DE60120501T2

DE60120501T2 - mRNA AMPLIFIZIERUNG

Info

Publication number: DE60120501T2
Application number: DE60120501T
Authority: DE
Inventors: Dietlind ZOHLNHÖFER; Christoph Klein
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2021-03-24
Also published as: WO2001071027A3; ATE329060T1; JP2004508010A; US20040029124A1; DE60120501D1; EP1728874B1; CA2402534A1; EP1370683B1; EP1370683A2; AU2001242509B2; CA2402534C; ES2264440T3; WO2001071027A2; AU4250901A; EP1728874A1; DK1370683T3; US7229760B2; IL151872A0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Amplifizierung von mRNA einer Probe, umfassend die Schritte: i.) Herstellung von cDNA aus polyadenylierter RNA, wobei mindestens ein Primer verwendet wird, der an die polyadenylierte RNA hybridisiert und eine 5'-Poly(C)- oder eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst, wobei die Konzentration des mindestens einen Primers im Bereich von 10 μM bis 60 μM liegt; ii)(aa) Entfernung von nicht-hybridisiertem, überschüssigem Primer/nicht-hybridisierten, überschüssigen Primern und/oder überschüssigen dNTPs, falls anwesend; ii)(ab) 3'-Verlängerung der hergestellten cDNA mit einem Poly(G)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(C)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), oder einem Poly(C)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen verwendet wurde(n); oder ii)(b) 3'-Verlängerung der hergestellten cDNA mit einem Poly(G)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(C)-Flanke umfasst/umfassen verwendet wurde(n), oder einem Poly(C)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen verwendet wurde(n), unter Verwendung einer RNA-Ligase, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von überschüssigem Primer/überschüssigen Primern und/oder überschüssigen dNTPs; und iii.) Amplifizierung der verlängerten cDNA mit einem Primer, welcher an die in Schritt ii(ab) oder ii(b) erzeugte(n) Verlängerung(en) hybridisiert hybridisieren. Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Identifizierung von exprimierten Genen in einer Testprobe, zur Identifizierung eines Arzneistoffkandidaten zur Behandlung eines pathologischen Zustandes und für den in-vitro-Nachweis eines pathologischen Zustandes unter Verwendung des Verfahrens zur Amplifizierung von mRNA. Zusätzlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Anwendung von amplifizierter/amplifizierten cDNA(s), wie durch das Verfahren der Erfindung erhalten bei Hybridisierung, Wechselwirkung und/oder enzymatischen Arrays. Überdies beschreibt die Patentschrift Verfahren zur Präparation von (einem) in vitro-Surrogat(en).
Die Untersuchung von Genexpression und Genexpressionsmuster wurde in letzter Zeit durch umfassende Analyse von mRNA-Expression auf cDNA-Filterassays oder cDNA-Mikroarrays revolutioniert (s. unter anderem, Southern, Trends Genet. 12 (1996), 110-115; Debouck, Nat. Genet. 21:48-50 (1999); Hacia, Nat. Genet., 21,42-7 (1999); Cole, Nat. Genet. 21, 38-41 (1999); Bowtell DD., Nat. Genet., 21,25-32 (1999); Cheung, Nat. Genet., 21, 15-19 (1999); Duggan, Nat. Genet., 21, 10-14 (1999); Southern, Nat. Genet., 21,5-9 (1999); WO97/13877. Zum Beispiel beschreibt WO97/13877 ein Verfahren zur Feststellung der Toxizität einer Verbindung in einem Testorganismus durch Messung der Genexpressionsprofile von ausgewählten Geweben. Lockhart (Nature Biotechnology 14 (1996), 1675-1680) beschreibt eine Herangehensweise, die auf Hybridisierung einer großen Anzahl von mRNAs zu kleinen Arrays von hoher Dichte, die Zehntausende von synthetischen Oligonucleotiden enthalten, basiert, was die gleichzeitige Überwachung von Zehntausenden (exprimierten) Genen ermöglicht. Weitere Mikroarrays zur Genexpression wurden beschrieben in Shalon (Pathol. Biol. 46 (1998), 107-109), Lockhardt (Nuc. Acids. Symp. Ser. 38 (1998), 11-12) oder in Schena (Trends Biotech. 16 (1998), 301-306). Allerdings ist eine bedeutende Beeinträchtigung der vorstehend beschriebenen cDNA-Array-Technologie die Tatsache, dass diese Technologien eine Menge von 2.5 bis 10 μg Nucleinsäuresonden erfordern, um entweder in der Form von mRNA, revers transkribierter RNA oder amplifizierter cDNA getestet zu werden (s. u. a. Schena (Science 270 (1995), 467-470 und PNAS U.S.A. 93 (1996), 10614-10619) oder Lockhardt (1996) a. a. O.). Diese Materialmenge wird normalerweise nur aus einer großen Zahl von Zellen wie etwa 10⁹ erlangt. Bryant, PNAS U.S.A. 96 (1999), 5559-5564 oder Mahadevappa, Nat. Biotech. 17 (1999), 1134-1136 berichteten über eine solche Herangehensweise unter Verwendung von mindestens 50000 Zellen. Die kleinste bislang verwendete Zahl von Zellen für die ex-vivo Analyse von Gewebe und entsprechender Genexpression war 1,000 Zellen (Luo, Nat. Medicine 5 (1999), 117-122). Jedoch würde eine Unmenge von physiologischen und/oder pathologischen Zuständen es erfordern, das Genexpressionsmuster oder „Transcriptom", definiert als die Gesamtheit von mRNA- Molekülen in einer gegebenen biologischen Probe (Velculescu, Cell, 88, 243-251 (1997) einer geringen Zahl von Zellen oder sogar einer Einzelzelle zu untersuchen. Zum Beispiel würde die Erforschung von räumlich oder zeitlich regulierter Genexpression bei Embryogenese deutlich von einem Verfahren profitieren, bei dem eine geringe Zahl von Zellen, insbesondere eine Einzelzelle, abgeleitet werden kann. Gleichermaßen würde es von hohem Interesse sein, das Genexpressionsmuster/Transcriptom von einzelnen Zellen oder einer geringen Zahl von Zellen, die aus erwachsenem Gewebe stammen, wie unter anderem Blut oder neuronale (Stamm)zellen, zu erforschen. Darüber hinaus könnten vielfache pathologische Zustände abgeklärt werden, z.B. die Darstellung von deregulierter Genexpression bei atypischer Proliferation, Mutaplasie, präneoplastischen Läsionen und/oder Karzinome in situ. Andere Beispiele von örtlich begrenzten pathologischen Prozessen, die erforscht werden könnten, umfassen, aber sind nicht begrenzt auf, Restenose, Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung oder Entzündungen bei Autoimmunität. Darüber hinaus hat eine verborgene Mikrometastase, die aus einem kleinen Krebs stammt, schlimme Konsequenzen, wenn die disseminierten Tumorzellen in entfernten Organen überleben und zu offensichtlichen Metastasen werden. Nach Ektomie eines Primärtumors ausgetretene Tumorzellen werden gegenwärtig in Knochenmarkaspiraten durch immunocytochemische Färbung mit gegen Cytokeratine gerichteten Antikörpern nachgewiesen (Übersicht in Pantel, J. Natl. Canc. Inst. 91, 1113-1124 (1999)). Während mehrere Studien die prognostische Bedeutung von Cytokeratin-positiven mikrometastatischen Zellen im Knochenmark bewiesen (Braun, N. Engl. J. Med. 342, 525-533 (2000); Pantel, J. Natl. Canc. Inst. 91, 1113-1124 (1999)), blieb die Biologie dieser Zellen wegen ihrer extrem geringen Häufigkeit im Bereich von 10^–5 bis 10^–9 weitgehend rätselhaft.
Die systemische Ausbreitung von Krebszellen erfordert, dass die Zellen aus einem festen Tumor kommen, sich über Blut- oder Lymphgefäße verteilen, endotheliale und Gewebebarrieren überqueren und ektopisch als Einzelzellen überleben. Die phänotypischen Veränderungen, welche diese Schritte begleiten, werden als Entwicklungsprozess, die so genannte epitheliomesenchymale Transformation (EMT), betrachtet (Hay, Acta Anatomica, 154, 8-20, (1995); Birchmeier, Acta Anatomica, 156,217-226 (1996)). Nur ein kleiner Anteil der aus einem Tumor disseminierten Zellen kann EMT-assoziierte Merkmale erwerben (Boyer, Acta Anatomica, 156, 227-239 (1996)). Die epigenetischen Veränderungen, die zur EMT führen, sind bislang nicht bekannt, aber sie können wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von zukünftigen Behandlungen haben.
Wesentliche technische Hürden bei der Untersuchung der epigenetischen Änderungen von, z.B. disseminierten Tumorzellen oder pathologischem modifiziertem Gewebe, sind begrenzte Zugänglichkeit, geringe Häufigkeit, eindeutige Identifizierung und nachfolgende Analyse des Transcriptoms auf einem Einzelzellniveau- oder einem Niveau von geringer Zahl von Zellen. (s. z.B. WO90/01065). Eine Vielfalt von Protokollen zur Herstellung von „Einzelzell-cDNA-Bibliotheken" und der umfassenden Amplifizierung von mRNA aus einzelnen Zellen wurde entwickelt (s. Belyavsky, Nucl. Acid Res., 17, 2919-2932 (1989); Brady, Methods in Enzymology, 225, 611-623 (1993); Brady, Current Biology, 5, 909-922 (1995) und Karrer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3814-3818 (1995). Zum Beispiel beschreibt Brady (1995) die Analyse der Genexpression in einer komplexen Differenzierungshierarchie durch Amplifizierung von cDNA aus Einzelzellen. Jedoch haben diese Methoden deutliche Beeinträchtigungen, wie die Begrenzung auf 3'-Enden und eine unzureichende Empfindlichkeit, wenn PCR-Amplifikate mit cDNA-Arrays hybridisiert werden.
Bei diesen Verfahren wurde die während der Amplifizierung von cDNA-Fragmenten eingeführte Schwankung durch Einschränkung der Länge der cDNAs während reverser Transkription reduziert. Dies wurde durch Niedersubstratbedingungen für die Reverse Transcriptase erzielt; d.h. die Verwendung von geringen Konzentrationen eines Oligo-d(T)-Primers und geringen dNTP-Konzentrationen. Jedoch gibt es ein Risiko einer unbefriedigenden reversen Transkription und nachfolgender PCR-Effizienz, was zu willkürlichen Ergebnissen führen kann, wenn Transcriptom/Genexpressionsmuster von Zellen/Einzelzellen zu untersuchen sind. Darüber hinaus begrenzt die Verwendung eines Oligo(dT)-Primers zur PCR-Amplifizierung die Verwendung von hohen Annealing-Temperaturen und demnach stringenten Annealing-Bedingungen. Üblicherweise wird Annealing bei 42°C durchgeführt (Brail, Mut. Res. Genomics 406 (1999), 45-54). Wie hierin vorstehend hervorgehoben, kann solche Herangehensweise passend für eine 3'-begrenzte cDNA-Synthese sein. Jedoch verringern höhere Annealing-Temperaturen die Anwesenheit von Sekundärstrukturen bei der cDNA und die Wahrscheinlichkeit von unspezifischem Annealing mit inneren Sequenzen der cDNA, was eine Verkürzung der Amplifikate verglichen mit den cDNA-Molekülen ergeben würde. Annealing-Temperaturen des Verfahrens der Erfindung sind vorzugsweise über 45°C, mehr bevorzugt über 55°C und noch mehr bevorzugt sogar über 65°C.
Wie hier vorstehend erwähnt, ist die Menge an mRNA bei einer geringen Zahl von Zellen oder sogar einer Einzelzelle unzureichend für die Verwendung bei einer direkten umfassenden Analyse. Daher erfordert eine umfassende Analyse von exprimierter mRNA (von einem „Transcriptom") aus einer geringen Zahl von Zellen oder sogar aus einer einzigen Einzelzelle Amplifizierung von extrahierter und/oder revers transkribierter polyadenylierter mRNA. Bis heute führte die PCR-Amplifizierung von kleinen mRNA-Mengen nicht zu einer verlässlichen Darstellung der relativen Expression von mRNA, die in einer bestimmten Zelle/geringen Zahl von Zellen zu einem spezifischen Zeitpunkt, einem spezifischen Entwicklungszustand und/oder einem spezifischen physiologischen Zustand vorhanden ist (Brail, Mut. Res. Genomics 406 (1999), 45-54), Brail (1999), (a. a. O.) folgern, dass das Verfahren, wie von Brady (Brady (1993) (a. a. O.) beschrieben, wahrscheinlich (eine) Schwankung(en) bei der Verlängerungsreaktion oder den PCR-Amplifizierungs-Schritten einführt. Insbesondere zeigte Brails Analyse (Brail (1999), a. a. O.) eine fünffache Schwankung sogar für reichlich vorhandene Haushaltsgene (direkter Vergleich von GAPDH und dem ribosomalen Gen L32).
Demnach besteht das technische Problem der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, welche den Bedarf einer umfassenden und einheitlichen Amplifizierung von mRNA erfüllen, insbesondere des Transcriptoms einer geringen Zahl von Zellen oder einer Einzelzelle. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erreicht.
Demgemäß bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Amplifizierung von mRNA einer Probe, umfassend die Schritte:

(i) Herstellung von cDNA aus polyadenylierter RNA, wobei mindestens ein Primer verwendet wird, der an die polyadenylierte RNA hybridisiert und eine 5'-Poly(C)- oder eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst, wobei die Konzentration des mindestens einen Primers im Bereich von 10 μM bis 60 μM liegt;
(ii)(aa) Beseitigung von nicht-hybridisiertem, überschüssigem Primer/nicht-hybridisierten, überschüssigen Primern und/oder überschüssigen NTPs, falls anwesend;
(ab) 3'-Verlängerung der hergestellten cDNA mit einem Poly(G)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(C)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), oder einem Poly(C)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n); oder
(b) 3'-Verlängerung der hergestellten cDNA mit einem Poly(G)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(C)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), oder einem Poly(C)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), unter Verwendung einer RNA-Ligase, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von überschüssigem Primer/überschüssigen Primern und/oder überschüssigen NTPs; und
(iii) Amplifizierung der verlängerten cDNA mit einem Primer, welcher an die in Schritt ii.(ab) oder ii.(b) erzeugten Verlängerungen hybridisiert.

Polyadenylierte RNA kann aus einer Probe durch Verfahren erhalten werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Diese Verfahren umfassen Oligo(dT)-Selektionsschritte. Die Probe kann tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein und kann ein Gewebe oder eine Zellprobe sein. Die Probe kann auch (ein) gezüchtete(s) Gewebe oder (eine) gezüchtete Zelle(n) umfassen. Besonders bevorzugt ist eine Probe menschlichen Ursprungs. Proben können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erhalten werden, welche Atherektomie, Debulking, Biopsie, Resektion mit Laser oder makroskopische chirurgische Prozeduren umfassen, aber nicht darauf begrenzt sind.
Die hier beschriebene Technik und das Verfahren zur Amplifizierung von mRNA aus der Probe umfasst Schritte, worin die aus einer Probe erhaltene polyadenylierte RNA für die Herstellung von (einem) ersten cDNA-Produkt(en) verwendet wird unter Verwendung, von (einem) Primer(n), der/die 5'-Oligo (dC)/Poly(C) (-oder 5'-Oligo (dG)/Poly (G)) flankierende Regionen umfasst/umfassen. Der 5'-Oligo(dC)- oder der 5'-Oligo(dG)-Primer umfasst vorzugsweise zwischen 8 und 20 Cytosin- (oder Guanin-)Nucleotide, mehr bevorzugt 10 Cytosin- (oder Guanin-)Nucleotide, mehr bevorzugt umfasst/umfassen der/die Primer 11, noch mehr bevorzugt umfasst/umfassen der/die Primer 13, am meisten bevorzugt umfasst/umfassen der/die Primer 15 Cytosin- (oder Guanin-)Nucleotide. Es wird bevorzugt, dass die erste cDNA-Synthese ausgeführt wird, nachdem möglicherweise verunreinigende tRNAs und rRNAs entfernt worden sind. So eine Entfernung kann durch einem Fachmann bekannte Verfahren ausgeführt werden, zum Beispiel durch Bindung der polyadenylierten mRNA an Oligo (dT)/Poly(T)-beschichtete feste Träger, wie hierin definiert, und nachfolgenden Waschschritten.
Darüber hinaus umfasst der erste cDNA-Syntheseschritt vorzugsweise Zufallsprimer, welche in einer Konzentration vorhanden sind, welche 2,000 bis 8,000 höher ist als die Primerkonzentrationen, die in früheren Studien verwendet wurden (zum Beispiel von 10 nM wie bei Trumper, Blood 81 (1993), 3097-3115 verwendet). Es wird darüber hinaus bevorzugt, dass die erste cDNA-Synthese, d.h. die Herstellung von cDNA aus polyadenylierter RNA, bei einer entsprechend hohen Konzentration von dNTPs ausgeführt wird, vorzugsweise bei einer Konzentration von 0.5 mM dNTPs. Der erste cDNA-Präparationsschritt (Schritt „i") kann auch Mittel zur Markierung der resultierenden cDNA umfassen. Die Markierungen können durch dem Fachmann bekannte Verfahren eingeführt werden (s. unter anderem „Current Protocols in Molecular Biology", herausgegeben von Ausubel et al., John Wiley & Sons, USA (1988)) und können die Verwendung von markierten dNTPs (wie Biotin-markierten, radioaktiv-markierten oder Fluorescein-markierten dNTPs) umfassen. Der erste cDNA-Syntheseschritt (reverse Transkription), wobei vorzugsweise Zufallsprimer verwendet werden, kann die Anwendung von Standardenzymen umfassen, vorzugsweise RNAse H-defiziente Reverse Transcriptase, wie Superscript II Reverse Transcriptase (GIBCO).
Da hohe dNTP-Konzentrationen die erste cDNA-Synthese verbessern, aber jede nachfolgende Reaktionen (wie Verlängerungsreaktionen) stören können, wird es bevorzugt, dass (vor Ausführung beliebiger weiterer Reaktionen und/oder Schritten des Verfahrens der Erfindung) freie überschüssige dNTPs beseitigt werden. (Ein) überschüssige(r), nicht hybridisierte(r) Primer wird/werden vorzugsweise auch beseitigt, bevor zusätzliche Schritte ausgeführt werden. Die Beseitigung kann unter anderem durch Waschschritte, wie Pufferaustausche (wie in den angefügten Beispielen gezeigt) oder durch Filtrationsverfahren (d.h. über Größen-selektive Membranen) erreicht werden. Allerdings kann der Beseitigungsschritt auch ausgelassen werden, sollten keine überschüssigen dNTPs und/oder Primer anwesend sein. Darüber hinaus kann der Beseitigungsschritt vermieden werden, sollte der nachfolgende „Verlängerungs-Schritt" durch einen RNA-Ligase-Schritt ausgeführt werden.
