método de acuerdo con la invención
Un método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada, que comprende poner en contacto una muestra archivada que comprende ADN con una proteasa para proveer una cantidad de ADN tratado con
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proteasa; tratar el ADN con un reactivo de bisulfito sin una etapa previa de extracción de ADN; purificando el ADN tratado con bisulfito.
El método puede llevarse a cabo en escala de placa o escala de tubo. Puede ser llevado a cabo manualmente o por un robot. Por lo tanto, es posible llevar a cabo el método de la invención manualmente tanto en escala de tubo como en escala de placa manualmente o mediante un robot. Esta última posibilidad tiene la ventaja de un bajo esfuerzo de manejo y una reducción en los costes.
Una realización de la invención comprende una etapa de eliminación de parafina, una etapa de lisis, una etapa de tratamiento con bisulfito, una etapa de purificación y una etapa de amplificación.
En otra realización, la muestra archivada se somete directamente a una etapa de lisis, en la que la parafina se licua por calentamiento. Esta etapa de lisis típicamente conduce a ADN libre de entrecruzamiento, lo que hace posible también dejar fuera la etapa de extracción de ADN y continuar con la etapa de tratamiento con bisulfito si se desea, seguido de la etapa de amplificación.
Etapa de eliminación de parafina
De acuerdo con la invención, la etapa de eliminación de parafina comprende la disolución de parafina mediante un solvente orgánico. En una realización preferida, la muestra se lava adicionalmente con otro solvente orgánico que permite después una mejor rehidratación. Por lo tanto, en una realización, la etapa de eliminación de parafina comprende la disolución de parafina mediante un solvente orgánico o la disolución de parafina mediante un solvente orgánico y el lavado con otro solvente orgánico.
En una realización preferida, el solvente orgánico que disuelve parafina es un solvente del grupo "limoneno, xileno o cualquier mezcla de estos solventes". En particular, se prefiere que el solvente orgánico sea limoneno. Esto es especialmente favorable porque el limoneno es menos peligroso, menos dañino para la salud y el medio ambiente que otros solventes adecuados. Adicionalmente, también es posible utilizar solventes orgánicos como benceno, etilbenceno, tolueno, isoparafina (también conocida como x-tra-solve (medite medizintechnik)) o cualquier solvente con propiedades químicas similares o cualquier mezcla de dichos solventes.
Un solvente orgánico que es adecuado para lavar la muestra y prepararla para una mejor rehidratación después de disolver la parafina es un solvente del grupo de "etanol, metanol, isopropanol o cualquier mezcla de estos solventes entre sí o con agua". Se prefiere particularmente usar etanol como solvente de lavado después de disolver la parafina. Por supuesto, también se pueden usar solventes adicionales con propiedades químicas comparables.
En una realización de la invención, el solvente orgánico para disolver parafina es un solvente del grupo "limoneno, xileno o cualquier mezcla de estos solventes", y en donde el solvente de lavado es un solvente del grupo de "etanol, metanol, isopropanol o cualquier mezcla de estos solventes entre sí o con agua ".
En una realización preferida de la invención, la etapa de eliminación de parafina comprende la adición de un volumen adecuado de limoneno a la muestra archivada. El volumen de limoneno depende por lo tanto de la cantidad de muestra. Para 1-6 secciones de 10 pm que se usan típicamente como material de partida (véase más arriba) se usan 0,1-3 ml de limoneno. Una persona con experiencia normal en la técnica sabrá cómo ajustar el volumen de limoneno a muestras más pequeñas o más grandes. Después de la incubación, preferiblemente durante al menos 5 min a 10-70°C, y centrifugación, se elimina el limoneno con la parafina disuelta.
En una realización de la invención, la etapa de eliminación de parafina comprende
adición de 0,1-3 ml de limoneno a la muestra archivada,
incubación durante al menos 5 minutos a 10-70 °C,
centrifugación, y
eliminación del limoneno.
En una realización particularmente preferida, se añaden 0.5-1.5 ml, preferiblemente 1 ml, de limoneno a la muestra archivada para eliminar la parafina. Subsecuentemente, la muestra se incuba con agitación durante 5-120 min a 1530 °C, preferiblemente durante 10-60 min a temperatura ambiente. La agitación puede ser continua o se repite brevemente varias veces. Después de la centrifugación durante al menos 5.000 x g durante 1-20 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, el tejido se localiza en el fondo del tubo y se elimina la mezcla de limoneno y parafina.
En una realización de la invención, la etapa de eliminación de parafina comprende adición de 1 ml de limoneno a la muestra archivada,
incubación durante 10 min-1 h a temperatura ambiente mezclando la muestra,
centrifugación al menos 5,000 x g por 5 min, y eliminación del limoneno.
En una realización preferida de la invención, la muestra de tejido después de la eliminación de parafina se lava con etanol. Si se usa la cantidad típica de muestra (1-6 secciones de 10 |jm de espesor), un volumen adecuado de etanol 5 para esta etapa de lavado es de 0,1-3 ml. Una persona con experiencia normal en la técnica sabrá cómo ajustar este volumen si se utilizan muestras más pequeñas o más grandes. Después de la adición de etanol, la muestra se incuba a 15-30°C durante hasta 10 min. Pero incluso incubaciones más largas son posibles porque no son desfavorables. Después de la centrifugación, se elimina el etanol y la muestra de tejido se seca a 15-65 °C.
En una realización de la invención, el solvente de lavado es etanol, y la realización comprende
10 adición de 0.1-3 ml de etanol,
opcional, incubación por hasta 10 minutos a 15-30 °C,
centrifugación,
eliminación del etanol, y
secado.
15 En una realización particularmente preferida, se añaden 0,5-1,5 ml, preferiblemente 1,0 ml de etanol como solución de lavado. La incubación tiene lugar durante 1-10 minutos, preferiblemente durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación. La agitación puede ser continua o se repite brevemente varias veces. Después de la centrifugación durante al menos 5.000 x g durante 1-20 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, el tejido se localiza en el fondo del tubo y se elimina el etanol. La muestra de tejido se seca a 45-65 °C durante 5-60 min, preferiblemente a 50 °C 20 durante 10-30 min.
Una realización preferida de la invención comprende las siguientes etapas: adición de 1 ml de etanol,
incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente mezclando la muestra, centrifugación al menos 5,000 x g durante 5 min,
25 eliminación del etanol, y
incubación durante 10-30 minutos a 50 °C.
Etapa de lisis
la etapa de lisis se lleva a cabo mediante el uso de proteasa. Esta proteasa puede ser una serina proteasa, una tiol proteasa, una carboxi proteasa, una metaloproteasa, proteinasa K o cualquier mezcla de estas proteasas.
30 Dependiendo de la proteasa, el tiempo para la digestión puede variar. La razón de esto son las diferentes actividades de las proteasas. De acuerdo con la invención, se prefiere elegir una proteasa con una alta actividad enzimática. Pero de acuerdo con la invención, también se prefiere elegir una proteasa que esté disponible a bajo coste. Por lo tanto, es particularmente preferido elegir una proteasa con una alta relación actividad/coste enzimático. Por eso, es particularmente preferido elegir la proteinasa K para la lisis.
35 Además, el tiempo para la digestión también depende de la textura y naturaleza de la muestra de tejido. Por ejemplo, los tejidos como el tejido mamario se digieren con bastante rapidez, debido a la cohesión suelta de las células. Por una parte, los tejidos como el colon o el tejido hepático pueden necesitar digestiones más largas debido a la compactibilidad del tejido.
Otro factor importante que tiene una influencia significativa en el momento de la digestión es la forma geométrica de 40 la muestra. En general, las muestras con un área superficial grande son más digeribles que las muestras con un área superficial menor si tienen la misma textura y naturaleza y si se usa la misma proteasa para la digestión. Por lo tanto, se prefiere usar secciones de tejido o cortar muestras de tejido más grandes en pedazos. Pero, de acuerdo con la invención, también se prefiere ajustar el tiempo para la digestión en la forma geométrica de las muestras de tejido. Al hacerlo, ya no es necesario cortar secciones de tejido más grandes en pedazos. Debido a que esto también reduce el 45 esfuerzo de manejo, se prefiere particularmente usar tiempos largos para la digestión.
Tiempos de digestiones más largos también son particularmente más preferidos, porque se supone que permiten una mejor eliminación de proteínas entrecruzadas o péptidos a partir del aDn. La importancia de una eliminación completa de proteínas o péptidos contaminados ya se explicó en detalle anteriormente. De acuerdo con la invención, se prefiere someter a lisis las muestras de tejido con proteinasa K no más de 60 h, en particular no más de 48 h por razones de
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eficiencia. Esto es usualmente suficiente para una digestión completa que elimine todas las proteínas y péptidos contaminados.
Tomando en cuenta lo anterior mencionado, el tiempo mínimo de digestión es 2.5 h, preferiblemente 3 h. Este es especialmente el caso de tejidos fáciles de digerir que tienen un área superficial grande y el uso de proteinasa K.
Además, para una mejor eliminación de proteínas o péptidos contaminantes, se prefiere particularmente añadir una cantidad adicional de proteasa después de las primeras 24 h de digestión. Esto se recomienda porque la actividad enzimática disminuye con el tiempo debido a la autodigestión. Para algunos tejidos, puede ser ventajoso agregar cantidades adicionales de proteasa durante varias veces. Por ejemplo, para tejido de colon o de próstata, se prefiere particularmente añadir tres veces proteinasa K.
En una realización de la invención, la etapa de lisis se lleva a cabo mediante el uso de una proteasa seleccionada del grupo "una serina proteasa, una tiol proteasa, una carboxi proteasa, una metaloproteasa, proteinasa K o cualquier mezcla de estas proteasas".
En una realización preferida, la etapa de lisis comprende la adición de 0,05-1 ml de un regulador de lisis a 1-10 secciones de tejido fijadas con formalina desparafinadas de 10 pm de espesor o una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada. El regulador de lisis comprende 50 mmol/l de Tris (tris- hidroximetilaminometan) pH 8,0, 1 mmol/l de EDTA, 0,5% de Tween 20 v/v. Por supuesto, es posible el uso de cualquier otro regulador de lisis tal como es conocido por los expertos en la técnica. Subsecuentemente, se añaden 0,1-3 mg de proteinasa K. La proteinasa K puede disolverse en un regulador adecuado, preferiblemente el regulador de lisis utilizado. Esto se puede hacer mediante la adición de 10-100 pl de una solución de proteinasa K que comprende 10-30 g/l de proteinasa K. Después de la adición de la proteasa, la mezcla se agita. La mezcla se incuba durante al menos 2,5 ha 40-70 °C. A continuación, si se desea, la proteinasa K puede inactivarse mediante calentamiento o mediante el uso de inhibidores. Una persona con experiencia normal en la técnica sabe cómo ajustar el volumen de dichas soluciones si el grosor de la sección varía o si se usa una cantidad de muestra más o menos grande.
En una realización preferida, la etapa de lisis comprende
adición de 0,05-1 ml de regulador de lisis que comprende 50 mmol/l de tris-hidroximetil-amino-metano pH 8,0, 1 mmol/l de EDTA, 0,5% de Tween v/v a 1-10 secciones de tejido fijadas con formalina desparafinada o una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada,
adición de 10-100 pl de proteinasa K que comprende 10-30 g/l de proteinasa K, agitando subsecuentemente la muestra,
incubación durante al menos 2,5 h a 40-70°C, y
opcional, inactivación de la proteinasa K por calentamiento o mediante el uso de un inhibidor.
En una realización particularmente preferida, la etapa de lisis comprende la adición de 100-300 pl, preferiblemente 190 pl de regulador de lisis a 1-10 secciones de tejido fijadas en formalina desparafinadas de 10 pm de espesor o una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada. Adicionalmente, se añaden 0,45-1,5 mg, preferiblemente 0,6 mg de proteinasa K. En particular, la proteinasa K se agrega como 15-50 pl, preferiblemente como 20 pl de una solución de proteinasa K que comprende 30 pg/pl de proteinasa K. La agitación subsecuente se lleva a cabo mediante sometimiento a vórtex riguroso. Después de esto, la mezcla se incuba durante 2,5-60 horas a 45-65°C, preferiblemente durante 3-48 horas a 50-60°C, en donde la mezcla se agita continuamente o se repite brevemente muchas veces. La inactivación de la proteinasa K se puede lograr mediante la incubación de la mezcla durante 5-20 min al menos a 90 °C, preferiblemente durante 10 min al menos a 95 °C. ¡¡¡Todas las temperaturas de
almacenamiento se superan!!! En una variante especial, se prefiere que se añadan al menos 0,6 mg de proteinasa K, por ejemplo 20 pl de una solución de 30 pg/pl de proteinasa K después de las primeras 24 h de la incubación. Una persona con experiencia normal en la técnica sabe cómo ajustar el volumen de dichas soluciones si el grosor de la sección varía o si se usa una cantidad de muestra más o menos grande.
En una realización preferida, la etapa de lisis comprende
adición de 190 pl de regulador de lisis a 1-6 secciones de tejido fijadas con formalina desparafinada o una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada,
adición de 20 pl de solución de proteinasa K que comprende 30 g/l de proteinasa K, subsecuente riguroso sometimiento a vórtex,
incubación durante 3-48 h a 50°C-60°C mezclando la muestra, y opcional, adición de al menos 20 pl de solución de proteinasa K después de las primeras 24 h de incubación a 50°C-60°C, y
incubación durante 10 min al menos a 95°C.
En otra realización preferida, la muestra archivada se somete directamente a la etapa de lisis que comprende la adición de 0,05-1 ml de un regulador de lisis a 1-10 secciones de tejido fijadas en formalina desparafinadas de 10 pm de espesor o una cantidad igual de biopsia de tejido fijado con formalina desparafinada. El regulador de lisis comprende 50 mmol/l de Tis (tris-hidroximetil-amino-metano) pH 8,0, 1 mmol/l de EDTa, 0,5% de Tween 20 v/v. Preferiblemente, 5 también comprende 5 ng/pl de ADN poli-dA. Por supuesto, también se pueden usar otros reguladores de lisis adecuados como los conocen los expertos en la técnica. Subsecuentemente, la mezcla se incuba durante 5-20 min a 40-75 °C. Después de esto, se añaden 0,15-1,2 mg de proteinasa K, por ejemplo 5-40 pl de una solución de proteinasa K 30 pg/pl. La mezcla luego se incuba durante al menos 2,5 h a 40-70 °C con agitación. A continuación, si se desea, la proteinasa K puede inactivarse mediante calentamiento o mediante el uso de inhibidores. Una persona con 10 experiencia normal en la técnica sabe cómo ajustar el volumen de dichas soluciones si el grosor de la sección varía o si se usa una cantidad de muestra más o menos grande.
En una realización preferida, la muestra archivada está directamente sometida en la etapa de lisis que comprende
adición de 50-1,000 pl de regulador de lisis a 1-10 secciones de tejido fijado con formalina desparafinada o una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada, el regulador de lisis pH 8.0 que comprende 15 50 mmol/l de tris- hidroximetil-amino-metano, 1 mmol/l de EDTA, 0,5% de Tween v/v, y 5 ng/pl de ADN poli-dA opcional,
incubación durante 5-20 min a 40-75°C,
adición de 5-40 pl de solución de proteinasa K, la solución de proteinasa K que comprende 30 mg/ml de proteinasa K, incubación durante al menos 2,5 h a 40-70°C, y
opcional, inactivación de la proteinasa K por calentamiento o mediante el uso de un inhibidor.
20 En una variante particularmente preferida se añaden 75-200 pl, preferiblemente 100 pl de regulador de lisis a 1-6 secciones de tejido fijadas con formalina desparafinadas de 10 pm de espesor o una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada. Después de la adición, la mezcla se incuba durante 7-15 min a 50-70°C en un termomezclador a 500-2,000 rpm, preferiblemente durante 10 min a 65°C en un termomezclador a 1,000 rpm. Subsecuentemente, se añaden 0,21-0,6 mg, preferiblemente 0,3 mg de proteinasa K, por ejemplo 7-20 ul, 25 preferiblemente 10 ul a una solución 30 ug/ul de proteinasa K. La mezcla se incuba luego durante 2,5-60 horas a 50- 65°C en un termomezclador a 1.000-2.000 rpm, preferiblemente durante 3-48 horas a 60°C en un termomezclador a 1.400 rpm. La proteinasa K puede inactivarse incubando la mezcla durante 5-20 minutos al menos a 90°C, preferiblemente durante 10 min al menos a 95°C. La inactivación de proteinasa K también se puede lograr mediante la adición de inhibidores de proteinasa K. Una persona con experiencia normal en la técnica sabe cómo ajustar el 30 volumen de dichas soluciones si el grosor de la sección varía o si se usa una cantidad de muestra más o menos grande.
En una realización particularmente preferida, la etapa de lisis comprende
adición de 100 pl de regulador de lisis a 1-6 secciones de tejido fijadas con formalina desparafinada o una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada,
35 incubación durante 10 minutos a 65°C en un termomezclador a 1.000 rpm,
incubación a 50°C en un termomezclador a 1.400 rpm
adición de 10 pl de solución de proteinasa K,
incubación durante 3-48 h a 60°C en termomezclador a 1.000 rpm, e
incubación durante 10 min a > 95°C.
40 En el caso de que la muestra archivada se someta directamente a la etapa de lisis, se prefiere que el ADN se pueda someter directamente al tratamiento con bisulfito, dejando fuera la etapa de extracción de ADN. Esto es particularmente preferido si la cantidad de muestra archivada es pequeña o si una persona con experiencia normal en la técnica esperaría solo pequeños rendimientos de ADN.
Etapa de tratamiento con bisulfito
45 En una realización, la etapa de tratamiento con bisulfito se lleva a cabo esencialmente como se describe en el documento WO05/038051. De acuerdo con esto, en una realización, el ADN se hace reaccionar con un reactivo de bisulfito, caracterizado porque dicha reacción se lleva a cabo en presencia de un compuesto del grupo de dioxano, uno de sus derivados y un éter cíclico alifático similar.
En otra realización, el ADN se hace reaccionar con un reactivo de bisulfito, caracterizado porque dicha reacción se 50 lleva a cabo en presencia de un compuesto de la siguiente fórmula:
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n = 1-35000 m = 1-3
R1 = H, Me, Et, Pr, Bu R2 = H, Me, Et, Pr, Bu
Preferidos son, por lo tanto, los compuestos de n-alquilenglicol, particularmente sus dialquiléteres, y especialmente el dietilenglicoldimetiléter (DME).
La conversión de bisulfito puede tener lugar tanto en solución como también en ADN unido a una fase sólida. Preferiblemente se usa disulfito de sodio (= bisulfito de sodio/metabisulfito de sodio), ya que es más soluble en agua que el sulfito de sodio. La sal de disulfito se desproporciona en solución acuosa a los aniones de sulfito de hidrógeno necesarios para la conversión de citosina. Cuando la concentración de bisulfito se analiza a continuación, esto se refiere a la concentración de sulfito de hidrógeno y aniones de sulfito en la solución de reacción. Para el método de acuerdo con la invención, son posibles rangtos de concentración de 0,1 a 6 mol/l. Particularmente preferido es un rango de concentración de 1 a 6 mol/l, y lo más particularmente preferido, 2-4 mol/l. Sin embargo, cuando se usa dioxano, la concentración máxima de bisulfito que se puede usar es menor (véase a continuación). Al seleccionar la concentración de bisulfito, se debe considerar que una alta concentración de bisulfito conduce a una conversión alta, pero también conduce a una alta tasa de descomposición debido al pH más bajo.
El dioxano se puede utilizar en diferentes concentraciones. Preferiblemente, la concentración de dioxano es de 10 a 35% (vol/vol), particularmente preferida es de 20 a 30%, y lo más particularmente preferido es de 22 a 28%, especialmente de 25%. Una concentración de dioxano superior al 35% es problemática, ya que esto da como resultado una formación de dos fases dentro de la solución de reacción. En las realizaciones particularmente preferidas con una concentración de dioxano de 22-28%, la concentración de bisulfito preferida final asciende a 3.3 a 3.6 mol/l, y en la realización más particularmente preferida con una concentración de dioxano de 25%, asciende a 3.5 mol/l (véase Ejemplos).
Los compuestos de n-alquilenglicol de acuedo con la invención se pueden utilizar en un rango de concentración diferente. El DME se usa preferiblemente en concentraciones entre 1-35% (vol/vol). Existe preferiblemente entre 5 y 25%, y lo más preferiblemente 10% de DME.
Los depuradores preferidos utilizados de acuerdo con la invención son derivados de cromano, por ejemplo, ácido 6- hidroxi-2,5,7,8,-tetrametilcroman2-carboxílico (también conocido como: Trolox-C™). Se enumeran depuradores adicionales en la solicitud de patente WO 01/98528.
La conversión de bisulfito puede realizarse en un amplio rango de temperatura de 0 a 95 °C. Sin embargo, a temperaturas más altas aumentan las tasas tanto de la conversión como de la descomposición del ADN, en una realización preferida, la temperatura de reacción se encuentra entre 0-80°C, preferiblemente entre 30-80°C. Particularmente preferido es un rango entre 50-70 °C; más particularmente preferido entre 57-65 °C. El tiempo de reacción óptimo del tratamiento con bisulfito depende de la temperatura de reacción. El tiempo de reacción normalmente es de entre 1 y 18 horas (véase: Grunau et al., 2001, Nucleic Acids Res. 2001,29 (13): E65-5). El tiempo de reacción es ordinariamente de 4 a 6 horas para una temperatura de reacción de 60 °C.
En una realización particularmente preferida del método de acuerdo con la invención, la conversión de bisulfito se realiza a temperaturas de reacción moderadas, en donde la temperatura de reacción se aumenta claramente durante un tiempo corto al menos una vez durante el curso de la conversión. De esta manera, la efectividad de la conversión con bisulfito puede aumentar sorprendentemente claramente. Los aumentos de temperatura de corta duración se denominan "termopicos" a continuación. La temperatura de reacción "estándar" fuera de los termopicos se denota como la temperatura de reacción básica. La temperatura de reacción básica asciende a entre 0 y 80°C, preferiblemente entre 30-80°C, más preferiblemente entre 50-70°C, lo más preferiblemente entre 57-65°C, como se describió anteriormente.
La temperatura de reacción durante un termopico aumenta a más de 85 °C por al menos un termopico. La cantidad óptima de termopicos es una función de la temperatura de reacción básica. Cuanto mayor sea el número óptimo de termopicos, menor será la temperatura de reacción básica. Al menos una termospike es necesaria en cada caso. Y, por otro lado, en principio, cualquier cantidad de termopicos es concebible. Por supuesto, se debe considerar que con un gran número de aumentos de temperatura, la tasa de descomposición del ADN también aumenta, y ya no se garantiza una conversión óptima. El número de termopicos preferido es, por lo tanto, entre 1 y 10 termopicos cada vez, dependiendo de la temperatura de reacción básica. De este modo, se prefiere particularmente una cantidad de dos a cinco termopicos. Los termopicos aumentan la temperatura de reacción preferiblemente a 85 a 100 °C, particularmente preferiblemente a 90-100 °C, y lo más preferiblemente a 94 °C-100 °C.
La duración en el tiempo de los termopicos también depende del volumen del lote de reacción. Se debe asegurar que la temperatura se incremente de manera uniforme en toda la solución de reacción. Para un lote de reacción de 20 jl cuando se usa un termociclador, se prefiere una duración entre 15 segundos y 1.5 minutos, especialmente una duración entre 20 y 50 segundos. En una realización preferida particular, la duración es de 30 segundos. Operando 5 en un volumen de 100 jl, el rango preferido se encuentra entre 30 segundos y 5 minutos, especialmente entre 1 y 3 minutos. Particularmente preferido son 1.5-3 minutos. Para un volumen de 600 jl, se prefiere una duración de 1 a 6 minutos, especialmente entre 2 y 4 minutos. Particularmente preferido es una duración de 3 minutos. Una persona experta en la técnica será capaz de determinar fácilmente las duraciones adecuadas de los termopicos en relación con una variedad de volúmenes de reacción. El uso de termopicos anteriormente descrito conduce a tasas de 10 conversión significativamente mejores en la reacción de conversión con bisulfito, incluso cuando los solventes desnaturalizantes descritos anteriormente no se utilizan.
En una variante 10-60 jl de la solución que contiene el ADN genómico extraído se mezcla con 50-120 jl de solución de bisulfito. La solución de bisulfito tiene un pH en el rango de 4,7 a 6,5, preferiblemente en el rango de 5,0 a 6,0, y particularmente preferido en el rango de 5,45 a 5,50. La solución de bisulfito comprende hidrogenosulfito en una 15 concentración de 3.5-6.0, preferiblemente en una concentración de 4.4-5.3, y particularmente preferida en una concentración de 4.83-4.93 mol/l. Por ejemplo, tal tipo de solución de bisulfito se puede obtener añadiendo 4.708 g de disulfito de sodio y 1.128 g de sulfito de sodio a 10 ml de agua. Después de disolver las sales, el volumen final es de aproximadamente 12 ml. A la mezcla de la solución de ADN genómico y la solución de bisulfito se añaden 8-45 jl de una solución depuradora de radicales orgánicos. La solución depuradora de radicales orgánicos comprende un 20 solvente orgánico y 50-1,000 mmol/l, preferiblemente 100-750 mmol/l, y particularmente preferido 158-500 mmol/l del depurador de radicales ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico o cualquier otro depurador de radicales adecuado. Después de la adición de la solución de depurador de radicales, se aplica un protocolo de temperatura durante 3-8 h. El protocolo se caracteriza porque la reacción se lleva a cabo en un rango de temperatura de 0-80°C con incrementos adicionales de 2 a 5 temperaturas (termopicos) durante 1-10 min a 85-100°C, incluido un aumento 25 de temperatura inicial (thermospike) para 85-100°C
En una realización, la etapa de tratamiento con bisulfito comprende
mezcla de 10-60 jl de la solución que contiene el ADN genómico con 50-120 jl de solución de bisulfito, la solución de bisulfito tiene un pH en el rango de 5,45 a 5,50 que comprende 4,83-4,93 mol/l de hidrogenosulfito,
adición de 8-45 jl de una solución depuradora de radicales orgánicos, la solución depuradora de radicales orgánicos 30 que comprende un solvente orgánico y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico de 158-500 mmol/l, y
aplicar un protocolo de temperatura durante 3-8 h, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo en un rango de temperatura de 0-80 °C con incrementos de temperatura adicionales de 2-5 durante 1-10 min a 85 a 100 °C, incluido un aumento de temperatura inicial a 85 - 100 °C.
La etapa de bisulfito puede llevarse a cabo como se describe a continuación: 44-50 jl de una solución que contiene 35 el ADN genómico extraído se mezclan con 83-95 jl de una solución de bisulfito. La solución de bisulfito tiene un pH en el rango de 5.45 a 5.50 y comprende hidrogenosulfito en una concentración de 4.83-4.93 mol/l. Por ejemplo, tal tipo de solución de bisulfito se puede obtener añadiendo 4.708 g de disulfito de sodio y 1.128 g de sulfito de sodio a 10 ml de agua. Después de disolver las sales, el volumen final es de aproximadamente 12 ml. Después de la adición de la solución de bisulfito, se añaden 13-15 jl de una solución de DME, comprendiendo la solución de DME 250-1,000 40 mmol/l, preferiblemente 350-750 mmol/l, y particularmente preferida 500 mmol/l de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil- croman-2-carboxílico disuelto en dietilenglicoldimetiléter (DME). A continuación, se aplica un protocolo de temperatura durante 4-7 h. El protocolo se caracteriza porque la reacción se lleva a cabo en un rango de temperatura de 57-65 °C con incrementos adicionales de 2-5 temperaturas (termopicos) durante 3-5 min a 94-100 °C, incluido un aumento de temperatura inicial (thermospike) para 94-100 °C.
45 En una realización preferida, la etapa de tratamiento con bisulfito comprende
mezcla de 44-50 jl de solución que contiene el ADN genómico con 83-95 jl de la solución de bisulfito
adición de 13-15 jl de solución de DME, la solución de DME que comprende 500 mmol/l de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametil-croman-2-carboxílico disuelto en dietilenglicoldimetiléter, y
aplicar un protocolo de temperatura durante 4-7 h, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo en un rango de 50 temperatura de 57-65°C con incrementos de temperatura adicionales de 2 a 5 durante 3-5 min a 94-100°C, incluido un aumento de temperatura inicial a 94-100°C.