Die 3'-Verlängerungsreaktion des Verfahrens der vorliegenden Erfindung (s. Schritt (ii)(ab) oder (ii)(b) des Verfahrens der Erfindung) umfasst die Verlängerung mit Poly(G), wenn in Schritt „i" (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(C)-Flanke umfasst, verwendet wurde(n), oder mit einem Poly(C), wenn in Schritt „i" (ein) Primer, welcher eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n). Wie in den angefügten Beispielen demonstriert, wurde überraschenderweise gefunden, dass unter anderem an Poly(G)-Schwänze bindende Poly(C)-Primer mindestens 100mal empfindlicher sind als an Poly(A)-Schwänze bindende Poly(T)-Primer, wie zuvor auf dem Fachgebiet vorgeschlagen (Brady (1993), a. a. O.; Trumper, Blood, 81, 3097-3115 (1993)).
Die Verlängerungsreaktion kann durch Verwendung eines Enzyms mit 3'-terminaler Desoxynucleotid-Transferase-Aktivität, vorzugsweise in einem kein Cacodylat enthaltenden Aufbewahrungspuffer, wie terminate Desoxynucleotid-Transferase (MBI Fermentas; Pharmacia) ausgeführt werden Jedoch sollte erwähnt werden, dass der „Verlängerungs"-Schritt auch durch RNA-Ligase ausgeführt werden kann (s.: Edwards, Nucl. Acids. Res., 19, 5227-5232 (1991)). In diesem Fall können Oligo(dC) oder Oligo(dG) flankierende Regionen an das 3-Ende der einzelsträngigen cDNA-Moleküle durch die RNA-Ligase ligiert werden. Sequenzen der flankierenden Regionen sind zur Hybridisierung an die flankierende Region des/der cDNA-Synthese-Primer(s) fähig, (Edwards, Nucl. Acid. Res. 19 (1991), 5227-5232). Schließlich kann die polyG/polyC-Schwanz tragende cDNA weiter amplifiziert werden, da diese cDNA(s) eine 5' Primer-eingeführten Oligo(C) (oder-G)-Spanne und eine 3' Oligo(G) (oder-C)-Spanne, eingeführt durch z.B. terminale Desoxynucleotid-Transferase, umfasst/umfassen. Die zweite PCR-Reaktion kann bei Anwesenheit von markierten Nucleotiden ausgeführt werden. Bevorzugt werden mit Biotin markierte, mit Fluorescein markierte, mit Dioxygenin markierte oder radioaktiv markierte Nucleotide, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind. Darüber hinaus ist es innerhalb des Schutzbereichs dieser Erfindung, dass markierte („tagged") Oligonucleotidprimer (wie mit Biotin, Fluorescein, Dioxygenin oder radioaktiv markierte Oligonucleotidprimer) verwendet werden, um ein einzelnes Tag/eine einzelne Markierung pro cDNA-Spezies zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist mindestens ein Primer in Schritt „i" ein Zufalls-Primer, ein Oligo(dT)-Primer oder eine Kombination davon. Der Zufalls-Primer kann eine Spanne von 4 bis 10 Zufalls-Nucleotiden, vorzugsweise eine Spanne von 5 bis 9 Zufalls-Nucleotiden umfassen. Am meisten bevorzugt umfasst der Primer ein Zufalls-Hexamer- oder ein Zufalls-Octamer-Oligonucleotid. Es ist besonders bevorzugt, dass der Zufalls-Primer eine Sequenz hat, wie in SEQ ID Nos:1 oder 7 bis 9 gezeigt. Noch mehr bevorzugt ist der Zufalls-Primer CFI5CN6, wie in den angefügten Beispielen verwendet, der die Nucleotide 5'-(CCC)₅GTCTAG-A(N)₆ (SEQ ID NO:8) umfasst.
Wie in den angefügten Beispielen gezeigt, kann/können der/die Zufalls-Primer auch in Kombination mit anderen Zufalls-Primern oder (einem) Oligo(dT)-Primer(n) verwendet werden. Zum Beispiel kann in Schritt „i" der vorliegenden Erfindung ein Primerpaar (CFI5c8, entsprechend SEQ ID NO:9) und (CFI5cT, entsprechend SEQ ID NO:10) verwendet werden, umfassend die Sequenzen 5'-(CCC)₅GTCTAGA(N)₈ und 5'-(CCC)₅GTCTAGATT(TTT)₄TVN, worin „V" G, C oder A repräsentiert und N G, T, C oder A repräsentiert. Deswegen wird es besonders bevorzugt, dass eine Kombination eines Poly d(C)/(G)-Primers, der ein Octamer (s. z.B. SEQ ID NO:9) in Kombination mit einen Oligo (dT)-Primer (s. SEQ ID NO:10) umfasst, verwendet wird.
Demgemäß hat in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung der Oligo(dT)-Primer, der in Schritt „i" zu verwenden ist, die Sequenz, wie bei SEQ ID NO:10 gezeigt, umfassend die Sequenz 5'-(CCC)₅GTCTAGATT(TTT)TVN. Wie hier vorstehend erwähnt, kann/können der/die Oligo (dT)-Primer, der/die in Schritt „i" des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist/sind, alleine oder in Kombination mit (einem) Zufalls-Primer(n) wie hierin vorstehend beschrieben, verwendet werden. Der/die Oligo (dT)-Primer ist/sind vorzugsweise ein Primer, der/die eine Oligo (dT)-Spanne umfassen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration von mindestens einem Primer in Schritt „i" im Bereich von 10 μM bis 60 μM. Wie im angefügten Beispiel gezeigt, ist die am meisten bevorzugte Konzentration etwa 50 μM.
In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst der Primer in Schritt „iii" eine Spanne von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 12, am meisten bevorzugt von mindestens 15 Nucleotiden, die zur Hybridisierung mit dem/den in Schritt „ii(ab)" oder „ii(b)" hergestellten Schwanz/Schwänzen fähig sind. Es wird bevorzugt, dass der Primer nicht mehr als 20 Nucleotide umfasst, die zur Hybridisierung mit dem/den in Schritt „ii(ab)" oder „ii(b)" des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellten Schwanz/Schwänzen fähig sind. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt der Primer in Schritt „iii" die Sequenz, wie bei SEQ ID NO:11, 12, 13, 14 oder 15 gezeigt. Wie in den angefügten Beispielen gezeigt, ist ein besonders bevorzugter Primer in Schritt „iii" der Primer „CP2", der die Nucleotidsequenz 5'TCAGAATTGATG(CCC)₅ umfasst (s. SEQ ID NO:14), mit welcher besonders gute Ergebnisse in diesem „umfassenden Amplifizierungs"-Schritt erreicht wurden. Deswegen, sollte ein einzelner Primer in diesem Schritt verwendet werden, ist der vorstehend beschriebene „CP2"-Primer besonders bevorzugt, wenn in Schritt „ii(ab)" oder „ii(b)" eine Poly(G)-Verlängerung ausgeführt wurde. Ein Vorteil der Verwendung von nur einem einzelnen Primer in Schritt „iv" der Erfindung ist, dass mögliche „Primer-Primer"-Wechselwirkungen vermieden werden können und relativ hohe Primerkonzentrationen, vorzugsweise über 0.2 μM, mehr bevorzugt über 0.8 μM, noch mehr bevorzugt über 1,0 μM angewendet werden können. Höhere Primerkonzentrationen über 1,0 μM oder 1,2 μM können auch verwendet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die polyadenylierte RNA (und/oder die zu amplifizierende mRNA) an einen festen Träger gebunden. Der feste Träger kann unter anderem ein Kügelchen, eine Membran, ein Filter, eine Vertiefung, ein Chip oder ein Röhrchen sein. Besonders bevorzugt wird ein magnetisches Kügelchen, ein Latexkügelchen oder ein Kügelchen aus kolloidalem Metall. Die polyadenylierte RNA kann jedoch auch an feste Träger wie Polystyrolkügelchen gebunden werden. Auf dem Fachgebiet bekannte feste Phasen umfassen auch Glas- und/oder Siliciumoberflächen, Nitrocellulosestreifen oder -membranen und Plastik(test)röhrchen. Passende Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren, insbesondere polyadenylierter RNA auf festen Phasen beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und desgleichen. Die feste Phase kann einen oder mehrere zusätzliche(n) Rezeptor(en) behalten, wie zum Beispiel eine Poly(T)-Spanne, welche die Fähigkeit hat/haben, polyadenylierte RNA anzuziehen und zu immobilisieren. Dieser Rezeptor kann auch eine veränderte Substanz umfassen, die hinsichtlich der Nucleinsäure entgegengesetzt geladen ist. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst der feste Träger (wie das magnetische Kügelchen) deswegen eine Oligo(dT)-Spanne.
Wie in den angefügten Beispielen gezeigt, kann die mRNA/polyadenylierte RNA, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren ist, leicht auf einem Oligo (dT)-beschichteten festen Träger, wie Oligo (dT)-beschichtete magnetische Kügelchen, isoliert werden.
In einer noch anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die zu amplifizierende mRNA von einem Gewebe, einer geringen Zahl von Zellen oder einer Einzelzelle. Die geringe Zahl von Zellen kann im Bereich von 10⁶ bis 2 Zellen liegen. Das Gewebe, die Zellen oder die Einzelzelle kann von pflanzlichem oder tierischem Ursprung sein. Es wird besonders bevorzugt, wenn das Gewebe, die Zellen oder die Einzelzelle von menschlichem Ursprung ist/sind. Das Gewebe, die Zellen oder die Einzelzelle können darüber hinaus eine pathologische Probe sein und/oder eine Probe, welche in Verdacht steht, pathologisch zu sein. Ob pathologisch, verdächtig, pathologisch zu sein, oder normal/gesund, können das Gewebe, (die geringe Zahl von) Zellen oder Einzelzelle aus einer Körperflüssigkeit oder aus einem festen Gewebe stammen. Körperflüssigkeiten können Blut, lymphatische Flüssigkeit, peritonale Flüssigkeit, spinale/cerebrospinale Flüssigkeit, Amnionflüssigkeit, Urin oder Stuhl umfassen. Das feste Gewebe kann aus allen tierischen/menschlichen Organen oder Drüsen stammen. Darüber hinaus kann das Gewebe bösartige Transformationen, wie Tumoren oder restenotisches Gewebe umfassen. Deswegen können das Gewebe, (die geringe Zahl von) Zellen oder Einzelzellen auch aus Karzinomen, Sarkomen, Lymphomen, Leukämien oder Gliomen sein. Jedoch sollte betont werden, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch bei Proben verwendet werden kann, die aus gutartigem Gewebe, normalem Gewebe, sowie aus gezüchteten Proben, wie Gewebe- und/oder Zellkulturen, stammen. Gewebe, geringe Zahl von Zellen und/oder Einzelzellen können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erhalten werden, welche Biopsien, Aspirationen oder Verdünnungen umfassen, aber nicht darauf begrenzt sind. Proben können auch durch FACS-Sortierung oder Isolation durch immunologische Verfahren oder „Rezeptor/Ligand"-Bindungsverfahren getrennt und erhalten werden. Wie in den angefügten Beispielen gezeigt, können Proben auch durch Artherektomie, z.B. durch eine spiralenförmige Vorrichtung für Artherektomie (X-Sizer, Endicor), erhalten werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das Gewebe, die geringe Zahl von Zellen oder die Einzelzelle ein chemisch fixiertes Gewebe, eine chemisch fixierte geringe Zahl von Zellen oder eine chemisch fixierte Zelle. Die Fixierung kann in (Para)formaldehyd ausgeführt werden. Bevorzugte Konzentrationen sind im Bereich von 0.1 bis 1%, am meisten bevorzugt ist jedoch eine Konzentration von 0.1%. Die Fixierung wird vorzugsweise für weniger als 30 Minuten ausgeführt (wenn Konzentrationen unter 1% verwendet werden). Am meisten bevorzugt wird die Fixierung bei einer (Para)formaldehyd-Konzentration von 0.1% für 5 Minuten ausgeführt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiter einen Schritt „iv", worin die hergestellte amplifizierte cDNA weiter modifiziert wird. Die Modifikation kann die Einführung von Nachweismitteln umfassen, zum Beispiel die Einführung von Nucleotidanaloga, welche an (ein) Chromophor(e), (einem) fluoreszierenden Farbstoff(en), (einem) Radionucleotid(en), Biotin oder DIG gekoppelt sind. Die Markierung der amplifizierten cDNA kann durchgeführt werden, wie in den angefügten Beispielen beschrieben oder wie unter anderem beschrieben in Spirin (1999), Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 40, 3108-3115.
Darüber hinaus wird es bevorzugt, dass die erhaltene amplifizierte cDNA an einen festen Träger gebunden wird, wie hier vorstehend beschrieben.
Da standardmäßige, Cacodylat enthaltende Puffer (wie einige cDNA-Synthese-Puffer) einzelne Schritte des Verfahrens der Erfindung stören können (wie die „Verlängerungsreaktion"), wird es bevorzugt, dass alle oder einzelne Schritte in einem Nicht-Cacodylatpuffer ausgeführt werden. Besonders bevorzugt ist ein Phosphatpuffer und am meisten bevorzugt ist ein KH₂PO₄-Puffer, wie in den angefügten Beispielen verwendet. Vorzugsweise ist der Puffer ein Puffer von geringer Ionenstärke (s. Nelson, Methods in Enzymology, 68, 41-50 (1979)). Darüber hinaus führt die Verwendung von dGTP oder dCTP bei „Verlängerungs" reaktionen zu einer kurzen Verlängerung von 15-30 Nucleotiden, während die Verwendung von dATP oder dTTP zu langen Verlängerungen führt, die sich von 70 bis mehreren hundert Nucleotiden erstrecken (Nelson (1979), I.c.; MBI Fermentas 1998/1999 Katalog, S. 125); Deng, Methods Enzymology, 100, 96-116, (1983)). Lange Poly(dA)/(dT)-Schwänze resultieren jedoch in nicht-homogenen Populationen von cDNAs während der Amplifizierung auf Grund von verschiedenen Hybridisierungs/Annealing-Stellen. Dagegen führte das Verfahren der Erfindung mit seinem kurzen (10-30 Basen) 5'-Primer und 3'-Verlängerung Oligo(dC)- oder Oligo(dG)-flankierende Regionen ein, die homogene Populationen von amplifizierten cDNAs herstellen, die vorzugsweise die codierenden Regionen der ursprünglichen cDNA-Moleküle amplifizieren.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die Probe, welche die zu amplifizierende mRNA/polyadenylierte RNA umfasst, aus einer Zelle und/oder einem Gewebe (oder ist eine Zelle und/oder ein Gewebe), dessen/deren genetische Identität durch vergleichende Genomhybridisierung (CGH) definiert wurde. Wie in den angefügten Beispielen gezeigt, wurde ein Verfahren, umfassend CGH einer Einzelzelle kürzlich beschrieben (SCOMP; s. Klein (1999), PNAS USA 96, 4494-4499)), welche eine eindeutige Identifizierung einer Einzelzelle ermöglicht. Mit diesem Verfahren ist es möglich, unter anderem eine Tumorzelle und/oder eine Zelle von Tumor-Ursprung durch ihre Chromosomenaberrationen zu identifizieren. Unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens zur mRNA-Amplifizierung und Kombination des Verfahrens mit SCOMP ist es deswegen möglich, genomische DNA und mRNA aus derselben Einzelzelle zu isolieren.
Die Beschreibung beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung eines in vitro-Surrogats für (eine) pathologisch modifizierte Zelle(n) oder (ein) pathologisch modifiziertes Gewebe, umfassend die Schritte:

(a) Amplifizierung von mRNA der/des pathologisch modifizierten Zelle(n) oder Gewebes gemäß den Schritten des Verfahrens, das hier vorstehend beschrieben ist;
(b) Feststellung der Menge und, fakultativ, der biophysikalischen Merkmale der erhaltenen cDNA und/oder des Transkripts davon, dabei Bestimmung des Genexpressionsmusters der/des pathologisch modifizierten Zelle(n) oder Gewebes;
(c) Auswahl einer in vitro-Zelle, deren Genexpressionsmuster dem Genexpressionsmuster der/des pathologisch modifizierten Zelle(n) oder Gewebes gleicht; und
(d) Anpassung des Genexpressionsmusters der in vitro-Zelle and das Genexpressionsmuster der pathologisch modifizierten Zelle oder des pathologisch modifizierten Gewebes.

Der Begriff „in vitro-Surrogat", wie hierin verwendet, bedeutet (eine) Zelle(n) oder (eine) Zelllinie(n), welche fähig ist, eine pathologische Situation oder einen pathologischen Zustand nachzuahmen. Das Surrogat kann unter anderem bei medizinischen, pharmakologischen oder naturwissenschaftlichen Experimenten nützlich sein und kann für Arzneistoff-Screening-Zwecke verwendet werden. Insbesondere kann so eine Surrogatzelle/Surrogatzelllinie verwendet werden, um mögliche Arzneistoffe und/oder Medikamente zu identifizieren. Solche Identifizierung kann durch Screenen von Bibliotheken von chemischen und/oder biologischen Stoffen ausgeführt werden, und das/die Surrogat(e) wird/werden vorzugsweise bei Hochdurchsatzscreenings verwendet.
Die Feststellung der Menge und, fakultativ, der biophysikalischen Merkmale der erhaltenen cDNA und/oder des Transkripts davon kann durch Verfahren ausgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind und/oder wie hierin beschrieben.
Der Begriff „in vitro-Zelle", wie hierin verwendet, bezieht sich vorzugsweise auf eine Zelle, welche in Kultur gehalten werden kann. Die Zelle wird vorzugsweise für mindestens 1 Stunde, mehr bevorzugt für mindestens 6 Stunden, mehr bevorzugt für mindestens 12 Stunden, mehr bevorzugt für mindestens einen Tag, mehr bevorzugt für mindestens zwei Tage, mehr bevorzugt für mindestens 3 Tage, mehr bevorzugt für mindestens eine Woche, am meisten bevorzugt für mehrere Wochen in Kultur gehalten.
Das Surrogat/in vitro-Surrogat sollte genau das Transcriptom/Genexpressionsmuster der pathologisch modifizierten Zelle oder des pathologisch modifizierten Gewebes widerspiegeln. Das Surrogat sollte sehr dem pathologisch modifizierten Gewebe oder der pathologisch modifizierten Zelle gleichen. Es wird deswegen bevorzugt, dass die „in vitro-Zelle", wie in Schritt c. hierin vorstehend erwähnt, ähnlich wie das pathologisch modifizierte Gewebe/die pathologisch modifizierte Zelle ist. Zum Beispiel kann die „in vitro-Zelle" aus einem ähnlichen Gewebe oder Organ wie das pathologisch modifizierte/kranke Gewebe stammen. Unter anderem können glatte Muskelzellen von Kranzarterien als „in vitro-Zellen" verwendet werden, deren Genexpressionsmuster dem Genexpressionsmuster von restenotischem Gewebe gleicht. Gleichermaßen können Leberzellen (wie z.B. HepG2) verwendet werden, um ein Surrogat für pathologisch modifiziertes Lebergewebe zu erhalten, kultivierte Nierenzellen (wie z.B. ATCC 45505) für nierenkrankes Gewebe, Kardiomyoblasten (wie z.B. Rattenkardiomyocyten) für herzmuskelkrankes Gewebe oder NCI-Zelllinien, wie in Ross, Nat. Genetics 24 (2000), 227-235 beschrieben, für tumorige Erkrankungen, neoplastische Erkrankungen oder Krebs.
Die „Anpassung" von Schritt (d), wie hierin vorstehend erwähnt, wird ausgeführt, um das Genexpressionsmuster der ausgewählten „in vitro-Zelle" einem Genexpressionsmuster anzupassen, welches stärker das Genexpressionsmuster des pathologisch modifizierten Gewebes/der pathologisch modifizierten Zelle widerspiegelt. Insbesondere, wenn es gefunden wurde (in Schritte (a) und (b) des Verfahrens wie hierin vorstehend beschrieben), dass ein besonderes Transkript/exprimiertes Gen (oder eine Gruppe von besonderen Transkripten/exprimierten Genen) im Vergleich zur „in vitro-Zelle" (oder einer Kontrollzelle) herunterreguliert wurde, sollte versucht werden, die Expression des Transkripts/exprimierten Gens (oder Gruppe der Transkripte/exprimierte Gene) in der „in vitro-Zelle" hochzuregulieren. Demgemäß, sollte ein spezifisches Transkript/exprimiertes Gen (oder eine Gruppe von Transkripten/exprimierten Genen) im Vergleich zur „in vitro-Zelle" (oder einer Kontrollzelle) hochreguliert werden, sollte versucht werden, das Transkript/exprimierte Gen (oder eine Gruppe davon) in der „in vitro-Zelle" herunterzuregulieren. Besondere Methoden, Faktoren, Verbindungen und/oder Substanzen, welche nützlich sein können, um das Genexpressionsmuster der in vitro-Zelle anzupassen, werden hierin nachstehend beschrieben.
Der Anpassungsschritt kann das Inkontaktbringen der in vitro-Zelle mit mindestens einer Verbindung, einem Faktor, einer Substanz, einer Vielzahl von Verbindungen, Faktoren, Substanzen oder eine Kombination davon umfassen und die Feststellung, ob das Inkontaktbringen zu einem modifizierten Genexpressionsmuster/Transkriptom bei der in vitro-Zelle führt. Die Feststellung des Genexpressionsmusters kann durch das Verfahren der Erfindung ausgeführt werden, aber kann auch andere auf dem Fachgebiet bekannte Analyseverfahren umfassen, wie biochemische oder biophysikalische Verfahren. Besonders bevorzugt sind hierbei Verfahren wie Proteomanalyse, umfassend ein- oder zweidimensionale (Gel-)Elektrophorese, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrographie oder auf Antikörper bezogene Nachweisverfahren (Blotting oder Arraysysteme).
Die vorstehend erwähnten pathologisch modifizierte(n) Zelle(n) oder die/das pathologisch modifizierte(n) Gewebe und/oder in vitro-Zelle ist vorzugsweise von tierischem Ursprung. Besonders bevorzugt werden hierbei (eine) Zelle(n) oder (ein) Gewebe, die aus Primaten, Nagetieren oder Artiodactyla stammen und/oder erhalten werden. Noch mehr bevorzugt sind (eine) Zelle(n) und/oder (ein) Gewebe von Menschen, Affen, Schweinen, Rindern, Ratten oder Mäusen.
Das hierin beschriebene Verfahren zur Herstellung eines in vitro-Surrogats für (eine) pathologisch modifizierte Zelle(n) oder (ein) pathologisch modifizierte(s) Gewebe umfasst die weiteren Schritte:

b(1). Bestimmung des Genexpressionsmusters von (einer) Kontrollzelle(n) oder (einem) Kontrollgewebe(n); und
b(2). Bestimmung des Gens/der Gene, welche(s) unterschiedlich in der/den pathologisch modifizierten Zelle(n) oder dem/den pathologisch modifizierten/modifiziertem Gewebe(n) und in den Kontrollzellen oder Kontrollgewebe(n) exprimiert wird/werden.

Die hier erwähnte Kontrollzelle(n) oder Kontrollgewebe können durch einen Fachmann leicht bestimmt werden. Zum Beispiel kann gleiches Gewebe von einem gesunden Spender verwendet werden. Wie gezeigt, z.B. in den angefügten Beispielen, kann ein Kontrollgewebe für restenotisches Gewebe Media oder Media/Intima von gesunden Kranzarterien sein. Darüber hinaus kann/können (eine) Kontrollzelle(n) oder Kontrollgewebe während Biopsien von Lebergewebe, Nierengewebe, Prostata, Zervixgewebe usw. erhalten werden.
Es wird beschrieben, dass das Genexpressionsmuster, d.h. das „Transcriptom" der Kontrollzelle oder des Kontrollgewebes auch durch Verwendung des Verfahrens zur Amplifizierung von mRNA einer Probe bestimmt wird, wie hierin beschrieben. Vorzugsweise umfasst die Transcriptomanalyse von Proben wie die pathologisch modifizierte(n) Zelle(n) oder das/die pathologisch modifizierte(n) Gewebe, die Kontrollzelle(n) oder Kontrollgewebe die Schritte:

i. Herstellung von cDNA aus polyadenylierter RNA aus der pathologisch modifizierten Zelle oder dem pathologisch modifizierten Gewebe, der Kontrollzelle oder dem Kontrollgewebe und/oder der in vitro-Zelle, wobei mindestens ein Primer verwendet wird, der an die polyadenylierte RNA hybridisiert und eine 5'-Poly(C)- oder eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst, wobei die Konzentration des mindestens einen Primers im Bereich von 10 μM bis 60 μM liegt;
ii.(aa) Beseitigung von nicht-hybridisiertem, überschüssigem Primer/nicht-hybridisierten, überschüssigen Primern und/oder überschüssigen dNTPs, falls anwesend;
(ab) 3'-Verlängerung der hergestellten cDNA mit einem Poly(G)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(C)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), oder einem Poly(C)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n); oder
(b) 3'-Verlängerung der hergestellten cDNA mit einem Poly(G)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(C)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), oder einem Poly(C)-Schwanz, wenn in Schritt i. (ein) Primer, welcher) eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), unter Verwendung einer RNA-Ligase, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von überschüssigem Primer/überschüssigen Primern und/oder überschüssigen dNTPs; und
iii. Amplifizierung der verlängerten cDNA mit einem Primer, welcher an die in Schritt ii.(ab) oder ii.(b) erzeugten Verlängerungen hybridisiert;
iv. Verwendung der amplifizierten cDNA in (einem) Hybridisierungsassay(s); und
v. Nachweis von Unterschieden und/oder Ähnlichkeiten beim Genexpressionsmuster der pathologisch modifizierten Zelle oder des pathologisch modifizierten Gewebes, der Kontrollzelle oder des Kontrollgewebes und/oder der in vitro-Zelle.

Die Ausführungsformen, wie hier vorstehend für das Verfahren der Erfindung beschrieben, können für die Transcriptomanalyse der pathologisch modifizierten Zelle(n) oder des/der pathologisch modifizierten Gewebe(s), der Kontrollzelle(n) oder des Kontrollgewebe(s) und/oder der in vitro-Zelle angewendet werden.
Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung eines in vitro-Surrogats kann unter anderem für restenotisches Gewebe oder für eine restenotische Zelle verwendet werden. Die Kontrollzelle oder das/die Kontrollgewebe können aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus glatten Muskelzellen, Media/Intima von (gesunden) Kranzarterien und Media/Intima von (gesunden) peripheren Arterien bestehen.
Die zum Genexpressionsmuster einer pathologisch modifizierten Zelle(n) oder (eines) Gewebe(s) aufzunehmende „in vitro-Zelle" kann aus einer primären Zellkultur, einer sekundären Zellkultur, einer Gewebekultur oder einer Zelllinie stammen. Vorzugsweise, aber nicht darauf begrenzt, sind diese Zellen und/oder Zellkulturen gezüchtete Muskelzellen, gezüchtete glatte Muskelzellen, gezüchtete glatte Muskelzellen von Kranzarterien, HepG2-Zellen, Jurkat-Zellen, THP-1-Zellen, Monomac-6-Zellen oder U937-Zellen. Solche Zellen sind leicht erhältlich aus Quellen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie DSMZ, Braunschweig oder die ATCC, USA. Darüber hinaus können Kardiomyoblasten als „in vitro-Zelle" zur Anpassung zu einem „Surrogat" verwendet werden.
Der Anpassungsschritt (Schritt d. des vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung eines in vitro-Surrogats) kann die Exposition der in vitro-Zelle zu physikalischen und/oder chemischen Änderung(en) umfassen, worin die physikalische(n) Änderung(en) Temperaturveränderungen, Lichtveränderungen, Druck, pH-Änderungen, Änderungen der Ionenstärke oder Änderungen der Zusammensetzung der Gasphase(n) (wie O₂, N₂, CO, CO₂) umfassen kann/können und die chemischen Änderungen Mediumauswechselungen, Mediumsubstitutionen, Mediumverbrauch und/oder Mediumzugaben umfassen können. Es wird besonders bevorzugt, dass die chemischen Änderungen die Exposition zu Verbindungen wie Wachstumsfaktoren, Hormonen, Vitaminen, Antikörpern oder Fragmenten und/oder Derivaten davon, kleine Molekülliganden, Cytokinen, Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Antibiotika, natürliche und/oder nicht-natürliche Rezeptorliganden oder Komponenten von Signaltransduktionswegen umfassen. Der Anpassungsschritt kann auch Cokultivierung mit anderen Zellen/Zelllinien umfassen, zum Beispiel Cokultivierung mit Blutzellen, Gliazellen, Dendritzellen oder Osteoklasten. Die Blutzellen können Monocyten und T-Lymphocyten umfassen.
In dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung eines in vitro-Surrogats kann das Cytokin IFN-γ (oder ein funktionelles Derivat davon) sein, der natürliche und/oder nicht-natürliche Rezeptorligand kann ein Ligand für IFN-γ-Rezeptor (a- und/oder b-Kette) sein, der Transkriptionsfaktor kann IRF-1 oder ISGF3-γ-(p48) sein, die Kinase kann Tyrosinkinase Pyk2 sein, die Komponenten der Signaltransduktionswege können DAP-1, BAG-1, Pim-1 oder IFN-γ-induzierbares Protein 9-27 sein, der Wachstumsfaktor kann Plättchenwachstumsfaktor AA, Angiotensin oder Fibroblastenwachstumsfaktor sein oder das Antibiotikum kann Rapamycin sein.
In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „funktionelles Derivat" von IFN-γ auf Derivate, die die biologischen Eigenschaften von natürlichem IFN-γ beibehalten oder im Wesentlichen beibehalten. Beispiele solcher Derivate sind Muteine. Dasselbe gilt entsprechend für andere hierin erwähnte Komponenten.
(Ein) in vitro-Surrogat(e), wie durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten, sind besonders nützlich bei Drug-Screening-Verfahren und/oder bei toxikologischer Analyse. Solche Verfahren umfassen, aber sind nicht begrenzt auf, den Nachweis von modifiziertem Genexpressionsmuster nach Inkontaktbringen der in vitro-Surrogate mit einer Testsubstanz und/oder einem möglichen Arzneistoffkandidat. Solche Screeningverfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden unter anderem in Scherf, Nat. Genetics 24 (2000), 236-244; Ross, Nat. Genetics 24 (2000), 227-235 beschrieben. Hochdurchsatzscreenings werden in Sundberg, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000), 47-53; Hopfinger, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000), 97-103; Vidal, Trends Biotechnol. 17 (1999), 374-381; Gonzales, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1989), 624-631; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol. 2 (1998), 597-603 beschrieben und/oder zusammengefasst.
Zusätzlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen in einer Testprobe, worin das Verfahren die Schritte umfasst von (a) Bereitstellen einer Testprobe und einer Kontrollprobe, wobei jede polyadenylierte RNA umfasst; (b) Anwenden der Schritte des Verfahrens zur Amplifizierung von mRNA der vorliegenden Erfindung auf die Test- und Kontrollprobe; und (c) Vergleichen der erhaltenen amplifizierten cDNA der Testprobe mit der erhaltenen amplifizierten cDNA der Kontrollprobe. Die Test- und Kontrollprobe können aus denselben Organismen stammen, aber können auch aus verschiedenen Organismen/Individuen stammen. Darüber hinaus kann die Testprobe Gewebekulturen oder Zellkulturen umfassen. Darüber hinaus umfasst die Test- und/oder Kontrollprobe vorzugsweise dieselbe Art von (einer) Zelle(n) und/oder (eines) Gewebe(s). Der Vergleich von Schritt (c) kann ausgeführt werden, wie zum Beispiel in den angefügten Beispielen gezeigt, und kann Hybridisierung der erhaltenen amplifizierten cDNA mit cDNA-Arrays einbeziehen. Das Verfahren zur Identifizierung unterschiedlich exprimierter Gene kann deswegen den Vergleich von Gewebe, (einer geringen Zahl von) Zellen oder einer Einzelzelle von verschiedenartigem Ursprung umfassen. Zum Beispiel können pathologisches und nicht-pathologisches Gewebe, (geringe Zahl von) Zellen oder Einzelzellen auf dem Transcriptom-Niveau verglichen werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Identifizierung eines Arzneistoffkandidaten zur Verhinderung oder Behandlung eines pathologischen Zustandes oder einer pathologischen Störung, umfassend die Schritte (a) Inkontaktbringen einer Probe, welche polyadenylierte RNA umfasst, mit dem Arzneistoffkandidat; (b) Anwenden der Schritte des Verfahrens zur Amplifizierung von mRNA der vorliegenden Erfindung auf die Probe; und (c) Nachweis der Anwesenheit, der Abwesenheit, der Steigerung oder der Verminderung von bestimmten exprimierten Genen in der Probe.
Die Probe, die mit dem Arzneistoffkandidaten in Kontakt zu bringen ist, kann ein isoliertes Organ, Gewebe, (geringe Zahl von) Zellen oder eine Einzelzelle sein. Die Probe kann auch ein Gewebe oder eine Zellkultur sein. Darüber hinaus ist es auch vorgesehen, dass ein Labortier und/oder ein Individuum mit dem Arzneistoffkandidaten in Kontakt gebracht wird und dass nach (oder während) des Kontakts eine entsprechende Probe erhalten wird, zum Beispiel durch Biopsie.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum in vitro-Nachweis eines pathologischen Zustandes oder einer Anfälligkeit für einen pathologischen Zustand in einem Individuum, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen einer Probe, welche polyadenylierte RNA des Individuums umfasst; (b) Anwenden des Verfahrens zur Amplifizierung von mRNA der vorliegenden Erfindung auf die Probe; und (c) Nachweis eines pathologischen Zustandes oder einer Anfälligkeit für einen pathologischen Zustand basierend auf der Anwesenheit, der Abwesenheit, der Steigerung, der Verminderung oder der Menge des/der exprimierten Gens/Gene in der Probe.
Die Anwesenheit, Abwesenheit, Steigerung oder Verminderung oder Menge kann unter anderem durch Vergleichen der erhaltenen cDNA(s) mit erhaltener/erhaltenen cDNA(s) aus einer gesunden Kontrollprobe nachgewiesen werden. Die Probe(n) kann/können von menschlichem Ursprung sein.
Zudem beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung von amplifizierter cDNA, wie durch das Verfahren der Erfindung zur in vitro- und/oder in vivo-Expression erhalten. Verfahren zur in vitro- und/oder in vivo-Expression sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden unter anderem beschrieben in („Current Protocols in Molecular Biology", herausgegeben von Ausubel et al., John Wiley & Sons, USA (1988); Schoelke, Nature Biotech., 18, 233-234 (2000)) oder in „Biotechnology"; herausgegeben von Rehn und Reed, VCM Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, FRG, (1993). Darüber hinaus wird in vitro-Expression in Pflanzenzellen beschrieben in Weissbach „Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, San Diego, U.S.A. (1988). Besonders bevorzugte Systeme zur in vitro-Expression sind auf dem Fachgebiet bekannte Translationssysteme, wie E.coli-Lysate zur gekoppelten Transcription/Translation (Basset, J. Bacteriol., (1983) 156, 1359-1362), Weizenkeimtranslationssysteme oder Reticulocytenlysate (Walter, Methods Enzymol., 93, 682-691 (1983); Dasnahapatra, Methods Enzymol., 217, 143- 151 (1993); Hancock, Methods Enzymol, 255, 60-65 (1995); Wilson, Methods Enzymol., 250, 79-91 (1995)). Die in vitro- und/oder in vivo-Expression der amplifizierten cDNA umfasst Transkriptions- sowie Translationsereignisse und umfasst deswegen die Herstellung von mRNA sowie, falls gewünscht, von (einem) Protein(en) und/oder (einem) Peptid(en). Deswegen bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von amplifizierter cDNA, wie durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur in vitro- und/oder in vivo-Herstellung von mRNA-Transkripten erhalten.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Verwendung von amplifizierter cDNA, wie durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten, oder der mRNA-Transkripte, wie hier vorstehend definiert und durch in vitro- und/oder in vivo-Expression der cDNA erhalten, wie durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung, bei Hybridisierungsassays und/oder Wechselwirkungsassays erhalten.
Vorzugsweise werden Hybridisierungsassays unter definierten Bedingungen ausgeführt. Am meisten bevorzugt sind die Hybridisierungsbedingungen stringente Bedingungen. Jedoch bezieht sich der Begriff „Hybridisierung", wie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, auf stringente oder nicht-stringente Hybridisierungsbedingungen. Die Hybridisierungsbedingungen können gemäß konventionellen Protokollen festgelegt werden, beschrieben zum Beispiel in Sambrook, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y., Ausubel, „Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), oder Higgins und Hames (Hrsg.) „Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985).
Der Hybridisierungsassay kann die Hybridisierung an Oligonucleotid-Arrays, cDNA-Arrays und/oder PNA-Arrays umfassen, der Wechselwirkungsassay umfasst die Wechselwirkung mit (einem) Kohlenhydrat(en), (einem) Lectin(en), einem Ribozym(en), (einem) Protein(en), (einem) Peptid(en), (einem) Antikörper(n) oder (einem) Fragment(en) davon, und/oder (einem) Aptamer(en).