En otra realización particularmente preferida, 15-20 jl de solución que contiene el ADN genómico aislado se mezclan con 60-85 jl de una solución de bisulfito. La solución de bisulfito tiene un pH en el rango de 5.45 a 5.50 y comprende hidrogenosulfito en una concentración de 4.83-4.93 mol/l. Después de la adición de la solución de bisulfito, se añaden 55 25-35 jl de solución de dioxano. La solución de dioxano comprende 50-500 mmol/l, preferiblemente 75-300 mmol/l, y
particularmente preferido 158 mmol/l de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico disuelto en 1, 4- dioxano. A continuación, se aplica un protocolo de temperatura durante 4-7 h. El protocolo se caracteriza porque la
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reacción se lleva a cabo en un rango de temperatura de 57-65 °C con incrementos adicionales de 2-5 temperaturas (termopicos) durante 3-5 min a 94-100 °C, incluido un aumento de temperatura inicial (thermospike) para 94-100 °C.
En una realización preferida, la etapa de tratamiento con bisulfito comprende
mezcla de 15-20 jl de solución que contiene el ADN genómico con 60-85 jl de la solución de bisulfito,
adición de 25-35 jl de solución de dioxano, la solución de dioxano que comprende 158 mmol/l de ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico disuelto en 1,4-dioxano,
aplicar un protocolo de temperatura durante 4-7 h, que se caracteriza porque la reacción se lleva a cabo en un rango de temperatura de 57-65 °C con incrementos de temperatura adicionales de 2-5 durante 3-5 min a 94-100 °C, incluido un aumento de temperatura inicial a 94-100 °C.
Etapa de purificación de AND
Después de que se completa la conversión de bisulfito, el ADN se desulfona y se purifica. Se conocen diferentes métodos para este propósito (por ejemplo, véase: DE 101 54 317 A1 = US 10/416,624; Grunau et al. 2001, loc. cit.). Normalmente, la solución de reacción se trata primero con hidróxido de sodio. Subsecuentemente se lleva a cabo una neutralización y precipitación con alcohol del ADN.
En una realización preferida de las realizaciones descritas anteriormente de acuerdo con la invención, la purificación se realiza por medio de una filtración en gel, por ejemplo, con columnas Sephadex-G25 o con columnas Sephadex- G50. La sal de bisulfito se puede eliminar de manera muy efectiva de esta manera, sin la necesidad de etapas de lavado adicionales. En una segunda realización preferida, la purificación se realiza a través de superficies de unión a ADN, por ejemplo, a través de la resina de purificación de ADN Wizard de Promega (véase: Kawakami et al., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 22, 2000, pp. 1805-11). Una tercera realización preferida utiliza partículas magnéticas para la purificación, por ejemplo, con la ayuda del proceso Magna-Pure. Estos métodos de purificación conducen a resultados particularmente buenos en combinación con los compuestos de n-alquilenglicol de acuerdo con la invención, particularmente con DME. La purificación se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La persona experta en la técnica sabe que puede obtenerse un rendimiento incrementado aún más por la variación de las instrucciones del fabricante utilizando experimentos estándar. De forma correspondiente, los protocolos optimizados también son parte de esta invención. El experto en la materia conoce instrucciones técnicas adicionales para purificar ácidos nucleicos mediante filtración en gel, superficies de unión a ADN y partículas magnéticas, y se proveen, por ejemplo, a partir de las instrucciones del fabricante.
En una realización más particularmente preferida, la purificación se realiza por medio de una ultrafiltración. Tal procedimiento tiene varias ventajas técnicas y da como resultado una purificación sorprendentemente exitosa del ADN convertido. La tasa de recuperación del ADN convertido que, inicialmente se derivó de una muestra archivada, es muy alta (> 25%). La ultrafiltración también tiene otras ventajas. Por ejemplo, la purificación es muy flexible con respecto al volumen de las muestras que se utilizarán. Además, las sales de bisulfito se pueden eliminar casi por completo. Además, se puede realizar una desulfonación en la membrana del filtro, lo que adicionalmente da como resultado un ahorro de tiempo.
El experto en la materia conoce diferentes sistemas de ultrafiltración comercialmente disponibles, que pueden usarse para el método de acuerdo con la invención. En una realización preferida, se usan columnas Microcon™ de Millipore.
El experto en la técnica sabe que otros procedimientos pueden ser indicados con otros sistemas de ultrafiltración, y que también se puede obtener un buen rendimiento variando las condiciones indicadas anteriormente.
Además, el ADN tratado con bisulfito también se puede purificar de acuerdo con la invención por medio de la capacidad del ADN para unirse a superficies de sílica, en particular a membranas de sílica. Debido a su alta fiabilidad y reproducibilidad y también para reducir el esfuerzo de manipulación, se prefieren los kits basados en sílica. Para una persona con experiencia normal en la técnica, se conoce una gran cantidad de kits que podrían ser adecuados para la purificación de ADN tratado con bisulfito.
Por lo tanto, en una primera etapa se eligieron los kits más prometedores. Estos kits son: QlAamp Viral RNA Mini, columnas Zymo Spin IC en combinación con el regulador suministrado con el kit QlAamp Viral RNA Mini, la purificación StrataPrep PCR, Autoseq G50, MicroSpin G25, ChargeSwitch® Forensic DNA Purification Kit y Charge Switch genomic DNA Purification kit . En una segunda etapa, estos kits se probaron de acuerdo con los siguientes criterios: i) un esfuerzo de manipulación mínimo; ii) un tiempo mínimo de longitud; iii) rendimiento de ADN; y iv) concentración de sulfito en la solución de ADN después de la purificación. Como referencia, se usó la purificación por medio de un dispositivo Microcon™ (ejemplo 2d). Se obtuvieron resultados comparativamente buenos como por medio de un dispositivo Microcon™ con el kit QlAamp Viral RNA Mini.
Además, también se utilizan preferiblemente kits que contienen las mismas soluciones y/o materiales equivalentes, como columnas o reguladores. Estos kits son el DNeasy 96 Tissue Kit, el kit de sangre QlAamp 96 DNA, el kit QlAamp
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DSP 96 Virus MDX, el kit DNeasy Tissue, el kit QlAamp DNA Mini, el kit QlAamp DNA Micro, el QlAamp Viral RNA Mini o el Kit QIAamp DSP Virus (todos Qiagen). Estos kits se basan en la unión del ADN a las superficies de sílica.
Para la purificación después del tratamiento con bisulfito, las instrucciones del fabricante se modifican cada una en realizaciones preferidas mediante la adición de una etapa hidrolítica alcalina. Esta etapa hidrolítica alcalina se lleva a cabo mediante incubación con una solución alcalina que comprende un alto contenido de un alcohol.
De acuerdo con la invención, la solución alcalina comprende hidróxido de sodio o cualquier otro hidróxido con propiedades químicas similares, como hidróxido de potasio o cualquier mezcla de estos, así como etanol o cualquier otro alcohol con propiedades químicas similares como isopropanol o cualquier combinación de estos. En particular, se prefiere que la solución alcalina comprenda hidróxido de sodio y etanol. Se prefiere especialmente que la concentración de hidróxido de sodio esté en el rango de 0,1-0,3 mol/l, preferiblemente 0,15-0,25 mol/l, y particularmente preferido 0,2 mol/l, mientras que el contenido de etanol está en el rango de 60-95%, preferiblemente 75-93%, y particularmente preferido 90%.
De acuerdo con la invención, la tasa de recuperación del ADN convertido es tan buena como la tasa de recuperación obtenida con dispositivos Microcon™ (> 25%).
De acuerdo con la invención también se pueden usar otros kits, por ejemplo, otros kits que se basan en la unión del ADN a superficies de sílica, en particular a membranas de sílica. En principio, también se pueden usar otros kits siempre que conduzcan a resultados similares. Esos kits son, por ejemplo, kits que se basan en la tecnología "chargewitch" (Invitrogen). Estos pueden ser el kit de purificación de ADN forense ChargeSwitch® y el kit de purificación de ADN genómico de interruptor de carga.
De acuerdo con la invención, la etapa de purificación de ADN sigue a la etapa de tratamiento con bisulfito. En el caso de que la etapa de tratamiento con bisulfito no se lleve a cabo, esta etapa de purificación podría ser dispensable y, por lo tanto, no es necesario de acuerdo con la invención llevar a cabo esta etapa.
En una realización preferida de la invención, la etapa de purificación se lleva a cabo por medio del DNeasy 96 Tissue Kit, el QIAamp 96 DNA Blood Kit, el DNeasy Tissue Kit, el QIAamp DNA Mini Kit y el QIAamp DNA Micro Kit. También se puede usar el QIAamp DSP 96 Virus mDx Kit, QIAamp Viral RnA Mini o el QIAamp DSP Virus Kit. Estos kits son favorables en caso de que solo se esperen pequeñas cantidades de ADN. De acuerdo con la invención, también se pueden usar dispositivos y soluciones de otros kits si conducen a resultados similares con respecto a la calidad y cantidad de ADN purificado. Por ejemplo, pueden ser dispositivos y soluciones de kits basados en la tecnología "charge-switch" (invitrogen). De acuerdo con esta realización, la muestra tratada con bisulfito se mezcla con 500-620 |jl de regulador de unión, el regulador de unión comprende 1-50 ng/jl, preferiblemente 5-25 ng/jl, particularmente preferido 10 ng/jl de ARN o una cantidad comparable de cualquier ácido nucleico disuelto en el regulador AVL. Después de esto, se agregan 500-620 jl de etanol. La mezcla luego se incuba a 0-37 °C durante 5-20 minutos, antes de aplicarla en una columna de una placa del DNeasy 96 Tissue Kit, el QIAamp 96 DNA Blood Kit o el QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit o en una columna del DNeasy Tissue Kit, el QIAamp DNA Mini Kit, el QIAamp DNA Micro Kit, el QIAamp Viral RNA Mini Kit, el QIAamp DSP Virus Kit. En cualquier caso, el ADN se une a una columna. A continuación, la columna se lava con 300-1.000 jl de regulador de lavado AW1. Esto es seguido por una hidrólisis alcalina, en la que se aplican 450-550 jl de una solución que contiene 0,2 mol/l de hidróxido de sodio y 90% de etanol durante 1025 min a 15-26 °C a la columna y con ello al ADN. Despué, la columna se lava con 300-1.000 jl de regulador de lavado AW2, antes de que el ADN se eluya de la columna mediante la adición de 50-150 jl de uno de los reguladores de elución AE, AVE, EB o agua.
También es posible llevar a cabo la etapa de purificación con un regulador de unión que no comprenda ningún ARN ni ninguna cantidad comparable de ningún ácido nucleico. Las realizaciones correspondientes también son parte de la invención.
En una realización de la invención, la etapa de purificación se realiza por medio del DNeasy 96 Tissue Kit, el QIAamp 96 DNA Blood Kit, el QIAamp DSP 96 Virus mDx Kit, el DNeasy Tissue Kit, el QIAamp DnA Mini Kit, el QIAamp DnA Micro Kit, el QIAamp Viral RNA Mini, el QIAamp DSP Virus Kit, que comprende
mezclar la muestra tratada con bisulfito con 500-620 jl de regulador de unión, opcionalmente el regulador de unión que contiene 10 ng/jl de ARN disuelto en el regulador AVL,
adición de 500-620 jl de etanol,
incubación a 0-37°C durante 5-20 min,
unión del ADN sobe una placa del DNeasy 96 Tissue Kit, el QIAamp 96 DNA Blood Kit, o kit QIAamp DSP 96 Virus MDx Kit o en una columna del DNeasy Tissue Kit, el QIAamp DNA Mini Kit, el QIAamp DNA Micro Kit , el QIAamp Viral RNA Mini, el QIAamp DSP Virus Kit,
lavar con 300-1,000 jl de regulador de lavado AW1,
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tratamiento con 450-550 |jl de una solución que contiene 0,2 mol/l de hidróxido de sodio y 90% de etanol durante 1025 min a 15-26°C,
lavar con 300-1,000 jl de regulador de lavado AW2,
elución con 50-150 jl de uno de los reguladores de elución AE, AVE, EB o agua.
En una realización particularmente preferida, se mezclan 100-200 jl de muestra tratada con bisulfito con 520-600 jl de regulador de unión AVL que comprende opcionalmente 10 ng/jl de ARN, preferiblemente 140 jl de muestra tratada con bisulfito se mezcla con 560 jl de regulador de unión. Después de esto, se agregan 520-600 jl, preferiblemente 560 jl de etanol. La mezcla se centrifuga luego a 750-2000 x g al menos durante 1 s, preferiblemente a 1,450 x g durante 1 s. Después de esto, se incuba a 15-25 °C durante 7-15 min, preferiblemente a temperatura ambiente durante 10 min. Subsecuentemente, se agrega a una columna de una placa del DNeasy 96 Tissue Kit, el QlAamp 96 DNA Blood Kit, o el QlAamp DSP 96 Virus MDx Kit o en una columna del DNeasy Tissue Kit, el QlAamp DNA Mini Kit, el QlAamp DNA Micro Kit, QlAamp Viral RNA Mini o QlAamp DSP Virus Kit. Después de la centrifugación de la placa a 4.000-6.000 xg durante 1-10 min, preferiblemente a 5.790 xg durante 4 min, o de la columna a> 15,000 xg durante 0,5-10 min, preferiblemente a 20,000 xg durante 1 min, el ADN se une a una columna A continuación, la columna se lava con 300-750 jl, preferiblemente con 500 jl de regulador de lavado AW1. Subsecuentemente, la placa se centrifuga a 4.000-6.500 x g durante 1-5 min, preferiblemente a 5.790 xg durante 2 min y la columna se centrifuga a>
15.000 x g durante 0,5-5 min, preferiblemente a> 20,000 x g durante 1 min, respectivamente. Esto es seguido por una hidrólisis alcalina, en la que se añaden 470-530 jl, preferiblemente 500 jl de una solución que comprende 0,2 mol/l de hidróxido de sodio y 90% de etanol durante 11-20 minutos a 17-24 °C, preferiblemente durante 15 min a temperatura ambiente a la columna y con ello al ADN. Esta solución se retira por centrifugación de la placa a 4.000-6.500 xg durante 1-5 min, preferiblemente a 5.790 xg durante 2 min y de la columna a> 15,000 xg durante 0,5-5 min, preferiblemente por> 20,000 xg durante 1 min, respectivamente. Aunque no es necesario, puede ser favorable repetir la etapa de lavado que incluye la etapa de centrifugación subsecuente con el regulador de lavado AW1 como se describió anteriormente. Sin embargo, la columna se lava mediante la adición de 300-750 jl, preferiblemente 500 jl de regulador de lavado AW2. Esto es seguido por una centrifugación de la placa a 4.000-6.500 xg durante 5-30 min, preferiblemente a 5.790 xg durante 15 min y de la columna a> 15,000 xg durante 0.5-10 min, preferiblemente a 20,000 xg durante 3 min, respectivamente. Además, después de eliminar el flujo a través de la columna, se centrifuga a > 15,000 x g durante 0,5-5 min, preferiblemente a 20,000 x g durante 1 min. La elución del ADN de una columna de una placa se lleva a cabo mediante la adición de 75-170 jl, preferiblemente 120 jl de regulador de elución que puede ser Ae, AVE o EB (todos Qiagen) o agua, cada uno precalentado a 60-80 °C, preferiblemente a 70 °C. La placa se incuba durante 1-20 min a 15-30 °C, preferiblemente durante 5 min a temperatura ambiente, antes de centrifugarse a 4.000-6.500 x g durante 0.5-20 min, preferiblemente a 5.790 x g durante 2 min. La elución del ADN de una columna del DNeasy Tissue Kit, el QlAamp DnA Mini Kit, el QlAamp DNA Micro Kit, el QlAamp Viral RNA Mini o el QlAamp DSP Virus Kit se lleva a cabo de la siguiente manera: En una primera aplicación se añaden 25-150 jl, preferiblemente 35-120 jl de regulador de elución. El regulador de elución puede ser AE, AVE o EB (todos Qiagen) o agua, cada uno ajustado a 15-30 °C, preferiblemente a temperatura ambiente. Después de la incubación durante 0,5-20 min a 15-30 °C, preferiblemente durante 1-5 min a temperatura ambiente, la columna se centrifuga durante 0,5-5 min a 4.000-8.000 x g, preferiblemente durante 1 min a 6.000 x g. Aunque no es necesario, podría ser favorable realizar un segundo paso de elución. Al hacerlo, se añaden 25-75 jl, preferiblemente 35-60 jl del regulador de elución especificado anteriormente. Nuevamente, la columna se incuba durante 0,5-20 min a 15-30 °C, preferiblemente durante 1-5 min a temperatura ambiente, antes de centrifugarse durante 0,5-5 min a 4.000-8.000 xg, preferiblemente durante 1 min a
6.000 x gramo. El flujo a través de la primera y segunda etapa de elución que contiene el ADN se combinan.
En una realización preferida, la etapa de purificación de ADN comprende
mezcla de 140 jl de muestra tratada con bisulfito con 560 jl de regulador de unión,
adición de 560 jl de etanol,
centrifugación a 1,450 x g durante 1 s,
incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos,
aplicación de la mezcla de reacción en una o dos etapas en una placa del DNeasy 96 Tissue Kit, el QlAamp 96 DNA Blood Kit, o el QlAamp DSP 96 Virus MDx Kit o en una columna del DNeasy Tissue Kit, el QlAamp DNA Mini Kit , el QlAamp DNA Micro Kit, el QlAamp Viral RNA Mini, el QlAamp DSP Virus Kit,
centrifugación de la placa a 5.790 x g durante 4 minutos o de la columna a> 20.000 x g durante 1 minuto,
aplicación de 500 jl de regulador AW1 y subsecuente centrifugación de la placa a 5.790 xg durante 2 minutos o de la columna a> 20.000 xg durante 1 minuto,
aplicación de 500 jl de una solución que contiene 0,2 mol/l de hidróxido de sodio y 90% de etanol, incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente y subsecuente centrifugación de la placa a 5,790 x g durante 2 min o de la columna a> 20,000 x g durante 1 min,
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opcional, aplicación de 500 |jl de regulador AW1 y subsecuente centrifugación de la placa a 5.790 x g durante 2 minutos o de la columna a> 20.000 xg durante 1 minuto,
aplicación de 500 jl de regulador AW2 y subsecuente centrifugación de la placa a 5.790 xg durante 15 minutos o de la columna a 20.000 xg durante 3 minutos,
centrifugación de la columna a 20,000 x g por 1 min,
elución del ADN de la placa mediante la aplicación de 120 jl de regulador de elución AE, AVE o EB o agua precalentada a 70 °C, incubación durante 5 min a temperatura ambiente y centrifugación durante 2 min a 5.790 xg o elución del ADN de una columna mediante una primera aplicación de 35-120 jl de regulador de elución AE, AVE o EB o agua ajustada a temperatura ambiente, incubación durante 1-5 minutos a temperatura ambiente y centrifugación durante 1 minuto a 6.000 xg, y una segunda aplicación opcional de 35-60 jl de regulador de elución Ae, AVE o EB o agua ajustada a temperatura ambiente, incubación durante 1-5 minutos a temperatura ambiente y centrifugación durante 1 minuto a 6.000 x g.
En una realización preferida, la etapa de purificación se lleva a cabo por medio de un dispositivo de filtro Microron™ (Millipore). Esto se hace esencialmente como se describe en las instrucciones del fabricante con una etapa adicional de hidrólisis alcalina y algunas modificaciones. La muestra después del tratamiento con bisulfito se ajusta con agua hasta un volumen de 350-500 jl, antes de aplicarse a un dispositivo de filtro Microron™ que detiene el ADN. A continuación, se aplican 25-1.000 jl de una solución que comprende 0,1-0,3 mol/l, preferiblemente 0,15-0,25 mol/l, y particularmente preferido 0,2 mol/l de hidróxido de sodio, en donde es favorable pero no necesario incubar la solución alcalina para 3 -25 min a 15-26 °C. El dispositivo luego se lava con 200-1,000 jl de regulador TE. El regulador TE tiene un pH de 8,0 y comprende 10 mmol/l de Tris (tris-hidroximetilaminometano) y 0,1 mmol/l de EDTA. El ADN se elimina del dispositivo por medio de 30-100 jl de regulador TE precalentado a 40-65 °C. El regulador en el dispositivo se incuba durante 5-25 min a 10-60 °C y luego contendrá el dNa.
En una realización, la etapa de purificación se lleva a cabo por medio de un dispositivo de filtro Microron™, que comprende
ajuste de la muestra después de la reacción de bisulfito con agua hasta un volumen de 350-500 jl, aplicación del ADN en un dispositivo de filtro Microron™,
tratamiento con 25-1,000 jl de hidróxido de sodio 0,2 mol/l, incubación opcional durante 3-25 min a 15-26°C,
lavar con 200-1,000 jl de regulador TE, el regulador TE pH 8,0 que contiene 10 mmol/l de tris-hidroximetil-amino- metano y 0,1 mmol/l de EDTA,
eliminación del ADN por medio de 30-100 jl de regulador TE precalentado a 40-65 °C incubado durante 5-25 min a 10-60°C.
En una realización particularmente preferida, la muestra después de la reacción con bisulfito se ajusta con agua hasta un volumen de 370-450 jl, preferiblemente de 400 jl para la purificación. La mezcla luego se agrega a un dispositivo de filtro Microron™. Subsecuentemente, el dispositivo se centrifuga a 10, 000-18,000 x g durante 5-30 min, preferiblemente a 14,000 x g durante 15 min. Aunque no es necesario, es favorable seguir con 1-2 repeticiones de una etapa de lavado. Para cada etapa de lavado se añaden 400 jl de regulador TE como se describió anteriormente y subsecuentemente el dispositivo se centrifuga a 10.000-18.000 xg durante 5-30 minutos, preferiblemente a 14.000 xg durante 12 minutos. Después, se añaden al dispositivo 50-700 jl, preferiblemente 100-400 jl de hidróxido de sodio 0,2 mol/l. Aunque no es necesario, es favorable incubar la solución del dispositivo durante 5-20 minutos a 15-30 °C, preferiblemente durante 10 minutos a temperatura ambiente. Subsecuentemente, el dispositivo se centrifuga a 10.000
18.000 xg durante 5-30 minutos, preferiblemente a 14.000 xg durante 10-12 minutos. Después de esto, el dispositivo se lava de 1 a 4 veces como se describió anteriormente. El ADN se recupera mediante elución en uno o dos pasos. De este modo, se añaden 30-85 jl, preferiblemente por 37.5-75 jl del regulador TE precalentado a 45-60 °C, preferiblemente a 50 °C. El regulador en el dispositivo se incuba luego durante 7-15 min a 12-55 °C, preferiblemente durante 10 min a 15-50 °C, antes de que el dispositivo se invierta y se centrifugue a 500-5,000 xg a 0.5-20 min, preferiblemente a 1,000 xg por 5 min. Esta realización se lleva a cabo esencialmente como se describe en el documento WO05/038051.
En una realización preferida, la etapa de purificación comprende
ajuste de la muestra después de la reacción de bisulfito con agua hasta un volumen de 400 jl,
aplicación de la mezcla en un dispositivo de filtro Microcron™ y subsecuente centrifugación a 14,000 x g por 15 min,
opcional, 1-2 repeticiones de la siguiente etapa de lavado: aplicación de 400 jl de regulador TE, el regulador TE pH 8 conteniendo 10 mmol/l de tris-hidroximetilamino-metano y 0.1 mmol/l de EDTa, centrifugación subsecuente a 14,000 xg para 12 min,
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aplicación de 100-400 |jl de hidróxido de sodio 0,2 mol/l, incubación opcional durante 10 min a temperatura ambiente y centrifugación subsecuente a 14,000 x g durante 10-12 min
1-4 repeticiones de lo siguiente: aplicación de 400 jl de agua o regulador TE y subsecuente centrifugación a 14,000 x g por 12 min
elución en una o dos etapas mediante la aplicación de 37,5-75 jl de regulador TE precalentado a 50 °C, incubación durante 10 min a 15-50 °C, y subsecuente inversión del dispositivo de filtro Microron™ y centrifugación a 1.000 x g durante 5 min.
Etapa de amplificación
En una realización de la invención la etapa de amplificación comprende una detección de posiciones que están metiladas en el ADN genómico de la muestra archivada. Alternativamente, también comprende una detección de posiciones que son no metiladas en el ADN genómico de la muestra archivada. Desde luego, también es posible detectar simultáneamente las posiciones que están metiladas y detectar posiciones que no están metiladas en el ADN genómico de la muestra archivada por la etapa de amplificación.
Se prefiere especialmente que el patrón de metilación sea analizado por medio de secuenciación con bisulfito, el método COBRA, el método Ms-SNuPE (Extensión de Cebador de Nucleótido Individual Sensible a Metilación), el método MSP (metilación Específico para Metilación), incluyendo el método MSP anidado, el método HeavyMetil™, el método MetiLight™, o el ensayo qM. Desde luego, si se desea, también es posible combinar dos o más de estos métodos.
En una realización de la invención, la etapa de amplificación se lleva a cabo por uno o más de los siguientes métodos y/o por una combinación de uno o más de los siguientes métodos de uno con otro: PCR, el método de secuenciación con bisulfito, el método COBRA, el método Ms-SNuPE (Extensión de Cebador de Nucleótido Individual Sensible a Metilación), el método MSP (metilación Específico para Metilación), el método MSP anidado, el método HeavyMetil™, el método MetiLight™, o el ensayo QM.
De acuerdo con la invención, se da una mejor capacidad de amplificación si se hace una o más de las siguientes enmiendas en comparación con las condiciones normales que una persona con habilidades normales en la técnica escogería probablemente con respecto a los métodos especificados anteriormente: i) incremento en la concentración de la actividad de polimerasa; ii) incremento en la concentración de cada nucleótido, con lo cual simultáneamente la concentración de cloruro de magnesio también tiene que ser ajustada como se explica más adelante; y iii) elongación del tiempo para la etapa de elongación y fusión como se explica más adelante. Este es el caso para el ADN tratado con bisulfito derivado de muestras archivadas así como para ADN genómico no tratado con bisulfito derivado de muestras archivadas.
En una realización preferida de la invención la etapa de amplificación se lleva a cabo con el uso de ADN polimerasa y comprende uno o más de lo siguiente: A) La concentración de ADN polimerasa está en el rango de 0.05-0.3 U/pl de la mezcla de reacción. B) La concentración de cada nucleótido está en el rango de 200-800 pmol/l. Por lo tanto la concentración de cloruro de magnesio (MgCh) en la mezcla de reacción se ajusta a la concentración de nucleótidos como es bien conocido por los experimentados en la técnica. C) El tiempo para elongar el ADN de plantilla está en el rango de 0.1-1.0 s/bp del ADN de plantilla. Este tiempo usualmente comprende para un PCR la etapa de elongación así como la etapa de fusión si el caso. Si la fusión se lleva a cabo a una temperatura por debajo de 53°C, este tiempo corresponde solamente a la etapa de elongación.
En una realización, el método de la invención incluye un método para amplificar ADN derivado de una muestra archivada, que comprende uno o más de los siguientes:
- la concentración de polimerasa está en el rango de 0.05-0.3 U/pl,
- la concentración de cada nucleótido está en el rango de 200-800 pmol/l,;
- el tiempo de la etapa de elongación está en el rango de 0.1-1.0 s/bp.
En una realización particularmente preferida la etapa de amplificación comprende uno o más de los siguientes: A) Una concentración de polimerasa en el rango de 0.08-0.25 U/pl, preferiblemente la concentración es 0.15 U/pl en la mezcla de reacción. B) La concentración de cada nucleótido está en el rango de 350-650 pmol/l, preferiblemente la concentración de cada nucleótido es 400 pmol/l en la mezcla de reacción. Como ya se explicó anteriormente la concentración de cloruro de magnesio (MgCh) en la mezcla de reacción se ajusta por lo tanto a la concentración de los nucleótidos como es bien conocido por los expertos en la técnica. C) El tiempo para elongar el ADN de plantilla está en el rango de 0.25-0.75 s/bp del ADN de plantilla, preferiblemente es 0.5 s/bp del ADN de plantilla. Como ya se describió, este tiempo comprende usualmente para un PCR en la etapa de elongación así como la etapa de fusión si el caso. Si la fusión se lleva a cabo a temperaturas por debajo de 53°C, este tiempo corresponde solamente a la etapa de elongación.
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En una realización preferida, la etapa de amplificación comprende uno o más de los siguientes:
- la concentración de polimerasa es 0.15 U/jl,
- la concentración de cada nucleótido es 400 jmol/l,
- el tiempo de la etapa de elongación es 0.5 s/bp.