Die vorstehend erwähnten Arrays sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (s. unter anderem, Debouck, Nat. Genet. 21:48-50 (1999); Hacia, Nat. Genet., 21, 42-7 (1999); Cole, Nat. Genet. 21, 38-41 (1999); Bowtell DD., Nat. Genet., 21, 25-32 (1999); Cheung, Nat. Genet., 21, 15-19 (1999); Duggan, Nat. Genet., 21,10-14 (1999); Southern, Nat. Genet., 21, 5-9 (1999)). Insbesondere können cDNA-Arrays erhalten werden von Clontech, Palo Alto; Research Genetics, Huntsville und umfassen cDNA-Mikroarrays, und Oligionucleotid-Arrays können erhalten werden von Affymetrix, Santa Clara. cDNA-Arrays können unter anderem gemäß den Verfahren präpariert werden, beschrieben in DeRisi, Nat. Genet. (1986), 14, 457-460; Lashkari, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13057-13062 (1997); Winzeler, Methods Enzymol. 306, 3-18 (1999); oder Schena (1995), a. a. O., Oligonucleotid-Arrays, unter anderem, gemäß nach Southern (1999), a. a. O.; Chee, Science, 274, 610-614 (1996). Die vorstehend erwähnten Arrays können Makroarrays sowie Mikroarrays umfassen.
Wie in den angehängten Beispielen gezeigt, kann die cDNA, wie durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten, (oder mRNA-Transkripte der cDNA) auf cDNA-Arrays/cDNA-Mikroarrays verwendet werden, um das Genexpressionsmuster/Transcriptom einer (Test)probe, umfassend polyadenylierte RNA, abzuleiten.
Hybridisierungsassays, wie hier vorstehend beschrieben, sind nützlich unter anderem bei medizinischen, diagnostischen, pharmakologischen sowie naturwissenschaftlichen Ansätzen. Wie in den angefügten Beispielen gezeigt, ist es möglich, DNA, wie durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten, zu verwenden, um das (Gen)expressionsmuster von pathologisch modifizierten Zellen und/oder pathologisch modifizierten Geweben, z.B. tumorigen (Zell)geweben, restenotischem Gewebe abzuleiten.
Die angefügten Beispiele dokumentieren unter anderem, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann, um unterschiedlich exprimierte Gene in restenotischem Gewebe abzuleiten. Auf diese Weise wurden 224 Gene identifiziert, die bei Restenose unterschiedlich exprimiert wurden, worin im Vergleich zu Kontrollen 167 Gene überexprimiert und 56 Gene unterexprimiert wurden. Der Nachweis von spezifischen, unterschiedlich exprimierten Genen oder Genexpressionsmuster(n) kann deswegen auch bei diagnostischen Verfahren angewendet werden, um unter anderem restenotisches Gewebe zu definieren. Wie in den angefügten Beispielen beschrieben, kann darüber hinaus das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei der Diagnose von neoplastischen Erkrankungen, Krebs nützlich sein.
Die amplifizierte cDNA, wie durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten, ist deswegen besonders nützlich bei der Erstellung von Genexpressionsprofilen von Geweben und/oder Zellen. Solche Genexpressionsprofile/Genexpressionsmuster können besonders nützlich und wichtig beim Screenen zum Auffinden von Arzneistoffen sein. Es wird besonders bevorzugt, dass Daten, erhalten durch solche Genexpressionsprofilerstellung, in Kombination mit Arzneistoffaktivitätsmuster verwendet werden (s. unter anderem Weinstein, Science 275 (1997), 343-349; Weinstein, Science 258 (1992), 447-451, van Osdol, J. Natl. Cancer Inst. 86 (1994), 1853-1859 oder Pauli, J. Natl. Cancer Inst. 81 (1989), 1088-1092). Darüber hinaus ist es vorgesehen, dass cDNA, wie durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten, und/oder mRNA-Transkripte davon bei Assays verwendet werden, worin Genexpressionsmuster und Arzneistoffaktivitätsprofile korreliert werden, wie beschrieben in Scherf, Nat. Genetics 24 (2000), 236-244 und in Ross, Nat. Genetics 24 (2000), 227-235. Weiter können die „Transcriptom"-Daten, die durch die Verfahren der Erfindung erhalten wurden, wie hierin vorstehend beschrieben, auch auf dem Protein-Niveau korreliert werden, wie in den angefügten Beispielen demonstriert.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von amplifizierter cDNA, erhalten durch das Verfahren der Erfindung, für sequenzspezifische PCR, cDNA-Clonierung, substraktiver Hybridisierungs-Clonierung und/oder Expressionsclonierung. Spezifische PCR kann z.B. verwendet werden, um die relativen Mengen von Transkripten innerhalb einer gegebenen Probe und zwischen Proben zu bestimmen. Die durch die vorliegende Erfindung hergestellte cDNA könnte auch auf subtraktive Hybridisierungs-Clonierung angewendet werden, um für cDNAs zu selektieren, die spezifisch für oder abwesend von der Probe sind, was in den angefügten Beispielen demonstriert wird (Rothstein, Methods Enzymol. 225, 585-610 (1993); Diatchenko, Methods Enzymol., 303, 349-380 (1999)).
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Adapter-Primer
verwendet werden mit dem voranstehend erwähnten Verfahren, d.h. der substraktiven Hybridisierungs-Analyse. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform können die Primer
während der Amplifizierung der resultierenden cDNA-Populationen verwendet werden, welche durch die vorstehend erwähnte substraktive Hybridisierungs-Analyse erhalten werden können.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform werden die Primer
für das zuvor erwähnte Verfahren, wie in den angefügten Beispielen gezeigt, verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Kit bereit, der mindestens einen Primer, wie hierin vorstehend definiert, umfasst.
Vorteilhafterweise umfasst der Kit der vorliegenden Erfindung weiter neben (einem) Primer(n), fakultativ, feste Träger (wie magnetische Kügelchen), Enzyme, wie Reverse Transkiptase(n), RNA-Ligase oder terminale Desoxynucleotidytransferase sowie (einen) Reaktionspuffer (wie cDNA-„Waschpuffer" oder „Verlängerungspuffer") und/oder (eine) Aufbewahrungslösung(en). Darüber hinaus können Teile des Kits der Erfindung einzeln in Fläschchen oder in Kombination in Behältern oder Multicontainer-Einheiten verpackt werden. Der Kit der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft zur Ausführung des/der Verfahren(s) der Erfindung verwendet werden und könnte unter anderem bei einer Vielfalt von Anwendungen, wie vorstehend verwiesen, verwendet werden, z.B. bei diagnostischen Kits oder als Forschungshilfsmittel. Zusätzlich kann der Kit der Erfindung Mittel zum Nachweis, passend für wissenschaftliche und/oder diagnostische Zwecke, enthalten. Die Fertigung der Kits folgt vorzugsweise Standardprozeduren, welche dem Fachmann bekannt sind.
Die Figuren zeigen:
1. Parameter zur Bestimmung des Amplifizierungsausgangs. a) Zwanzig HT29-Dickdarmkarzinomzellen ((ATCC: HTB-38) Spuren 1-20) wurden einzeln isoliert und mRNA bei Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Zufalls-Hexamer-Primern revers transcribiert (Spuren 1-5, 80 μM; Spuren 6-10, 8 μM; Spuren 11-15, 0.8 μM; Spuren 16-20, 0.08 μM). 1/10 der cDNA wurde anschließend für den Nachweis des ki-ras-Transcripts durch genspezifische PCR getestet. b) Einfluss des homopolymeren Schwanzes auf Empfindlichkeit. Ein 350 bp TGF-α-Fragment wurde isoliert, verdünnt und entweder mit dA oder dG verlängert. Fortlaufende Verdünnungen wurden durch PCR unter Verwendung von jeweils Poly-dT oder Poly-dC enthaltenden Primern getestet und einem Primer innerhalb der TGF-α-Sequenz. Die informativen Verdünnungen werden in Duplikaten gezeigt. (Spuren 1+2, Negativkontrolle; Spuren 3+4, 10^–3-Verdünnung; Spuren 5+6, 10^–5-Verdünnung). c) FL4-N6 geprimte und revers transkribierte mRNA wurde dG-verlängert und amplifiziert unter Verwendung der CP3 + FL4-Primer (Spuren 1-3) oder CP2 + FL4-Primer bei unterschiedlichen Annealing-Temperaturen (Spur 1+4, 68°C, Spur 2+5 65°C, Spur 3+6, Negativkontrolle). d) Eine wie in c) identische Menge mRNA wurde unter Verwendung des CFL5cN6-Primers revers transkribiert und mit dem CP2-Primer amplifiziert. Eine gleiche Menge cDNA wie in c) (Spur 3+4) resultierte in Amplifizierung eines weiten Bereich von cDNA-Fragmenten, wie es eine 1:200- Verdünnung (Spur 1+2) bei unterschiedlichen Annealing-Temperaturen tat (Spur 1+3, 68°C; Spur 2+4, 65°C; Spur 5, Negativkontrolle).
2. Genspezifische PCR für β-Actin und verschiedenen MAGE-Transkripte unter Verwendung von unamplifizierter gepoolter cDNA von A431-Zellen als Positivkontrolle (+) und Amplifikaten von A431-Einzelzellen (Spur 2-4 und 6-8), die vor umfassender PCR in zwei Hälften (a+b) geteilt wurden. Zwei unabhängige Experimente wurden durchgeführt (Spur 1-4 und 5-8) mit Spur 1 und Spur 5 als Negativkontrollen für die umfassende PCR.
3. CGH-Profile von zwei normalen Leukocyten (rot) und zwei MCF-7-Brustkrebszellen (blau), bei denen die genomische DNA aus dem Überstand nach mRNA-Isolierung isoliert wurde. Die Chromosomenverhältnisse der normalen Zellen sind innerhalb der gestrichelten Linien, was den Schwellenwert für Signifikanz ergibt, während die Profile der Krebszellen gleich sind im Hinblick auf ihre Chromosomendeletionen und Amplifizierungen.
4. CGH-Profil von Zelle B, abgeleitet von einer Brustkrebspatientin mit sehr kleinem Primärtumor (Stadium T1a). Chromosomendeletionen sind mit einem roten Balken links vom und Chromosomengewinne mit einem grünen Balken rechts vom Chromosomensymbol markiert.
5. Diagramm zur Veranschaulichung der gemeinsamen und unterschiedlich exprimierten Gene von Zelle B, C und L.
6. Hybridisierung von Zelle L (links) und die Matrix von Positionen und Namen von immobilisierten cDNAs. Gene werden in Duplikaten in diagonaler Richtung getüpfelt, mit den blauen Gensymbolen orientiert von links oben nach rechts unten und den roten Gensymbolen orientiert von rechts oben nach links unten.
7: Immunohistochemische Färbungen der Neointima aus In-Stent-Restenose von menschlicher Kranzarterien nach v. Giesson (linke Tafel) und alpha-Actin aus glattem Muskel (rechte Tafel). Das gezeigte Experiment ist repräsentativ für 3 unabhängige Exemplare. Balken zeigen 100 μM an.
8: PCR mit genspezifischen Primer für β-Actin (Spuren 1), EF-1α (Spuren 2) und α-Actin (Spuren 3) als eine Kontrolle für erfolgreiche PCR-Amplifizierung des ersten Strangs cDNA, hergestellt aus einem mikroskopischen Gewebe-Exemplar. Gezeigt wird ein Repräsentant von jeder Studiengruppe (rechte Tafel: Patient B; linke Tafel: Kontrollspender b). Die Position von drei Größenmarken (M) ist gezeigt.
9: cDNA-Array-Analyse. Derselbe Array ist gezeigt mit drei unabhängigen Hybridisierungsexperimenten, die mRNA, isoliert aus Neointima (Tafel A) oder aus einem Kontrollgefäß (Tafel B) und bei Abwesenheit einer biologischen Probe (Tafel C) vergleichen. Der cDNA-Array enthielt 588 Gene, einschließlich neun Haushaltsgene und drei Negativkontrollen [M13 mp 18 (+) Strang-DNA; lambda-DNA; pUC18-DNA]. Das hier gezeigte Experiment ist ein Repräsentant von Hybridisierungsexperimenten mit 10 Neointima- und 10 Kontrollexemplaren. Kreise zeigen vier Hybridisierungssignale (A-D) an, die zwischen Restenose und Kontrolle unterschiedlich exprimiert wurden.
10: Transkriptionsprofile von mikroskopischen Proben aus menschlicher In-Stent-Neointima und Kontrollgefäßen. Jede Spalte repräsentiert eine Genexpressionsanalyse eines einzelnen Exemplars für 53 ausgewählte Gene. Ein Pfeil zeigt Gene an, die signifikante Hoch- oder Herunterregulierung bei Neointima versus Kontrolle zeigen. Acht stark exprimierte Haushaltsgene werden unten gezeigt. Ein grauer Wert entspricht einer Signalintensität, wie unten in der Figur gezeigt.
11: Verifizierung von unterschiedlich exprimierten mRNAs aus cDNA-Arrays durch genspezifische PCR. Die Größe der erwarteten PCR-Fragmente wird rechts angezeigt.
12: Immunhistochemische Färbung von Neointima aus Restenose der Halsschlagader für das FKBP12-Protein. Das gezeigte Experiment ist ein Repräsentant von drei unabhängigen Experimenten. Die Balken repräsentieren einen Abstand von 100 μm. Tafel A zeigt eine Hematoxylin-Eosin-Färbung, Tafel B-D zeigt Färbung für FKBP12 von der Grenzzone zwischen gesunder Media und Neointima (Tafel B), von gesunder Kontrollmedia (Tafel C) und neointimalem Gewebe (Tafel D).
13: cDNA-Array-Analyse einer Genexpression. Vier Clontech Atlas-Mikroarrays, enthaltend insgesamt 2435 menschliche cDNAs, wurden mit cDNA, markiert mit Dig-dUPT, hybridisiert, hergestellt aus RNA aus In-Stent-Neointima (n=10) und aus Kontrollmedia/Intima (n=11), wie in Materialien und -Methoden beschrieben. Die Flecken zeigen den Durchschnitt der relativen Expression von zwei untersuchten Gruppen an. Tafel A zeigt die Expression aller untersuchten Gene in dieser Studie. Tafel B zeigt Expression von 224 unterschiedlich exprimierten Genen, das waren mehr als 2.5-fach induzierte oder reduzierte in Neointima und zeigten eine statistische Signifikanz von p<0.03 beim Wilcoxon-Test. Für diese Darstellung wurden Nullwerte durch einen Wert von 0.0001 ersetzt, da Nullwerte auf einer logarithmischen Skala nicht darstellbar sind.
14: Clusterabbildung, die verschiedene Klassen von Genexpressionsprofilen der zweihundertvierundzwanzig Genen zeigt, deren mRNA-Niveaus zwischen Neointima und Kontrolle unterschiedlich waren. Dieser Teilsatz von Genen wurde in vier Gruppen auf Grundlage ihrer Expression in verschiedenen Zelltypen geclustert. Das Expressionsmuster von jedem Gen in diesem Satz wird hier als horizontaler Streifen angezeigt. Jede Spalte repräsentiert das durchschnittliche mRNA-Expressionsniveau der untersuchten Gruppe. Für jedes Gen wird der Durchschnitt des mRNA-Niveaus von Neointima (n=10), von Kontrolle (n=11), von sich vermehrenden CASMCs (n=2) und von Blutproben (n=10), auf das mRNA-Expressionsniveau der Haushaltsgene normalisiert, durch eine Farbe repräsentiert, gemäß der Farbskala am Boden. Gruppe I enthielt Gene, die nur im Neointima-Exemplar exprimiert wurden (14A). Gruppe II enthielt Gene, die gleichzeitig in Neointima und sich vermehrenden CASMCs exprimiert wurden (14B). Gruppe III bestand aus Genen, deren mRNA in Neointima sowie in Blut exprimiert wurde (14C). Gruppe IV enthielt Gene, deren mRNA im Kontrollexemplar überexprimiert wurden (14D).
15: Erweiterte Ansicht des Transkriptionsfaktorcluster, das 14 Gene enthält, die in Neointima versus Kontrolle hochreguliert wurden, und drei Transkriptionsfaktoren, die in Neointima herunterreguliert wurden. In diesem Fall repräsentiert jede Spalte ein einzelnes Exemplar, und jede Reihe repräsentiert ein einzelnes Gen.
16: Erweiterte Ansicht der IFN-γ-assoziierten Cluster, die 32 Gene enthalten, die in Neointima versus Kontrolle hochreguliert wurden. In diesem Fall repräsentiert jede Spalte ein einzelnes Exemplar, und jede Reihe repräsentiert ein einzelnes Gen.
17: Immunohistochemische Färbungen von Neointima aus einer Restenose der Halsschlagader und gesunder Kontrollmedia für das IRF-1-Protein (linke Tafel: Kontrollmedia; rechte Tafel: Neointima). Das hier gezeigte Experiment ist ein Repräsentant von 6 unabhängigen Experimenten.
18: Immunohistochemische Färbung von Neointima aus einem koronaren In-Stent für das IRF-1-Protein. Tafel A zeigt eine Hematoxylin-Eosin-Färbung des neointimalen Exemplars aus In-Stent-Restenose, Tafel B zeigt eine Färbung für den glatten Muskelzellmarker α-Actin, Tafel C zeigt die immunohistochemische Färbung für den Transkriptionsfaktor IRF-1 in Neointima aus In-Stent-Restenose und Tafel D zeigt immunohistochemische Färbung für CD3. Das hier gezeigte Experiment ist ein Repräsentant von drei unabhängigen Experimenten.
19: Ansicht des IFN-γ-assoziierten Clusters, der 32 Gene enthält, die in Neointima versus Kontrolle hochreguliert wurden, verglichen zur Expression in kultivierten CASMCs und zu kultivierten CASMCs, die für 16 h mit 1000 U/mL IFN-γ stimuliert wurden. In diesem Fall repräsentiert jede Spalte ein einzelnes Exemplar, und jede Reihe repräsentiert ein einzelnes Gen. Ein grauer Wert entspricht einer Signalintensität, wie unten in der Figur gezeigt.
20: Doppelte Färbung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark. Zellen in kleinen Aggregaten (von sieben und von zwei Zellen) in der oberen Tafel und eine Einzelzelle, nachgewiesen im Knochenmark von zwei verschiedenen Patienten, wurden für Cytokeratin (rote Fluoreszenz) und Emmprin (blau) gefärbt.
21: Unterschiedliche Expression des Transferrin-Rezeptors (CD71) auf Tumorzellen. DAPI-Färbung von Zellkernen (linke Tafel), hochregulierte CD71-Expression wurde in Tumorgewebe (rechte Tafel) gefunden.
22: Wirkung von IFNγ auf das Überleben von kultivierten SMCs. Durchflusscytometrie-Analyse von spontaner (Tafel A und C) und H₂O₂-induzierter Apoptose (Tafel B und D). Zellen wurden mit FITC-markierten Annexin V und PI 6 h nach Behandlung mit 100 μmol/l H₂O₂ doppelt gefärbt. Eine repräsentative Analyse von 5 unabhängigen Experimenten wird gezeigt.