En una realización preferida de la invención, la etapa de amplificación se lleva a cabo con el fin de amplificar un fragmento definido, una subfracción de fragmentos o para amplificar el genoma completo. Para esto, puede usarse uno o más de los métodos tal como son conocidos para los experimentados en la técnica. Para esto, la etapa de amplificación puede ser llevada a cabo mediante reacciones de amplificación que no son métodos basados en PCR por ejemplo, por la técnica NASBA/TMA. Pero más preferiblemente, se usan los métodos de reacción en cadena mediada por ligasa (LCR), y en particular la reacción en cadena de polimerasa (PCR).
Preferiblemente, tal amplificación se utiliza para un enriquecimiento del ADN de interés que lleva la información epigenómica de la muestra archivada. Después de esto puede ejecutarse cualquier método para análisis por metilación, en particular, el método de secuenciación por bisulfito, el método COBRA, el método Ms-SNuPE (Extensión de Cebador de Nucleótido Individual Sensible a Metilación), el método MSP (metilación Específico para Metilación), el método MSP anidado, el método HeavyMetil™, el método MetiLight™, o el ensayo QM.
Adicionalmente, también se prefiere que después de una amplificación de un fragmento definido, una subfracción de fragmentos o el genoma completo el ADN amplificado es sometido a análisis adicionales, por ejemplo el análisis de mutaciones puntuales o SNP.
En principio, de acuerdo con la invención es posible que las mezclas de reacción de la amplificación comprendan más de dos cebadores. Por lo tanto la amplificación dará como resultado más de un amplicón. En caso de que la amplificación se lleve a cabo por PCR, tal procedimiento es conocido como PCR multiplex por los experimentados en la técnica. Tal procedimiento es en particular ventajoso si solamente hay disponibles pequeñas cantidades de ADN. Adicionalmente tiene también la ventaja de una reducción de costes, disminución del esfuerzo de manipulación y acortamiento del experimento, por ejemplo, resultados obtenidos más tempranamente.
Realizaciones para pequeñas cantidades de una muestra archivada como material de partida
En una realización de la invención, se usan pequeñas cantidades de una muestra archivada como material de partida. Tales pequeñas cantidades pueden ser cualquier parte de un tejido de una muestra archivada. Esta parte de tejido está en el siguiente rango de tamaño: el área está entre 0,025-50 mm2, preferiblemente entre 0,05-10 mm2, y lo más preferiblemente entre 0,1-3 mm2. De ese modo, el grosor de la parte de tejido está en el rango de 5-20 pm, preferiblemente en el rango de 7-13 pm, y lo más preferiblemente la parte de tejido tiene un grosor de 10 pm. Por supuesto, las partes de tejido con otras dimensiones también son aplicables. Si la parte de tejido es de un volumen diferente, una persona con experiencia normal en la técnica sabrá cómo ajustar las siguientes realizaciones para pequeñas cantidades de una muestra archivada como material de partida.
Microdisección
En una realización preferida, la célula de una muestra archivada se microdiseca. Por lo tanto, una sección de una muestra archivada en el rango de 5-20 pm, preferiblemente en el rango de 7-13 pm, y lo más preferiblemente de 10 pm de grosor se monta en un portaobjetos como se especifica a continuación. La microdisección se puede realizar, por ejemplo, mediante un procesamiento de captura láser. Pero cualquier otro método conocido por los expertos en la técnica es también adecuado.
Diversos métodos para la microdisección por medio de un procesamiento de captura por láser son conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, Eltoum IA, Siegal GP and Frost AR. 2002. Microdissection of histologic sections: past, present, and future. Adv Anat Pathol. Sep;9(5):316-22). En una realización preferida, el método de captura por láser es el sistema AutoPix™ LCM (Arcturus, EE. UU.). En resumen, una película se fusiona térmicamente con el área de tejido respectiva por medio de un láser, con lo que se disecciona el área del tejido.
En otra realización preferida, la microdisección mediada por láser se lleva a cabo montando la sección de tejido sobre un portaobjetos recubierto con membrana, por ejemplo sobre MembraneSlides (P.A.L. M. Microlaser Technologies AG, Alemania).
En otra realización preferida, la sección de tejido se monta sobre un portaobjetos microscópico convencional. Después de esto, la sección de tejido se somete a una tinción antes de que las áreas deseadas se microdisecten. Por supuesto, también son aplicables procedimientos similares siempre que permitan la identificación de las partes deseadas de la muestra, en particular siempre que permitan la identificación de la célula o grupo de células deseado en la muestra. Dicha tinción puede ser, por ejemplo, también una tinción con hematoxilina-eosina, una tinción con azul de metileno, una tinción con hemo-eosina, una tinción con azan, una tinción periódica con ácido-schiff, una tinción con azul prusiano, una tinción con Masson-Goldner, una tinción con Ladewig , una tinción elastica-van Gieson, una tinción de
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Gomori, una tinción de verde de metilo, una tinción roja rápida nuclear, una tinción de azul de Evans, una tinción de color verde claro SF de color amarillento, una tinción de Wright, una tinción de May-Grunwald, una tinción azul de toluidina O, una tinción azul de B, una tinción de Giemsa o cualquier otra tinción histológica o histopatológica. Pero también se puede usar cualquier tinción inmunohistológica, por ejemplo, cualquier tipo de tinción que se base en anticuerpos o en la hibridación de ADN o ARN. Estos métodos de tinción están bien descritos y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las realizaciones correspondientes se incluyen a continuación en el método de acuerdo con la invención. Por supuesto, cualquier tinción puede omitirse por completo si no se desea o no es adecuada para la microdisección.
La microdisección se lleva a cabo por medio de un instrumento Microbeam (P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Bernried, Alemania). Pero también se pueden usar instrumentos similares que permitan una disección de células individuales, de un grupo de células o de partes de tejido de acuerdo con la invención. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica y, por lo tanto, se incluyen aquí como realizaciones preferidas.
El material diseccionado se recoge en tubos preferiblemente con tapas adhesivas para su procesamiento adicional. Las tapas adhesivas pueden ser de cualquier tipo de tapas adhesivas, por ejemplo, Adhesive Caps 200 (P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Bernried, Alemania). Debido a la microdisección, no es necesaria la eliminación de parafina.
En otra realización preferida, el material diseccionado se recoge en la tapa de un tubo normal que contiene el volumen de regulador de lisis especificado a continuación.
Etapa de Lisis
En una realización, el material de muestra microdisecado se somete a una etapa de lisis. Por lo tanto, se añadieron cuidadosamente 20 pl de regulador de lisis (50 mmol/l de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mmol/l de EDTA, 0,5 v/v% de Tween, 10 ng/pl de poli-dA, 3 mg/ml de proteinasa K) a la tapa. Como ya se ha descrito anteriormente, también son aplicables otros reguladores de lisis como los conocen los expertos en la técnica. Los tubos se cerraron cuidadosamente evitando un aflojamiento de la caída de la tapa. Subsecuentemente, los tubos se incubaron durante 1-48 h, preferiblemente durante 5-24 h, y lo más preferiblemente durante 12 ha 40-80 °C, preferiblemente a 50-70 °C, y lo más preferiblemente a 60 °C. Esto puede hacerse, por ejemplo, en un baño de agua, un termomezclador o un ciclador de PCR. Si se utiliza un ciclador de PCR, preferiblemente también la tapa del ciclador se ajusta a la misma temperatura que el ciclador, porque el material de muestra se encuentra en las tapas.
Después de la incubación, la muestra se centrifuga para transferir la muestra lisada al fondo del tubo.
En una realización preferida, la cantidad de regulador de lisis se ajusta a los tamaños del material diseccionado. Esto se caracteriza porque al menos el material diseccionado está completamente cubierto por el regulador de lisis. Después de la lisis del material, el regulador de lisis se concentra a 20 pl por centrifugación al vacío, liofilización o cualquier otro método adecuado como conocen los expertos en la técnica.
Tratamiento con bisulfito
En una realización, la muestra lisada es sometida entonces directamente a tratamiento con bisulfito debido a la pequeña cantidad de material de partida y por lo tanto de ADN. Para el tratamiento con bisulfito, se agregan a la tapa 9-70 pl, preferiblemente 12-52 pl, y lo más preferiblemente 38 pl de solución de bisulfito. Se utiliza una solución de bisulfito tal como ya describió anteriormente. Subsecuentemente la solución de bisulfito en la tapa es incubada durante 0.5-15 minutos, preferiblemente durante 2-10 minutos, y lo más preferiblemente durante 5 minutos a 0-80°C, preferiblemente a 10-40°C, en particular preferiblemente a 15-30°C, y lo más preferiblemente a temperatura ambiente. La adición e incubación de la solución de bisulfito en la tapa disuelve cualquier ADN remanente en la tapa. Después de la incubación, la muestra es centrifugada.
En una realización preferida, la adición de la solución de bisulfito se lleva a cabo en dos etapas que se parecen entre sí. Esto tiene la ventaja de que todo el ADN unido a la tapa es sujeto para procesamiento subsecuente. En la primera etapa, se agregan 9-35 pl, preferiblemente 12-26 pl, y lo más preferiblemente 19 pl de solución de bisulfito. Se utiliza una solución de bisulfito como ya se describió anteriormente. Subsecuentemente la solución de bisulfito en la tapa es incubada durante 0.5-15 minutos, preferiblemente durante 2-10 minutos y lo más preferiblemente durante 5 minutos a 0-80°C, preferiblemente a 10-40°C, en particular preferiblemente a 15 a 3.0°C, y lo más preferiblemente a temperatura ambiente. La adición e incubación de la solución de bisulfito en la tapa disuelve cualquier ADN remanente en la tapa. Después de la incubación, la muestra es centrifugada, antes de que se agregue de nuevo solución de bisulfito en una segunda etapa que es repetición de la primera etapa.
Después de esto, en una realización, se agregan 2-12 pl, preferiblemente 4-8 pl, y lo más preferiblemente 6 pl de la solución de DME como se describió anteriormente. La conversión con bisulfito en lo que sigue se lleva a cabo como se describió ya anteriormente. Las realizaciones correspondientes para cantidades pequeñas de material de partida están incluidas aquí. En una realización particular se aplica el siguiente protocolo de temperaturas: 5 minutos 99°C, 22 minutos 60°C, 3 minutos 99°C, 97 minutos 60°C, 3 minutos 99°C y 177 minutos 60°C. Por lo tanto se usan uno o más baño de agua, termomezcladores o ciclizadores de PCR.
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Purificación de ADN
En una realización, el ADN después del tratamiento con bisulfito se purifica. Por lo tanto, pueden usarse métodos para la purificación de pequeñas cantidades de ADN tal como los conocen los expertos en la técnica. En una realización preferida, la purificación se lleva a cabo por medio de columnas Zymo-Spin IC (Zymo Research, EE. UU.). Por lo tanto, se añadieron 75-250 pl, preferiblemente 125-210 pl, y lo más preferiblemente 166 pl de regulador AVL, AL o ATL (todos de Qiagen, Alemania) a las columnas de Zymo-Spin IC. A continuación, la mezcla de reacción de bisulfito se agrega a la columna. La punta de pipeta usada puede colocarse en el tubo de reacción de bisulfito respectivo para su uso posterior con el fin de evitar la pérdida de ADN debido a que las gotas se pegan en la punta, pero esto no es estrictamente necesario de acuerdo con la invención. De acuerdo con la invención también se puede usar una nueva punta de pipeta. Además, se añaden 20-170, preferiblemente 60-120 pl, y lo más preferiblemente 90 pl de regulador AVL, AL o ATL al tubo de reacción de bisulfito vacío y posteriormente se transfieren a la columna IC Zymo-Spin correspondiente. La mezcla de reacción de bisulfito y el regulador AVL, AL o ATL transferido se mezclan en las columnas transfiriendo con pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces. Subsecuentemente, la mezcla se incuba en la columna durante 1-30 minutos, preferiblemente durante 3-15 minutos, y lo más preferiblemente durante 10 minutos a 0-60°C, preferiblemente a 10-40°C, en particular preferiblemente a 15-30. °C, y lo más preferiblemente a temperatura ambiente. Después de esta incubación, se añaden 175-400 pl, preferiblemente 225-275 pl, lo más preferiblemente 250 pl de etanol a las columnas y se mezclan. Posteriormente, la columna se centrifuga durante 0,5-10 min, preferiblemente durante 1-5 min, lo más preferiblemente durante 1 min a 10,000-20,000 x g, preferiblemente para 14,000-18,000 x g, y lo más preferiblemente para 16,000 x g. La columna se transfiere entonces a un nuevo tubo de recolección de 2 ml. Después de esto, se añaden 250-750 pl, preferiblemente 350-650 pl, y lo más preferiblemente 500 pl de un regulador o solución que comprende 0,2 mol/l de NaOH y/o 90% v/v de etanol a la columna. También en su lugar, se pueden usar soluciones amortiguadoras o soluciones adecuadas como se describieron anteriormente. A continuación, la columna se centrifuga durante 0,5-10 min, preferiblemente durante 1-5 min, lo más preferiblemente durante 1 min a 10,000-20,000 x g, preferiblemente para 14,000-18,000 x g, y lo más preferiblemente para 16,000 x g. La columna se transfiere a un nuevo tubo de recolección de 2 ml. Después de esto, se añaden 250-750 pl, preferiblemente 350-650 pl, y lo más preferiblemente 500 pl de regulador AW1 (Qiagen, Germay) a cada columna. De nuevo, la columna se centrifuga durante 0,5-10 min, preferiblemente durante 1-5 min, lo más preferiblemente durante 1 min a 10,000-20,000 xg, preferiblemente para 14,000-18,000 xg, y lo más preferiblemente para 16,000 xg y se transfiere a un nuevo tubo de recolección de 2 ml. A continuación, se añaden 250-750 pl, preferiblemente 350-650 pl, y lo más preferiblemente 500 pl de regulador AW2 (Qiagen, Germay) a cada columna. De nuevo, la columna se centrifuga durante 0,5-15 min, preferiblemente durante 1-8 min, lo más preferiblemente durante 3 min a 10,000-20,000 x g, preferiblemente para 14,000-18,000 x g, y lo más preferiblemente para 16,000 x g. Posteriormente, la columna se coloca en un tubo de recolección para la elución de ADN que es adecuada para un análisis posterior. La elución se lleva a cabo mediante una etapa. Por lo tanto, el ADN se eluye mediante la adición de 15-50 pl, preferiblemente de 20-30 pl, y lo más preferiblemente de 25 pl de agua o de regulador AE, AVE o EB (todos Qiagen) precalentados a 3070 °C, preferiblemente 40-60 °C, y lo más preferiblemente hasta 50 °C. A continuación, la columna se incuba durante 0-10 min, preferiblemente durante 1-5 min, lo más preferiblemente durante 1 min, antes de centrifugarse durante 0,510 min, preferiblemente durante 1-5 min, lo más preferiblemente durante 1 min a 1,000-10,000 xg, preferiblemente para 4,000-8,000 xg, y lo más preferiblemente para 6,000 x g.
En una realización preferida, la elución se lleva a cabo en dos etapas. En una primera etapa, el ADN se eluye mediante la adición de 7,5-25 pl, preferiblemente de 10-15 pl, y lo más preferiblemente de 12,5 pl de agua o de regulador AE, AVE o EB (todos Qiagen) precalentados a 30-70 °C, preferiblemente 40-60 °C, y lo más preferiblemente a 50 °C. A continuación, la columna se incuba durante 0-10 min, preferiblemente durante 1-5 min, lo más preferiblemente durante 1 min, antes de centrifugarse durante 0,5-10 min, preferiblemente durante 1-5 min, lo más preferiblemente durante 1 min a 1,000-10,000 xg, preferiblemente para 4.000-8.000 xg, y lo más preferiblemente para 6,000 x g. Después, la segunda etapa de elución se lleva a cabo como una repetición de la primera etapa de elución.
Análisis subsiguiente
En una realización, el ADN se cuantifica directamente después de la lisis o después del tratamiento con bisulfito y la subsecuente purificación por medio de un ensayo en tiempo real (véase el ejemplo 10).
En una realización preferida, el ADN después del tratamiento con bisulfito y la subsecuente purificación está sujeto a un análisis o amplificación subsecuente. En una realización particular, se prefiere que el análisis subsecuente sea un análisis del patrón de metilación del ADN original derivado de la muestra archivada.
Para el análisis o la amplificación del ADN purificado y tratado con bisulfito derivado de pequeñas cantidades de una muestra archivada, consulte lo dicho anteriormente de acuerdo con la etapa de amplificación. Las realizaciones correspondientes se incluyen aquí.
Uso de los métodos
Los métodos divulgados aquí se usan preferiblemente para la detección del estado de metilación del ADN de una muestra tomada de un tejido de una persona enferma o saludable o de una persona cuyo estado de salud no está determinado hasta el momento con respecto a una enfermedad definida. En una manera particularmente preferida los
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estados de metilación de ADN así determinados son comparados entonces uno con otro y/o con referencia a un estado de metilación de ADN de referencia.
Por lo tanto la invención también comprende el uso del método de acuerdo con una o más de las realizaciones para la detección del estado de metilación del ADN.
En caso de que el estado de salud de una persona de quien se deriva la muestra no está o está solo insuficientemente determinado hasta el momento, los resultados del análisis de estado de metilación del ADN pueden ser utilizados para determinar el estado de salud de dicha persona con respecto a una enfermedad específica o cualquier predisposición para una enfermedad específica. Por lo tanto se prefiere particularmente que el estado de metilación de ADN se use para diagnóstico de una enfermedad o para diagnosticar una predisposición hacia una enfermedad. Adicionalmente, también se prefiere particularmente que el estado de metilación de aDn se utiliza para el diagnóstico de una progresión de una enfermedad, si el estado de salud de una persona con respecto a dicha enfermedad específica ha sido ya determinado.
De acuerdo con la invención, el uso de los métodos descritos aquí se prefiere especialmente si la enfermedad es una enfermedad de tipo cáncer.
El uso de métodos descritos aquí se prefiere en particular, si el uso está caracterizado porque el estado de metilación de ADN se utiliza para diagnosticar una enfermedad, para diagnosticar una predisposición para una enfermedad y/o para diagnosticar la progresión de una enfermedad, en donde en particular la enfermedad es una enfermedad tipo cáncer.
El uso de métodos descritos aquí se prefiere en particular, si está caracterizado porque se predice si el estado de salud de una persona será influenciado positiva o negativamente por un fármaco o sustancia química o no. Esto es preferido particularmente si el uso de los métodos descritos aquí está caracterizado porque el estado de metilación de ADN se utiliza para predecir si el estado de salud de una persona será influenciado positiva o negativamente por un fármaco o sustancia químico o no. El uso es preferido especialmente si el estado de salud está caracterizado por una enfermedad, una predisposición para una enfermedad y/o por una progresión de una enfermedad. Esto es lo más especialmente preferido si la enfermedad es una enfermedad tipo cáncer.
El uso de los métodos y kits descritos aquí es especialmente preferido si el estado de metilación de ADN es caracterizado porque las posiciones están metiladas o no metiladas en comparación con condiciones normales y si existe una enfermedad definida individual o una predisposición para una enfermedad definida individual. Desde luego, el uso de los métodos descritos aquí también es preferido si el estado de metilación de ADN puede ser también caracterizado en que las posiciones están metiladas o no metiladas en comparación con diversos niveles de condiciones de enfermedad y si existe una enfermedad gradualmente progresiva.
El uso de métodos descritos aquí es preferido especialmente, si el estado de metilación de ADN está caracterizado en que las posiciones están metiladas o no metiladas en comparación con condiciones normales si existe una enfermedad definida individual.
Si el estado de salud de una persona de quien se deriva la muestra es determinado independientemente a partir del estado de metilación del ADN, los resultados del análisis del estado de metilación del ADN pueden ser utilizados para identificar un estado de metilación de ADN específico de una enfermedad. Tal estado de metilación de ADN específico de una enfermedad puede incluir uno o más sitios de una metilación potencial de ADN y/o el conocimiento de la presencia o ausencia de una metilación en dinucleótidos CG, en el caso de presencia o ausencia de una enfermedad particular. Por lo tanto se prefiere particularmente utilizar cualquier método descrito en aquí para la identificación de un objetivo específico de indicación. De acuerdo con esto, a) se prepara el ADN de una muestra archivada originada de un tejido enfermo y se determina el estado de metilación del ADN; b) se prepara el ADN de una muestra originada de un tejido saludable y se determina el estado de metilación del ADN; c) se define un objetivo específico de indicación como la diferencia en el estado de metilación de ADN de un ADN derivado de un tejido enfermo en comparación con el ADN derivado de un tejido saludable. Por lo tanto la muestra de tejido enfermo y la muestra del tejido saludable pueden originarse de diferentes personas. Preferiblemente estas personas son parientes. Se prefiere particularmente que la muestra del tejido enfermo y la muestra del tejido saludable se originen de la misma persona, y se prefiere especialmente que las muestras se originen de tejidos adyacentes.
Desde luego, de la misma manera también pueden identificarse objetivos específicos de indicación que son específicos para una predisposición a una enfermedad o que son específicos para una progresión de una enfermedad.
El uso de acuerdo con una o más realizaciones de acuerdo con la invención es preferido para identificar un objetivo específico de indicación, en donde
a) se prepara el ADN de una muestra archivada originada de un tejido enfermo y se determina el estado de metilación del ADN,
b) se prepara el ADN de una muestra originada de un tejido saludable y se determina el estado de metilación del ADN,
c) se define un objetivo específico de indicación como las diferencias en el estado de metilación de ADN de un ADN derivado de un tejido enfermo en comparación con el ADN derivado de un tejido saludable.
El uso de los métodos descritos aquí es preferido si el objetivo específico de indicación es una proteína, péptido o ARN o cualquier otra sustancia bioactiva endógena como por ejemplo hormonas.
5 En particular, el uso es preferido si el objetivo específico de indicación es una proteína, péptido o ARN.
Dicho uso es preferido si un modulador conocido per se de la proteína, péptido, ARN u otra sustancia bioactiva endógena está asignado a la indicación específica del tejido enfermo.
En particular, se prefiere un uso en donde un modulador conocido per se de la proteína, péptido o ARN está asignado a la indicación específica del tejido enfermo.
10 Adicionalmente, el uso de tal modulador es particularmente preferido para preparar una composición farmacéutica en el caso de una indicación específica. Esto es especialmente preferido si la indicación específica es una indicación específica de cáncer.
En particular, se prefiere el uso del modulador asignado a la indicación específica del tejido enfermo para preparar una composición farmacéutica con una indicación específica, en particular una indicación específica de cáncer.
15 Los métodos divulgados aquí son usados preferiblemente para el diagnóstico y/o prognosis de eventos adversos para pacientes o individuos, con lo cual diagnóstico significa diagnosticar un evento adverso, una predisposición para un evento adverso y/o una progresión de un evento adverso. Estos eventos adversos pertenecen a al menos una de las siguientes categorías: interacciones indeseadas entre fármacos; enfermedades cancerosas; disfunción, daño o enfermedad del CNS; síntomas de agresión o perturbaciones de comportamiento; consecuencias clínicas, sicológicas 20 y sociales de daño cerebral; perturbaciones sicóticas y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; enfermedad, disfunción o daño cardiovasculares; disfunción, daño o enfermedad del tracto gastrointestinal; disfunción, daño o enfermedad del sistema respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o convalecencia; disfunción, daño o enfermedad del cuerpo tal como una anormalidad en el proceso de desarrollo; disfunción, daño o enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conectivo o de los huesos; disfunción, daño o enfermedad endocrinos 25 y metabólicos; dolores de cabeza o disfunción sexual.
Los métodos divulgados aquí también son preferiblemente utilizados para distinguir tipos de células, tejidos o para investigar diferenciación celular. Sirven en particular de manera preferida para analizar la respuesta de un paciente a un tratamiento con un fármaco.
Métodos para el análisis de metilación de ADN
30 Los siguientes métodos para la detección de la metilación de ADN son todas las realizaciones preferidas de la invención. Estos métodos permiten la determinación del estado de metilación de uno o de una pluralidad de dinucleótidos CpG (por ejemplo, islas CpG) dentro de una secuencia de ADN. Tales métodos que involucran, entre otras técnicas, el método DMH, secuenciación de ADN tratado con bisulfito, un cierto número de ensayos de metilación con base en PCR, algunos de ellos - conocidos como COBRA, MS-SNuPE, MSP, MSP anidado, HeavyMetilTM, 35 MetiLightTM y ensayo QM - son descritos en mayor detalle ahora:
MÉTODO DMH. El método DMH se lleva a cabo de acuerdo con la invención tal como está descrito en principio en Huang et al. (Huang et al., Hum Mol Genet, 8:459-470,1999), en la US 09/497,855, en la DE 102005007185.6, en la DE102005025 240.0, en la DE102005036500.0, o en la US 60/710,556. De acuerdo con éstos, el ADN genómico es fragmentado por endonucleasas de restricción antes de ser sometido a un microarreglo de ADN de islas CpG clonadas.
40 Pero el método DMH también incluye varias mejoras: Después del aislamiento del ADN, tiene lugar por diferentes medios un enriquecimiento del ADN metilado o no metilado. Estos medios pueden ser uno o más de los siguientes: por ejemplo endonucleasas de restricción o proteínas, péptidos u oligómeros que se enlazan especialmente al dinucleótido CpG bien sea específico sobre dinucleótidos CpG metilados o no metilados. Se prefieren especialmente cuatro variantes de enriquecimiento por medio de endonucleasas de restricción:
45 El enriquecimiento mediante el uso de enzimas de restricción específicas de la metilación solamente sin una adición previa de enzimas de restricción específicas de no metilación pero con una amplificación selectiva subsecuente de fragmentos en el rango de 50-5,000 bp a través de un enlazante (también conocidos como adaptadores por los experimentados en la técnica). Enzimas de restricción preferidas son del grupo "BisI, BstUI, BshI236l, AccII, BstFNI, McrBC, MvnI, HpaII (HapII), (HhaI, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV y mezclas de dos o más de las enzimas antes 50 mencionadas".
Otro enriquecimiento se lleva a cabo mediante una primera restricción de ADN por una o más enzimas de restricción específicas de la no metilación; en segundo lugar, fragmentos más pequeños de 50 bp son descartados y subsecuentemente se ligan enlazadores a cada extremo de cada fragmento; en tercer lugar, los fragmentos provistos con el enlazante son sujetos a restricción por una o más enzimas de restricción específicas de la metilación; y en
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cuarto lugar, los fragmentos resultantes son sometidos a una amplificación, en donde solamente se amplifican fragmentos que no son restringidos en la etapa tres. De acuerdo con este procedimiento se enriquecen los fragmentos de 50-5,000 bp. Por lo tanto es preferible que se usen tres enzimas de restricción específicas de la metilación diferentes, una o más de las enzimas de restricción específicas de metilación tienen un sitio de restricción en la longitud de 4 bp en particular que no contengan ningún CG. Las enzimas de restricción específicas de no metilación son seleccionadas del grupo "MseI, BfaI, Csp6I, TrulI, Tvu1I, Tru9I, Tvu9I, MaeI, XspI y mezclas de dos o más de las enzimas antes citadas". Preferiblemente se usa una mezcla de MseI, BfaI y Csp6I. Las enzimas de restricción específicas de la metilación pueden ser cualquier enzima que bien corte ADN no metilado o metilado específicamente por metilación. Preferiblemente la enzima específica de metilación es seleccionada del grupo de "BisI, BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, McrBC, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV, EagI y mezclas de dos o más de las enzimas antes citadas". En particular se prefiere el uso de BstUI, HpaII, HpyCH4IV y HinP1I.
Además de esto, un enriquecimiento también es posible de acuerdo con el método de "representación NotI" como se ejemplifica en WO02/086163. De acuerdo con esto, el ADN es restringido por enzimas adecuadas como BamHI de BglII. Después de la inactivación de las enzimas, el fragmento se hace circular por autoligación, antes de que sean sometidas a otra restricción por NotI la cual solamente corta su sitio de reconocimiento no metilado. A través de esto, solamente los fragmentos con sitios de reconocimiento de NotI no metilados son linealizados sobre los cuales se ligan los enlazantes específicos. Por lo tanto es posible amplificar aquellos fragmentos. En principio este método puede ser también ajustado a otras enzimas de restricción específicas de la metilación como las listadas anteriormente.