23: Die Wirkung einer IFNγ-Rezeptor-Nullmutation auf die Entwicklung von Neointima in einem Mausmodell von Restenose. (A-D) Repräsentative Mikrophotographien von Querschnitten von Maushalsschlagadern von Wildtyp- (wt) und IFN-γR^-/--Knockout (ko)-Mäusen sind für die unbehandelte Arterie (Kontrolle) und für die contralaterale abgebundene Arterie (abgebunden) 4 Wochen nach Ligatur gezeigt. Die van-Giesson-Färbungsprozedur wurde verwendet. Die Balken repräsentieren eine Länge von 100 μm. (E) Daten aus 16 Wildtyp- und 11 IFN-γR^-/--Mäusen werden als Durchschnitt ± SEM (Balken) gezeigt und mit dem t-Test für ungepaarte Proben analysiert. Die Skala zeigt die Dicke der Media und Neointima in μm. Offene Spalten: Kontrolltiere vor und nach Ligatur der Halsschlagader; gefüllte Spalten: Knockout-Tiere vor und nach Ligatur der Halsschlagader. Die schattierte Fläche zeigt die Dicke der Neointima an.
24: Ablaufdiagramm einer SSH-Analyse, durchgeführt mit Einzelzellen oder kleinen Zellproben.
25: Screening von Kolonien durch Southern-Blot unter Verwendung von markiertem Treiber und Tester als Sonden. Spur 1-9 Kolonien, erhalten nach Subtraktion. Kolonie #4 wurde als ESE1 identifiziert, einem Epithel-spezifischen Transkriptionsfaktor. M = Molekulargewichtsmarker.
26: Unterschiedliche Expression von ESE1 in Tumorzellen, analysiert durch PCR und Gelelektrophorese. Spur 1-4 Brustkrebs-Einzelzellen, 5-7 Knochenmark von gesunden Spendern. M = Molekulargewichtsmarker.
Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden biologischen Beispielen beschrieben werden, welche lediglich erklärend sind und nicht als Begrenzung des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden sollen.
Beispiel 1: Herstellung und umfassende Amplifizierung von cDNA einer Einzelzelle
Die Menge von mRNA aus Einzelzellen ist für die direkte Anwendung bei Array-basierter Transcriptom-Analyse zu gering. Es wurde berichtet, dass die gesamte RNA aus 50,000 Zellen (10 μg) die Nachweisgrenze für Herangehensweisen mit direkter Markierung ist (Mahdevappa, Nat. Biotechnol., 17, 1134-1136 (1999)). Unter Verwendung eines linearen Amplifizierungsschrittes konnte diese Zahl auf 1000 Zellen reduziert werden (Luo, Nat. Med., 5, 117-122 (1999)), welche noch weit jenseits der Anwendbarkeit für die Untersuchung von mikrometastatischen Zellen ist. Demnach ist reverse Transcription von mRNA und Amplifizierung der cDNA notwendig. Schlüssel ist die Entwicklung einer ungestörten umfassenden Amplifizierungsprozedur. In einer vereinfachten Art und Weise besteht die Herangehensweise aus vier grundlegenden Schritten: (1) Isolierung der mRNA auf einem Oligo-dT-beschichteten festen Träger, (2) cDNA-Synthese unter Verwendung von Zufalls-Primern, die eine 5'-Oligo-dC- (oder dG-) flankierende Region enthalten, (3) 3'-Verlängerungsreaktion mit dGTP (oder dCTP), wobei eine 3'-Oligo-dG-flankierende Region hergestellt wird, gefolgt von (4) einzelner Primer-basierter Amplifizierung unter Verwendung eines Primers, der an Oligo-dG- (oder-dC) flankierende Regionen der cDNA-Moleküle hybridisiert. Um diese vier grundlegenden Schritte zu erfüllen und hohe Empfindlichkeit und Verlässlichkeit bei der cDNA-Synthese, 3'-Verlängerung und pCR-Amplifizierung zu erhalten, mussten tRNA und rRNA beseitigt werden.
Darüber hinaus waren Konzentrationen von Zufalls-Primern 2000-8000mal höher für cDNA-Synthese verglichen zu früher beschriebenen Oligo-dT-basierten Herangehensweisen (Brady, Methods. Enzymol., 225, 611-623 (1993); Trumper, Blood, 81, 3097-3115 (1993)), die 10 nM cDNA-Synthese-Primer verwendeten. Zwanzig HT29 Dickdarmkarzinomzellen (ATCC: HTB-38) wurden einzeln isoliert und prozessiert. Nach Zelllyse in cDNA-Synthese-Puffer, der das Detergenz Igepal enthielt, wurden Gruppen von fünf Zellen gebildet und mit vier verschiedenen Konzentrationen von Zufalls-cDNA-Synthese-Primern revers transkribiert. Durch genspezifische RT-PCR wurde die cDNA-Synthese für jede Konzentration getestet. 1a zeigt, dass höhere Konzentrationen von Zufalls-Primern für cDNA-Synthese zu gesteigerten Nachweisraten von spezifischen Transkripten (z.B. ki-ras) führten. Überschüssiger Primer, ein effektiver Konkurrent der nachfolgenden Verlängerungs- und Amplifizierungsreaktion, wurde deswegen vorzugsweise vor beiden Schritten beseitigt. Ebenso verbesserten hohe dNTP-Konzentrationen die cDNA-Synthese, aber störten die nachfolgende Verlängerungsreaktion und mussten beseitigt werden. Standardmäßiger Cacodylat enthaltender Verlängerungspuffer störte die folgende PCR und wurde durch einen KH₂PO₄-Puffer von geringer Ionenstärke ersetzt (Nelson, Methods Enzymol., 68, 41-50 (1979). Die Gewinnung von mRNA auf Oligo-dT-beschichteten magnetischen Kügelchen liefert einfache Bedienung während mRNA-Isolierungs- und Pufferaustauschschritten. Im Folgenden werden die Isolation von Einzelzellen, mRNA-Isolation, cDNA-Synthese und 3'-Verlängerung kurz beschrieben und veranschaulicht.
Tumorzellen wurden aus Knochenmark isoliert, wie beschrieben (Klein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4494-4499 (1999)). Kurz, es wurden lebensfähige Knochenmarksproben für 10 Min. mit 10 μg/ml monoclonalem Antikörper 3B10-C9 in Anwesenheit von 5% AB-Serum, um unspezifische Bindung zu verhindern, angefärbt. 3B10-positive Zellen wurden mit B-Phycoerythrin-konjugierten Ziegenantikörper gegen Maus-IgG (The Jackson Laboratory) nachgewiesen und in PCR-Röhrchen auf Eis überführt. Oligo-dT-Kügelchen wurden zugegeben, die Zellen in 10 μl Lysepuffer (Dynal) lysiert, die Röhrchen für 30 Min. rotiert, um mRNA zu gewinnen. 10 μl cDNA-Waschpuffer-1 (Dynal), der 0.5% Igepal (Sigma) enthielt, wurde zugegeben und mRNA, an die Kügelchen gebunden, gewaschen in cDNA-Waschpuffer-2 (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, ergänzt mit 0.5% Tween-20 (Sigma)), in ein frisches Röhrchen überführt und wieder in cDNA-Waschpuffer-1 gewaschen, um irgendwelche Spuren von LiDS und genomischer DNA zu beseitigen. mRNA wurde mit Superscript II Reverse Transcriptase (Gibco BRL) revers transkribiert unter Verwendung der vom Hersteller gelieferten Puffer, ergänzt mit 500 μM dNTP, 0.25% Igepal, 30 μM Cfl5c8-Primer (5'-(CCC)₅ GTC TAG ANN (N)₆-3') und 15 μM CFL5cT (5'-(CCC)₅ GTC TAG ATT (TTT)₄ TVN, bei 44°C für 45 Min. Die Proben wurden während der Reaktion rotiert, um Sedimentation der Kügelchen zu vermeiden. cDNA blieb über die mRNA an die paramagnetischen Kügelchen gebunden und wurde einmal im Verlängerungswaschpuffer (50 mM KH₂PO₄, pH 7.0, 1 mM DTT, 0.25% Igepal) gewaschen. Kügelchen wurden im Verlängerungspuffer (10 mM KH₂PO₄, pH 7.0, 4 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT, 200 μM GTP) resuspendiert und cDNA-mRNA-Hybride wurden bei 94°C für 4 min denaturiert, auf Eis abgekühlt, 10 U TdT (MBI-Fermentas) zugegeben und bei 37°C für 60 min oder 37°C, 60 min und 22°C über Nacht inkubiert. Nach Inaktivierung des Verlängerungsenzyms (70°C, 5 min) wurde PCR-Mix I zugegeben, bestehend aus 4 μl Puffer 1 (Roche, Taq lange Matrize), 3% deionisiertem Formamid (Sigma) in einem Volumen von 35 μl. Die Sonden wurden bei 78°C im PCR-Cycler (Perkin Elmer 2400) erhitzt, PCR-Mix II, enthaltend dNTPs bei einer Endkonzentration von 350 μM, CP2-Primer (5'-TCA-GAA-TTC-ATG-CCC-CCC-CCC-CCC-CCC-3', Endkonzentration 1.2 μM) und 5 Einheiten des DNA-Poly-Mix wurde zugegeben, (Roche, Taq Long Template) in einem Volumen von 5 μl für eine Heißstartprozedur. Vierzig Zyklen wurden laufen gelassen bei 94°C, 15 Sek., 65°C, 30°C, 68°C, 2 Min. für die ersten 20 Zyklen und eine 10-Sek.-Verlängerung der Anbauzeit von jedem Zyklus für die verbleibenden 20 Zyklen und einen letzten Anbauschritt bei 68°C, 7 Min. Diese PCR-Amplifizierungsbedingungen unterscheiden sich wesentlich von Brail, Mut. Res. Genomics, 406, 45-54 (1999). Die Annealing-Temperatur ist bei Brail nur 42°C für 2 Min. im Gegensatz zu 65°C, angewendet in diesem Beispiel des Verfahrens der Erfindung.
Die Verlängerungseffizienz sowie die Empfindlichkeit der nachfolgenden PCR von Poly-dA- und Poly-dG-Schwanz tragenden Sequenzen wurde unter Verwendung eines definierten cDNA-Fragments mit einem Homopolymerschwanz von entweder Poly-dA oder Poly-dT festgelegt. Die Poly-(dA)- und Poly-(dG)-Schwanz tragenden Fragmente wurden verdünnt und dann durch PCR amplifiziert unter Verwendung von jeweils gleicher Mengen von Poly(dT)- bzw. Poly(dC)-Primern. In diesen Experimenten wurde gefunden, dass Poly-C-Primer-Bindung an Poly-G-Schwänze mindestens 100mal mehr Empfindlichkeit aufweist als Poly-T-Primer and Poly-dA-Schwänze (1b, vergleiche Spuren 1,2 bis 3,4)
Verschiedene cDNA-Syntheseprimer, welche die gleiche Poly-dC flankierende Region teilen, in Kombination mit Zufalls-Hexameren (N6), Octameren (N8), Oligo-dT (dT)₁₅ alleine oder in Kombination, wurden verglichen. Alle funktionierten gut und verlässlich. Die besten Ergebnisse wurden mit einer Kombination von Poly-dC -N8 und Poly-dC-(dT)₁₅-Primern erhalten (Daten nicht gezeigt).
Die dramatischste Verbesserung wurde erhalten, wenn nur ein Primer (1c) für die umfassende PCR verwendet wurde anstatt zwei (1d). Der cDNA-Synthese-Primer bestand aus einem 3'-Zufalls-Hexamer und flankierender Region von entweder einer Poly-dC-Spanne (CFI5c) oder einer flankierenden Sequenz von allen vier Basen (FI4N6). Zwei Poly-dC-bindende Primer wurden in Kombination mit einem zusätzlichen Primer, bindend an FI4 komplementäre Sequenz (1c), getestet. Die Verwendung eines zusätzlichen Primers (FL4) zu den Poly-dC-bindenden Primern (CP2, CP3) verhinderte Amplifizierung (1c, Spuren 1,2 und 4,5). Dies beruht wahrscheinlich auf hohen Primerkonzentrationen, die für optimale Empfindlichkeit erforderlich sind. Die Verwendung des CP2-Primers alleine resultierte in Amplifizierung eines weiten Bereichs von cDNA-Molekülen (0.2-3 kB). Sogar stark verdünnte cDNA (1:200) war noch für umfassende Amplifizierung ausreichend (1d).
Beispiel II: Transcriptomanalyse von Einzelzellen: Spezifität, Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit und Eignung für cDNA-Array-Analyse
Isolierte Einzelzellen aus kultivierten Zelllinien wurden durch das optimierte Protokoll für cDNA-Synthese, Verlängerung und Amplifizierung analysiert. Insgesamt wurden bisher 100 Einzelzellen erfolgreich für β-Actin und EF-1α-Expression durch genspezifische PCR getestet (Daten nicht gezeigt). Für cDNAs für Haushaltsgene wurde gefunden, dass sie in einer ausreichenden Kopienzahl pro Zelle relativ unabhängig von der für spezifische Amplifizierung bei der sekundären PCR verwendeten Region sind. Für weniger reichlich vorhandenen Transkripte wurde es gefunden, dass die Größe der gewählten codierenden Sequenz die Nachweisraten bestimmte. Die höchste Empfindlichkeit wurde mit den zwei Primern erhalten, die weniger als 200 bp getrennt waren (Daten nicht gezeigt).
Die PCR-Amplifikate aus Einzelzellen wurden für Eignung der cDNA-Array-Analyse getestet. Für diesen Zweck wurde die erhaltene cDNA mit Dig(Digoxigenin) markiert. Dig-UTP wurde durch PCR eingeführt. Zur Expressionsprofil-Erstellung wurden 0.1-1 μl der ursprünglichen PCR-amplifizierten cDNA-Fragmente zur Reamplifizierung bei Anwesenheit von mit Digoxigenin-markierten dUTP (Boehringer Mannheim), 50 μM dig-dUTP, 300 μM dTTP und andere dNTPs bei einer Endkonzentration von 350 μM verwendet. Reamplifizierungsbedingungen waren im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben; Modifizierungen waren die Verwendung von 2.5 Einheiten des DNA-Poly-Mix. Anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Min. gefolgt durch 12 Zyklen bei 94°C, 15 Sek., 68°C, 3 Min. und eine letzte Anbauzeit von 7 Min. Spezifische Transkripte wurden unter Verwendung von 1 μl einer 1/10-Verdünnung der ursprünglichen PCR zu einem Endvolumen von 10 μl nachgewiesen.
Die Spezifität der Hybridisierung von mit Digoxigenin markierten Sonden wird in Tabelle 1 gezeigt, wo die Expressionsmuster von Genen aus Einzelzellen von unterschiedlichem histogenetischen Ursprung gezeigt werden. Zellen waren MCF-7 (ATCC-Nummer HTB-22), A431 (ATCC-Nummer CRL-1555), K-562 (ATCC-Nummer CCL-243), JY (International Histocompatibility Workshop: IHW9287). Nur die MCF-7- und A431-Zelle exprimierten die Cytokeratin-Gene, Marker für ihren epithelialen Ursprung, während die Erythroleukämie-K562-Zelle und EBV-transformierte B-Zelle JY Gene von hämatopoetischen Ursprung exprimierte, einschließlich CD33, CD37, CD38 und kappa-leichte Kette in der B-Zelle. Zudem wurden die Hoden- und Tumorspezifischen MAGE-Gene in allen Krebszellen stark exprimiert, aber nicht in der viral transformierten B-Zelle. Diese Daten zeigen, dass Einzelzelle-PCR-Amplifikate für cDNA-Array-Analyse nützlich sind und Zelltyp-spezifische Genexpressionsmuster von Einzelzellen produzieren.
Tabelle 1: Expression von histogenetisch informativen Genen durch Einzelzellen, die aus unterschiedlichen Geweben stammen. Tabelle 1
In Kultur gewachsene einzelne Zellen wurden isoliert, cDNA synthetisiert, amplifiziert und mit einem Array von histogenetisch informativen Genen hybridisiert. Zellen waren aus den folgenden Zelllinien MCF-7 (Brustkrebs); A431 (Epidermoidkarzinom); K562 (chronische myeloische Leukämie); JY (Epstein-Barr-Virus-transformierte B-Zelllinie).
Um die Reproduzierbarkeit festzulegen, wurde das Expressionsmuster von vier MCF-7-Zellen unter Verwendung eines cDNA-Arrays Generation 4 mit 110 unterschiedlichen Genen verglichen (Tabelle 2). Spezialangefertigte cDNA-Arrays wurden präpariert, wie folgt. cDNAs wurden mit genspezifischen Primern aus menschlicher cDNA PCR-amplifiziert, PCR-Amplifikate wurden auf dem Gel aufgereinigt und 15 ng DNA pro Amplifikat wurden auf Nylonmembranen (Boehringer) unter Verwendung eine BioGrid Tüpfel-Robotervorrichtung (Biorobotics) getüpfelt. DNA-Makroarrays wurden Generation 4 und Generation 5 genannt (s. hierin nachstehend).
Filter Generation 4: Getüpfelte Gene waren: Protein Name HUGO Name Protein Name HUGO Name
Tabelle 2: Gemeinsam und unterschiedlich exprimierte Gene von vier einzelnen MCF-7-Zellen. Tabelle 2
Die Heterogenität der Genexpression von einzelnen Zellen stammt aus demselben Zellclon. Vier aus Zellkultur isolierte MCF-7-Zellen wurden durch Einzelzellanalyse der Genexpression analysiert. Aufgelistet sind die Transkripte, die in allen vier Einzelzellen (4/4), in drei von vier (3/4), in zwei von vier (2/4) und in einer von vier (1/4) nachgewiesen wurden. 18/46 (39%) exprimierte Gene wurden in allen Zellen nachgewiesen. 61% Gene konnten nur in einem Teil von den vier Zellen gefunden werden. 63 Gene waren negativ für alle getesteten Zellen.