Como cuarto procedimiento de enriquecimiento por medio de endonucleasas de restricción, se prefiere la MS AP-PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa Cebada Arbitrariamente Sensible a la Metilación). Esta técnica es bien conocida en el arte y fue descrita por primera vez por Gonzalgo et al., Cancer Res., 57:594-599, 1997. En principio, el ADN genómico es sometido a una digestión de restricción, por ejemplo HpaII. Los fragmentos resultantes son sometidos entonces a una amplificación en donde se usan cebadores aleatorios los cuales son ricos en dinucleótidos CG. De acuerdo con esto, se amplifican regiones de ADN que son ricas en dinucleótidos CG.
Un enriquecimiento del ADN metilado o no metilado también puede suceder por medio de proteínas, péptidos u oligómeros que se enlazan específicamente a ADN metilado o no metilado. El enlazamiento puede ser específico o no específico de la secuencia. Sin embargo, se separa un ADN no enlazado por ADN enlazado a través del enlazamiento. Dependiendo de qué clase de ADN es de interés, el ADN metilado o no metilado, o cual clase de ADN está enlazado, la fracción enlazada o no enlazada de ADN es analizada adicionalmente. Esto significa que las proteínas pueden ser usadas con ADN no metilado específicamente elanzado, así como proteínas que se enlacen específicamente a ADN metilado. Adicionalmente, es posible enlazar ese ADN, el cual se analiza subsecuentemente. Por lo tanto el ADN no enlazado es retirado antes de que el ADN enlazado sea liberado de la proteína. Por otro lado también es posible dejar enlazar el ADN de fondo a las proteínas y por lo tanto ser retirado de la mezcla de reacción. Desde luego, también es posible llevar a cabo tal enriquecimiento en dos etapas subsecuentes mediante con lo cual el orden no es relevante. En una etapa, se usan las proteínas que se enlazan específicamente a ADN no metilado y en la otra etapa, las proteínas que se enlazan específicamente a ADN metilado. Tal procedimiento tiene la ventaja de que simultáneamente el ADN no metilado y el ADN metilado son enriquecidos mientras que el ADN sin o con solo unas pocas posiciones CpG es removido.
Puede lograrse un enriquecimiento por proteínas cuya metilación enlace específicamente a ADN y también mediante el uso de sus dominios o péptidos. Tales proteínas pueden ser, por ejemplo MeCP2, MBD1, mBD2, MBD4 y Kaiso. Esta última enlaza la secuencia específicamente a saber sobre posiciones CpGpCpG simétricas metiladas. A manera de ejemplo, el dominio de enlazamiento Metilo-CpG de la proteína MeCP2 o el dominio CXXC-3 de la proteína MBD1 se mencionan como dominios adecuados para enriquecimiento (para una revisión: Shiraishi et al., Anal Biochem. 2004 Jun 1; 329 (1):1-10; Hendrich and Tweedie, Trends Genet. 2003 May, 19 (5): 269-77; J0rgensen et al., Molecular and Cellular Biology, 2004, 3387-3395).
Típicamente, las proteínas, dominios o péptidos son enlazados a una superficie sólida por ejemplo sobre perlas que permiten una separación por medio de procedimientos por lotes o por una cromatografía de columna (Cross et al., Nature Genetics, 1994 (6) 236-244; Shiraishi et al., Anal Biochem. 2004 Jun 1; 329 (1):1-10). Los métodos bioquímicos que tienen que ser aplicados son conocidos por los experimentados en la técnica. Estos puede incluir por ejemplo el uso de marcadores de biotina o histidina (por ejemplo, Gretch et al., Anal Biochem., 1987, (163) 270-7; Janknecht et al., Prc Nat. Acad Sci, 1991, (88) 8972-6).
Además, un enriquecimiento también puede ser logrado por anticuerpos específicos de la metilación por ejemplo por medio del anticuerpo 5-metilcitosina disponible de Abcam Inc. De nuevo el enriquecimiento puede ser llevado a cabo en un procedimiento por lotes o por cromatografía de columna. Los detalles son conocidos por las personas experimentadas en el arte (por ejemplo: Fisher et al., Nucleic Acids Res. 2004, 32(1), 287-97). Por otro lado, un enriquecimiento también puede ser logrado por inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de la metilación y anticuerpos secundarios adecuados, seguido por un tratamiento con proteinasa K.
Otra variante de enriquecimiento es la inmunoprecipitación por cromatina (CHIP). Los detalles son conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo: Matarazzo et al., Biotechniques, 2004, 37(4), 666-8, 670, 672-3.) De acuerdo con esto, un inmunoprecipitación se lleva a cabo con anticuerpos que son específicos para proteínas que enlazan 5-
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metilcitosina como MeCP2, MBD1, MBD2, MBD4 o Kaiso. Por lo tanto las proteínas se fijan sobre el ADN antes de que se agreguen los anticuerpos. En particular se prefiere purificar el ADN primero y luego agregar las proteínas enlazantes al ADN. También se prefiere particularmente aplicar un método físico adecuado tal como ultracentrifugación antes de la segunda etapa de precipitación. Un kit adecuado está disponible de Panomics, Inc.
Adicionalmente, puede lograrse un enriquecimiento mediante oligómeros de enlazamiento triple, los cuales pueden ser oligómeros APN o ADN. Este método está descrito en detalle en WO04/113564. En principio, un oligómero de enlazamiento triple se pone en contacto con ADN. Después de esto forma preferencialmente una hélice triple con ADN no metilado en comparación con el ADN metilado. De esto se toma ventaja para el enriquecimiento.
En principio, un ADN puede ser fragmentado aleatoriamente o no aleatoriamente antes de ser sometido a enriquecimiento por cualquier método usando proteínas, péptidos u oligómeros. Esto se hace como es conocido por los experimentados en la técnica. La fragmentación puede ser llevada a cabo aleatoriamente por ejemplo con sonicación o desgarramiento. Pero también puede ser llevada a cabo no aleatoriamente, preferiblemente mediante el uso de endonucleasas de restricción específicas de la metilación, en particular del grupo de "BisI, BsfUI, BshI236I, AccII, BsfFNI, McrBC, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinP1I, HpyCH4IV y cualquier mezcla de dos o más de las enzimas antes mocionadas".
Una reducción adicional de la complejidad puede lograrse por métodos físicos los cuales se aplican antes o después de una amplificación. Tales métodos físicos pueden ser por ejemplo electroforesis en gel, cromatografía de exclusión por tamaño o filtración.
Después del enriquecimiento del ADN, los fragmentos son marcados preferencialmente con un colorante fluorescente adecuado. Tal colorante permite un barrido selectivo mono o bidimensional. Típicamente se usan Cy3 y/o Cy5 como colorantes. Pero también son conocidos otros colorantes adecuados por los experimentados en la técnica. Adicionalmente, se prefiere que los fragmentos sean marcados con biotina, la cual interactúa con otra sustancia en el proceso de detección realmente. Por lo tanto es necesario llevar a cabo dos disposiciones las cuales se comparan una con otra.
La marcación es llevada a cabo preferencialmente por medio de una amplificación, en particular amplificaciones del genoma completo. Varios métodos adecuados son conocidos por los experimentados en la técnica.
Los fragmentos marcados son sometidos entonces a una disposición de ADN la cual puede ser bien una disposición de islas CpG clonadas o una disposición de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos de la microdispoción de oligonucleótidos pueden ser cualquier oligonucleótido adecuado para la detección de la metilación o no metilación de dinucleótidos CpG. Preferiblemente los oligonucleótidos son diseñados después de los fragmentos derivados de acuerdo con las siguientes dos estrategias:
De acuerdo con la primera estrategia, A) el genoma de un organismo deseado es analizado en cuanto a sus primeros fragmentos, los cuales son flanqueados por sitios de reconocimiento de enzimas de restricción específicas de no metilación de interés y que están en el rango de 100-1,200 bp. B) Segundos fragmentos son seleccionados entonces bajo aquellos primeros fragmentos que tienen no más de 50%, preferiblemente no más de 20% de repeticiones. Estas dos etapas A) y B) pueden llevarse a cabo en orden arbitrario. Adicionalmente, C) los segundos fragmentos seleccionados son analizados en cuanto a la presencia de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción específicas de metilación de interés. Esos segundos fragmentos que incluyen tal sitio de reconocimiento son seleccionados como terceros fragmentos. De nuevo, las etapas A), B) y C) pueden ejecutarse en orden arbitrario.
De acuerdo con la segunda estrategia, A) el genoma de un organismo deseado es analizado en cuanto a primeros fragmentos, los cuales son flanqueados por sitios de reconocimiento de enzimas de restricción específicas de la metilación de interés y que están en el rango de 100-1,200 bp. B) Segundos fragmentos son seleccionados entonces bajo estos primeros fragmentos que no tienen más de 50%, preferiblemente no más de 20% de repeticiones. C) Los segundos fragmentos seleccionados son analizados en cuanto a la presencia de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción específicas de la metilación de interés. Estos segundos fragmentos que incluyen tal sitio de reconocimiento son seleccionados entonces como terceros fragmentos. De nuevo, las etapas A), B) y C) pueden llevarse a cabo en orden arbitrario.
Los fragmentos seleccionados de acuerdo a estas estrategias pueden coincidir con fragmentos obtenidos por procedimientos de enriquecimiento. La secuencia de los oligonucleótidos de la matriz disposición se escoge a partir de los fragmentos seleccionados, de tal manera que hibriden a los fragmentos seleccionados o que sean idénticos a ellos y por lo tanto hibriden a la contracadena. Estos oligonucleótidos son sintetizados entonces sobre la disposición o son enlazados a ella después de la síntesis. Típicamente se derivan 3-30 oligonucleótidos de un fragmento, con lo cual es posible que las secuencias de oligonucleótidos se superpongan. Preferiblemente los oligonucleótidos tienen una distancia definida entre uno y otro de tal forma que da como resultado la llamada "disposición de arado", similares a la descrita por Kapranov et al., Science, 2002, 296(5569):916-9.
De acuerdo con el método DMH, los fragmentos hibridados sobre los oligonucleótidos inmovilizados contienen preferiblemente secuencias de ácido nucleico, cuyas posiciones de metilación son no metiladas o metiladas en caso de una enfermedad definida en comparación a la condición normal Los oligonucleótidos no tienen que codificar
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necesariamente para las posiciones de mutilación por sí mismos, aunque es posible. Además, es posible que la disposición de oligonucleótidos porte diferentes conjuntos de oligonucleótidos, adecuados para la detección de diferentes enfermedades o de predisposiciones para una enfermedad o de la susceptibilidad a efectos secundarios para un tratamiento médico definitivo. Adicionalmente, también es posible predecir el tipo, la agresividad o la progresión de una enfermedad o la efectividad de un tratamiento médico, en caso de que se base sobre las diferencias de metilación. Pueden hacerse conclusiones adicionales por comparación de los resultados obtenidos por medio de una disposición de oligonucleótidos de acuerdo con el método DMH con un resultado obtenido con las disposiciones con diferentes conjuntos de oligonucleótidos, por ejemplo conjuntos de oligonucleótidos adecuados para análisis SNP.
SECUENCIACIÓN CON BISULFITO. Los patrones de metilación de ADN y distribución de 5-metilcitosina pueden analizarse por análisis de secuenciación de un fragmento amplificado previamente del ADN genómico tratado con bisulfito, como lo describe Frommer et al. (Frommer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Puesto que el ADN tratado con bisulfito es amplificado antes de la secuenciación, el procedimiento de amplificación de acuerdo con la invención puede ser utilizado en combinación con este método de detección.
COBRA. El análisis COBRA es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación de ADN en loci de genes específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). En resumen, la digestión con enzimas de restricción se utiliza para revelar diferencias en la secuencia dependientes de la metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias en las secuencias dependientes de la metilación son introducidas primero en el ADN genómico por tratamiento estándar con bisulfito de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827- 1831, 1992) o como la describe Olek et al (Olek A, Oswald J, Walter J. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 5064-6). Amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito se lleva a cabo entonces utilizando cebadores no específicos de la metilación seguidos por digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, y detección utilizando sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido en una forma linealmente cuantitativa a través de un amplio espectro de niveles de metilación de ADN. Además, esta técnica puede ser aplicada confiablemente a ADN obtenido de muestras de tejido microdiseccionado embebido en parafina. Reactivos típicos (por ejemplo como pueden encontrarse en un kit basado en COBRA típico) para el análisis COBRA pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores PCR para genes específicos (o secuencia de ADN alterada por metilo o isla CpG); enzima de restricción y de regulador apropiado; oligo de hibridación de gen; oligo de hibridación de control; kit de marcación de quinasa para sonda oligo; y nucleótidos radiactivos. Adicionalmente, los reactivos de conversión por bisulfito pueden incluir: regulador para desnaturalización de ADN; regulador de sulfonación; reactivos o kits para recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna por afinidad); regulador de desulfonación; y componentes para recuperación de ADN.
Adicionalmente, la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido por bisulfito también se usa, en el método descrito por Sadri & Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996).
El procedimiento de conversión por bisulfito y amplificación de acuerdo con la invención puede ser utilizada en combinación con este método de detección.
Ms-SNuPE (Extensión por Cebador de Nucleótido Individual Sensible a Metilación). La técnica Ms-SNuPE es un método cuantitativo para establecer las diferencias en metilación en sitios CpG específicos con base en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido por extensión con cebador de nucleótido individual (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). En resumen, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo, con 5-metilcitosina saliente sin cambios. La amplificación de la secuencia objetivo deseada se lleva a cabo entonces utilizando cebadores de PCR específicos para ADN convertido por bisulfito, y el producto resultante es aislado y usado como una plantilla para el análisis de metilación en los sitios CpG de interés. Pueden analizarse cantidades pequeñas de ADN (por ejemplo, secciones de patología microdiseccionadas), y evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en sitios CpG.
Reactivos típicos (por ejemplo, con los que podrían encontrarse en un kit típico basado en Ms-SNuPE) para el análisis por Ms-SNuPE pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores para PCR para genes específicos (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla de CpG); reguladores y desoxinucleótidos para PCR optimizados; kit para extracciones en gel; cebadores de control positivo; cebadores para Ms-SNuPE para genes específicos; reguladores de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos radiactivos. Adicionalmente, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: regulador de desnaturalización de ADN; regulador de sulfonación; reactivos o kits para recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); regulador de desulfonación; y componentes para recuperación de ADN.
El procedimiento de conversión y amplificación por bisulfito de acuerdo con la divulgación puede usarse en combinación con este método de detección.
MSP. El MSP (PCR específico para metilación) permite el establecimiento del estado de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. UsA 93:9821-9826, 1996; Patente de los Estados Unidos No.
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Los pares de cebador MSP contienen al menos un cebador, el cual hibrida a un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los cebadores MSP específicos para ADN no metilado contienen una "T" en la posición 3' de la posición C en el CpG. Preferiblemente, por lo tanto, se requiere que la secuencia base de dichos cebadores comprenda una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos la cual hibrida a la secuencia de ácido nucleico convertida con bisulfito, en donde la secuencia base de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG. El MSP requiere solamente pequeñas cantidades de ADN, es sensible a 0.1% de alelos metilados de un locus de una isla de CpG dada, y puede ser ejecutado sobre el ADN extraído a partir de muestras embebidas en parafina. Reactivos típicos (por ejemplo como los que podrían encontrarse en un kit típico basado en MSP) para análisis por MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores para PCR metilados y no metilados para un gen específico (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG), reguladores y desoxinucleótidos para PCR optimizados, y sondas específicas. El procedimiento de conversión y amplificación por bisulfito de acuerdo con la invención pueden ser utilizado en combinación con este método de detección.
MSP ANIDADO (Belinsky and Palmisano en la solicitud de los Estados Unidos 20040038245). Considerando el conflicto aparente de requerir alta especificidad del cebador MSP para diferenciar suficientemente entre posiciones CG y TG, pero que permite una no coincidencia con el fin de crear un sitio de restricción único, se prefiere utilizar una versión enmendada de MSP, conocida como MSP anidado, tal como se describe en WO 02/18649 y la solicitud de patente de los Estados Unidos 20040038245 de Belinsky y Palmisano. Este método para detectar la presencia de metilación del promotor específico del gen comprende las etapas de: expandir el número de copias de la región genética de interés utilizando una reacción en cadena de polimerasa para amplificar una porción de dicha región en donde reside la metilación del promotor, generando por lo tanto un producto de amplificación; y utilizar una alícuota del producto de amplificación generado por la primera reacción en cadena de polimerasa en una segunda reacción en cadena de polimerasa específica de la metilación para detectar la presencia de metilación. En otras palabras un PCR específico de no metilación se lleva a cabo antes del PCR específico de la metilación. El procedimiento de conversión y amplificación por bisulfito de acuerdo con la invención puede ser utilizado en combinación con este método de detección.
HEAVYMETILTM. (WO 02/072880 ; Cottrell SE et al. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1):e10) Una realización adicional preferida del método comprende el uso de oligonucleótidos bloqueadores. En el ensayo HeavyMetilTM se hibridan oligonucleótidos de sonda de bloqueo al ácido nucleico tratado con bisulfito concurrentemente con los cebadores de PCR. La amplificación por PCR del ácido nucleico se termina en la posición 5' de la sonda de bloqueo, de tal manera que la amplificación de un ácido nucleico es suprimida donde está presente la secuencia complementaria de la sonda bloqueadora. Las sondas pueden ser diseñadas para hibridar al ácido nucleico tratado con bisulfito en una manera específica del estado de metilación. Por ejemplo, para la detección de ácidos nucleicos metilados dentro de una población de ácidos nucleicos no metilados, la supresión de la amplificación de los ácidos nucleicos que son no metilados en la posición en cuestión sería llevada a cabo mediante el uso de sondas de bloqueo que comprende una “CpA' o “TpA” en la posición en cuestión, en oposición a "CpG" si se desea la supresión de la amplificación de los ácidos nucleicos metilados.
Para los métodos de PCR que utilizan oligonucleótidos bloqueadores, la perturbación eficiente de la amplificación mediada por la polimerasa requiere que los oligonucleótidos bloqueadores no sean elongados por la polimerasa. Preferiblemente, esto se logra a través del uso de bloqueadores que son 3'desoxioligonucleótidos u oligonucleótidos derivados en la posición 3' con un grupo diferente a hidroxilo "libre". Por ejemplo, los 3'-O-acetilo oligonucleótidos son representativos de una clase preferida de molécula bloqueadora.
Adicionalmente, la descomposición mediada por polimerasa de los oligonucleótidos bloqueadores debería ser precluida. Preferiblemente, tal preclusión comprende bien sea el uso de una polimerasa que carece de actividad de 5'-3'exonucleasa, o el uso de oligonucleótidos bloqueadores modificados que tienen, por ejemplo, puentes tioato en los terminales 5' del mismo y hacen que la molécula de bloqueador sea resistente a la nucleasa. Aplicaciones particulares pueden no requerir tales modificaciones en 5' del bloqueador. Por ejemplo, si el bloqueador - y los sitios de enlazamiento del cebador se superponen, por lo tanto el enlazamiento precluyente del cebador (por ejemplo con bloqueador en exceso), la degradación del oligonucleótido bloqueador será sustancialmente precluida. Esto se debe a que la polimerasa no extenderá el cebador hacia y a través de (en la dirección 5'-3') del bloqueador- un proceso que normalmente da como resultado la degradación del oligonucleótido bloqueador hibridado.
Una realización de bloqueador/PCR particularmente preferida, para propósitos de la presente invención y tal como es implementada aquí, comprende el uso de oligómeros de ácido nucleico peptídico (PNA) como oligonucleótidos bloqueadores. Tales oligómeros bloqueadores PNA son adecuados idealmente, puesto que ni son descompuestos ni extendidos por la polimerasa.
Preferiblemente, por lo tanto, se requiere que la secuencia base de dichos oligonucleótidos bloqueadores comprenda una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos la cual hibrida a la secuencia de ácido nucleico tratada
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químicamente, en donde la secuencia bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.
El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede ser utilizado en combinación con este método de detección.
Preferiblemente, los ensayos de PCR en tiempo real se llevan a cabo especificados por el uso de tales cebadores de acuerdo con la invención. Los ensayos de pCr en tiempo real pueden ejecutarse con cebadores específicos de la metilación (MSP- tiempo real) como PCR específica para la metilación ("MSP"; tal como se describió anteriormente), o con cebadores específicos de no metilación en presencia de bloqueadores específicos de metilación (HM en tiempo real) ("HEAVYMETILTM", como se describió anteriormente). El PCR en tiempo real puede llevarse a cabo con cualquier sonda marcada de manera detectable adecuada. Para detalles véase a continuación.
Ambos de estos métodos (MSP o HM) pueden ser combinados con el método de detección conocido como MetiLight™ (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), el cual en general incrementa la especificidad de la señal generada en tal ensayo. Siempre que la sonda en tiempo real usada sea específica para la metilación en sí mismo, la tecnología debe denominarse como MetiLight™, un método ampliamente usado.
Otro ensayo hace uso de la sonda específica de metilación, el así llamado ensayo "QM" (metilación cuantitativa). Una metilación no específica, por lo tanto una amplificación por PCR en tiempo real, no desplazada se lleva a cabo acompañada mediante el uso de dos sondas específicas de metilación (MetiLighat™) una para el amplificado metilado y una segunda para el no metilado. De esta manera se generan dos señales que pueden ser utilizadas para a) determinar la relación de ácidos nucleicos metilados (CG) a no metilados (TG), y al mismo tiempo b) la cantidad absoluta de ácidos nucleicos metilados puede ser determinada, cuando se calibre el ensayo con una cantidad conocida de ADN de control.
MetiLight™. El ensayo MetiLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza PCR en tiempo real basado en fluorescencia (TaqMan™) como tecnología que no requiere manipulaciones adicionales después de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). En resumen, el proceso MetiLight™ comienza con una muestra mixta de ADN genómico que es convertido, en una reacción con bisulfito de sodio, en una reserva mixta de diferencias de secuencia dependientes de la metilación de acuerdo con procedimientos estándar (el proceso con bisulfito convierte residuos de citosina no metilados en uracilo). El PCR basado en fluorescencia se lleva a cabo entonces, bien sea en una reacción "no desplazada" (con cebadores que no se superpone con sitios de metilación de CpG conocidos), o en una reacción "desplazada" (con cebadores de PCR que se superponen con dinucleótidos CpG conocidos). La discriminación de secuencia puede ocurrir bien sea en el nivel del proceso de amplificación o en el nivel del proceso de detección por fluorescencia, o en ambos.
El ensayo MetiLight™ puede ser utilizado como prueba cuantitativa para patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencia ocurre al nivel de la hibridación con sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR provee una amplificación no desplazada en la presencia de una sonda fluorescente que se superpone con sitio de metilación putativo particular. Se provee un control no desplazado de la cantidad de ADN ingresado por una reacción en la cual ni los cebadores, ni la sonda se depositan sobre ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para metilación genómica sondeando la reserva de PCR desplazada bien sea con oligonucleótidos de control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de la técnica "MSP"), o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potenciales.
El proceso MetiLight™ puede ser utilizado con una sonda "TaqMan®" en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico de doble cadena es tratado con bisulfito de sodio y luego sometido a uno de dos conjuntos de reacciones de PCR utilizando sondas TaqMan ®; por ejemplo, bien sea con cebadores desplazados y sondas TaqMan® o cebadores no desplazados y sondas TaqMan®. La sonda TaqMan® tiene marcación doble con moléculas fluorescentes "informadoras" y "de detención", y está diseñada para ser específica para una región de contenido relativamente alto de GC de tal forma que se funde a una temperatura de aproximadamente 10°C por encima en el ciclo de PCR con respecto a los cebadores de avance o retroceso. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de fusión/extensión en PCR. Puesto que la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante el PCR, eventualmente alcanzará la sonda TaqMan® fusionada. La actividad de endonucleasa de la Taq polimerasa 5' a 3' desplazará entonces la sonda TaqMan® digiriéndola para liberar la molécula informadora fluorescente para detección cuantitativa de su señal ahora no detenida utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.
Las variaciones de la metodología de detección por TaqMan™, que también son adecuadas para uso con la invención descrita incluyen el uso de tecnología de sonda dual (LightCycler™) o de cebadores de amplificación fluorescentes (tecnología Sunrise™). Ambas de estas técnicas pueden ser adaptadas de una manera adecuada para uso con el ADN tratado con bisulfito y además para el análisis de metilación dentro de dinucleótidos CpG. Reactivos típicos (por ejemplo, como los que podrían encontrarse en un kit típico basado en MetiLight™) para el análisis MetiLight™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para secuencias por bisulfito específicas, esto es, regiones genéticas convertidas con bisulfito (o ADN convertido con bisulfito o islas de CPG convertidas con bisulfito); sondas (por ejemplo
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TaqMan® o LightCycler™) específicas para dichas secuencias convertidas con bisulfito amplificadas; reguladores y desoxinucleótidos optimizados para PCR; y una polimerasa, tal como Taq polimerasa.
El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede ser utilizado en combinación con este método de detección.
Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden llevar un marcador directa o indirectamente detectable. Se prefieren marcadores en la forma de marcadores fluorescentes, radionúclidos o fragmentos de moléculas desprendibles que tienen una masa típica, los cuales pueden ser detectados en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores de masa, se prefiere que los amplificados marcados tengan una carga neta individual positiva o negativa, permitiendo una mejor detección en el espectrómetro de masas. La detección puede llevarse a cabo y visualizarse por medio de, por ejemplo, espectrometría de masas de matriz de desorción/ionización asistida por láser (MALDI) o utilizando espectrometría de masas con aspersión de electrones (ESI).
La espectrometría de masas de matriz de desorción/ionización asistida por (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficiente para el análisis de biomoléculas (Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988). Un analito es embebido en una matriz absorbente de luz. La matriz es evaporada mediante un pulso corto de láser transportando así la molécula del analito hacia la fase de vapor de una manera no fragmentada. El analito es ionizado por colisiones con moléculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones hacia un tubo de vuelo libre de campo. Debido a sus diferentes masas, los iones son acelerados a diferentes velocidades. Los iones más pequeños alcanzan el detector más pronto que los más grandes. La espectrometría MALDI-TOF es muy adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es de alguna manera más difícil (Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995). La sensibilidad con respecto al análisis de ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces menos que para péptidos, y disminuye de manera no proporcional con el incremento del tamaño del fragmento. Además, para ácidos nucleicos que tienen un esqueleto cargado negativamente de manera múltiple, el proceso de ionización a través de la matriz es considerablemente menos eficiente. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz juega un papel eminentemente importante. Para la desorción de péptidos, de han encontrado varias matrices muy eficientes que producen una cristalización muy fina. Hay ahora varias matrices que responde al ADN, sin embargo, la diferencia en sensibilidad entre los péptidos y los ácidos nucleicos no ha sido reducida. Esta diferencia en sensibilidad puede ser reducida, sin embargo, modificando químicamente el ADN de tal manera que se haga más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos fosforotioato, en los cuales los fosfatos usuales del esqueleto son sustituidos con tiofosfatos, pueden ser convertidos en un ADN de carga neutra utilizando química de alquilación sencilla (Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995). El acoplamiento de una etiqueta de carga a este ADN modificado da como resultado un incremento en la sensibilidad por MALDI-TOF al mismo nivel que la encontrada para péptidos.
Los amplificados también pueden ser detectados y/o analizados adicionalmente por medio de oligonucleótidos que constituyen todo o parte de un "arreglo" o "chip de ADN" (esto es, una disposición de diferentes oligonucleótidos y/o oligómeros de APN enlazados a una fase sólida). Tal disposición de diferentes secuencias de oligonucleótidos y/o oligómeros de APN puede ser caracterizada, por ejemplo, de tal forma de que se disponga sobre la fase sólida en la forma de una red rectangular o hexagonal. La superficie de fase sólida puede estar compuesta de silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro. También pueden usarse nitrocelulosa así como plásticos tales como nilón, que pueden existir en la forma de pellas o también como matrices de resina. Una revisión de la técnica anterior en la manufactura de disposiciones de oligómeros puede ser obtenida de una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999, y de la literatura citada allí). Se usan frecuentemente sondas marcadas fluorescentemente para el barrido de disposiciones de ADN inmovilizado. La unión simple de colorante Cy3 y Cy5 al 5'-OH de la sonda específica es particularmente adecuada para marcas de fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede ser llevada a cabo, por ejemplo, con un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, están disponibles comercialmente.
La conversión con bisulfito y el proceso de amplificación de acuerdo con la invención pueden ser utilizados en combinación con este método de detección.