46 Gene (42%) wurden in mindestens einer Zelle exprimiert und 63 (58%) waren negativ für alle vier Zellen. Achtzehn der 46 (39%) exprimierten Gene wurden in allen vier Zellen nachgewiesen, während für die verbleibenden 29 (61%) gefunden wurde, dass sie heterogen exprimiert werden. Um auszuwerten, ob diese Heterogenität auf interzellulärer Schwankung beruhte oder ein Artefakt der Methode ist, wurde es getestet, ob Disparität auch mit der cDNA einer einzelnen A431-Zelle, die für zwei getrennte PCR-Amplifizierungen aufgeteilt wurde, beobachtet wurde. In einem ersten Experiment wurden genspezifische PCRs mit den umfassend amplifizierten PCR-Produkten, erhalten aus 50% von Einzelzell-cDNA (2), durchgeführt. Zum Vergleich wurde cDNA, isoliert aus einem Pool von 500.000 A431-Zellen, zu solch einem Ausmaß verdünnt, dass die Intensität der β-Actin-Bande gleich war zu der, die aus 50% Einzelzell-cDNA erhalten wurde. Nach 32 Zyklen und mit einer cDNA-Menge, entsprechend etwa 10.000 Zellen, erreichte das β-Actin-Signal der Poolkontrolle und 50% der Einzelzell-cDNA die Plateau-Phase der Amplifizierung. Wie in 2 gezeigt, war die Schwankung zwischen zwei cDNA-Hälften derselben Zelle sehr gering. Bei zwei unabhängigen Experimenten ergab jede Hälfte (a+b) aus sechs A431-Zellen β-Actin-Banden von gleicher Intensität.
Um die Verlässlichkeit der umfassenden Amplifizierung der cDNA zu testen, wurde eine zweite Gensequenz-spezifische PCR-Amplifizierung durchgeführt. Da bekannt ist, dass die Effizienz von genspezifischer PCR-Amplifizierung Primersequenzabhängig ist, wurde die Amplifizierung von MAGE-Transkripten getestet, welche sehr anspruchsvoll hinsichtlich des Primeraufbaus sind (Kufer, WO98/46788 (1998); Serrano, Int. J. Cancer 83, 664-669 (1999)). Das Niveau der MAGE-Expression, bestimmt durch sequenzspezifische PCR, war einheitlich geringer als das von beta-Actin. Die relative Häufigkeit von MAGE-Transkripten in aufgeteilten Einzelzellproben nach umfassender Amplifizierung der cDNA (2, Spuren 2-4 und 6-8) war mit der Kontrollprobe aus unamplifizierter cDNA aus zusammengefassten Zellen vergleichbar (2, +). In 4 von 6 Fällen waren die Ergebnisse für beide Hälften der cDNA identisch. Der Mangel an einem MAGE-Transkript in Zellhälfte 7a und 8b zeigt höchstwahrscheinlich eine ungleiche Verteilung der cDNAs zwischen den zwei Hälften an.
Die beobachtete Sequenz-unabhängige Amplifizierung ist typisch für den Poly-dC-Primer, welcher fünfzehn Cytosinreste enthält und deswegen Primerbindungsstellen mit gleich hohem CG-Gehalt einführt. Die experimentellen Bedingungen, geeignet für solch einen Primer, d.h. hohe Annealing-Temperatur (65°C) bei Anwesenheit von 3% denaturierendem Formamid, führt zu einer beachtlichen Reproduzierbarkeit und führte keine größeren quantitativen Änderungen in das Einzelzell-Transcriptom ein. Die Amplifikate aus den aufgeteilten Einzelzell-cDNAs und, als Kontrolle, die cDNA aus 5,000 gepoolten Zellen wurden markiert und mit einem cDNA-Array hybridisiert, das 193 unterschiedliche Gene repräsentiert. Die meisten Transkripte konnten mit beiden Hälften der Einzelzell-Amplifikate nachgewiesen werden (Tab. 3).
Tabelle 3: Genexpressionsmuster von Einzelzellen, die in zwei Pools von cDNA vor umfassender PCR aufgeteilt wurden, verglichen mit gepoolter cDNA von 5000 Zellen. Tabelle 3
Die cDNA von zwei Einzelzellen wurde vor PCR-Amplifizierung aufgeteilt und mit einem cDNA-Pool, der aus 5000 Zellen stammte, verglichen. Alle cDNAs wurden durch umfassende PCR amplifiziert und durch Hybridisierung mit einem cDNA-Array analysiert. Die Genexpressionsprofile der entsprechenden Hälften (1.1 und 1.2; 2.1 und 2.2) werden zum Zellpool (+) nebeneinander gestellt. Die Gene werden gemäß der Signalstärke (je dunkler, desto stärker) und des Nachweises in beiden Hälften derselben Zelle aufgelistet. Der verwendete Filter war Generation 5, Gene und Proteinnamen werden nachstehend aufgelistet (zur Präparation des Generation 5-Filters, s. hier vorstehend (Generation 4-Filter)).
Generation 5 Filter
Insgesamt wurden 148 Signale für die vier cDNA-Hälften erhalten. Von diesen wurden 95 (64%) in den entsprechenden Hälften gefunden, während 53 (36%) nur in einer Hälfte gefunden wurde. Von den 53 einzelnen positiven Signalen repräsentierten 46 (87%) sehr gering vorkommende Transkripte, mit 26 (49%) nicht nachweisbaren und 20 (37%) Zellen nur schwach exprimierten in der Kontrolle der gepoolten Zellen. Sieben Gene (AXL, BAG1, BCL2L1, SHGC-74292, B61, TGFBR2 und ABCC1) wurden ausschließlich in der gepoolten Probe nachgewiesen, jedoch mit einem ziemlich schwachen Signal. Dagegen wurden 33 Gene nur in den Halbzell-Experimenten, aber nicht in der Kontrolle gefunden. Die Signalintensität der beiden Hälften war ziemlich gleich, mit 55% und 76% der Signale, die dieselbe Stärke in den entsprechenden Hälften haben. Signale, die nicht in zwei entsprechenden Hälften identisch waren, können auf eine Nicht-Zufallsverteilung der cDNA-Fragmente vor PCR zurückzuführen sein. Besonders können in geringer Kopienzahl (<10) anwesende Transkripte solch einem Verteilungseffekt unterliegen, welcher jedoch nicht erhalten werden kann, wenn Proben nicht aufgeteilt werden.
Beispiel III: Kombinierte Transcriptom- und Genomanalyse aus Einzelzellen
Ein Verfahren der CGH (vergleichende genomische Hybridisierungs-)Analyse aus Einzelzellen (SCOMP) wurde kürzlich beschrieben (Klein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4494-4499 (1999)). Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Tumorzelle eindeutig durch ihre Chromosomenaberrationen identifiziert werden. Es wurde deswegen versucht, sowohl genomische DNA wie auch mRNA aus derselben Zelle zu isolieren. Isolierte Einzelzellen wurden in 10 μl Lysepuffer (Dynal) lysiert und Röhrchen für 30 Min. rotiert, um mRNA zu gewinnen. 10 μl cDNA-Waschpuffer-1 (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, ergänzt mit 0.5% Igepal enthaltendem (Sigma)) wurde zugegeben und an die Kügelchen gebundene mRNA in cDNA-Waschpuffer-2 (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, ergänzt mit 0.5% Tween-20 (Sigma)) gewaschen, in ein frisches Röhrchen überführt und wieder in cDNA-Waschpuffer-1 gewaschen, um irgendwelche Spuren von LiDS und genomischer DNA zu beseitigen. mRNA wurde mit Superscript II Reverse Transcriptase (Gibco BRL) revers transkribiert unter Verwendung des vom Hersteller gelieferten Puffers, ergänzt mit 500 μM dNTP, 0.25% Igepal, 30 μM Cfl5c8-Primer (5'-(CCC)₅ GTC TAG ANN (N)₈-3') und 15 μM CFL5cT (5'-(CGC)₅ GTC TAG ATT (TTT)₄ TVN, bei 44°C für 45 min. Die Proben wurden während der Reaktion rotiert, um Sedimentation der Kügelchen zu vermeiden. Die verwendeten und in 1 c und d erwähnten Primer waren Cfl5cN6 (5'-(CCG)₅ GTC TAG ANN (N)₆-3') und FL4N6 5'-TTT CTC CTT AAT GTC ACA GAT CTC GAG GAT TTC (N)₆-3') cDNA blieb an die paramagnetischen Kügelchen über die mRNA gebunden und wurde einmal gewaschen im Verlängerungswaschpuffer (50 mM KH₂PO₄, pH 7.0, 1 mM DTT, 0.25% Igepal). Die Kügelchen wurden im Verlängerungspuffer (10 mM KH₂PO₄, pH 7.0, 4 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT, 200 μM GTP) resuspendiert und cDNA-mRNA-Hybride wurden bei 94°C für 4 min denaturiert, abgekühlt auf Eis, 10 U TDT (MBI-Fermentas) zugegeben und bei 37°C für 60 min oder 37°C, 60 min und 22°C über Nacht inkubiert. Nach Inaktivierung des Verlängerungsenzyms (70°C, 5 min) wurde PCR-Mix I, bestehend aus 4 μl Puffer 1 (Roche, Taq lange Matrize), 3% deionisiertes Formamid (Sigma) in einem Volumen von 35 μl, zugegeben. Die Sonden wurden bei 78°C im PCR-Cycler (Perkin Elmer 2400) erhitzt, PCR-Mix II, enthaltend dNTPs bei einer Endkonzentration von 350 μM, CP2-Primer (5'-TCA-GAA-TTC-ATG-CCC-CCC-CCC-CCC-CCC-3', Endkonzentration 1.2 μM) und 5 Einheiten des DNA-Poly-Mix wurde zugegeben, (Roche Taq Long Template) in einem Volumen von 5 μl für eine Heißstartprozedur. Vierzig Zyklen wurden laufen gelassen bei 94°C, 15 s, 65°C, 30°C, 68°C, 2 min für die ersten 20 Zyklen und eine 10 Sek.-Verlängerung der Anbauzeit jedes Zyklus für die verbleibenden 20 Zyklen, und ein letzter Anbauschritt bei 68°C, 7 min. Die in 1 c verwendeten PCR-Primer waren CP3(5'-GCT GAA GTG GCG AAT TCC GAT GCC (C)₁₂-3') und FL4(5'-CTC CTT AAT GTC ACA GAT CTC GAG GAT TTC-3').
Die Überstände aus der Zelllyse und alle Waschschritte (cDNA-Waschpuffer 1 und 2) der mRNA-Isolierung wurden gesammelt (Gesamtvolumen 60 μl). Nach Überführung in ein silanisiertes Röhrchen wurde die genomische DNA über Nacht bei –20°C in Anwesenheit von 20 μg Glykogen (Roche) mit Ethanol ausgefällt. Alle nachfolgenden Schritte wurden durchgeführt, wie veröffentlicht (Klein, (1999), a. a. O.)
Eine größere Besorgnis war die unvollständige Fällung der genomischen DNA, die schließlich zu DNA-Verlusten führt, wie bei Chromosomendeletionen in krebsartigen Zellen gesehen. Jedoch zeigten Experimente mit Zellen von einem definierten Karyotyp deutlich, dass entweder die zelluläre DNA gänzlich verloren ging (30% der Fälle) oder vollständig gefällt wurde (70%) (Daten nicht gezeigt). Die vollständige Gewinnung von genomischer DNA kann auf der Tatsache beruhen, dass Interphasenchromosomen weitgehend verflochten sind, so dass entweder alles oder nichts gefällt wird. Der Verlust von vollständiger DNA wird wahrscheinlich durch die Änderung der Reaktionsröhrchen während der Trennung von genomischer DNA und mRNA eingeführt. Die Karyotypen von zwei normalen und zwei MCF-7-Brustkrebszellen, deren DNA gefällt worden war, werden in 3 gezeigt. Die Profile der zwei normalen Zellen zeigten keine signifikante Abweichung von der mittleren Linie, während multiple genomische Aberrationen von zwei MCF-F7-Zellen fast identisch waren. Daher können maligne EpCAM-positive Zellen durch ihren genomischen Phänotyp von normalen EpCAM-positiven Zellen im Knochenmark eindeutig unterschieden werden. Dies ist von besonderer Wichtigkeit, da EpCAM-Expression ein unzureichender Beweis für die (maligne) Identität von Tumorzelle(n) in Knochenmarkproben ist. Es soll beachtet werden, dass gesunde Spender auch 0.5-5%₀ „3 3B1O-C9-positive Zellen zeigten (3B10-C9, Prof. Judy Johnson, Institut für Immunologie, München) ist ein mAB von hoher Affinität gegen EpCAM), wenn durch Immunfluoreszenz bestimmt.
Beispiel IV: Aktivitätsbezogene Genexpression in drei mikrometastatischen Zellen
Einzelne Tumorzellen wurden aus drei Patienten mit unterschiedlichen Tumoren und Krankheitsstadien isoliert. Die erste Patientin (C) hatte eine 10jährige Vorgeschichte von Zervixkarzinom und stellte sich mit einem verdächtigen Befund bei Röntgenaufnahme des Brustraumes vor. Beim zweiten Patienten (L) wurde kürzlich ein Adenokarzinom der Lunge diagnostiziert, welches postoperativ als pT2, N3, M0 eingestuft wurde. Die Knochenmarksprobe wurde während der Narkose vor der Operation erhalten. Die dritte Probe wurde aus dem Beckenkamm einer 31 Jahre alten Brustkrebspatientin (B) abgesaugt, deren Erkrankung im Stadium pT1a, pN1a (1/18), M0 war. Wegen eines lokalen Rezidivs, des histologischen G3-Gradings und des Befunds einer Cytokeratin-positiven Zelle im Knochenmark, erhielt diese Patientin hoch dosierte Chemotherapie (HD). Die Knochenmarksprobe wurde einen Monat nach Abschluss der HD genommen. SCOMP wurde bei allen drei Zellen durchgeführt und zeigte vielfache Chromosomenaberrationen, welche den krebsartigen Ursprung der Zellen verifizierten (Tab. 4).
Tabelle 4: Genomische Aberrationen von 3B10-C9-positive Zellen, isoliert aus Knochenmark von drei Patienten mit Zervixkarzinom (C), Lungenkrebs (L) und Brustkrebs (B). Tabelle 4
Zusammenfassung der CGH-Daten, erhalten aus den drei mikrometastatischen Zellen. Verluste (L) und Gewinne (G) auf dem kurzen (p) und langen (q) Arm jedes Chromosoms sind für jede Zelle gegeben.
Die Zelle von Patient B, der die am wenigsten fortgeschrittene Erkrankung hatte, zeigte das geringste Ausmaß von Chromosomenänderungen (4).
mRNA wurde aus allen drei Zellen isoliert und Proben für SCAGE hergestellt, wie voranstehend beschrieben. Als Kontrolle wurde die Prozedur ohne die Zugabe einer Zelle durchgeführt. cDNA-Amplifikate wurden mit Clontech Cancer 1.2 Filter und mit neu hergestellten Arrays (Axxima A6, Martinsried), umfassend insgesamt 1,300 Gene, hybridisiert.
Nicht radioaktive Hybridisierung mit Nylonfiltern wurde, wie folgt, ausgeführt:
15 ng der unterschiedlichen PCR-amplifizierten und subclonierten cDNA-Fragmente wurden auf positiv geladene Nylonfilter von Axxima AG, Martinsried, getüpfelt. Die Filter wurden über Nacht bei Anwesenheit von 50 μg/ml E. coli- und 50 μg/ml pBS-DNA in 6 ml Dig Easy Hyb-Puffer (Roche Biochemicals) vorhybridisiert. 9 μg markierte PCR-Produkte aus Einzelzellen wurden mit 100 μg Heringssperma, 300 μg genomischer DNA von E. coli und 300 μg gemischt, für 5 min bei 94°C denaturiert, zu 6 ml Dig Easy-Hybridisierungspuffer zugegeben und für 36 Stunden hybridisiert. Stringenz-Waschungen wurden durchgeführt gemäß dem Roche-Digoxigenin-Hybridisierungsprotokoll unter Zugabe von zwei letzten Stringenz-Waschungen in 0.1 × SSC + 0.1% SDS für 15 min bei 68°C. Der Nachweis der an Filter gebundenen Sonden wurde durchgeführt, gemäß dem Digoxigenin-Nachweis-Systemprotokoll, geliefert mit dem Kit (Roche).
Nur drei Gene mussten von der Analyse ausgeschlossen werden, weil ein Signal bei mindestens einer der Negativkontrollen erhalten wurde. Diese Gene waren VHL-bindendes Protein, Caspase 10, TGF-β und Hämoglobin α. Die Zahl der positiven Zellen erstreckte sich von 5.3% (70/1313), 7.0% (92/1313) bis 11.8% (155/1313) für Zellen von Patienten B, C und L, jeweils. Diese Zahlen waren wesentlich geringer als jene aus in vitro-gewachsenen Karzinom-Einzelzellen, wo Signale mit 10-20% der Gene erhalten wurden (Daten nicht gezeigt). Alle drei Tumorzellen exprimierten Gene, die bekannterweise eine Rolle bei der Regulation von Vermehrung, Replikation oder Wachstumsarretierung spielen (5; Tab. 5).
Tabelle 5: Hochregulierte Gene, impliziert im Zellzyklus-Status in Zellen C, L und B. Tabelle 5
Zellen C und B exprimierten mehrere positive Regler des Zellzyklus, während nur B und L Zellzyklusinhibitoren exprimierten.
Zelle C exprimierte die höchste Anzahl von für den Zellzyklusablauf wichtigen Genen, einschließlich Cyclin A (CCNA), EB1, RC2, P2G4, PIN1, RBBP4 und CENPF. Da die meisten dieser Gene straft transkriptionell reguliert und ihre mRNAs schnell abgebaut werden, wenn die Zellteilung fortschreitet, zeigt ihre Expression nicht nur an, dass Zelle C am Zyklus beteiligt war, sondern bei dieser Aktivität durch SCAGE genau gewonnen werden kann.
Zelle B exprimierte eine Anzahl von für die Replikation sowie für die Zellzyklusinhibition wichtigen Genen. Das Muster der Transkripte weist darauf hin, dass die Zelle in einem Zustand von DNA-Reparatur war. Die Coexpression von GADD45 (DDIT1) und p21 (CDKN1A) sind indikativ für Wachstumsarretierung (Smith, Science, 266, 1376-1380 (1994)). Ebenso wurde die Expression von positiven Zellzyklusreglern wie DNA-PK, RFC2, LIG1, ADPRT und PRIM1 in DNA-Reparatur einbezogen (Lindahl, Science, 286, 1897-1905 (1999); Barnes, Cell, 69, 495-503 (1992), Mossi, Eur. J. Biochem., 254, 209-216 (1998); Lee, Mol. Cell Biol. 17, 1425-1433 (1997)). Da diese Zelle eine alkylierende, genotoxisch hoch dosierte Chemotherapie überlebte, kann ihr Expressionsprofil interpretiert werden, als ob Wiedereintritt in den Zellzyklus umgangen wurde. Diese Interpretation wird durch die Expression von pro-apoptotischen Genen wie Caspase-6 und BAD gestützt, die nur in dieser Zelle gefunden wurden. Der Ausführung der Apoptose bei dieser Zelle kann jedoch durch Expression von Survivin (ApI4) entgegengewirkt werden (5; Tab. 5).