Además, métodos adicionales para análisis de metilación son conocidos por personas experimentadas en la técnica. Tales métodos son por ejemplo métodos en los cuales el ADN tratado con bisulfito es sometido a métodos de análisis basados en disposición de ADN tal como los descritos en WO 99/28498, WO 01/38565, o en WO 02/18632.
EJEMPLOS.
Ejemplo comparativo 1.
a) Etapa de remoción de parafina
Reactivos químicos necesarios:
Limoneno145, Fluka Chemika, Art Nr. 89188
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Procedimiento:
1. Tubos de reacción giratorios de cierre seguro o tapa de rosca (que contienen 1-5 secciones de un tejido embebido en parafina fijado con formalina) durante 1 minuto a 5,000 x g
2. Agregar 1 ml de limoneno a cada tubo. Introducir todas las piezas en el líquido. En algunos casos el material de muestra es muy frágil con piezas pequeñas de parafina/tejido en el tubo - asegurarse de que el material que se adhiere a la tapa del tubo caiga dentro del tubo.
3. 1 hora de incubación a temperatura ambiente a 1,000 rpm en termomezclador, con vórtex vigoroso al menos 3 veces durante la incubación.
4. Cloque los tubos en centrífuga y hágalos girar a 16,000 rcf (= 16,000 x g) durante 5 minutos, el tejido se aglomerará en el fondo del tubo.
5. Use una pipeta de 1 ml para succionar el limoneno de cada muestra. ¡Debe tenerse gran cuidado de no perturbar la pella!
Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pella sobre el tubo y permita que limoneno entre suavemente a la punta de la pipeta; para retirar las últimas gotitas debe utilizarse una punta amarilla.
6. Si el tejido se deposita sólo débilmente en el fondo (es decir, no forma una pella definida) haga lo siguiente:
• repita la centrifugación otra vez durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf 5417 a velocidad máxima (> 20,000 rcf)
• repita entonces la remoción del limoneno: asegúrese de que la punta de la pipeta está presionada contra el fondo del tubo y el limoneno es retirado muy lentamente de tal forma que no succione el tejido. Retire tanto limoneno como sea posible.
b) Etapa de lisis
Preparar un gran volumen del regulador de lisis (0.5 o 1 l), dependiendo del número de muestras que se van a procesar para un proyecto. Este regulador puede ser almacenado a temperatura ambiente durante 3 meses. Verifique la contaminación y lleve a cabo esterilización por filtración de una alícuota antes de cada uso.
Reactivos químicos:
TRIS (tris-hidroximetil-amino-metano), Merck, Art. Nr. 1.01549.0500, MW = 121.14 g/mol Prepare una solución de reserva de 1 mol/l:
disuelva 121.14 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con HCl y complete hasta un 1 l EDTA (ácido etilendiaminotetraacético),
EDTA Sodio (Titriplex III) de Merck, Art. Nr. 159294 MW = 372.24 g/mol
Prepare una solución de reserve de 0.5 mol/l: Disuelva 186.1 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con NaOH, completa hasta 1 l. Tween (Tween 20), Fluka, Chemika Art Nr. 93773
Este detergente se agrega al regulador en porcentaje en volumen. Para agregar Tween al regulador tómese 1 ml de Tween (en un tubo de 2 ml), caliéntelo a 50°C y agregue el volumen deseado al regulador con una punta de pipeta ancha.
Composición del regulador de lisis: 50 mmol/l TrisHCl, pH 8.0, 1 mmol/l EDTA,
0. 5% Tween (volumen %)
Proteinasa K, Roth
Prepare siempre una solución de reserva fresca de 30 mg/ml en H2O. El tamaño de la solución de reserva debería ser ajustado para el número de muestras que se van a procesar. Por ejemplo 300 mg de proteinasa K disueltos en 10 ml de H2O serán suficientes para ~ 400 muestras.
Procedimiento:
1. Añada 190 pl del regulador de lisis preparado a cada muestra. Es importante asegurar que todo el material de muestra está cubierto por el regulador de lisis.
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2. Agregue 20 |jl de la solución preparada de proteinasa K.
3. Someta a vórtex el tubo rigurosamente para asegurar una mezcla apropiada de la muestra con el regulador de lisis y la proteinasa K. Asegúrese de que las tapas del tubo están cerradas herméticamente - ¡de otra manera habrá pérdida de líquido!
4. Incube a 60°C, con agitación a 1,000 rpm (termoagitador).
5. Incube durante 40 a 48 horas, no son necesarias adiciones subsecuentes de proteinasa K.
6. Haga rotar en la mañana y en la tarde de cada día para eliminar gotitas de la tapa, someta a vórtex vigorosamente.
7. Incube las muestras a > 95°C durante 10 minutos con el fin de inactivar la proteinasa K. Para esto, fije el termomezclador a una temperatura de 99°C, puesto que la temperatura real en la fijación más alta está algunos grados por debajo de la temperatura indicada.
(proteinasa k activa en el lisado reducirá el rendimiento del PCR, especialmente si el lisado se utiliza directamente para cuantificación del ADN genómico por PCR en tiempo real)
Verificación de la calidad de la lisis (durante la lisis)
Después de la etapa de lisis 5, debería haber una solución homogénea, tal vez turbia en el tubo sin piezas visibles de tejido remanentes. Sin embargo, debe haber piezas visibles de tejido en muchas de las muestras dejadas después de la primera etapa de incubación con proteinasa K adicional y debe considerarse el incremento de volumen de lisis. Si solamente algunas individuales tienen material no digerido remanente este puede ser desechado. ¡Tenga mucho cuidado!
Almacenamiento:
Las muestras sometidas a lisis pueden ser almacenadas bien sea a -20°C, o -80°C (dependiendo del tiempo de almacenamiento) o ser usadas inmediatamente para continuación del procesamiento.
c) Etapa de extracción de ADN
Equipo necesario
• centrífuga de placas (Sigma o Qiagen, capaz de hasta 5,758 x g (6,000 rpm))
• pipeteadores para volúmenes de 10 jl hasta 1, 000 j l (multicanal para volúmenes grandes)
• Contenedor de residuos para flujo de ADN (por ejemplo, recipiente con eliminación de ADN) Material requerido:
• Dneasy 96 Tissue Kit (Qiagen # 69581 o 69582)
• puntas de pipeta (100 jl, 1000 jl)
• tubos Falcon de 15 jl y 50 jl Reactivos químicos necesarios:
• etanol, grado biología molecular Procedimiento:
Asegúrese con marcación respectiva que todas las placas en un ensamble están giradas en la misma dirección (pozo A1 sobre pozo A1 etc.).
1. Distribuya 400 jl de AL/E en microtubos de recolección y transfiera el lisado (200 jl) a los tubos; selle los tubos con tapas para tubos de recolección; utilice la tapa de la placa para fijar los tubos en la gradilla
2. Mezcle agitando 15 segundos con AMBAS manos; gire por un período corto (deje que la centrífuga alcance 1,450 x g y detenga);
3. Coloque la placa DNeasy 96 sobre un bloque S (selle los pozos no usados de la placa DNeasy con lámina AirPore Tape). Cuidadosamente aplique la mezcla de la etapa 2 sobre las columnas. Selle con AirPore Tape. Centrifugue a 5,790 x g durante 10 minutos. Si hay todavía fluido visible en las membranas, agregue una etapa de centrifugación.
4. Remueva la cinta. Agregue 500 jl de AW1. Selle con una lámina AirPore Tape. Vacíe el bloque S. Haga rotar durante 5 minutos a 5,790 x g.
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5. Retire la cinta. Agregue 500 |jl de AW2. Selle con nueva lámina AirPore Tape. Vacíe el bloque S. HAga rotar durante 15 minutos a 5,790 x g, esto debería dejar la membrana seca.
6. Coloque la placa DNeasy sobre una placa de microtubos de elución. Para eluir el ADN agregue 120 jl de regulador AE o ddH2O precalentados a 70°C a cada pozo. Selle la placa con una nueva lamina de AirPore Tape. Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Haga rotar durante 2 minutos a 5,790 x g.
7. Selle los microtubos de elución con las tapas provistas. Almacene a -20°C o -80°C (dependiendo del tiempo de almacenamiento)
d) Etapa de tratamiento con bisulfito y e) etapa de purificación de ADN Equipo necesario:
• Termociclador (por ejemplo Eppendorf, Tetrad)
• Centrífuga de placas (Sigma o Qiagen, capaz de hasta 5,700 x g)
• Pipeteadores para volúmenes desde 10 jl hasta 1000 jl (Eppendorf multicanal + pipeteadores Matrix)
Material necesario:
• Placas de PCR + tiras de tapas
• QlAamp 96 DNA Blood Kit (Qiagen #51161 para 4 placas o 51162 para 12)
• Bloques y tapas de pozos redondos adicionales (1 adicional necesario para cada purificación de 96 muestras; #19576 para 24 placas)
• Regulador QIA AVL (#19073 para 155 jl, 560 jl por muestra requerida)
• puntas de pipeta (100 jl, 1,000 jl, Eppendorf + Matrix)
• Tubos Falcon de 15 ml y 50 ml
• contenedor de residuos para fluido de ADN (por ejemplo recipiente con eliminación de ADN)
Reactivos químicos necesarios:
• bisulfito de sodio (Na2S2O5, 190. 1 g/mol), Merck 1.06528.0500
• sulfito de sodio, anhidro (Na2SO3, 126.04 g/mol), Fluka 71988
• ddH2O grado biología molecular (filtrada por 0.2 jm, tratada con DEPC, sometida a autoclave, libre de DNasas y RNasas)
• dietilenglicoldimetiléter (DME), Merck 8.02934.0250
• ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman2-carboxílico (250.29 g/mol), Aldrich 23, 881-3
• etanol, grado biología molecular
• pellas de hidróxido de sodio (NaOH, 40.0 g/mol), Merck 1.06482.1000
Preparación de soluciones (suficiente para 80 reacciones, !siempre para ser preparadas frescas¡):
Solución de bisulfito: se disuelven disulfito de sodio (4.708 g) y sulfito de sodio (1.128 g) agregando 10 ml de ddH2O (la solución es 4.9 M). El volumen final es alrededor de 12 ml. Verifique el pH de la solución - si no está entre 5.45 y 5.5, descarte la solución y repita su preparación. Agite vigorosamente y si es necesario, caliente la solución a 50°C en un baño de agua con vórtex a una velocidad máxima durante 30 segundos. Repita este procedimiento tantas veces como sea necesario hasta que la sal se haya disuelto completamente.
Solución de DME - depurador de radicales Disuelva 125.3 mg del ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman2- carboxílico agregando 1.0 ml de DME. Someta a vórtex rigurosamente con el fin de asegurar que todas las partículas no disueltas permanezcan. El DME es peligroso y potencialmente carcinogénico. Por lo tanto, tome precauciones apropiadas cuando maneje este reactivo químico. Si sólo se van a tratar pocas muestras con bisulfito, prepare volúmenes menores.
Regulador de desulfonación: Disuelva 0.8 g de hidróxido de sodio en 10 ml de ddH2O para preparar una solución de reserva 2 mol/l. Para el regulador de desulfonación mezcle 1.0 ml de hidróxido de sodio 2 mol/l y 9.0 ml de etanol. ¡La solución tiene que ser preparada fresca antes de cada purificación¡
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Procedimiento de reacción con bisulfito (volumen final de 140 |jl):
Transfiera con una pipeta las siguientes soluciones en placas de PCR en el orden mostrado.
1. 44 jl de regulador/agua que contiene el ADN que va a ser tratado con bisulfito
2. 83 jl de solución de bisulfito (la aplicación con pipeteado del bisulfito y la muestra pueden ser intercambiadas)
3. 13 jl de solución de DME, que contiene el depurador de radicales
4. mezcle exhaustivamente
5. coloque en pozos de 0.2 ml del termociclador. ¡Utilice tiras de tapas para cerrar los pozos¡
Programa de temperatura en un termociclador
• 5:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C
• 22:00 minutos incubación a 60°C
• 3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C
• 1:27:00 horas incubación a 60°C
• 3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C
• 2:57:00 horas incubación a 60°C
• enfriamiento a 20°C
Purificación de ADN mediante el uso de una combinación del QlAamp Viral RNA Mini Kit y el QlAamp 96 DNA Blood Kit:
1 Preparación del regulador de enlazamiento AVL
• Agregue 1 ml de regulador AVL a 310 jg de ARN transportador liofilizado. Disuelva exhaustivamente.
• Transfiera a la botella de regulador AVL (30 ml), y mezcle exhaustivamente antes de utilizar el regulador AVL por primera vez.
Este regulador puede ser almacenado a 2-8°C para uso futuro hasta por 6 meses. Sin embargo, si se desarrolla un precipitado, redisuelva entonces calentando a 80°C por no más de 5 minutos. Esto debe hacerse no más de un total de 6 veces. Enfríe hasta temperatura ambiente antes del uso. Una alícuota del regulador AVL preparado también puede ser almacenada a temperatura ambiente por hasta 2 semanas.
2. Preparación de condiciones de enlazamiento
• Para cada muestra deben usarse dos pozos; estos deberían estar en 2 bloques de pozos redondos con el fin de mantener la disposición original (por ejemplo, pozo A1 de la placa de bisulfito estará dividido en 70 jl en el pozo A1 del bloque 1 y 70 jl en el pozo A1 del bloque 2, véase ilustración más abajo).
• En cada pozo de bloques transfiera con una pipeta 280 jl de regulador AVL preparado/ARN transportador. Agregue 70 jl de solución de ADN/bisulfito de la placa de PCR, coloque ADN) directamente en el regulador y transfiera con una pipeta hacia arriba y hacia abajo 3 veces para asegurar una transferencia completa del ADN y mezcle. Agregue 280 jl de etanol. Selle los pozos utilizando tapas para bloques. Mezcle vigorosamente agitando con AMBAS manos durante al menos 15 segundos. (¡¡¡El etanol tiende a rehusar mezclarse con fluidos con base acuosa!!!)
• Alternativamente, si las cantidades de ADN son muy críticas: transfiera con una pipeta solamente 200 jl en los bloques, utilice los 80 jl restantes para lavar los pozos de la placa de bisulfitación después de la transferencia del ADN. •
• Haga rotar brevemente a 1.450 x g (alcance 1.450 x g y detenga) para hacer que las gotas bajen. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.
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Preparación de condiciones de enlazamiento
Bloques de pozo redondo 1 * 2
1a centrifugación para enlazamiemto
Tratamiento con bisulfito
Placa QlAamp
Placa de POR
2a centrifugación
centr.
3. Enlazamiento
• Ambos pozos son cargados subsecuentemente sobre UNA columna (véase ilustración más arriba)
• Coloque la placa QIAamp 96 sobre la parte superior de un bloque S
• Aplique 630 |jl del primer pozo por muestra de placa QIAamp 96
• Selle la placa con una lámina de AirPore Tape, haga rotar a 5,790 x g durante 4 minutos
• Vacíe el bloque S
• Repita el enlazamiento con un segundo pozo de cada muestra sobre la misma columna como con el primer pozo (carga, sellamiento, rotación, vaciamiento de bloque S)
4. Lavado y 5. desulfonación
• Coloque la placa QIAamp 96 del bloque S
• Agregue 500 jl de regulador AW1
• Selle la placa con nueva lámina AirPore Tape
• Haga rotar a 5,90 x g durante 2 minutos
• Vacíe el bloque S, coloque la placa sobre el bloque S
• Agregue 500 jl de NaOH 0.2 mol/l sobre la placa QIAamp 96
• Selle con una lámina nueva de AirPore Tape, incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente.
• Centrifugue a 5,90 x g durante 1 minuto.
• Vacíe el bloque S
• Agregue 500 jl de AW2
• Selle la placa con nueva lámina AirPore Tape
• Haga rotar a 5,90 x g durante 15 minutos
6. Elución
• Coloque la placa QIAqmp 96 sobre la gradilla de microtubos de elución.
• Agregue 100 jl de AE o ddH2O precalentados a 70°C.
• Sella la placa con una nueva lámina de AirPore e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos
• Haga rotar a 5,790 x g durante 4 minutos
• Selle los tubos con tapas
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El ADN puede ser entonces amplificado y analizado subsecuentemente por medio de los métodos sensibles para el análisis de metilación de ADN.
Ejemplo comparativo 2.
Todas las etapas se harán en los tubos en los que se proveen las muestras, esto es, los tubos provistos por el proveedor de las muestras, estos pueden ser tubos tanto de 1.5 como de 2.0 ml (preferidos). Por favor, reconfirme que los formatos de tubo encajan en la centrífuga.
Los solventes y reguladores pueden ser suministrados bien sea con pipetas de canal sencillo o multipipetas
a) Remoción de parafina Reactivo químico necesario:
Limoneno145, Fluka Chemika, Art Nr. 89188 Procedimiento:
1. Agregue 1 ml de limoneno a cada tubo (que contiene 1 a 5 láminas de muestra de cirugía embebida en parafina - fijada con formalina). Coloque todas las piezas en el líquido. En algunos casos el material de la muestra es ya muy frágil con pequeñas piezas de parafina/tejido en el tubo - asegurarse de que el material que se adhiera a la tapa del tubo cae dentro del tubo.
2. Incubación durante 1 hora a temperatura ambiente a 1000 rpm, vórtex vigorosamente al menos durante 3 veces durante la incubación.
3. Coloque los tubos en la centrífuga y haga rotar a 16,000 rcf (= 16,000 x g) durante 5 minutos, el tejido formará pellas en el fondo del tubo.
4. Usa una pipeta de 1 ml para succionar el limoneno de cada muestra. ¡Tenga gran cuidado para no perturbar la pella! Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pastilla sobre el tubo y permita que el limoneno entre suavemente a la punta de la pipeta, en algunos casos puede ser más fácil retirar el volumen completo en dos más bien que en una etapa de pipeta. Es correcto si permanecen pequeñas cantidades (hasta 50 jl) de limoneno en el tubo.
5. Si el tejido se deposita sólo débilmente en el fondo (esto es, no forma una pella definida) haga lo siguiente:
• repita la centrifugación de nuevo durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf 5417 a velocidad máxima (> 20,000 rcf)
• entonces repita la remoción de limoneno: asegúrese de que la punta de la pipeta es presionada contra el fondo del tubo y que el limoneno es retirado muy lentamente de tal manera que no succione el tejido. Retire tanto limoneno como sea posible.
Obvie la etapa del etanol, si fue posible retirar casi todo el limoneno (si quedan 50 jl, esto estará bien)
6. Agregue 1 ml de etanol (pureza > 99%).
7. Someta a vórtex, 10 minutos de incubación a temperatura ambiente a 1,00 rpm.
8. Coloque los tubos en la centrífuga y hágalos rotar a 16,000 rcf durante 5 minutos, el tejido se depositará de nuevo en el fondo del tubo.
9. Utilice la pipeta para succionar el etanol, ¡debe tenerse gran cuidado para no perturbar las pellas! Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pella sobre la pared del tubo y permita que suavemente etanol entre a la punta de la pipeta.
10. retire tanto etanol como sea posible con la pipeta.
11. el etanol residual no retirado por la pipeta debe ser evaporado por incubación en un termomezclador a 50°C. Esto puede tomar entre 10 a 30 minutos, pero tenga cuidado de no sobresecar las muestras.
No es necesario el secado, si la etapa del etanol fue obviada.
b) Etapa de lisis
Prepare un volumen más grande del regulador de lisis (0.5 o 1 l), dependiendo del número de muestras que se van a procesar para un proyecto. Este regulador puede ser almacenado a temperatura ambiente durante 3 meses. Después de este tiempo es prudente preparar un regulador fresco.
Reactivos químicos:
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TRIS (tris-hidroximetil-amino-metano), Merck, Art. Nr. 1.01549.0500, MW = 121.14 g/ml Prepare una solución de reserva de 1 mol/l:
Disuelva 121.14 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con HCl y complete hasta 1 l.
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético),
EDTA de sodio (Titriplex III) de Merck, Art. Nr. 159294 MW = 372.24 g/mol
Prepare una solución de reserve de 0.5 mol/l:
Disuelva 186.1 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con NaOH, complete hasta 1 l.
Tween (Tween 20), Fluka, Chemika Art Nr. 93773
Este detergente se agrega al regulador en porcentaje en volumen. Para agregar Tween al regulador tome 1 ml de Tween (en un tubo de 2 ml), caliéntelo a 50°C y agregue el volumen deseado al regulador con una punta de pipeta ancha.
Composición de regulador de lisis:
50 mmol/l TrisHCl, pH 8.0, 1 mmol/l EDTA, 0.5% Tween (volume %)
Proteinasa K, Roth
Preparare una solución de reserva de 30 mg/ml en H2O. El tamaño de la solución de reserva debe ser ajustado al número de muestras que se van a procesar. Por ejemplo: 300 mg de proteinasa K disueltos en 10 ml de H2O serán suficientes para ~ 400 muestras. La proteinasa K puede ser almacenada a 4°C durante hasta una semana con seguridad. Si se van a procesar más muestras se recomienda preparar soluciones frescas repetidamente.
Procedimiento:
1. Agregue 190 pl del regulador de lisis preparado a cada muestra. Es importante asegurarse de que todo el material de muestra es cubierto por el regulador de lisis.
2. Agregue 20 pl de la solución de proteinasa K preparada.
3. Someta a vórtex el tubo rigurosamente para asegurar una mezcla apropiada de la muestra con el regulador de lisis y la proteinasa K. Asegúrese de que las tapas de los tubos están cerradas herméticamente - ¡de otra manera habrá pérdida de líquido¡
4. Incubar a 50°C, con agitación a 1,000 rpm (termoagitador).
5. Incubar durante 40 a 48 horas, no son necesarias adiciones subsecuentes de proteinasa K.
6. Haga rotar en la mañana y en la tarde de cada día para eliminar las gotitas de la tapa, someta a vórtex vigorosamente.
Verificación de la calidad de la lisis (durante la lisis):
Después de estas etapas de lisis, debe haber una solución homogénea, tal vez turbia en el tubo sin piezas visibles de tejido remanente. Sin embargo, debería haber piezas visibles de tejido en MUCHAS de las muestras dejadas después de la primera etapa de incubación adicional con proteinasa K y debería tenerse en consideración el incremento del volumen de la lisis. Si sólo las muestras individuales tienen algún material no digerido remanente este puede ser despreciado. ¡Tenga mucho cuidado!
7. Incube las muestras Incubar a > 95°C durante 10 minutos con el fin de inactivar la proteinasa K. Para esto fije la temperatura del termomezclador a 99°C, puesto que la temperatura real en la fijación más alta está algunos grados por debajo de la temperatura indicada (La proteinasa K activa en el lisado reducirá el rendimiento del PCR, especialmente si el lisado se usa directamente para la cuantificación de ADN genómico por RT-PCR).
8. Las muestras sometidas a lisis pueden ser almacenadas bien sea a -20°C o -80°C (dependiendo del tiempo de almacenamiento) o ser usadas inmediatamente para continuación del procesamiento.
c) Extracción de ADN con el kit QIAGEN DNeasy Tissue
Duración aproximada para 30 muestras:
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Preparación de dispositivos y materiales: 15 minutos; Preparación: 30 min; Procedimiento: 1.5 horas Se necesitan los siguientes dispositivos:
centrífuga, por ejemplo modelo Eppendorf 5417R; Pipetas y/o multipipetas Eppendorf; 1tubos de reacción de 1.5 ml y 2 ml; termomezclador.
Se necesitan los siguientes reactivos:
Lisados de muestras en parafina (-210 jl o más, si se agregaron regulador de lisis + proteinasa K, los volúmenes actuales pueden diferir ligeramente, pueden presentarse volúmenes inferiores porque fueron tomadas alícuotas para cuantificación, pérdida por evaporación. También pueden presentarse volúmenes más grandes porque la cantidad de tejido lisado fue mayor que el promedio)
Etanol para biología molecular (96-100%)
Kit de DNeasy (Qiagen cat nr. 69504 [50 columns] o 69506 [250 columnas])
Preparación (antes de incoar la extracción real):
1. Mezcle el regulador AL exhaustivamente agitando antes del uso. El regulador AL es estable durante 1 año cuando se almacena a temperatura ambiente. Si se ha formado un precipitado en el regulador AL, disuelva incubando a 70°C.
2. Se suministra regulador AW como concentrado. Agregue la cantidad apropiada de etanol (96-100%) antes de un primer uso (estas cantidades difieren para los kits 69504 y 69506, respectivamente). El regulador AW 1 es estable durante 1 año cuando se almacena cerrado a temperatura ambiente.
3. El regulador AW 2 se suministra como concentrado, la cantidad apropiada de etanol (96-100%) antes del primer uso (estas cantidades difieren para los kits 69504 y 69506, respectivamente). El regulador AW 2 es estable durante 1 año cuando se almacena cerrado a temperatura ambiente.
4. Si las muestras fueron congeladas después de la lisis del tejido asegúrese de que las muestras están equilibradas a temperatura ambiente.
5. Caliente un termomezclador a 70°C.
6. Todas las etapas de centrifugación deben llevarse a cabo a temperatura ambiente.
7. Sea cuidados de no causar derrames cuando utilice la multipipeta en lugar de pipeteadores individuales. Procedimiento de extracción:
1. Agregue 210 jl (si el lisado tiene un volumen mayor: 1 volumen de regulador de lisis + volumen de proteinasa K usados) de regulador AL al tubo (1.5 o 2.0 ml) que contiene el lisado, mezcle exhaustivamente vórtex. Coloque el tubo en un termomezclador e incube a 70°C, agitando a 1000 rpm durante 10 minutos.
2. Agregue 210 jl (si el lisado tiene un volumen mayor: de nuevo 1 volumen de regulador de lisis + volumen de proteinasa K usados) de etanol (96-100%) a la muestra, y mezcle por vórtex con pulso durante 15 segundos. Después de la mezcla, centrifugue brevemente el tubo para eliminar las gotas del interior de la tapa.
3. Aplique cuidadosamente la mezcla de la etapa 2 (hasta 700 jl cabrán dentro de la columna, ¡incluyendo los precipitados!) sobre una columna de rotación DNeasy la cual ya está colocada en un tubo de recolección de 2 ml (provisto por Qiagen) sin humedecer el borde. Cierre la tapa y centrifugue a 6,000 x g (= rcf, u 8,000 rpm) durante 1 minuto. Coloque la columna de rotación DNeasy en un tubo de recolección de 2 ml limpio (provisto por Qiagen), y descarte el tubo que contiene el filtrado.
4. Si los lisados fueran mayores de 210 jl la columna tiene que ser cargada una segunda vez: colóquela en un tubo de 2 ml nuevo, agregue el volumen remanente de la mezcla de la etapa 2, haga rotar como en la etapa 3.
5. Abra cuidadosamente la columna de rotación y agregue 500 jl de regulador AW 1 (este es el mismo para grandes lisados, también) sin humedecer el borde. Cierre la tapa y centrifugue a 6,000 x g durante 1 minuto. Coloque la columna de rotación en un tubo de recolección de 2 ml limpio (provisto), y descarte el tubo de recolección que contiene el filtrado.
6. Abra cuidadosamente la columna de rotación y agregue 500 jl de regulador AW 2 sin humedecer el borde. Cierre la tapa y centrifugue a velocidad completa 20,000 x g (14,000 rpm) durante 3 minutos.
7. Opcional: Descarte el filtrado. Con el fin de evitar el arrastre de etanol, deben usarse nuevos tubos (no provistos por Qiagen). Centrifugue de nuevo durante 1 minuto a 20,000 x g (14,000 rpm).
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8. Coloque la columna de rotación DNeasy en un tubo de reacción de 1.5 ml tubo limpio y ya marcado (no provisto por Qiagen), y descarte el tubo de recolección que contiene el filtrado. Abra cuidadosamente la columna de rotación DNeasy y agregue 60 jl del regulador de elución AE (a temperatura ambiente) al centro de la columna. Incube a temperatura ambiente durante 1 minuto, luego centrifugue a 6,000 x g (8,000 rpm) durante 1 minuto. Agregue de nuevo 60 jl de nuevo regulador de elución al centro de la columna, incube durante 1 minuto y centrifugue a 6,000 x g durante 1 minuto utilizando el mismo tubo. El volumen final es 120 jl (suficiente para 2 reacciones repetidas con nuevo protocolo), aunque puede ocurrir alguna pérdida debido a la retención de líquido en la columna. Si la concentración final de ADN no es crítica, pueden escogerse también volúmenes de elución más grandes (¡los volúmenes van a ser definidos específicamente para el proyecto!)
9. Si las muestras se usan para tratamiento con bisulfito dentro de los 2 días siguientes manténgalas a +4C en un refrigerador. Para almacenamiento a largo plazo se recomienda -20°C.
Análisis:
Se utiliza una alícuota del eluato (3 jl) para cuantificar la concentración de ADN utilizando un ensayo de PCR genómico en tiempo real. La cuantificación por UV es opcional.
d) Tratamiento con bisulfito y e) Purificación de ADN con el dispositivo Microcon™
Equipo necesario:
• termociclador (por ejemplo, Eppendorf, Tetrad)
• centrífuga (capaz de hasta 14,000 x g)
• pipeteadores para volúmenes de 100 jl y 1000 jl Material necesario:
• dispositivos Microcon Centrifugal Filter, Microcon® YM-30 (Millipore/Amicon 42410)
• puntas de pipeta (100 jl, 1000 jl)
• tubos de PCR de 200 jl (por ejemplo, Eppendorf 0030 124.359)
• tubos de 1.5 ml (por ejemplo Eppendorf 0030 120.086)
• tubos Falcon de 15 ml y 50 ml Reactivos químicos necesarios:
• bisulfito de sodio (Na2S2O5, 190.1 g/mol), Merck 1.06528.0500
• sulfito de sodio anhidro (Na2SO3, 126.04 g/mol), Fluka 71988
• ddH2O grado biología molecular (filtrada por 0.2 jm, tratada con DEPC, sometida a autoclave, libre de DNasas y RNasas)
• dietilenglicoldimetiléter (DME), Merck 8.02934.0250
• ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman2-carboxílico (250.29 g/mol), Aldrich 23,881-3
• Tris-hidroximetil-aminometano (C4H8O2, M = 121.14 g/mol), Merck 1.01549.0500
• pellas de hidróxido de sodio (NaOH, 40.0 g/mol), Merck 1.06482.1000
• EDTA (Titriplex® III, C10H14N2OsNa2 * 2H2O, 372.24 g/mol), Merck 1.08418.0250 Preparación de soluciones (suficientes para 80 reacciones):
Solución de bisulfito: Se disuelven disulfito de sodio (4.708 g) y sulfito de sodio (1.128 g) agregando 10 ml de ddH2O (la solución es 4.9 M). El volumen final es alrededor de 12 ml. Verifique el pH de la solución - si no está entre 5.45 y 5.5, descarte la solución y repita la preparación. Agite vigorosamente y si es necesario, caliente la solución a 50°C en un baño de agua con vórtex a velocidad máxima durante 30 segundos. Repita este procedimiento tan frecuentemente como sea necesario hasta que la sal se haya disuelto completamente.
Solución de DME - depurador de radicales: disuelva 125.3 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman2- carboxílico agregando 1.0 ml de DME. Someta a vórtex vigorosamente con el fin de asegurarse que no permanecen partículas no disueltas. El DME es peligroso y potencialmente carcinogénico. Por lo tanto tome las precauciones
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adecuadas cuando manipule este reactivo químico. Si sólo se van a tratar pocas muestras con bisulfito, prepare volúmenes más pequeños.
NaOH 0.2 mol/l: Disuelva 0.32 g de hidróxido de sodio en 40 ml de ddH2O. Regulador
TE: 10 mmol/l Tris/0.1 mmol/l EDTA, pH 8
General:
• Este procedimiento está diseñado para ser aplicado en tubos de PCR de 200 pl. El número total de muestras está limitado por el número de tubos que pueden ser manipulados en los termocicladores, centrífugas, etc.
• Las soluciones de trabajo no deberían ser almacenadas durante periodos prolongados de tiempo. Es mejor prepararlas frescas y escalar las soluciones de acuerdo con el número de muestras que se van a procesar.
• Todas las soluciones recolectadas como residuo en este procedimiento deberían ser recolectadas, por ejemplo, en una botella de vidrio y descartadas finalmente como solventes orgánicos libres de halógenos
Procedimiento de tratamiento con bisulfito:
Transfiera con una pipeta las siguientes soluciones en tubos de PCR en el orden mostrado.
1. 50 pl de regulador/agua que contiene el ADN que va a ser tratado con bisulfito.
2. 95 pl de solución de bisulfito.
3. 15 pl de solución de DME, que contiene el depurador de radicales.
¡El volumen total de la mezcla de reacción es 160 pl! ¡Cierre herméticamente las tapas de los tubos de PCR! Programa de temperatura:
• 5:00 minutos desnaturalización de DNA a 99°C
• 22:00 minutos incubación a 50°C
• 3:00 min desnaturalización de DNA a 99°C
• 1:27:00 horas incubación a 50°C.
• 3:00 minutos desnaturalización de DNA a 99°C
• 2:57:00 horas incubación a 50°C
• Enfriamiento a 20°C
Debido a la alta molaridad de las sales de bisulfito algo de la sal puede precipitar. Estos precipitados no afectarán la reacción con bisulfito.
Procedimiento de purificación de ADN:
• Después de que la incubación ha terminado, transfiera la solución de reacción (160 pl) en un tubo de recolección de 1.5 ml.
• Agregue 120 pl ddH2O al tubo de reacción. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo y transfiera la solución al mismo tubo de recolección.
• ¡Repita la etapa con 120 pl adicionales de ddH2O!
• Cierre las tapas, someta a vórtex intensamente y haga rotar por un período corto para remover gotas de la tapa.
• Tome toda esta solución (400 pl) y transfiérala con una pipeta en un reservorio de muestra de un dispositivo de filtro Microcon ensamblado - ¡no toque la membrana con la punta de la pipeta!
• Selle con la tapa anexa.
• Coloque el ensamblaje en la centrífuga, alinee la cinta de la tapa hacia el centro del rotor y haga rotar durante 15 minutos a 14,000 x g. •
• Después de la rotación, extraiga el ensamblaje y descarte el fluido. POR FAVOR TOME NOTA: La eficacia de la centrifugación puede variar dependiendo del modelo de centrífuga en particular y del instrumento usado. ¡Por lo tanto
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para todas las etapas de centrifugación verifique siempre el volumen de muestra pasado a través de la membrana! Si es necesario, incremente los tiempos de rotación en etapas de 2 minutos.
• Para desulfonación agregue 400 jl de 0.2 NaOH mol/l a la membrana
• Coloque el ensamblaje de nuevo en la centrífuga y haga rotar durante 12 minutos a 14,000 x g. Extraiga el ensamblaje y descarte el fluido.
• Para lavar agregue 400 jl de ddH2O
• coloque el ensamblaje de nuevo en la centrífuga y haga rotarla durante 12 minutos a 14,000 g. Extraiga el ensamblaje y descarte el fluido.
• ¡Repita esta etapa dos veces adicionales! POR FAVOR TOME NOTA: Después de esto la membrana debería lucir húmeda, pero no debería estar cubierta por un volumen visible de líquido.
• Para la elución saque el ensamblaje de filtro de la centrífuga.
• Agregue 75 jl de regulador TE precalentado (50°C) en el reservorio de la muestra. (Nota: Si la cantidad total es crítica, la elución debería llevarse a cabo durante 2 etapas de elución subsecuentes, por ejemplo 2 x 37.5 jl - debería definirse antes de cada estudio).
• Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación en un termomezclador a 1,000 rpm.
• Invierta el dispositivo de filtración y colóquelo en un nuevo tubo Microcon de 1.5 ml.
• Eluya el ADN de la membrana haciendo rotar durante 5 minutos a 1,000 g.
• Opcional: Si se desea transfiera el ADN a un tubo nuevo - la tapa de los tubos Microcon tiende a abrirse rápidamente.
• Almacene el ADN a -80°C para almacenamiento a largo plazo o a +4°C para uso inmediato.
Ejemplo 3
Todas las etapas se realizarán en los tubos en los que se proveen las muestras. Los tubos pueden ser tubos de 1,5 y 2,0 ml. Revise otra vez, por favor que los formatos de los tubos quepan en la centrífuga.
Los solventes y reguladores se pueden suministrar con pipetas monocanal o multipetas
a) Eliminación de parafina
Producto químico necesario:
Limoneno145, Fluka Chemika, Art Nr. 89188
Procedimiento:
1. Agregue 1 ml de limoneno a cada tubo (que contiene de 1 a 5 secciones de un tejido embebido en parafina y fijado con formalina). Empuje todas las piezas en el líquido. En algunos casos, el material de muestra ya es muy frágil con trozos pequeños de parafina/tejido en el tubo. Asegúrese de que el material adherido a la tapa del tubo regrese al tubo.
2. 1 h de incubación a temperatura ambiente a 1.000 rpm, agite en vórtice vigorosamente al menos 3 veces durante la incubación.
3. Coloque los tubos en la centrífuga y gírelos a 16,000 rcf (= 16,000 x g) durante 5 min, el tejido se sedimentará en el fondo del tubo.
4. Use una pipeta de 1 ml para absorber el limoneno de cada muestra. ¡Debe tenerse gran cuidado para no perturbar las pellas!. Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pella sobre el tubo y permita que el limoneno ingrese suavemente en la punta de la pipeta. En algunos casos, puede ser más fácil eliminar todo el volumen en dos etapas en lugar de una.
Está bien. si pequeñas cantidades (hasta 50 jl) de limoneno permanecen en el tubo.
5. Si el tejido se deposita solo débilmente en la parte inferior (es decir, no forma una buena pella) haga lo siguiente:
Repita la centrifugación de nuevo durante 5 minutos en la centrífuga Eppendorf 5417 a la velocidad máxima (> 20,000 rcf)
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Luego repita la eliminación de limoneno: asegúrese de que la punta de la pipeta esté presionada contra el fondo del tubo y el limoneno se extrae muy lentamente, de tal forma para no succionar el tejido. Eliminar tanto limoneno como sea posible.
Deje fuera la etapa de etanol, si fuera posible eliminar casi todo el limoneno (si quedan 50 pl, esto estará bien).
6. Agregue 1 ml de etanol (pureza> 99%).
7. Vórtex, 10 minutos de incubación a temperatura ambiente a 1.000 rpm.
8. Coloque los tubos en la centrífuga y gírelos a 16,000 rcf por 5 min. El tejido se sedimentará nuevamente en el fondo del tubo.
9. Use una pipeta para absorber el etanol, ¡debe tenerse gran cuidado para no perturbar las pellas! Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pella en la pared del tubo y permita que el etanol entre suavemente en la punta de la pipeta.
10. Retire la mayor cantidad de etanol posible con la pipeta.
11. El etanol residual no eliminado por transferencia con pipeta debe evaporarse por incubación en un termomezclador a 50 °C. Esto puede tomar entre 10 y 30 minutos, pero tenga cuidado de no secar demasiado las muestras.
No se necesita secado, si la etapa de etanol se omite.
b) Etapa de lisis
Prepare un volumen mayor del regulador de lisis (0.5 o 1 1), dependiendo del número de muestras que se procesarán para un proyecto. Este regulador puede almacenarse a temperatura ambiente durante 3 meses. Después de este tiempo, es prudente preparar un nuevo regulador.
Productos químicos
TRIS (tris-hidroximetil-amino-metano), Merck, art. Nr.
1.01549.0500,
MW = 121.14 g/ml
Prepare una solución madre de 1 mol/l:
disuelva 121.14 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con HCl y llene hasta 1 1.
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético),
EDTA de sodio (Titriplex III) de Merck, art. Nr. 159294 MW = 372.24 g/mol
Prepare una solución madre de 0.5 mol/l:
Disuelva 186.1 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con NaOH, llene hasta 1 1.
Tween (Tween 20), Fluka, Chemika Art Nr. 93773
Este detergente se agrega al regulador en porcentaje de volumen. Para agregar Tween al regulador, tome 1 ml de Tween (en un tubo de 2 ml), caliente a 50 °C y agregue el volumen deseado al regulador con una punta de pipeta ensanchada.
Composición del regulador de lisis:
50 mmol/l de TrisHCl, pH 8,0, 1 mmol/l de EDTA, 0,5% de Tween (% en volumen)
Proteinasa K, Roth
Prepare una solución madre de 30 mg/ml en H2O. El tamaño de la solución madre se debe ajustar al número de muestras que se procesarán. Por ejemplo, 300 mg de proteinasa K disueltos en 10 ml de H2O serán suficientes para ~ 400 muestras. La proteinasa K puede almacenarse a 4 °C durante hasta una semana de forma segura. Si se procesarán más muestras, se recomienda preparar soluciones nuevas repetidamente.
Procedimiento:
1. Agregue 190 |jl del regulador de lisis preparado a cada muestra. Es importante asegurarse de que todo el material de muestra esté cubierto por regulador de lisis.
2. Agregue 20 jl de la solución de proteinasa K preparada.
3. Someta a vórtex el tubo rigurosamente para asegurar una mezcla adecuada de la muestra con el regulador de lisis 5 y la proteinasa K. Asegúrese de que las tapas de los tubos estén bien cerradas; de lo contrario, ¡se perderá líquido!
4. Incube a 50 °C, agitando 1,000 rpm (termohilador).
5. Incube durante 40 a 48 h, no es necesario agregar más proteinasa K.
6. Gire en la mañana y en la noche de cada día para eliminar las gotas de la tapa, someeta a vórtex enérgicamente. Control de calidad de la lisis (durante la lisis):
10 Después de estas etapas de lisis, debe haber una solución homogénea, tal vez turbia en el tubo, sin restos visibles de tejido. Sin embargo, si hubiera muestras visibles de tejidos en MUCHAS de las muestras que quedan después de la primera incubación durante la noche, se debe considerar la etapa adicional de proteinasa K y el aumento del volumen de lisis. Si solo las muestras individuales tienen algo de material no digerido, esto puede ser descuidado. ¡Mire detenidamente!
15 7. Incube las muestras a> 95 °C durante 10 minutos para obtener proteinasa K inactiva. Para ello, ajuste la temperatura
del termomezclador a 99 °C, ya que la temperatura real en el ajuste más alto es algunos grados por debajo de la temperatura indicada. (La proteinasa K activa en el lisado reducirá el rendimiento de la PCR, especialmente si el lisado se usa directamente para la cuantificación del ADN genómico mediante RT-PCR).
8. Las muestras sometidas a lisis pueden almacenarse a -20 °C o -80 °C (dependiendo del tiempo de almacenamiento) 20 o pueden usarse inmediatamente para el procesamiento corriente abajo
Ejemplo comparativo 4
Todas las etapas se realizarán en los tubos en los que se proveen las muestras. Los tubos pueden ser tubos de 1.5 y 2.0 ml. Verifique que los formatos de los tubos quepan en la centrífuga.
Los solventes y reguladores se pueden suministrar con pipetas monocanal o multipetas.
25 a) Eliminación de parafina
Producto químico necesario:
Limoneno145, Fluka Chemika, Art Nr. 89188
Procedimiento:
30 1. Agregue 1 ml de limoneno a cada tubo (que contenga de 1 a 6 secciones de una muestra de cirugía fijada con
formalina embebida en parafina o una cantidad igual de una biopsia). En algunos casos, el material de muestra ya es muy quebradizo con pequeños trozos de parafina/tejido en el tubo: asegúrese de que el material adherido a la tapa del tubo regrese al tubo.
2. 10 min de incubación a temperatura ambiente, durante la incubación, someta a vórtez varias veces (2-4 x 5 35 segundos) de manera que la muestra se desintegre tanto como sea posible. Esto puede variar de muestra a muestra.
3. Coloque los tubos en la centrífuga y gire a 16,000 rcf (= 16,000 x g) durante 5 min. El tejido se sedimentará en el fondo del tubo.
4. Use una pipeta de 1 ml para absorber el limoneno de cada muestra. ¡Debe tenerse gran cuidado de no perturbar la pella!. Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pella sobre el tubo y permita que el limoneno ingrese suavemente
40 en la punta de la pipeta. En algunos casos, puede ser más fácil eliminar todo el volumen en dos etapas en lugar de una. Está bien, si pequeñas cantidades (pocos jl) de limoneno permanecen en el tubo.
5. Si el tejido se deposita solo débilmente en la parte inferior (es decir, no forma una buena pella) haga lo siguiente:
repita la centrifugación de nuevo durante 5 min en la centrífuga Eppendorf 5417 a velocidad máxima (> 20,000 rcf)
luego repita la eliminación de limoneno: asegúrese de que la punta de la pipeta esté presionada contra el fondo del 45 tubo y que el limoneno se elimine muy lentamente, como para no succionar el tejido. Eliminar tanto limoneno como sea posible.
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6. Agregue 1 ml de etanol (pureza> 99%).
7. 10 minutos de incubación a temperatura ambiente. Durante la incubación, agite con vórtice los tubos 2-3 veces de modo que el sedimento se afloje y todo el tejido se empape en etanol.
8. Coloque los tubos en la centrífuga y gírelos a 16,000 rcf durante 5 min., El tejido volverá a sedimentar en el fondo del tubo.
9. Use una pipeta para absorber el etanol, ¡debe tenerse gran cuidado de no perturbar la pella! Coloque la punta de la pipeta opuesta a la pella en la pared del tubo y permita que el etanol entre suavemente en la punta de la pipeta. Retire la mayor cantidad de etanol posible con la pipeta.
10. El etanol residual no eliminado por pipeteo debe evaporarse por incubación en un termomezclador a 50 °C. Esto puede tomar entre 10 y 30 minutos, pero tenga cuidado de no secar demasiado las muestras.
b) Etapa de lisis
Prepare un volumen mayor del regulador de lisis (0.5 o 1 l), dependiendo de la cantidad de muestras que se procesarán para un proyecto. Este regulador puede almacenarse a temperatura ambiente durante 3 meses. Después de este tiempo, es prudente preparar un nuevo regulador.
Productos químicos:
TRIS (tris-hidroximetil-amino-methan), Merck, art. Nr. 1.01549.0500; MW = 121,14 g/ml; Prepare una solución madre de 1 mol/l: disuelva 121.14 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con HCl y llene hasta 1 l. Se debe prever una solución Tris 50 mmol/l de esta solución madre por dilución.
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético); EDTA de sodio (Titriplex III) de Merck, art. Nr. 159294; MW = 372,24 g/mol; prepare una solución madre de 0.5 mol/l: disuelva 186.1 g en 800 ml de H2O y ajuste a pH 8.0 con NaOH, llene hasta 1 l.
Tween (Tween 20), Fluka, Chemika Art Nr. 93773; este detergente se agrega al regulador en porcentaje de volumen. Para agregar Tween al regulador, tome 1 ml de Tween (en un tubo de 2 ml), caliente a 50 °C y agregue el volumen deseado al regulador con una punta de pipeta ensanchada.
Composición del regulador de lisis:
50 mmol/l de TrisHCl, pH 8,0, 1 mmol/l de EDTA, 0,5% de Tween (% en volumen).
Proteinasa K, Roth
Prepare una solución madre de 10 mg/ml en H2O. El tamaño de la solución madre se debe ajustar al número de muestras que se procesarán. Por ejemplo, 100 mg de proteinasa K disueltos en 10 ml de H2O serán suficientes para -160 muestras. La proteinasa K se puede almacenar a 4°C durante un máximo de dos semanas de forma segura. Si se procesarán más muestras, se recomienda preparar soluciones nuevas repetidamente.
Procedimiento:
1. Agregue 150 pl del regulador de lisis preparado a cada muestra. Es importante asegurarse de que todo el material de muestra esté cubierto por regulador de lisis.
2. Agregue 20 pl de la solución de proteinasa K preparada. Agite en vórtex el tubo rigurosamente para asegurar una mezcla adecuada de la muestra con el regulador de lisis y la proteinasa K. Muy brevemente, hágalo girar para reducir las gotitas. Asegúrese de que las tapas de los tubos estén bien cerradas; de lo contrario, ¡se perderá líquido!
3. Incube a 50 °C, agitando 1.000 rpm (termoagtador).
4. Incube durante 40 h, con un total de 3 inyecciones de proteinasa K (siempre 20 pl).
5. Después de cada período de incubación, los tubos deben centrifugarse brevemente para eliminar cualquier líquido de la tapa para evitar el riesgo de contaminación (a través de guantes). Después de la inyección de proteinasa K, las muestras deben someterse a vórtex para garantizar una mezcla adecuada. Gire hacia abajo y continúe con la incubación.
Esquema de incubación: 1 noche, 1 día, 1 noche Calendario de trabajo sugerido:
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a. Por persona, no más de 24 muestras deben procesarse en paralelo.
b. La desparafinación de la muestra de 24 muestras tomará aproximadamente 2 h.
c. Primera etapa de proteinasa K a las 16:00.
d. Segunda etapa de proteinasa K al día siguiente 8:00.
e. Tercera etapa de proteinasa K este día a las 16:00.
f. La lisis completa el día siguiente a las 8:00.
Control de calidad de la lisis (después del final de la lisis):
Después de estas etapas de lisis, debe haber una solución clara en el tubo sin restos visibles de tejido. Sin embargo, si hubiera muestras visibles de tejidos en MUCHAS de las muestras que quedan, se deberían considerar etapas adicionales de proteinasa K. Si solo las muestras individuales tienen algo de material no digerido, esto puede ser neglicencia.
6. Incubar las muestras a> 95 °C durante 10 minutos para obtener proteinasa K inactiva. Para esto, la temperatura del termomezclador se establece en 99 °C, ya que la temperatura real en el ajuste más alto es algunos grados por debajo de la temperatura indicada. (La proteinasa K activa en el lisado reducirá el rendimiento de la PCR, especialmente si el lisado se usa directamente para la cuantificación del ADN genómico mediante RT-PCR)
7. Las muestras sometidas a lisis se pueden almacenar a -20 °C o -80 °C (dependiendo del tiempo de almacenamiento) o se pueden usar inmediatamente para el procesamiento corriente abajo.
c. Extracción de ADN con QIAGEN DNA-Mini-Kit
Exposición de tiempo para 30 muestras:
Suministro de dispositivos y materiales (15 min); Preparación (0,5 h); Implementación (1.5 h).
Suministro de dispositivos y materiales:
Se necesitan los siguientes dispositivos/medios de trabajo:
centrífuga Eppendorf 5417R, pipetas Eppendorf, tubos de reacción de 1,5 ml, tubos de reacción de 2 ml, termomezclador o baño de agua.
Se necesitan los siguientes reactivos:
Unidades de muestra (líquidas o tisulares)
Solución salina regulada con fosfato (PBS)
Etanol (96-100%)
Agua para biología molecular (filtrado de 0,2 pm, tratado con DEPC, esterilizado en autoclave y libre de DNasas, ARNasas, proteasas y fosfatasas)
QlAamp DNA-Mini-Kit
Preparación de soluciones:
1. Mezcle el regulador AL completamente sacudiendo antes de usar. El regulador AL es estable durante 1 año cuando se almacena a temperatura ambiente. Si se ha formado un precipitado en el regulador AL, disuelva incubándolo a 70 °C.
2. El regulador AW 1 se suministra como concentrado. Agregue 125 ml de etanol (96-100%) antes del primer uso. El regulador AW 1 es estable durante 1 año cuando se almacena cerrado a temperatura ambiente.
3. El regulador AW 2 se suministra como concentrado. Agregue 160 ml de etanol (96-100%) antes del primer uso. El regulador AW 2 es estable durante 1 año cuando se almacena cerrado a temperatura ambiente.
4. Equilibre las muestras a temperatura ambiente.
5. Caliente un baño de agua o termomezclador a 56 °C.
6. Equilibrar el regulador de elución deseado (regulador AE o agua) a temperatura ambiente.
7. Todas las etapas de centrifugación deben llevarse a cabo a temperatura ambiente. Procedimiento:
5
1. Agregue 200 jl de regulador AL a la muestra. Mezcle por vórtex de pulso durante 15 segundos.
2. Incube a 56 °C durante 10 min. ¡Una incubación más larga puede conducir a la degradación del ADN!
3. Agregue 200 jl de etanol (96-100%) a la muestra, y mezcle por vórtex de pulso durante 15 segundos. Después de mezclar, centrifugue brevemente el tubo de reacción de 1,5 ml para eliminar las gotas del interior de la tapa.
10 4. Aplique con cuidado la mezcla de la etapa 3 en una columna de centrifugación QlAamp previamente colocada en
un tubo de recolección de 2 ml sin mojar el borde. Cierre la tapa y centrifugue a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1 minuto. Coloque la columna giratoria QlAamp en un tubo de recolección limpio de 2 ml (incluido) y deseche el tubo que contiene el filtrado.
5. Con cuidado, abra la columna QlAamp de giro y agregue 500 jl de regulador AW 1 sin mojar el borde. Cierre la 15 tapa y centrifugue a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1 minuto. Coloque la columna giratoria QlAamp en un tubo de
recolección limpio de 2 ml (incluido) y deseche el tubo de recolección que contiene el filtrado.
6. Abra con cuidado la columna QlAamp de giro y agregue 500 jl de regulador AW 2 sin mojar el borde. Cierre la tapa y centrifugue a una velocidad máxima de 20,000 x g (14,000 rpm) durante 3 minutos.
7. Deseche el filtrado, seque los tubos de recolección golpeándolos sobre un pañuelo kleenex en el banco, inserte la 20 columna y centrifugue nuevamente durante 1 minuto a 8,000 rpm para eliminar el etanol residual presente en AW2.
8. Coloque la columna de centrifugación QlAamp en un tubo de reacción limpio de 1,5 ml y deseche el tubo de recolección que contiene el filtrado. Abra con cuidado la columna centrifugadora QlAamp y añada un volumen adecuado (50-150 jl) de regulador AE caliente (-40 °C) o agua.
9. lncube a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego centrifugue a 6.000xg (8.000 rpm) durante 1 minuto.
25 10. Tome el eluato y transfiera con pipeta por segunda vez en la columna giratoria QlAamp. lncubar a temperatura
ambiente durante 1 minuto, y luego centrifugar a 6.000 x g (8.000 rpm) durante 1 minuto. La incubación de la columna de centrifugación QlAamp cargada con regulador durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de la centrifugación generalmente aumenta el rendimiento de ADN.
11. Para uso inmediato, se recomienda un almacenamiento a + 4°C en la nevera, mientras que a largo plazo, se 30 recomienda almacenar a -20°C.
12. Opcional, la calidad y la cantidad se deben verificar por medición con el fotómetro. Una muestra de 200 jl de sangre humana completa normalmente produce 6 jg de aDn en 200 jl de agua (30 ng/jl) con una relación A260/A280 de 1,7-1,9. Un control de calidad adicional del estado del ADN sería cargar alrededor de 5 jl (1 jl de muestra + 4 jl de agua) en un gel de agarosa al 0,8%. Mediante esta comprobación, se puede determinar el nivel de degradación
35 del ADN y el tamaño promedio del fragmento, así como la concentración aproximada.
Ejemplo 5
a) Tratamiento con bisulfito y b) Purificación de ADN con dispositivo Microcon™ y uso de dioxano Equipo necesario:
• termociclador (por ejemplo, Eppendorf, Tetrad)
40 • centrífuga (capaz de hasta 14,000 x g)
• pipeteadores para volúmenes de 100 pl y 1000 pl Material necesario:
• Dispositivos Microcon Centrifugal Filter, Microcon® YM-30, Millipore/Amicon
• Puntas de pipeta (100 pl, 1,000 pl)
45 • Tubos de PCR de 200 ul, de pared delgada
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40
• Tubos de reacción de 1.5 ml
• Tubos Falcon de 15 ml y 50 ml Reactivos químicos necesarios:
• bisulfito de sodio (Na2S2O5, MW = 190.1 g/mol), Merck 1.06528.0500
• sulfito de sodio, anhidro (Na2SO3, MW = 126.04 g/mol ), Fluka 71988
• ddH2O grado biología molecular (filtrada por 0,2 |jm, tratada con DEPC, sometida a autoclave, libre de DNasas y RNasas)
• 1,4-dioxano, estabilizado (MW = 88.11 g/mol), Riedel de Haen 33147
• ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman2-carboxílico (MW = 250.29 g/mol), Aldrich 23,881-3
• Tris-hidroximetil-aminometano (M=121.14 g/mol), Merck 1.01549.0500
• pellas de hidróxido de sodio (MW = 40 g/mol), Merck 1.06482.1000
• EDTA (Titriplex® III, MW = 372.24 g/mol), Merck 1.08418.0250 Preparación de soluciones:
Solución de bisulfito: Se disuelven disulfito de sodio (4.708 g) y sulfito de sodio (1.128 g) agregando 10 ml de ddH2O (la solución es 4.9 M). Se verifica el pH de la solución - si no está entre 5.45 y 5.5, descarte la solución y repita la preparación.
Agite vigorosamente y si es necesario, caliente la solución a 50°C en un baño de agua que se somete a vórtex a una velocidad máxima durante 30 segundos. Repita este procedimiento tan frecuentemente como sea necesario hasta que la sal se haya disuelto completamente.