Das aus Zelle L erhaltene Transcriptom zeigte mit ihrer Beschäftigung in Dissemination und EMT kompatible Merkmale. Während die Genexpression von Zelle L nicht der einer periodisch durchlaufenden oder DNA-reparierenden Zelle ähnelte (s. voranstehend), sind ihre 84 unterschiedlich exprimierten Gene zumeist bei zytoskelettaler Reorganisation, Zelladhesion und extrazellulärer proteolytischer Aktivität beteiligt (Tab. 6; 6).
Tabelle 6: Hochregulierte Gene in Zelle L, indikativ für einen invasiven Phänotyp. Tabelle 6
Die vorliegende Studie analysierte zum ersten Mal zelluläre Aktivitäten von einzelnen Tumorzellen, die aus dem Knochenmark von Krebspatienten stammten. Zelle C stammte von einer Zervixkarzinompatientin, die sich mit Lungenmetastase nach einer zehnjährigen latenten Periode vorstellte. Diese Zelle wurde in Proliferation gefunden. Zelle B war aus Knochenmark einer Brustkrebspatientin mit einem ziemlich kleinen Primärkrebs, die wegen der offenkundigen Aggressivität ihres Tumors hoch dosierte Chemotherapie erhalten hatte. Diese Zelle zeigte relativ wenige und diskrete genomische Änderungen, ein Befund, der im Hinblick auf die für Dissemination erforderlichen genomischen Änderungen von besonderem Interesse ist. Des Weiteren muss diese Zelle vier Zyklen von regulärer Chemotherapie, bestehend aus Epirubicin und Taxol zusätzlich zu einer hoch dosierten Chemotherapie-Kur unter Beteiligung von alkylierenden Agenzien, überlebt haben. Das erhaltene Expressionsprofil ist diagnostisch für Wachstumsarretierung und laufende DNA-Reparatur.
Am meisten informativ hinsichtlich des Prozesses der Dissemination war das Transcriptom von Zelle L. Nachgewiesen bei einem Bronchialkrebs-Patienten ohne klinisch offensichtlicher Metastase, exprimierte die Zelle viele Gene, die für Proteine codieren, die an aktiver Migration und Invasion beteiligt sind. Das meiste der Aktivierungskaskade des uPA-Systems wurde exprimiert gefunden, bestehend aus dem Cathepsin B, D, L, dem uPA-Rezeptor und uPA selbst. Ebenso wurden Gene, beteiligt an der Organisation von Filopodien, Lamellipodien und Stressfasern, die Rho-Familienmitglieder RhoA und B, Rac1, Cdc42 und p160-Fels, und Gene, die für mehrere Adhesionsmoleküle codieren, in dieser Zelle hochreguliert. Ihr Zytoskelett schien sich Remodellierung zu unterziehen, wie durch Expression von vielen Cytokeratinen und Vimentin, einem Marker für EMT, gezeigt.
Es ist beachtenswert, dass die Zahl der Transkripte in Einzelzellen, isoliert aus kultivierten Zelllinien, wesentlich geringer war als die aus Tumorzellen, die vom Patienten stammten. Dieser Unterschied kann für eine straffere in vivo-Kontrolle der Transkription sprechen, die entspannter werden kann, wenn Zellen in Zellkultur gezüchtet werden, z.B. durch gesteigerte DNA-Demethylierung. Expressionsanalyse von ex vivo-Proben kann deswegen viel informativer sein als Studien an Zelllinien. Die minimale Zahl von Zellen, die bisher für cDNA-Array-Analyse verwendet wurden, war im Bereich von 1,000 Zellen (Luo (1999), a. a. O.). Die Empfindlichkeit der Array-Hybridisierung kann durch längere immobilisierte cDNA-Fragmente (Fragmentlänge auf Clontech-Arrays ist etwa 200 bp) weiter gesteigert, und die Menge an Information durch Verwendung von Glaschips mit höherer Dichte und Komplexität erhalten werden. Obwohl die vorliegende Studie nur 1,300 Gene analysierte, soll man bedenken, dass Expression von nur neun Proteinen bisher für mikrometastatische Zellen berichtet wurde. Diese Proteine sind ErbB2, Transferrin-Rezeptor, MHC Klasse I, EpCAM, ICAM-1, Plakoglobin, Ki-67, p120 und uPA-Rezeptor/CD87 (Pantel, J. Natl. Canc. Inst. 91, 1113-1124 (1999)).
Das hier beschriebene Verfahren hat das Potential für die Studie von Genexpression durch seltene Zellen auf vielen anderen Gebieten (wie hierin nachstehend gezeigt; zum Beispiel bei der Erforschung von menschlichem restenotischem Gewebe). Zum Beispiel könnte die Erforschung von räumlich und zeitlich regulierter Genexpression bei Embryogenese und der Analyse von Stammzellen und differenzierten Zellen in erwachsenen Geweben durchgeführt werden. Einzelzell-Analyse würde das Verständnis von atypischer Proliferation, Metaplasie, präneoplastische Läsionen und Carcinomata in situ außerordentlich fördern.
Eine Übersicht der genomischen Aberrationen und der Expressionsprofile derselben Zelle kann die Möglichkeiten von unterschiedlichen Genotypen und Phänotyp innerhalb einer Tumorzellpopulation enthüllen.
Herangehensweisen mit hoch-dosierter Chemotherapie, Chirurgie und antiangiogener Therapie können auf sich schnell teilende Zellen und große Tumormassen abzielen, aber sind ineffektiv bei der Entfernung von restlichen Zellen, die zu minimaler verbleibender Erkrankung führen. Adjuvante Therapien, wie Antikörper-basierende Herangehensweisen Riethmuller, J. Clin. Oncol., 16, 1788-1794 (1998) basieren noch auf Proteinzielen, die auf dem Primärtumor identifiziert wurden. Die hier gezeigte Herangehensweise stellt nun eine Gelegenheit bereit, Ziele für minimale verbleibende Erkrankung durch direkte Analyse der mikrometastatischen Zellen zu entdecken.
Beispiel V: Abweichende Genexpression in menschlichem restenotischem Gewebe
Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde darüber hinaus verwendet, um unterschiedlich exprimierte Gene im menschlichen restenotischen Gewebe nachzuweisen.
Eine hohe Quote von Restenose beschränkt signifikant den Erfolg von perkutaner transluminaler Koronarangioplastie mit nachfolgender Stent-Implantation als eine häufige Behandlung von atherosklerotischer Erkrankung der Kranzarterie. Obwohl mehrere zelluläre und molekulare Mechanismen bei der Entwicklung von In-Stent-Restenose identifiziert wurden, sind spezifische Ziele für eine effektive therapeutische Verhinderung der Restenose noch selten. In dieser Studie wurden unterschiedlich exprimierte Gene in einer mikroskopischen Atherektomie-Probe aus menschlicher In-Stent-Restenose identifiziert. Die Immunohistochemie zeigte, dass das restenotische Material hauptsächlich aus glatten Muskelzellen (SMC) mit seltenen Infiltraten von mononuklearen Zellen bestand. cDNA-Proben, präpariert aus restenotischem Exemplaren (n=10) und als Kontrolle aus Intima und Media von gesunden Muskelarterien (n=10) wurden unter Verwendung eines neuen Polymerase-Ketten-Reaktionsprotokolls amplifiziert und zur Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen mit cDNA-Arrays hybridisiert. Die Expression von Desmin und aus Brust stammendem Wachstumsfaktor wurde herunterreguliert, während gefunden wurde, dass die Expression von FK506-Bindungsprotein 12 (FKBP 12), Thrombospondin-1, Prostaglandin G/H-Synthase-1 und das 70-kDa-Hitzeschockprotein B in menschlicher Neointima mit hoher statistischer Signifikanz hochreguliert wurde. Unter Verwendung von Immunhistochemie wurde FKBP12, ein negativer Regler der TGF-β-Signalwirkung, auch zum Protein-Niveau in Neointima hochreguliert, was ein Grundprinzip für den therapeutischen Effekt des FKB12-Liganden Rapamycin bei der Behandlung eines Schweine-Restenosemodell bereitstellt.
Um weiteren Einblick in transkriptionelle und Signalwirkungsereignisse zu gewinnen, welche die Migration von glatten Muskelzellen, Proliferation und Synthese von extrazellulärer Matrix lenken, wurde ein Screening von unterschiedlicher Genexpression unter Verwendung der cDNA-Array-Methode mit Sonden, hergestellt aus mikroskopischem Exemplaren von menschlichem restenotischem Gewebe, angewendet. Die Leistung dieser Technologie ist die Fähigkeit, in einer Probe die Expression Tausender von Genen gleichzeitig zu studieren (Kurian, (1999) J Pathol 187:267-271). Eine frühere Hürde der Anwendung dieses Verfahrens war der Bedarf von Mikrogramm-Mengen an mRNA oder cRNA aus Proben, die üblicherweise aus 10⁶-10⁷ Zellen zusammengesetzt sind. Hier wurde die neue Technik verwendet, wie hier vorstehend beschrieben. Diese ermöglichte die Herstellung von repräsentativen cDNA-Amplifikaten aus einer Einzelzelle oder einer geringen Zahl von Zellen in Mengen, die ausreichend für eine reichhaltige cDNA-Hybridisierung sind.
10 Proben von jedem neointimaler und stiller Media für die Expression von 2,435 Genen von bekannter Funktion. Während die Expression von Haushaltsgenen zwischen normalen und restenotischem Gewebe weitgehend vergleichbar war, zeigten nahezu 10 Prozent der untersuchten Gene ein gesteigertes oder vermindertes Expressionsniveau. In der vorliegenden Studie wurde es auf ausgewählte Gene konzentriert, die früher mit Restenose assoziiert wurden. Desmin- und aus Brust stammender Wachstumsfaktorinhibitor (MDGI)-Expression wurde selektiv herunterreguliert, während gefunden wurde, dass die Expression von Prostaglandin G/H-Synthase-1 (COX-1), Thrombospondin-1 (TSP-1), Hitzeschock-Protein-70B (hsp70B) und FK506-bindendem Protein 12 (FKBP12) bei Hyperplasie der menschlichen Neointima hochreguliert wurde. Diese Befunde wurden alle durch genspezifische PCR bestätigt. Um die Signifikanz von gesteigerter Genexpression in Neointima zu untersuchen, wurde erforscht, ob gesteigerte mRNA-Niveaus ihre Widerspiegelung in einem gesteigerten Proteinniveau finden. Wie mit FKBP12 unter Verwendung von Immunhistochemie veranschaulicht, wurde in der Tat eine starke Überexprimierung des Reglers der TGF-β-Signalwirkung in restenotischem Gewebe gefunden. Diese Studie zeigt, dass die cDNA-Array-Technologie verwendet werden kann, um unterschiedlich exprimierte Gene in gesundem und kranken menschlichem Gewebe verlässlich zu identifizieren, sogar wenn nur sehr kleine Materialmengen verfügbar sind.
Die Gruppe der In-Stent-Restenose-Studie bestand aus 13 Patienten, die sich separaten Atherektomie-Verfahren durch Helix-Cutter-Atherektomievorrichtung (X-Sizer, Endicor) innerhalb des wieder eingeengten Stents zwischen 4-23 Monaten nach primärer Stent-Implantation unterzogen. Alle Patienten gaben nach Information Zustimmung zur Prozedur und erhielten 15,000 Einheiten Heparin vor dem Eingriff, gefolgt von intravenöser Heparin-Infusion, 1,000 Einheiten/h für die ersten 12 h nach Entfernung des Sheats als Standardbehandlung. Alle Patienten erhielten Aspirin, 500 mg intravenös, vor der Katheterisierung, und postinterventionelle antithrombotische Behandlung während der ganzen Studie, die aus Ticlopidin (250 mg bds) und Aspirin (100 mg bds) bestand.
Die Probenherstellung wurde, wie folgt, ausgeführt:
Die Atherektomie-Probe wurde nach Debulking der Läsion unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis die mRNA-Präparation ausgeführt wurde, wie beschrieben. Für Histologie und Immunhistochemie des In-Stent-restenotischen Gewebes aus Kranzarterien (n=3) wurden die Proben in 4% Paraformaledehyd fixiert und in Paraffin eingebettet, wie beschrieben.
Die Kontrollgruppe bestand aus 5 Proben von Muskelarterien des Gastrointestinaltrakts von fünf unterschiedlichen Patienten und 5 Proben aus Kranzarterien von drei unterschiedlichen Patienten, die sich einer Herztransplantation unterzogen. Die Kontrollproben wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren. Vor der mRNA-Präparation wurden Media und Intima der Kontrollarterien präpariert und durch Immunhistochemie auf atherosklerotische Änderungen untersucht. Wenn es keine atherosklerotischen Änderungen der Gefäßmorphologie gab, wurden die Proben (ca. 1×1 mm) als gesunde Kontrollproben verwendet und mRNA- und cDNA-Präparation wurden, wie beschrieben, durchgeführt.
Für Immunhistochemie von FKBP12 wurden Neointima-Proben von restenotischer Halsschlagader (n=2) durch Atherektomie erhalten und nach der Entfernung unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren. Drei 3 μm-serielle Gefrierschnitte der Proben wurden auf DAKO ChemMate^TM Capillary Gap Microscope Objektträger (100 μm) aufgebracht.
Präparation von mRNA und amplifizierter cDNA wurde, wie folgt, ausgeführt:
Proben von ruhenden Gefäßen oder In-Stent restenotischem Gewebe wurden schnell eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis die mRNA-Präparation und cDNA-Synthese durchgeführt wurden. Gefrorenes Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff zermahlen und das gefrorene Pulver in Lyse/Bindungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 1% LiDS, 5 mM Dithiothreit (DTT)) gelöst und homogenisiert, bis vollständige Lyse erhalten wurde. Das Lysat wurde für 5 min bei 10,000 g bei 4°C zentrifugiert, um Zelltrümmer zu beseitigen. mRNA wurde unter Verwendung des Dynbeads^® mRNA Direct Kit^TM (Dynal, Deutschland) in Anlehnung an die Empfehlung des Herstellers präpariert. Kurz, das Lysat wurde zu 50 μL vorgewaschene Dynabeads Oligo (dT)₂₅ pro Probe zugegeben und mRNA wurde unter Rotieren auf einem Mixer für 30 min bei 4°C anneliert. Der Überstand wurde entfernt und der Dynabeads Oligo (dT)₂₅/mRNA-Komplex wurde zweimal mit Waschpuffer, der Igepal enthielt (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 025% Igepal), gewaschen und einmal mit Waschpuffer, der Tween-20 enthielt (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 0.5% Tween-20).
cDNA wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung des Verfahrens, wie hier vorstehend beschrieben. Die cDNA-Synthese des ersten Strangs wurde als Festphasen-cDNA-Synthese durchgeführt. Eine Zufalls-Initialreaktion mit Hexanucleotid-Primern wurde für die reverse Transkriptionsreaktion verwendet. mRNAs wurden jeweils revers transkribiert in einem 20 μL-Reaktionsvolumen, das 1 × First Strand Buffer (Gibco); 0.01 M DTT (Gibco), 0.25% Igepal, 50 μM CFL5c-Primer [5'-(CCC)₅ GTC TAG A (NNN)₂-3'], jeweils 0.5 mM dNTPs (MBI Fermentas) und 200 U Superscript II (Gibco) enthielt, und bei 44°C für 45 min inkubiert. Eine nachfolgende Verlängerungsreaktion wurde in einem Reaktionsvolumen von 10 μL durchgeführt, das 4 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT, 0.2 mM dGTP, 10 mM KH₂PO₄ und 10 U terminaler Desoxynucleotid-Transferase (MBI Fermentas) enthielt. Die Mischung wurde für 24 min bei 37°C inkubiert.
cDNA wurde amplifiziert durch PCR in einem Reaktionsvolumen von 50 μL, das 1 × Puffer 1 (Expand^TM Long Template PCR Kit, Boehringer Mannheim), 3% deionisiertes Formamid, 1,2 μM CP2-Primer [5'-TCA GAA TTC ATG (CCC)₅-3'] 350 μM dNTP und 4.5 U DNA-Polymerase-Mix (Expand^TM Long Template PCR Kit, Roche Diagnostics, Mannheim) enthielt. Die PCR-Reaktion wurde für 20 Zyklen mit den folgenden Zyklusparametern durchgeführt: 94°C für 15 s, 65°C für 0:30 min, 68°C für 2 min; weitere 20 Zyklen mit: 94°C für 15 s, 65°C für 30 s, 68°C für 2:30 + 0:10/Zyklus min; 68°C 7 min; andauernd 4°C.
25 ng von jeder cDNA wurden mit Digoxigenin-11-dUTP (Dig-dUTP) (Roche Diagnostics) während der PCR markiert. Die PCR wurde in einer 50 μL-Reaktion mit 1 × Puffer 1, 120 μM CP2-Primer, 3% deionisiertem Formamid, 300 μM dTTP, 350 μM dATP, 350 μM dGTP, 350 μM dCTP, 50 μM Dig-dUTP, 4.5 U DNA-Polymerase-Mix durchgeführt. Zyklusparameter waren: ein Zyklus: 94°C für 2 min; 15 Zyklen: 94°C für 15 s, 63°C für 15 s, 68°C für 2 min; 10 Zyklen: 94°C für 15 s, 68°C für 3 min + 5 s/Zyklus; ein Zyklus: 68°C, 7 min, andauernd 4°C.
Die Hybridiserung von Clontech-cDNA-Arrays mit dUTP-markierten cDNA-Sonden wurde, wie folgt, ausgeführt:
cDNA-Arrays wurden vorhybridisiert in DigEASYHyb-Lösung (Roche Diagnostics), die 50 mg/L DNAsel (Roche Diagnostics) verdaute genomische E. coli-DNA, 50 mg/L pBluescript-Plasmid-DNA und 15 mg/L Heringssperma-DNA (Life Technologies) enthielt, für 12h bei 44°C, um durch Blockierung nicht-spezifische Nucleinsäure-Bindungsstellen auf der Membran zu verringern. Die Hybridisierungslösung wurde mit kommerziell erhältlichen cDNA-Arrays mit ausgewählten Genen, relevant für Krebs, kardiovaskuläre und Stressreaktion (Clontech), hybridisiert. Jede cDNA-Matrize wurde denaturiert und zur Vorhybridisierungslösung bei einer Konzentration von 5 μg/ml Dig-dUTP markierter cDNA zugegeben. Die Hybridisierung wurde für 48 Stunden bei 44°C durchgeführt.