Dioxano solución depuradora de radicales: Disuelva 197.2 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman2- carboxílico agregando 5 ml de 1,4-dioxano. Someta a vórtex rigurosamente con el fin de asegurarse que no permanezcan partículas sin disolver. El dioxano es peligroso. Por lo tanto tome las precauciones apropiadas cuando se manipule este reactivo químico. Si se van a tratar solamente unas pocas muestras con bisulfito, prepare volúmenes más pequeños.
NaOH 0.2 M: Disuelva 0.32 g de hidróxido de sodio en 40 ml de ddH2O.
Regulador TE: 10 mmol/l Tris, 0.1 mmol/l EDTA, pH 8 General:
• Este procedimiento puede ser aplicado a una muestra individual o a muchas muestras en paralelo.
• Las soluciones de trabajo no deben ser almacenadas por periodos prolongados de tiempo. Es mejor prepararlas frescas y escalar las soluciones de acuerdo con el número de muestras que se van a procesar. •
• Todas las soluciones recolectadas como residuos en este procedimiento deben ser recolectadas, por ejemplo en una botella de vidrio y descartadas finalmente como solventes orgánicos libres de halógenos.
Procedimiento:
Transferir con pipeta las siguientes soluciones a un tubo de PCR de 200 ul en el orden mostrado:
1. 20 jl de regulador/agua que contiene el ADN que va a ser tratado con bisulfito.
2. 85 jl de solución de bisulfito.
3. 35 jl de solución de dioxano, que contiene el depurador de radicales (el volumen total de la mezcla de reacción es 140 jl)
Programa de temperatura:
• 5:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C
• 25 minutos incubación a 60°C
• 5:00 minutos desnaturalización de ADN a 95 °C
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• 1:25 horas incubación a 60°C
• 5:00 minutos desnaturalización de ADN a 95°C
• 2:55 horas incubación a 60°C
• enfriar a 20°C hasta el final
Debido a la alta molaridad de las sales de bisulfito una parte de la sal puede precipitar. Estos precipitados no afectarán la reacción del bisulfito.
Purificación del ADN:
1. Después de que termina la incubación, se transfiere la solución de reacción (140 jl) a un tubo de recolección de 1.5 ml, se agregan 260 jl de ddH2O en el tubo de recolección.
2. Mezclar mediante vórtex.
3. Tomar todo esta solución (400 jl) y transferirla con pipeta al reservorio de muestra de un dispositivo de filtración Microcon ensamblado. (¡No toque la membrana con la punta de la pipeta!)
4 Selle con la tapa anexa.
5. Coloque el ensamblaje en la centrífuga, y la tira de tapas hacia el centro del rotor y haga rotar durante 15 minutos a 14,000 x g (= rcf).
6. Después de la rotación retire el ensamblaje y descarte el fluido. TOME NOTA: la eficacia de la centrifugación puede variar dependiendo del modelo particular de centrífuga e instrumento usado. ¡Por lo tanto todas las etapas de centrifugación siempre deben verificar el volumen de muestra que pasa a través de la membrana! Si es necesario, incremente los tiempos de rotación en etapas de 2 minutos.
7. Retire el ensamblaje de filtración de la centrífuga.
8. Agregue 400 jl de NaOH 0.2 mol/l a la membrana.
9. Coloque el ensamblaje de nuevo en la centrífuga y haga rotar durante 12 minutos a 14,000 x g, descarte el fluido.
10. Lave la membrana agregando 400 jl de agua y haga rotar durante 12 minutos, descarte el fluido.
11 Repita la etapa de lavado dos veces más.
12. La membrana debería parecer húmeda, pero no debe estar cubierta por un volumen visible de líquido.
13. Para elución, retire el ensamblaje de la centrífuga.
14. Agregue 75 jl de regulador TE precalentado (50°C) (Tris/HCl 10 mmol/l; EDTA 0.1 mmol/l) en el reservorio de muestra.
15. Incube durante 10 minutos con agitación en un termomezclador a 1,000 rpm (50°C).
16 Invierta el dispositivo de filtro y colóquelo en un nuevo tubo Microcon de 1.5 ml.
17. Haga rotar durante 5 minutos a 1,000 x g.
18. Almacene el ADN a -20°C para almacenamiento a largo plazo o a +4°C para uso inmediato.
Ejemplo 6 Purificación de ADN por medio de un QlAamp Viral RNA mini kit
Equipo necesario:
Centrífuga de tubo
Pipeteadores para volúmenes de 10 pl a 1000 pl Material necesario:
QlAamp Viral RNA Mini Kit (50) (Qiagen cat# 52904)
Puntas de pipetas (100 pl, 1.000 pl)
Productos químicos necesarios:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Etanol, grado de biología molecular
Pellas de hidróxido de sodio (NaOH, MW = 40,0 g/mol), Merck 1.06482.1000 Preparación de soluciones:
Regulador de desulfonación: disuelva 0,8 g de hidróxido de sodio en 10 ml de ddH2O para preparar una solución madre de 2 mol/l. Para el regulador de desulfonación, mezcle 1,0 ml de hidróxido de sodio 2 mol/l y 9,0 ml de etanol. ¡La solución debe prepararse recién antes de cada purificación!
Regulador AVL: agregue 1 ml de regulador AVL a un tubo de ARN transportador liofilizado. Disolver completamente Transfiera a la botella regulador AVL, y mezcle completamente antes de usar regulador AVL por primera vez. Este regulador puede almacenarse a 2-8 °C para uso futuro. Sin embargo, si se desarrolla un precipitado, se vuelve a disolver calentando a 80 °C. Esto debe hacerse no más de un total de 6 veces. Enfríe a temperatura ambiente antes de usar. Se puede mantener una pequeña alícuota a temperatura ambiente durante hasta 2 semanas.
Procedimiento:
1. Para la unión del ADN tratado con bisulfito, tansfiera con pipeta 560 pl de regulador AVL/ARN transportador preparado en los tubos que contienen 140 pl de solución de ADN tratada con bisulfito. Agregue 560 pl de etanol a las muestras. Pulso-vórtice durante 15 segundos Centrifugar brevemente.
2. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
3. Cargue 630 pl de la mezcla de la etapa 2 a la columna de giro QlAamp, que se coloca en un tubo de recolección (etiquetado previamente). Cierre la tapa y centrifugue a velocidad máxima durante 1 min.
4. Coloque la columna de giro en un tubo de recolección limpio de 2 ml y cargue el resto de la mezcla de la etapa 2. Cierre la tapa y centrifugue a velocidad máxima durante 1 minuto.
5. Para el lavado, agregue 500 pl de regulador AW1 a la columna de centrifugación en un tubo de recolección limpio de 2 ml. Centrifugar a velocidad máxima durante 1 min. Deseche el filtrado.
6. Para la desulfonación, agregue 500 pl de NaOH/etanol 0,2 mol/l a la columna de centrifugación en un tubo de recolección limpio de 2 ml. Incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a velocidad máxima durante 1 min.
7. Agregue 500 pl de regulador AW2 spin column en un tubo de recolección limpio de 2 ml. Centrifugar a 14,000 rpm durante 3 min. Deseche el filtrado.
8. Coloque la columna de giro QlAamp en un nuevo tubo de recolección de 2 ml. Centrifugar a 14,000 rpm durante 1 min para eliminar el posible arrastre de regulador AW2. Deseche el filtrado.
9. Coloque la columna de centrifugación QlAamp en un tubo de microcentrífuga preetiquetado de 1,5 ml. Agregue 75 pl de regulador AVE a las columnas de giro de QlAamp. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 9,000 rpm durante 1 min.
Ejemplo 7. Etapa de lisis por medio de calentamiento
1. Centrifugue 1-6 secciones de tejido embebido en parafina fijado con formalina en un tubo de reacción de 1.5 ml durante 5 minutos a 16,000 x g.
2. Agregue 100 pl de regulador de lisis (50 mmol/l TrisHCl, pH 8.0, 1 mmol/l EDTA, Tween 20 al 0.5% v/v, 5 ng/pl polydA)
3. Incube durante 10 minutos a 65°C con agitación a 1,000 rpm en un termomezclador.
4. Fije el termomezclador a 50° C y 1,400 rpm, deje las muestras en el termomezclador y déjelas enfriar.
5. Agregue 10 pl de proteinasa K (30 mg/ml).
6. Haga caer por rotación todas las gotitas de la pared del tubo. Asegúrese de que las tapas del tubo están cerradas herméticamente - de otra manera habrá pérdida de líquido.
7. Incube durante 40-48 horas a 60°C en un termomezclador con agitación a 1,000 rpm.
8. Incube las muestras a > 95°C durante 10 minutos con el fin de inactivar la proteinasa K. Para esto, fije la temperatura del termomezclador en 99°C. Transfiera los tubos INMEDIATAMENTE a otro termomezclador temperado a 50°C, agite a 1,400 rpm e incube durante 5 minutos. Esto evita la formación de una película de parafina.
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9. Aplique 44 |jl de este lisado directamente (sin extracción adicional) al ejemplo 8.
Ejemplo 8.
a) Tratamiento con bisulfito y b) Purificación de ADN por medio del dispositivo Microcon™ y utilizando DME.
Equipo necesario:
• termociclador (por ejemplo Eppendorf, Tetrad)
• centrífuga (capaz de hasta 14,000 x g)
• pipeteadores para volúmenes de 100 jl y 1,000 jl Material necesario
• dispositivos Microcon Centrifugal Filter, Microcon® YM-30 (Millipore/Amicon 42410)
• puntas para pipeta (100 jl, 1,000 jl)
• tubos de PCR de 200 jl (por ejemplo Eppendorf 0030 124.359)
• tubos de 1.5 ml (por ejemplo Eppendorf 0030 120.086)
• tubos Falcon de 15 ml y 50 ml Reactivos químicos necesarios:
• bisulfito de sodio (Na2S2O5, MW = 190.1 g/mol), Merck 1.06528.0500
• sulfito de sodio, anhidro (Na2SO3, MW = 126.04 g/mol), Fluka 71988
• ddH2O grado de biología molecular (filtrada por 0.2 jm, tratada con DEPC, sometida a autoclave, libre de DNasas y RNasas)
• dietilenglicoldimetiléter (DME), Merck 8.02934.0250
• ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman2-carboxílico (MW = 250.29 g/mol), Aldrich 23,881-3
• Tris-hidroximetil-aminometano (C4H8O2, MW = 121.14 g/mol), Merck 1.01549.0500
• pellas de hidróxido de sodio (NaOH, MW = 40.0 g/mol), Merck 1.06482.1000
• EDTA (Titriplex® III, C10H14N2OsNa2 * 2H2O, MW = 372.24 g/mol), Merck 1.08418.0250 Preparación de soluciones (suficiente para 80 reacciones):
Solución de bisulfito: Se disuelven bisulfito de sodio (4.708 g) y sulfito de sodio (1.128 g) agregando 10 ml de ddH2O (la solución es 4.9 M). El volumen final es alrededor de 12 ml. Verifique el pH de la solución - si no está entre 5.45 y 5.5, descarte la solución y repita la preparación. Agite vigorosamente y si es necesario, caliente la solución a 50°C en un baño de agua y luego someta a vórtex a una velocidad máxima durante 30 segundos. Repita este procedimiento tan frecuentemente como sea necesario hasta que la sal se disuelva completamente.
Solución de DME-depurador de radicales: Disuelva 125.3 mg del ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman2- carboxílico agregando 1.0 ml de DME. Someta a vórtex rigurosamente con el fin de asegurar que no permanezcan partículas no disueltas. Si se van a tratar con bisulfito solo pocas muestras, prepare volúmenes menores.
NaOH 0.2 M: disuelva 0.32 g de hidróxido de sodio en 40 ml de ddH2O.
Regulador TE: 10 mmol/l Tris, 0.1 mmol/l EDTA, pH 8.
General:
• Este procedimiento está diseñado para ser aplicado en tubos de PCR de 200 jl. El número total de muestras está limitado por el número de tubos que pueden ser manipulados en los termocicladores, centrífugas, etc.
• Las soluciones de trabajo no deberían ser almacenadas durante periodos prolongados de tiempo. Es mejor prepararlas frescas y escalar las soluciones de acuerdo con el número de muestras que se van a procesar.
• Todas las soluciones recolectadas como residuos en este procedimiento deberían ser recolectadas, por ejemplo, en una botella de vidrio y finalmente descartadas como solventes orgánicos libres de halógenos.
5
10
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20
25
30
35
40
Procedimiento de tratamiento con bisulfito:
Transfiera con pipeta las siguientes soluciones en los tubos de PCR en el orden mostrado.
1. 45 |jl de regulador/ agua que contiene el ADN que va a ser tratado con bisulfito.
2. 83 jl de solución de bisulfito.
3. 13 jl de solución de DME, que contiene el depurador de radicales.
4. Mezclar exhaustivamente.
5. Colocar en pozos de 0,2 ml en el termociclador.
¡El volumen total de la mezcla de reacción es 141 jl! ¡Cierre herméticamente las tapas de los tubos de PCR! Protocolo de Temperatura:
• 5:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C.
• 22:00 minutos incubación a 60°C.
• 3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C.
• 1:27:00 horas incubación a 60°C.
• 3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C.
• 2:57:00 horas incubación a 60°C.
• enfriar a 20°C.
Debido a la alta molaridad de las sales de bisulfito una parte de la sal puede precipitar. Estos precipitados no afectan la reacción del bisulfito.
Procedimiento de purificación del ADN:
• Después de que termina la incubación, transferir la solución de reacción (141 jl) a un tubo de recolección de 1.5 ml.
• Agregar 260 jl de ddH2O al tubo de recolección.
• Cierre las tapas, someter a vórtex intensamente y hacer rotar un tiempo corto para retirar las gotas de la tapa.
• Tomar toda esta solución (400 jl) y transferirla con pipeta al reservorio de muestra de un dispositivo de filtro Microcon ensamblado - ¡no toque la membrana con la punta de la pipeta!
• Selle con la tapa anexa.
• Coloque el ensamblaje en la centrífuga, alinee la tira de tapas hacia el centro del rotor y haga rotar durante 15 minutos a 14,000 x g (= rcf).
• Después de la rotación retire el ensamblaje y descarte el fluido. TOME NOTA: la eficacia de la centrifugación puede variar dependiendo del modelo particular de centrífuga e instrumento usado. ¡Por lo tanto todas las etapas de centrifugación siempre deben verificar el volumen de muestra que pasa a través de la membrana! Si es necesario, incremente los tiempos de rotación en etapas de 2 minutos.
• Para desulfonación, agregue 400 jl de NaOH 0.2 mol/l a la membrana.
• Coloque de regreso el ensamblaje en la centrífuga y haga rotar durante 12 minutos a 14,000 x g. Retire el ensamblaje y descarte el fluido.
• Agregue 400 jl de ddH2O.
• Coloque el ensamblaje de nuevo en la centrífuga y haga rotar durante 12 minutos a 14,000 x g. Retire el ensamblaje y descarte el fluido.
• ¡Repita esta etapa dos veces adicionales! POR FAVOR TOME NOTA: después de esto la membrana debería parecer húmeda, pero no debería estar cubierta por un volumen visible de líquido. •
• Para elución del ADN, retire el ensamblaje de filtro de la centrífuga.
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• Agregue 75 |jl de regulador TE precalentado (50°C) en el reservorio de muestra. (Nota: Si la cantidad total es crítica, la elución debería ser llevada a cabo en 2 etapas de elución subsecuentes, por ejemplo, 2 x 37.5 jl -lo que debería ser definido antes de cada estudio)
• Incube durante 10 minutos a 50°C con agitación en un termomezclador a 1,000 rpm.
• Invierta el dispositivo de filtración y colóquelo en un nuevo tubo Microcon de 1.5 ml.
• Eluya el ADN de la membrana haciendo rotar durante 5 minutos a 1,000 g.
• (si se desea transfiera el ADN a un nuevo tubo - la tapa de los tubos Microcon tiende a abrirse rápidamente)
• almacene el ADN a -80°C para almacenamiento a largo plazo o a +4°C para uso inmediato.
Ejemplo comparativo 9
9.1. Conjuntos de muestra
9.1.1. Población no tratada positiva para receptor de estrógenos (ER+) negativa para estatus nodal (NO)
Se analizaron muestras de tumores ER+ NO de pacientes no tratados con ninguna terapia adyuvante. Los marcadores que son capaces de mostrar una diferencia de supervivencia significativa en esta población se consideran como prognósticos. Puesto que la terapia adyuvante se ha convertido en el régimen de rutina para pacientes con cáncer de seno durante muchos años, el conjunto de muestras recolectadas es uno histórico de los ochenta del siglo pasado.
Todas las 508 muestras de este conjunto fueron obtenidas del Erasmus Medical Center en Rotterdam como pellas de núcleos celulares (muestras congeladas frescas).
9.1.2. Población ER+ NO tratada con tamoxifen (TAM)
Se supone que la población objetivo de la prueba final son pacientes con tumores ER+ NO que son tratados con terapia hormonal. Para verificar el rendimiento del comportamiento de los candidatos marcadores en esta población, se analizaron 589 muestras de tumores ER+ NO de pacientes tratados con tamoxifen. Todas las muestras fueron recibidas como tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (PET). Se proveyeron secciones de tres a diez 10 jm.
• Además, para 89 muestras de pacientes PET se incluyeron muestras congeladas frescas coincidentes para el mismo tumor en el estudio como controles.
9.2. Extracción de ADN
9.2.1. Extracción de ADN a partir de muestras congeladas frescas
De un total de 508 muestras frescas congeladas disponibles como pellas de núcleos celulares, se aisló el ADN genómico utilizando el DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La extracción se hizo de acuerdo con el protocolo Cell Culture utilizando proteinasa K con pocas modificaciones.
Se transfirieron con pipeta 20 jl de proteinasa K (Qiagen, Hilden, Alemania) a un tubo de reacción de 2 ml (Eppendorf Hamburgo, Alemania) que contenía las pellas. Se agregaron 200 jl de regulador PBS y se sometió a vórtex con pulsos durante la noche a 37°C. Se agregaron otros 200 jl de regulador AL y subsecuentemente se sometió a vórtex con pulsos de nuevo a 56°C durante 10 minutos. Después de incubación a 70°C durante 10 minutos, se agregaron 200 jl de etanol (96%) y se incubó durante 15 segundos. La mezcla fue aplicada a una columna y centrifugada a 6,000 x g durante 1 minuto. La columna fue colocada en un tubo de recolección de 2 ml provisto y se agregaron 500 jl de regulador AW 1. Después de la centrifugación a 6,000 x g durante 1 minuto, se agregaron 500 jl de regulador Aw 2 a la columna colocada en otro tubo de recolección de 2 ml provisto seguido por centrifugación a 20,000 x g durante 3 minutos. El tubo de recolección fue mantenido abierto para secar la pella de ADN durante varios minutos y se hizo rotar de nuevo a 6,000 x g para retirar el etanol residual presente en el regulador AW 2. La columna fue colocada en un tubo de reacción limpio de 1.5 ml (Eppendorf, Hamburg, Alemania) y se agregaron 60 jl de regulador AE precalentado (~ 40°C). Después de incubación a temperatura ambiente durante 1 minuto, las muestras fueron centrifugadas a 6,000 x g durante 1 minuto. El eluido fue transferido por pipeta una segunda vez sobre la columna incubada de nuevo a temperatura ambiente durante 1 minuto con la siguiente etapa de centrifugación bajo las mismas condiciones. La calidad y cantidad del ADN genómico extraído fue verificada por medición fotométrica (A260 y A280). El ADN extraído fue almacenado a -20°C hasta el procesamiento subsecuente.
9.2.2. Desparafinación, lisis y extracción de ADN a partir de muestras embebidas en parafina fijadas con formalina (PET)
Para la desparafinación, se procesaron 589 muestras provistas embebidas en parafina fijadas con formalina (PET) directamente en el tubo en el cual fueron suministradas por los proveedores. Se agregó 1 ml de limoneno a cada tubo
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que contenía 3 a 10 secciones, cada una de aproximadamente 10 |jm de espesor y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Durante la incubación fueron sometidas a vórtex rigurosamente varias veces (2-4 x 5 segundos). Las muestras en parafina fueron centrifugadas a 16,000 x g durante 5 minutos. El limoneno sobrenadante fue retirado muy cuidadosamente colocando una pipeta sobre el lado opuesto de la pella. Si no se recibió una pella, la centrifugación fue repetida a velocidad más alta (20,000 x g) durante el mismo tiempo y el limoneno remanente fue retirado. Después se agregó 1 ml de EtOH (pureza > 99%) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos mientras se sometía a vórtex 2-3 veces. Luego los tubos fueron centrifugados a 16,000 x g durante 5 minutos. Se retiró tanto etanol como fue posible sin perturbar la pella mediante una pipeta. El etanol residual no retirado por la pipeta fue evaporado por incubación en un termomezclador a 50°C durante 10 hasta 30 minutos.
Para someter el tejido a lisis, se agregaron 150 jl de regulador de lisis (TrisHCl 50 mmol/l, pH 8.0, EDTA 1 mmol/l, Tween al 0.5% (% en volumen ), TRIS (tris-hidroximetil-amino-metano), Merck, No. 1.01549.0500, EDTA sodio (Titriplex III) de Merck, No. 159294, Tween (Tween20), Fluka, No. 93773) así como 20 jl de proteinasa K (solución de reserva de 10 mg/ml en H2O, Roth, Karlsruhe) a cada muestra desparafinada. Después de someter a vórtex rigurosamente, las muestras fueron centrifugadas por poco tiempo e incubadas en un termoagitador a 50°C. Durante el período de incubación de aproximadamente 40 horas, se agregó proteinasa K cada 8-12 horas (en total tres veces). Los tubos fueron siempre centrifugados rápidamente antes de abrirlos para evitar contaminación. Después de la etapa de lisis, las muestras fueron verificadas para ver si eran claras y que no contenían ya residuos. Subsecuentemente la inactivación de la proteinasa K se logró por incubación de las muestras sometidas a lisis a 95°C durante 10 minutos. Si las muestras sometidas a lisis no fueron utilizadas directamente para la extracción del ADN, fueron almacenadas a -20°C.
El aislamiento del ADN de los lisados de las muestras de tejido embebidos en parafina fijados con formalina (PET) se hizo con el kit DNeasy Tissue (Qiagen cat no. 69504 [50 columnas] or 69506 [250 columnas]) con pocas modificaciones. Se agregaron 200 jl de regulador AL a 210 jl de lisado equilibrado a temperatura ambiente y se mezcló exhaustivamente por vórtex. Esta mezcla fue colocada en un termomezclador e incubada a 70°C mientras se agitaba durante 10 minutos. Luego se agregaron 200 jl de etanol al 96% y se mezcló por sometimiento a vórtex con pulso durante 15 segundos. Después de una breve centrifugación, la mezcla completa fue aplicada sobre una columna la cual fue colocada en un tubo de recolección de 2 ml (provisto por Qiagen). Esto fue seguido por centrifugación a
6.000 x g durante 1 minuto. Después de esto la columna fue colocada en un tubo de recolección de 2 ml (provisto por Qiagen) y se agregaron 500 jl de regulador AW 1. Se aplicó recentrifugación bajo las mismas condiciones. La columna fue colocada en un tubo de recolección adicional provisto y se agregó y regulador AW 2 seguido por centrifugación a
20.000 x g durante 3 minutos. Después de algunos minutos de secado, la etapa de centrifugación fue repetida a 20,000 x durante 1 minuto. Para eluir el aDn, la columna fue colocada en un tubo de reacción de 1.5 ml (Eppendorf, Hamburg, Alemania) y se transfirieron con pipeta sobre el centro de la columna 35 jl de regulador de elución AE (ajustado a temperatura ambiente). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 minuto, la columna fue centrifugada a 6,000 x g durante 1 minuto. Se agregaron otros 35 jl de regulador de elución a la columna y se repitió la centrifugación. Por lo tanto, el volumen final del ADN extraído fue aproximadamente 70 jl. El ADN se almacenó - 20°C.
9.3. Tratamiento con bisulfito
9.3.1. Tratamiento con bisulfito de muestras congeladas frescas
El ADN genómico extraído fue modificado por tratamiento con bisulfito. Durante la reacción con bisulfito, se sulfonaron primero las citosinas no metiladas, durante una siguiente etapa las desaminadas, y finalmente las desulfonadas convirtiéndolas en uracilo mientras que las 5'-metilcitosina permaneció sin afectarse.
Con el fin de evitar desplazamientos potenciales del proceso, todas las muestras fueron aleatorizadas en lotes de aproximadamente 30 muestras observando su seguimiento clínico. Esta aleatorización fue transferida a la disposición de placas de 384 pozos de las placas de ensayo dando como resultado una aleatorización satisfactoria para estas placas también. El tratamiento con bisulfito del ADN genómico derivado del material congelado fresco fue llevado a cabo como se describe en lo que sigue. 15 jl de ADN genómico lisado fue transferido por pipeta a una placa de 96 pozos para cada lote de bisulfito de acuerdo con la aleatorización. Después de esto se agregaron a cada pozo 60 jl de solución de bisulfito (4.9 M, pH 5.5; bisulfito de sodio, Merck 1.06528.0500, sulfito de sodio, anhidro, Fluka 71988, ddH2O grado biología molecular) y 25 jl de solución de dioxano que contiene el depurador de radicales (solución dioxano-depurador de radicales: 98.6 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman2-carboxílico, Aldrich 23,881-3 con 2.5 ml de 1,4-dioxano, Riedel de Haen 33147). El volumen total de 100 jl por pozo fue sellado mediante tiras de tapas.
La mezcla de reacción fue sometida a termociclización mediante el siguiente protocolo:
5:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C 1:30 minutos enfriamiento a 4°C 23:30 minutos incubación a 50°C
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3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C
1:30 minutos enfriamiento a 4°C
1:25:30 horas incubación a 50°C
3:00 minutos desnaturalización de ADN a 99°C
1:30 minutos enfriamiento a 4°C
2:55:30 horas incubación a 50°C
enfriamiento a 4°C
Después de la incubación, la reacción fue transferida a un tubo de recolección de 500 |jl (Eppendorf No. 124502, Hamburg, Alemania) y se agregaron 300 jl de ddH2O para incrementar la solubilidad de las sales de bisulfito.
La mezcla completa de 400 jl fue transferida con pipeta a un reservorio de un dispositivo de filtro Microcon™ ensamblado (Microcon™ YM-30, 42410, Millipore, Estados Unidos de América) y se selló con la tapa anexa. El ensamblaje fue centrifugado a 14,000 x g durante 15 minutos. Después de descargar el fluido, se agregaron 400 jl de regulador TE y se centrifugaron de nuevo a la misma velocidad durante 12 minutos. La etapa de lavado fue repetida una vez. Para la desulfonación, se agregaron 100 jl de NaOH 0.2 mol/l (Merck No. 1.06482.1000) al ensamblaje de filtro sin tocar la membrana y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. El ensamblaje fue centrifugado de nuevo a la misma velocidad durante 10 minutos. La solución residual de hidróxido de sodio fue retirada lavando la membrana con 400 jl de regulador TE y centrifugación a la misma velocidad durante 12 minutos. Para la elución del ADN convertido con bisulfito (bisADN), se transfirió con pipeta 50 jl del regulador TE precalentado (50°C) (Tris 10 mmol/l, Merck No. 1.01549.0500; EDTA 0.1 mmol/l, pH 8, Merck No. 1.08418.0250) en cada reservorio de muestra y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Subsecuentemente el dispositivo de filtro fue invertido y colocado en un nuevo tubo Microcon™ de 1.5 ml y centrifugado a 1,000 x g durante 5 minutos. Las muestras de ADN tratado con bisulfito fueron transferidas a una nueva placa de 96 pozos de acuerdo con su orden de muestra especificado. Las muestras de ADN tratado de bisulfito fueron almacenadas a -20°C.
9.3.2. Tratamiento con bisulfito de muestras de tejido embebido en parafina fijado con formalina (PET)
El tratamiento con bisulfito del ADN genómico derivado de tejido embebido en parafina fijado con formalina fue hecho de acuerdo con el ejemplo 5. Para este proceso, las muestras fueron aleatorizadas no sólo con respecto a su seguimiento clínico, sino también con respecto a sus proveedores. Para las muestras embebidas en parafina fijadas con formalina (PET), se utilizó la mitad del volumen obtenido de la extracción de ADN para la reacción subsecuente con bisulfito.
El procedimiento fue diseñado especialmente para el tratamiento con bisulfito de muestras de tejido embebido en parafina fijado con formalina (muestras PET) para incrementar la cantidad de bisADN resultante. Por lo tanto, se llevaron a cabo dos reacciones con bisulfito de la misma muestra de ADN y se purificaron sobre la columna de rotación Microcon™. Se llevaron a cabo las siguientes modificaciones en comparación con el protocolo para muestra fresca congelada (véase anteriormente). La primera etapa de transferir con pipeta 15 jl de ADN genómicos lisado a una placa de 96 pozos con 60 jl de solución de bisulfito (para ingredientes véase más arriba) y 25 jl de solución de dioxano (para ingredientes véase más arriba) que contenía el depurador de radicales se hizo dos veces para cada muestra de ADN. La etapa de incubación fue llevada a cabo con el mismo programa de termociclador que para las muestras frescas congeladas. Después de la incubación, ambas reacciones (200 jl en total) originadas de la misma muestra de ADN fueron transferidas a un tubo de recolección de 500 jl (Eppendorf No. 124.502, Hamburg, Alemania), mientras que cada pozo fue lavado con 100 jl de ddH2O y también transferido al tubo de recolección que contenía finalmente 400 jl de solución de reacción. Después de mezclar brevemente, la solución fue transferida con pipeta al reservorio de muestra de un dispositivo de filtro Microcon™ ensamblado y se purificó, desulfonó y eluyó el ADN de la muestra fresca congelada. Las muestras de ADN tratadas con bisulfito fueron almacenadas a -20°C.
9.4. Preparación de estándares de ADN para ensayos QM:
9.4.1. Preparación de estándares de cuantificación
Se trataron lotes de 2,000 ng de ADN genómico humano (Promega) con bisulfito. Por esto se mezclan 100 jl de ADN (2,000 ng) con 354 jl de solución de bisulfito y 146 jl de solución de dioxano. Por lo tanto, se aplicó el siguiente programa de temperatura para la reacción con bisulfito: 1. Baño de agua a 95°C durante 3 minutos; 2. Termomezclador a 50°C durante 30 minutos, agitando a 1,000 rpm; 3. Baño de agua a 95°C durante 3 minutos.; 4. Termomezclador a 50°C, 1.5 horas, con agitación a 1,000 rpm; 5. Baño de agua a 95°C, 3 minutos; 6. Termomezclador a 50°C durante 3 horas, agitación a 1,000 rpm). La desalinización, lavado y desulfonación se hizo a través de columnas Microcon™ YM- 30 (Millipore/Amicon) siguiendo las instrucciones de trabajo. La cuantificación del ADN estándar se hizo con un espectrómetro UV.
9.4.2. Preparación de estándares de calibración
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ADN por desplazamiento molecular (MDA)
El ADN por desplazamiento molecular (MDA) se genera de acuerdo con el kit de amplificación GenomiPhi™ DNA (Amersham Bioscience). En resumen, se aplica ADN genómico a una Phi-DNA-polimerasa en la presencia de cebadores aleatorios. Esto lleva a una amplificación del genoma completo de fragmentos de ADN que no están metilados.
Tratamiento Sss1
Para generar ADN MDA metilado, se trataron 13 tubos de 4.5 mg de ADN-MDA (700 ng/ml) con Sss1 en la siguiente reacción con un volumen total de 75 pl (manteniendo las soluciones de reacción sobre hielo):
4.5 pg MDA-DNA (6,3 pl)
57.3 pl H2O
0.375 pl 200 x SAM 3 pl (12 U) Sss1
7.5 pl NE-regulador2
La incubación se llevó a cabo a 37°C en un baño de agua. Después de aproximadamente 3 horas, se agregaron 0.375 pl de SAM y después de otras 5 horas, se agregaron 3 pl de Sss1 (2 veces). Se incuba durante la noche y subsecuentemente se inactiva a 65°C durante 10 minutos. Se reúnen los 13 tubos (975 pl) se toman 967 pl y se coloca ADN en un nuevo tubo Falcon de 10 ml. Se agregan 2 veces 967 pl de agua (20 ng/pl) y se toman alícuotas del ADN en 25 tubos Eppendorf de 1.5 ml que contienen cada uno 100 pl (2 pg).
Tratamiento con bisulfito del ADN-MDA tratado con Sss1
Se trataron con bisulfito 24 tubos cada uno de 2 pg. Esto se hizo mezclando 100 pl de ADN con 354 pl de solución de bisulfito y 146 pl de solución de dioxano. Después de esto se aplicó el siguiente programa de temperatura para la reacción con bisulfito: 1. Baño de agua a 95°C, 3 minutos; 2. Termomezclador a 50°C, 30 minutos, agitación a 1,000 rpm; 3. Baño de agua a 95°C, 3 minutos; 4. Termomezclador a 50°C, 1.5 horas, agitando a 1,000 rpm; 5. Baño de agua a 95°C durante 3 minutos; 6. Termomezclador a 50°C, agitando a 1,000 rpm, 3 horas. La desalinización, lavado y desulfonación se hizo a través de columnas Microcon™ YM-30 (Millipore/Amicon).
Tratamiento con bisulfito de ADN-MDA no tratado con Sss1
Para el tratamiento con bisulfito de ADN-MDA, se toma 82.9 pl de ADN-MDA (700 ng/pl), y se coloca en un nuevo tubo Falcon de 10 ml. Se agregan 3 veces 939 pl de agua (20 ng/pl), se toman alícuotas del ADN en 25 tubos Eppendorf de 1.5 ml que contienen 100 pl cada uno (2 pg), y se lleva a cabo 24 veces lo siguientes: Se mezclan 100 pl de ADN con 354 pl de solución de bisulfito y 146 pl de solución de dioxano y se aplica a continuación el siguiente programa de temperatura para la reacción con bisulfito: 1. Baño de agua a 95°C, 3 minutos; 2. Termomezclador a 50°C, 30 minutos, agitando a 1,000 rpm; 3. Baño de agua a 95°C 3 minutos; 4. Termomezclador a 50°C, 1.5 horas, agitando a 1,000 rpm; 5. Baño de agua a 95°C durante 3 minutos; 6. Termomezclador a 50°C, agitando 1,000 rpm, 3 horas. La desalinización, lavado y desulfonación se hace a través de columnas Microcon™ YM-30 (Millipore/Amicon).
Cuantificación del ADN-MDA convertido con bisulfito tratada con Sss1- y ADN-MDA no tratado con Sss1
El ADN-MDA tratado con Sss1 y el ADN-MDA no tratado con Sss1 fue diluido hasta 1 a 2 y 1 a 10 cada muestra, y se determinó la concentración de ADN en duplicado utilizando el ensayo C3 y el estándar de cuantificación preparado de acuerdo con 9.4.1. Ambos estándares fueron diluidos 1 a 10 y 1 a 100. Después de esto, se utilizaron 10 pl para la cuantificación por UV.
La determinación del sulfito residual se llevó a cabo utilizando el Merck Sulfit-Küvettentest 1.1 (Merck, Darmstadt) de acuerdo con el procedimiento descrito para la medición de muestras. Las concentraciones de sulfito estuvieron por debajo de 100 mg/l dando como resultado valores más abajo del valor crítico de 50 mg/l de sulfito en el PCR a través de la dilución de la solución de reserva.
Preparación de las mezclas estándar de calibración
Los estándares de calibración fueron preparados utilizando las soluciones de reserva de ADN-MDA tratadas con Sss1 y ADN-MDA no tratadas con Sss1 tratadas separadamente para los conjuntos de muestras de la población no tratada ER+ N0 y de la población tratada y ER+ N0 TAM de acuerdo con la Tabla 1a. Para eso, preparamos soluciones de ADN de 14 diferentes niveles de metilación (serie logarítmica) con la concentración de 1 ng/pl y se distribuyeron 40 pl de cada nivel a varias placas de 96 pozos (placa 05) para transferencia con pipeta automática en placas de ensayo de 384 pozos.
Tabla 1a: Preparación de estándares de calibración. ADN-MDA tratado con Sss1 y ADN-MDA no tratado con Sss1 fueron mezclados en las proporciones indicadas.
ADN ESTÁNDAR ADN 22.0 ng/pl ADN-MDA tratado 28 pg/pl MDA con Sss1
% de metilación
arriba abajo ng necesarios ng arriba ng abajo pl arriba pl abajo + pl H2O -> 10ng/pl
0
0
1.00 1500 0 1500 0 75 90
4
0.04 0.98 1500 60 1440 2.36 72 90.64
10
0.1 0.90 1500 150 1350 5.89 67.5 91.61
17
0.17 0.83 1500 255 1245 10.02 62.25 92.73
25
0.25 0.75 1500 375 1125 14.73 56.25 94.02
34
0.34 0.66 1500 510 990 20.04 49.5 95.46
44
0.44 0.56 1500 660 840 25.93 42 97.07
50
0.5 0.50 1500 750 750 29.46 37.5 98.04
56
0.56 0.44 1500 840 660 33 33 99
66
0.66 0.34 1500 990 510 38.89 25.5 100.61
75
0.75 0.25 1500 1125 375 44.2 18.75 102.05
83
0.83 0.17 1500 1245 255 48.91 12.75 103.34
90
0.9 0.10 1500 1350 150 53.04 7.5 104.46
96
0.96 0.04 1500 1440 60 56.57 3 105.43
100
1 0.00 1500 1500 0 58.93 0 106.07
441.96 562.5
Verificación del estado de mutilación de ADN tratado con bisulfito
5 Para verificar el estado de metilación del ADN-MDA tratado con Sss1 y ADN-MDA no tratado con Sss1, se llevó a cabo una secuenciación con bisulfito. Ambos tipos de ADN fueron amplificados utilizando los siguientes pares de cebadores que producen fragmentos que cubren las regiones que fueron amplificadas por los ensayos QM. La longitud de los productos de PCT para secuenciación está entre 200 y 500 bp.
Cebador 2064:300P22
Cebador 2064:514O22
Seq ID NO 1:
Seq ID NO 2:
GGAGGGGGTAGAGTTATTAGTT
TATACTTCCTCAAACAACCCTC
Cebador 4063:1431P22
Cebador 4063:1868O20
Seq ID NO 3:
Seq ID NO 4:
GTGATATTTGGGGATTGTTATT
ACTCCCTCCCCTATCTTACA
Cebador 15665:699P21
Cebador 15665:1124O22
Seq ID NO 5: TTTGTTGGGATTTGTTAGGAT
Seq ID NO 6: AAACATTTTACCCCTCTAAACC
Cebador 15947:907P24
Cebador 15947:1360O23
Seq ID NO 7:
Seq ID NO 8:
TGATTGTGTAGATTATTTTTGGTT
CAAACTCTCTAAACCTCAATCTC
Cebador 2265:176P22
Cebador 2265:582022
Seq ID NO 9:
Seq ID NO 10:
TTGGTGATGTTGATTAGAGTTT
TAAAACACCTTACATTTTCCCT
Cebador 15908:782P22
Cebador 15908:1228O23
Seq ID NO 11:
Seq ID NO 12:
GGTAGAGGAAGTAGTTGGTTTG
CTTTTATATTTCTCCCAATCTCC
Cebador 0003522:2102Q21
Cebador 0003522:1738R23
Seq ID NO 13:
Seq ID NO 14:
GTAGGGGAGGGAAGTAGATGT
TCCTCAACTCTACAAACCTAAAA
La secuenciación con bisulfito fue hecha de acuerdo con protocolos estándar y se llevó a cabo en un secuenciador ABI 3770 (placa de 96 pozos). Las secuencias y las proporciones de metilación esperadas pudieron ser confirmados por los fragmentos usados (datos no mostrados).
5 9.5.Cuantificación y ajuste de la concentración de ADN con bisulfito
9.5.1. Determinación de la concentración de sulfito en el ADN con bisulfito
Las concentraciones incrementadas de sulfito residual influyen en el ensayo QM. Por lo tanto, decidimos determinar la concentración de sulfito para cada una de las muestras tratadas con bisulfito de ambos conjuntos de muestras. El sulfito incrementado (mayor de 50 mg/l en la reacción de PCR) afecta la amplificación por PCR del ADN con bisulfito 10 dando como resultado valores de CT más altos en comparación con las concentraciones de sulfito por debajo de este rango. Los valores de CT representan el ciclo de umbral del punto de entrecruzamiento de un PCR en tiempo real.
El sulfito de sodio fue utilizado para preparar una solución de reserva estándar de sulfito con 1 g/l de SO32- en 1x regulador TE. Produjimos soluciones estándar desde 100 mg/l a 1.56 mg/l de sulfito a través de dilución paso a paso y vórtex intensivo entre 2 etapas de dilución para producir la curva estándar.
15 Tabla 2. Estándares de sulfito para prueba de sulfito.
Estándares de sulfito para prueba de sulfito en 384 MTP
Número
Adición de estándar en pl Número de solución Adición de TE pl Concentración de SO32-[mg/l]
1
100 Reserva 900 100
2
500 1 500 50
3
500 2 500 25
4
500 3 500 12.5
5
500 4 500 6.25
6
500 5 500 3.13
7
500 6 500 1.56
Se mezclaron la reserva de muestra y 27 pl de ddH2O. Se colocaron 10 pl de la muestra prediluida y 10 pl del reactivo de sulfito (Sulfit-Küvettentest -Merck, 1.14394.0001) en una placa de 384 pozos y se sometió a vórtex. Después de 2 minutos de tiempo de espera se midió la absorbancia de la solución con un lector Photometer-Plate a 412 nm. La 20 concentración de sulfito fue determinada de acuerdo con la curva de calibración en mg/l de sulfito.
Resultados
La cantidad de sulfito determinada para la solución de reserva de todas las muestras de la población ER + N0 no tratada estuvo entre 0-390 mg/l. La cantidad de sulfito se redujo hasta 0-30 mg/l para el conjunto completo de muestra
después del ajuste de la concentración de la muestra a 1 ng/pl, excepto para 1 muestra. Aquí medimos exactamente el valor límite de 100 mg/l.
La concentración de sulfito de la población tratada del conjunto de muestras ER+ N0 TAM se determinó con 0-1195 mg/l de sulfito. La concentración de sulfito para 7 muestras estaba en un rango crítico, pero todavía aceptable (entre 5 50 y 100 mg/l) y para 2 muestras por encima de 100 mg/l (120 mg/l).
En conclusión, el sulfito residual en el ADN tratado con bisulfito no constituyó un problema mayor.
9.5.2. Cuantificación basada en PCR en tiempo real del ADN con bisulfito
El diseño del ensayo GSTP1-C3 lo hace adecuado para cuantificar ADN de diferentes fuentes, incluyendo muestras frescas/congeladas, muestras remotas tales como plasma o suero, y ADN obtenido de especímenes en archivo tales 10 como material embebido en parafina fijado con formalina. La Tabla 3 provee una revisión de fragmentos y secuencias de oligonucleótidos.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    1. Un método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada, que comprende:
    poner en contacto una muestra archivada que comprende ADN con una proteasa para proveer una cantidad de ADN tratado con proteasa;
    tratar el ADN con un reactivo de bisulfito sin una etapa previa de extracción de ADN; purificar el ADN tratado con bisulfito.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el rendimiento del ADN purificado es al menos 20%, preferiblemente entre aproximadamente 30% y aproximadamente 50% del de la muestra archivada, y en donde al menos 5%, preferiblemente 5% a aproximadamente 60%, más preferiblemente, un promedio de aproximadamente 10% del ADN purificado es amplificable en una reacción de PCR que genera fragmentos de al menos 110 pb de longitud.
  3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra archivada es al menos una seleccionada del grupo que consiste en una biopsia de tejido embebida en parafina; una biopsia de tejido fija; una biopsia de tejido fijada embebida en parafina; una sección de tejido embebida en parafina o una porción de la misma; una sección de tejido fija o porción de la misma; una sección de tejido fijada, embebida en parafina o porción de la misma.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, que comprende además al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en: eliminar parafina; y amplificar el ADN, en donde la eliminación de parafina comprende opcionalmente disolver la parafina mediante un solvente orgánico, o comprende disolver la parafina mediante un solvente orgánico y lavar con otro solvente orgánico, en donde el solvente orgánico para disolver la parafina es preferiblemente un solvente seleccionado del grupo que consiste en limoneno, xileno y combinaciones de estos solventes, y en donde el solvente de lavado es un solvente seleccionado del grupo que consiste en etanol, metanol, isopropanol y combinaciones de estos solventes entre sí o con agua.
  5. 5. El método de la reivindicación 4, en donde la etapa de eliminación de parafina comprende:
    A. agregar 0.1-3 ml de limoneno a la muestra archivada;
    incubar durante al menos 5 minutos a una temperatura en el rango de aproximadamente 10 °C a aproximadamente
    70 °C;
    centrifugar la muestra incubada; y eliminar el limoneno de la misma; o
    B. agregar aproximadamente 1 ml de limoneno a la muestra archivada;
    incubar durante aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 1 h a temperatura ambiente con mezcla de la muestra;
    centrifugar la muestra incubada a una fuerza de al menos 5.000 x g durante aproximadamente 5 minutos; y eliminar el limoneno de la misma.
  6. 6. El método de la reivindicación 4,
    A. en donde el solvente de lavado es etanol, y en el que el lavado comprende: añadir aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 ml de etanol; centrifugar la muestra que contiene etanol;
    eliminar el etanol; y
    secar, que comprende opcionalmente además, después de la adición del etanol, la incubación durante hasta 10 minutos a una temperatura en el rango de aproximadamente 15°C a aproximadamente 30°C;
    o
    B. que comprende:
    adición de aproximadamente 1 ml de etanol;
    incubar durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente con mezcla de la muestra; centrifugar a una fuerza de al menos 5.000 x g durante aproximadamente 5 minutos;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    eliminar el etanol; e
    incubar durante un período de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 min a aproximadamente 50 °C.
  7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde la proteasa se selecciona del grupo que consiste en una serina proteasa, una tiol proteasa, una carboxi proteasa, una metaloproteasa, proteinasa K y combinaciones de estas proteasas.
  8. 8. El método de la reivindicación 7, en donde el contacto de la muestra archivada con la proteasa comprende:
    A. añadir aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1 ml de regulador de lisis que comprende aproximadamente 50 mmol/l de tris-hidroximetilamino-metano a pH 8,0, EDTA 1 mmol/l, Tween 20 al 0,5% v/v a desde 1 a aproximadamente 10 secciones de tejido fijas en formalina desparafinadas, o en una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada;
    añadir aproximadamente 10 a aproximadamente 100 pl de una solución de proteinasa K que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 g/l de proteinasa K, y subsecuentemente agitar la muestra; e
    incubar durante al menos 2,5 h a una temperatura de aproximadamente 40 a aproximadamente 70°C, que comprende opcionalmente además, después de la incubación, inactivar la proteinasa K mediante calentamiento, mediante el uso de un inhibidor, o ambos;
    o
    B. añadir aproximadamente 190 pl de regulador de lisis a 1 a aproximadamente 6 secciones de tejido fijadas con formalina desparafinadas, o a una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada;
    añadir aproximadamente 20 pl de solución de proteinasa K que comprende aproximadamente 30 g/l de proteinasa K, con subsecuente sometimiento a vórtex;
    incubar durante un período de aproximadamente 3 a aproximadamente 48 horas a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 60 °C mezclando la muestra; e
    uncubar durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura de al menos 95°C, que comprende opcionalmente además, después de incubar a aproximadamente 50°C a aproximadamente 60°C con mezcla durante 24 h, añadir al menos 20 pl de solución de proteinasa K después de las primeras 24 h de incubación a 50 °C-60 °C, y antes de la incubación a la temperatura de al menos 95 °C;
    o
    C. añadir aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 pl de regulador de lisis a 1 a aproximadamente 10 secciones de tejido fijadas con formalina desparafinadas, o a una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada, el regulador de lisis a pH 8,0 que comprende aproximadamente 50 mmol/l de tris-hidroximetil-amino- metano, 1 mmol/l de EDTA, 0,5% de Tween 20 v/v; incubar durante aproximadamente 5 a aproximadamente 20 minutos a una temperatura de aproximadamente 40 a aproximadamente 75°C; añadir aproximadamente 5 a aproximadamente 40 pl de solución de proteinasa K, comprendiendo la solución de proteinasa K aproximadamente 30 mg/ml de proteinasa K; e
    incubar durante al menos 2,5 h a una temperatura de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 °C, en donde opcionalmente:
    (i) el regulador de lisis comprende además aproximadamente 5 ng/pl de ADN poli-dA;
    (ii) la proteinasa K se inactiva mediante calentamiento, mediante el uso de un inhibidor, o ambos; y/o
    (iii) poner en contacto la muestra archivada con la proteasa comprende:
    añadir aproximadamente 100 pl de regulador de lisis a 1 a aproximadamente 6 secciones de tejido fijadas con formalina desparafinadas, o a una cantidad igual de una biopsia de tejido fijada con formalina desparafinada;
    incubar durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 65 °C en un termomezclador a 1.000 rpm;
    incubar a aproximadamente 50°C en un termomezclador a aproximadamente 1.400 rpm añadiendo aproximadamente 10 pl de solución de proteinasa K;
    incubar durante aproximadamente 3 a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 60°C en un termomezclador a aproximadamente 1.000 rpm; e
    incubar durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura superior a 95 °C.
  9. 9. El método de la reivindicación 1, en donde tratar el ADN con un reactivo de bisulfito comprende:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    A. mezcla de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 |jl de la solución que contiene el ADN genómico con aproximadamente 50 a aproximadamente 120 jl de solución de bisulfito, teniendo la solución de bisulfito un pH en el rango de aproximadamente 5,45 a aproximadamente 5,50 que comprende aproximadamente 4,83 a aproximadamente 4,93 moles/l de hidrogenosulfito;
    añadir aproximadamente 8 a aproximadamente 45 jl de una solución depuradora de radicales orgánicos, comprediendo la solución depuradora de radicales orgánicos un solvente orgánico y aproximadamente 158 a aproximadamente 500 mmol/l de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman2-carboxílico; y aplicar un protocolo de temperatura durante aproximadamente 3 a aproximadamente 8 h, en donde la reacción se lleva a cabo en un rango de temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 80°C con aproximadamente 2 a aproximadamente 5 aumentos de temperatura adicionales, en cada caso durante aproximadamente 1 a aproximadamente 10 minutos , a una temperatura de aproximadamente 85 a aproximadamente 100 °C que incluye un aumento de temperatura inicial a una temperatura de aproximadamente 85 a aproximadamente 100 °C;
    B. mezclar aproximadamente 44 a aproximadamente 50 jl de una solución que contiene el ADN genómico con aproximadamente 83 a aproximadamente 95 jl de la solución de bisulfito;
    añadir aproximadamente 13 a aproximadamente 15 jl de solución de DME, comprendiendo la solución de DME aproximadamente 500 mmol/l de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico disuelto en dietilenglicoldimetiléter; y
    aplicar un protocolo de temperatura durante aproximadamente 4 a aproximadamente 7 h, en donde la reacción se lleva a cabo en un rango de temperatura de aproximadamente 57 a aproximadamente 65°C con aproximadamente 2 a aproximadamente 5 aumentos de temperatura adicionales, en cada caso durante aproximadamente 3 a aproximadamente 5 minutos, a una temperatura de aproximadamente 94 a aproximadamente 100 °C que incluye un aumento de temperatura inicial a una temperatura de aproximadamente 94 a aproximadamente 100 °C;
    C. mezclar aproximadamente 15 a aproximadamente 20 jl de solución que contiene el ADN genómico con aproximadamente 60 a aproximadamente 85 jl de la solución de bisulfito;
    añadir aproximadamente 25 a aproximadamente 35 jl de solución de dioxano, compreniendo la solución de dioxano aproximadamente 158 mmol/l de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8 -tetrametil-croman-2-carboxílico disuelto en 1,4-dioxano; y
    aplicar un protocolo de temperatura durante aproximadamente 4 a aproximadamente 7 h, en donde la reacción se lleva a cabo en un rango de temperatura de aproximadamente 57 a aproximadamente 65°C con aproximadamente 2 a aproximadamente 5 aumentos de temperatura adicionales, en cada caso durante aproximadamente 3 a aproximadamente 5 minutos, a una temperatura de aproximadamente 94 a aproximadamente 100 °C que incluye un aumento de temperatura inicial a una temperatura de aproximadamente 94 a aproximadamente 100 °C.
  10. 10. El método de la reivindicación 1, en donde purificar el ADN tratado con bisulfito comprende el uso de al menos un kit, en donde el al menos un kit se selecciona del grupo que consiste en el DNeasy 96 Tissue Kit, el QlAamp 96 DNA Blood Kit y el QlAamp DSP 96 Virus MDx Kit, el DNeasy Tissue Kit, el QlAamp DNA Mini Kit, el QlAamp DNA Micro Kit, el QlAamp Viral RNA Mini y el QlAamp DSP Virus Kit, y en donde el uso de al menos un kit comprende:
    mezclar la muestra tratada con bisulfito con aproximadamente 500 a aproximadamente 620 jl de regulador de unión, en donde el regulador de unión comprende opcionalmente aproximadamente 10 ng/jl de ARN disuelto en el regulador AVL;
    añadir aproximadamente 500 a 620 jl de etanol;
    incubar a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 5 a aproximadamente 20 minutos;
    unir el ADN a una placa respectiva de al menos un kit seleccionado del grupo que consiste en el DNeasy 96 Tissue Kit, el QlAamp 96 DNA Blood Kit, o el QlAamp DSP 96 Virus MDx Kit o en una columna del DNeasy Tissue Kit, el QlAamp DNA Mini Kit, el QlAamp DNA Micro Kit, el QlAamp Viral RNA Mini y el QlAamp DSP Virus Kit;
    lavar con aproximadamente 300 a aproximadamente 1000 jl de regulador de lavado AW1;
    tratar con aproximadamente 450 a aproximadamente 550 jl de una solución que contiene aproximadamente 0,2 mol/l de hidróxido de sodio y aproximadamente 90% de etanol durante aproximadamente 10 a aproximadamente 25 min a una temperatura de aproximadamente 15 a aproximadamente 26°C;
    lavar con aproximadamente 300 a aproximadamente 1000 jl de regulador de lavado AW2; y
    eluir con aproximadamente 50 a aproximadamente 150 jl de uno de los reguladores de elución AE, AVE, EB o agua.
  11. 11. El método de la reivindicación 1, en donde la purificación del ADN comprende:
    A. detectar al menos una posición que está metilada en el ADN genómico de la muestra archivada, al menos una posición que no está metilada en el ADN genómico de la muestra archivada, o ambas;
    B. uso de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: el método de PCR; el método de secuenciamiento con bisulfito; el método COBRA; método Ms-SNuPE (Extensión de Cebador de Nucleótido Individual
    5 Sensible a Metilación), el método MSP (PCR Específico para Metilación); el método MSP anidado; el método HeavyMethyl™; el método MethyLight™; y el ensayo QM.
    imagen1
    imagen2
    concentración de dNTP incrementada
    1000
    250pM dNTPs (cada una)
    500uM dNTPs (cada una)
  12. 0.01 -
    1000
    100
  13. 0.01
    Entrada de ADN real en PCR [ngl
    FIGURA 2
    imagen3
    imagen4
    polimerasa incrementada
    1000
    100
    1U de Taq polimerasa
    3U de Taq polimerasa
    0,01
    100
    1000
    0,01
    Entrada de ADN real en PCR [nal
    F GURA 4
    imagen5
    1700
    1600
    1500
    1400
    1300
    c 1200
    o 1100
    ÍE 1000
    800
    700
    500
    400
    300
    200
    me íüq mo no OO (NTSJ m
    Muestra
    FGURA 5
    imagen6
    Muestra
    FIGURA 6
    711 bp
    ooi
    zvunoid
    imagen7
    imagen8
    Muestra
    FIGURA 8
    imagen9
    FIGURA 9
    imagen10
    imagen11
    FIGURA 11
    SDOuO
    30000
    „ 70000
    50000
    50000
    40000
    ■r 30000
    20000
    10000
    Muestra
    imagen12
    imagen13
    imagen14
    imagen15
    Muestra
    FIGURAIS
    imagen16
    FIGURA 16
    ST-276
    imagen17
    111
    FIGURA 18
    Muestra
    i"gi o i
    o o o
    o o o o
    imagen18
    Rendimiento de ADN de acuerdo con el ensayo CFF1
    112
    FIGURA 19
    8
    imagen19
    Rendimiento de ADN bisulfito - Ensayo C3
    imagen20
    imagen21
    imagen22
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