Blots wurden nachfolgend einmal in 2 × SSC/0.1% SDS und einmal in 1 × SSC/0.1% SDS bei 68°C gespült, gefolgt von Waschung für 15 min einmal in 0.5 × SSC/0.1 SDS und zweimal für 30min in 0.1 × SSC/0.1%SDS bei 68°C. Zum Nachweis von Dig-markierter cDNA, hybridisiert mit dem Array, wurde der Dig Luminescent Detection Kit (Boehringer, Mannheim) verwendet, wie im Benutzerhandbuch beschrieben. Zum Nachweis des Chemilumineszenz-Signals wurden Arrays Chemilumineszenz-Filmen für 30 min bei Raumtemperatur ausgesetzt. Die Quantifizierung der Array-Daten wurde durch Scannen der Filme und Analyse mit Array-Visionssoftware (Imaging Research Inc., St. Catherines, Canada) durchgeführt. Der Hintergrund wurde subtrahiert und die Signale wurden auf neun Haushaltsgene, anwesend auf jedem Filter, normalisiert, wobei der Durchschnitt der Haushaltsgen-Expressionssignale auf 1 gesetzt und der Hintergrund auf 0 gesetzt wurde. In einer Teststudie wurden sechs in eine der zwei Sonden angereicherte Clone weiter durch RT-PCR analysiert.
Ergebnisse der experimentellen Studien wurden als Durchschnittexpressionswerte der zehn untersuchten Proben der Studie oder Kontrollgruppe berichtet. Unterschiede zwischen den zwei Patientengruppen wurden durch Wilcoxon-Test (SPSS Version 8.0) analysiert. Ein p-Wert von weniger als 0.03 wurde als signifikant betrachtet.
Eine Auswahl von unterschiedlichen Hybridisierungssignalen wurde durch PCR unter Verwendung von genspezifischen Primern bestätigt. PCR-Reaktionen wurden durchgeführt unter Verwendung von 2.5 ng jeder cDNA in 25 μl-Reaktion, enthaltend 1 × PCR-Puffer (Sigma), 200 μM dNTPs, 0.1 μM von jedem Primer und 0.75 U Taq-Polymerase (Sigma). Die folgenden Primer wurden verwendet: Desmin, 5'-ACG ATT CCC TGA TGA GGC AG-3' und 5'-CCA TCT TCA CGT TGA GCA GG-3'; Thrombospondin-1, 5'-CTG AGA CGC CAT CTG TAG GCG GTG-3' und 5'-GTC TTT GGC TAC CAG TCC AGC AGC-5';
aus Brust stammender Wachstumsinhibitor 5'- AAG AGA CCA CAC TTG TGC GG-3' und
PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel unterzogen, das Ethidiumbromid (0.5 μg/ml Agaroselösung) in TAE-Puffer (20 mM Tris/HCl, 10 mM Essigsäure, 1 mM EDTA) enthielt.
Immunhistochemie wurde ausgeführt, wie folgt:
Immunhistochemie zur Zelltypisierung wurde an Paraffin-eingebetteten Schnitten von drei Neointima-Proben aus koronarer In-Stent-Restenose und zum Nachweis von FKBP12 an Gefrierschnitten von vier Neointima-Proben von einer Restenose der Halsschlagader durchgeführt. Drei μm-serielle Schnitte wurden auf DAKO ChemMate^TM Capillary Gap Microcope Objektträger (100 μm) aufgebracht, die über Nacht bei 65°C gebacken, deparaffiniert und gemäß Standardprotokollen entwässert wurden. Zum Auffinden von Antigen wurden die Proben 4 min in einem Druckkocher in Citratpuffer (10 mM, pH 6.0) gekocht. Endogene Peroxidase wurde blockiert durch 1% H₂O₂/Methanol für 15 Minuten. Unspezifische Bindung des primären Antikörpers wurde durch Vorinkubation der Objektträger mit 4% getrockneter Magermilch in Antibody Diluent (DAKO, Dänemark) reduziert. Immunfärbung wurde durch die Streptavidin-Peroxidase-Methode unter Verwendung des ChemMate Detection Kits HRP/Red Rabbit/Mouse (DAKO, Dänemark) gemäß der Hersteller-Beschreibung durchgeführt. Die Prozeduren wurden in einem DAKO TechMate^TM 500 Plus-automatisierten Färbesystem ausgeführt. Primäre Antikörper gegen Actin aus glattem Muskel (M0635, DAKO, Dänemark; 1:300), CD3 (A0452, DAKO, Dänemark; 1:80), MAC387 (E026, Camon, Deutschland; 1:20) und FKB12 (SA-218, Biomol, Deutschland, 1:20) wurden in Antibody Diluent verdünnt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Kerngegenfärbung mit Hematoxylin wurden die Objektträger entwässert und mit Pertex (Medite, Deutschland) abgedeckt.
Für die FKBP12-Immunhistochemie wurden 3-μm serielle Gefrierschnitte der Neointima-Probe von einer Restenose der Halsschlagader auf DAKO ChemMate^TM Capillary Gap Microscope-Objektträger (100 μm) aufgebracht.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
(a) Die zelluläre Zusammensetzung von In-Stent-restenotischem Material nach Debulking-Behandlung
Repräsentative Proben, erhalten aus X-Sizer-Behandlung einer neointimalen Hyperplasie wurden durch Immunhistochemie analysiert, um ihre zelluläre Zusammensetzung zu bestimmen. Das analysierte restenotische Gewebe wurde durch X-Sizer-Debulking aus Kranzarterien mehr als zwei Monate nach PTCA und Stent-Implantation entfernt. Die Menge des durch diese Prozedur hergestellten Gewebes war sehr gering, und enthielt abgeschätzt 300-10000 Zellen. 7A zeigt eine E.-van-Giesson-Färbung eines Schnitts, geschnitten von einer kleinen Probe von restenotischem Material nach Debulking-Behandlung. Mit dieser Färbeprozedur färben Kollagenfasern rot, Fibrin färbt gelb und Cytoplasma von glatten Muskelzellen färbt dunkel-gelb-braun. Die Mehrheit des Volumens von Material nach Debulking-Behandlung war aus losen extrazelluläre Matrix-ähnlichen Kollagenfasern, gefärbt in hellrot, zusammengesetzt. Gelbe Fibrinfärbung war kaum nachweisbar. Zellen mit spindelförmigen Kernen und einem gelb/braun-gefärbten Cytoplasma waren häufig. Ihre Identität als glatte Muskelzellen und ihre hohe Häufigkeit in restenotischem Material wurde durch Immunfärbung mit einem Antikörper gegen α-Actin von glatten Muskelzellen gestützt (7B). Dort wird das Färbemuster eines Schnitts aus einer ganzen Probe gezeigt, wie für eine Genexpressionsanalyse verwendet. Wie nachstehend beschrieben, ergaben solche Proben auch ein starkes für den glatten Muskel-spezifisches α-Actin-mRNA-Signal (s. 8). Diese Ergebnisse stützen Befunde aus früheren Studien (Komatsu, (1998), Circulation 98:224-233; Strauss (1992), J. Am. Coll. Cardiol. 20:1465-1473; Kearney (1997), Circulation 95:1998-2002), welche zeigen, dass der in Neointima gefundene Hauptzelltyp aus glatten Muskelzellen stammt. Wie in der Literatur beschrieben, konnten mononucleare Infiltrate in einigen Bereichen einer Probe von restenotischem Gewebe nach Debulking-Behandlung auch identifiziert werden (Daten nicht gezeigt). Diese Infiltrate bestanden hauptsächlich aus Makrophagen und zu einem geringeren Grad aus T-Lymphozyten. Keine B-Lymphozyten waren im restenotischen Gewebe unter Verwendung eines Antikörpers gegen CD20 zur immunhistochemischen Färbung nachweisbar (Daten nicht gezeigt).
(b) Expression von spezifischen Genen in mikroskopischen menschlichen Gewebeproben
Um optimalerweise die in situ mRNA-Niveaus zu bewahren, wurden restenotische und Kontrollproben unmittelbar nach der Ernte in flüssigem Stickstoff eingefroren und sorgfältig lysiert, wie hierin vorstehend beschrieben. Nach PCR-Amplifizierung der synthetisierten cDNA wurde die Menge der amplifizierten cDNA durch einen Dot-Blot-Assay gemessen und gefunden, dass sie zwischen 200-300 ng/μl ist. Die Qualität jeder amplifizierten cDNA-Probe wurde durch genspezifische PCR getestet unter Verwendung von Primern, die cDNAs für β-Actin, α-Actin aus glatten Muskelzellen und den ubiquitären Elongationsfaktor EF-1α nachweisen. 8 zeigt ein repräsentatives Ergebnis mit Material aus Patient B und Kontrollmedia aus Spender b. Bei beiden Proben waren PCR-Signale von korrekter Größe von Haushaltsgenen α-Actin und EF-1α in equivalenten Mengen nachweisbar (vgl. Spuren 1 und 2 mit Spuren 4 und 5). Zusätzlich wurden α-Actin-Signale als Marker für glatte Muskelzellen von jeder Probe erhalten (Spuren 3 und 6). Diese Ergebnisse zeigen, dass mRNA-Präparation, cDNA-Synthese und PCR-Amplifizierung von cDNA mit mikroskopischen menschlichen Restenose-Proben durchführbar ist.
(c) Vergleichendes Genexpressionsprofil unter Verwendung von mikroskopischen menschlichen Gewebeproben
Um unterschiedlich exprimierte mRNAs bei restenotischem versus gesunden Proben zu identifizieren, wurden cDNAs während der PCR-Amplifizierung mit Digoxigenin-markiertem dUTP markiert, wie hierin vorstehend beschrieben. Diese Markierung ermöglicht einen hoch empfindlichen Chemiluminszenz basierenden Nachweis von Hybridisierungssignalen von cDNA-Arrays auf fotografischen Filmen. Die Nylonfilter mit cDNA-Arrays wurden mit DNAsel-verdauter genomischen E. coli-DNA und mit DNAsel-verdauter pBluescript-Plasmid-DNA vorhybridisiert. Diese Prozedur wurde angewendet, um nichtspezifische DNA-Bindung zum Array maximal zu reduzieren. Jede markierte Probe wurde mit drei unterschiedlichen kommerziellen cDNA-Arrays hybridisiert, welche die Expressionsanalyse von insgesamt 2,435 bekannten Genen ermöglichte. 9 zeigt ein repräsentatives Hybridisierungsmuster, erhalten aus einem Array unter Verwendung der Sonden, präpariert aus restenotischem Gewebe von Patient B (Tafel A) und Media von Spender b (Tafel B). Im Einklang mit der in 8 gezeigten genspezifischen Analyse wurden vergleichbare Hybridisierungssignale mit der Positivkontrolle von menschlicher genomischer cDNA erhalten, die auf die rechten und unteren Spuren des Arrays getüpfelt worden waren und mit cDNA-Flecken von verschiedenen Haushaltsgenen (s. zum Beispiel Fleck D). Wenn eine biologische Probe bei der cDNA-Synthese und den PCR-Amplifizierungsreaktionen ausgelassen wurde, wurden fast keine Hybridisierungssignale erhalten (9, Tafel C), was zeigt, dass Hybridisierungssignale fast ausschließlich von zugegebenen Proben stammten und nicht aus DNA-Verunreinigungen in verwendeten Reagenzien oder Materialien.
Die Sichtprüfung der Hybridisierungsmuster identifizierte leicht eine Zahl von Signalen, die zwischen gesundem und krankem Gewebe unterschiedlich waren (zum Beispiel Signale A, B und C in 9A und B). Proben aus restenotischem Gewebe gaben einheitlich mehr Signale als Kontrollgewebe. Hybridisierungssignale, die bei der Verwendung von drei unterschiedlichen cDNA-Arrays mit 10 Restenose-Patientenproben und 10 normalen Media-Proben erhalten wurden, wurden durch densitometrische Analyse von fotografischen Filmen quantifiziert und die Daten elektronisch erstellt und für Statistiken weiter analysiert. Expressionsniveaus für 53 von 2,435 Genen werden in 10 gezeigt, wobei ein grauer Wert der Signalintensität entspricht, wie in der Figurenlegende gezeigt. Eine beachtliche Schwankung der Genexpression ist offensichtlich für die meisten gezeigten Gene, was genetische und physiologische Unterschiede von Patienten und Spendern widerspiegeln kann. Für weitere Analyse und Verifizierung durch genspezifische PCR kamen nur Gene in Betracht, die eine unterschiedliche Expression mit einem statistischen Unterschied von mindestens p=0.03 beim Wilcoxon-Test zeigten. Sechs solche Gene werden in der Liste hervorgehoben (10). Gefunden wurde, dass insgesamt 224 Gene von 2435 bekannten Genen in Neointima mit hoher statistischer Signifikanz unterschiedlich reguliert werden. Ihre umfangreiche detaillierte Analyse wird anderswo veröffentlicht werden. Indikativ für eine vergleichbare Probenqualität zeigten acht Haushaltsgene sehr ähnliche Hybridisierungssignalintensitäten mit allen 20 Proben (10, unten).
(d) Validierung von cDNA-Array-Daten durch genspezfische PCR
Aus der in 10 gezeigten Liste wurden sechs unterschiedlich regulierte Gene und ein Haushaltsgen zur Validierung von Hybridisierungssignalen durch PCR unter Verwendung von genspezifischen Primern ausgewählt. Alle erhaltenen PCR-Signale hatten die vorhergesagte Größe. Zur Stütze einer gleichen Probenqualität zeigte das β-Actin-Signal (unten) eine sehr ähnliche Intensität mit allen 20 Proben. Durch Vergleich der genspezifischen PCR-Signale (11) mit Hybridisierungssignalen, erhalten aus cDNA-Arrays (11), wurde gefunden, dass 135 von 140 Signalen hinsichtlich Intensität übereinstimmten. Dies entspricht einer 96%igen Wiedergabetreue der Hybridisierungssignale aus cDNA-Arrays, was zeigt, dass die hier angewendete Herangehensweise zur Genexpressionsprofil-Erstellung vergleichbar ist hinsichtlich Qualität und Empfindlichkeit zu genspezifischer PCR.
(e) Abweichende Genexpression in menschlichem restenotischem Gewebe
Desmin, ein mesenchymaler Marker, wurde stark exprimiert in der Kontrollmedia gefunden, während nur schwache Signale in der restenotischen Probe gefunden wurden (10 und 11). Desmin ist ein Marker für SMCs, die stark in ruhenden differenzierten SMCs exprimiert werden. Seine Expression ist in de-differenzierten, sich vermehrenden SMCs, z.B. in SMCs von atherosklerotischen Plaques, reduziert (Ueda (1991) Ciruclation 83: 1327-1332). Herunterregulierung von Desmin in restenotischem Gewebe impliziert, dass die spindelförmigen Zellen im restenotischem Material de-differenzierte, sich vermehrende SMCs sind. Umgekehrt wird TSP-1, ein extrazelluläres Matrixprotein, das wichtig bei TGF-β-Aktivierung und SMC-Migration und Proliferation ist (Yehualaeshet (1999), Am J Pathol 155:841-851; Scott (1988), Biochem.Biophys.Res.Commun. 150:278-286)) merklich bei der Mehrheit von neointimalen Proben gegenüber den Kontrollproben hochreguliert. Die COX-1, Stress-induziertes hsp70B und die ubiquitär exprimierten FKBP12-Gene wurden bei fast jeder neointimalen Hyperplasie hochreguliert und kaum, wenn überhaupt, in Kontrollproben exprimiert (10 und 11). Der Tumorsuppressor MDGI wurde stark im ruhenden glatten Muskel exprimiert, während wenig Expression in ein paar Neointima-Hyperplasie-Proben gefunden wurde.
Keine der restenotischen Läsionen exprimierte Desmin (0/0), verglichen mit 100% der Kontrollen (10/10), nur 30% (3/10) der neointimalen Proben exprimierten MDGI sehr schwach, während es stark in 8/10 (80%) der Kontrollen exprimiert wurde. Andererseits wurden TSP-1 (7/10), COX-1 (9/10), hsp70B (8/10) und FKBP12 (10/10) signifikant in neointimalen gegenüber Kontrollproben hochreguliert (TSP-1 [0/10], hsp70B [0/10], COX-1 [0/10], FKBP12 [1/10]).
(f) FKBP12-Proteinexpression wird in menschlichem restenotischem Gewebe hochreguliert
Die Hochregulation von mRNA-Niveaus zeigt nicht stringent ein gesteigertes Proteinniveau an. Unter den Genen, von denen gefunden wurde, dass sie in menschlicher Neointima hochreguliert werden, ist FKBP12 besonders interessant, da es ein Regler der TGF-β-Signalwirkung und Ziel für die Arzneistoffe FK506 und Rapamycin ist. Ein therapeutischer Effekt von Rapamycin bei Nagetiermodellen (Gallo (1999), Ciruclation 99:2164-2170) von Restenose wird schlecht verstanden, aber kann mit Änderungen im Expressionsniveau von FBP12 zusammenhängen. Unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch für FKBP12 ist, wurde menschliches restenotisches Gewebe von einer Restenose der Halsschlagader (n=3) und Kontrollgewebe (n=3) für die Expression des Proteins analysiert. Wie in 12 gezeigt, wurde ein Anstieg des FKBP12-Proteins im Zytoplasma von SMCs aus restenotischen Läsionen, wie durch ihre spindelförmigen Kerne identifiziert, nachgewiesen (12B und D). Während kein FKBP12 in Kontroll-SMCs von gesunder Media nachweisbar war (12C), wurde eine unterschiedliche Färbung in SMCs von Neointima gefunden (12D). Interessanterweise exprimierten besonders glatte Muskelzellen, die in der Grenzzone zwischen Neointima und gesunder Media von restenotischen Gefäßen liegen, hohe Niveaus des FKBP12-Proteins (11B).
Beispiel VI: Charakterisierung des Transcriptoms aus menschlichen restenotischem Gewebe
Die Expression von 2,435 Genen von bekannter Funktion (s. Beispiel V) wurde in Atherektomie-Proben von 10 Patienten mit In-Stent-Restenose, Blutzellen von 10 Patienten, normale Kranzarterie-Proben von 11 Spendern und gezüchteten glatten Muskelzellen von menschlichen Kranzarterien erforscht. 224 Gene, die unterschiedlich exprimiert wurden mit hoher statistischer Signifikanz (p<0.03) zwischen Neointima und Kontrollgewebe, welche, wie folgt, gruppiert werden konnten: (1) nur in Neointima exprimierte Gene; (2) sowohl in Neointima als auch in sich vermehrenden glatten Muskelzellen exprimierte Gene; (3) sowohl in Neointima als auch in Blutproben exprimierte Gene; und (4) in Kontrollgewebe, aber kaum in Neointima exprimierte Gene. Das Transcriptom der menschlichen Neointima zeigte signifikante Änderungen, bezogen auf Proliferation, Apoptose, Entzündung, Zytoskelett-Reorganisation und Gewebe-Remodellierung. Darüber hinaus wurden in Neointima 32 hochregulierte Gene identifiziert, die mit Interferon-γ-Signalwirkung zusammenhängen.
In der vorliegenden Studie wurden 10 Proben von neointimaler und 11 Proben von ruhender Intima/Media zur Expression von 2,435 menschlichen Genen von bekannter Funktion analysiert. Während die Expression von Haushaltsgenen zwischen normalem und restenotischem Gewebe im Wesentlichen vergleichbar war, zeigte eine beeindruckende Zahl von Genen (n=224) ein gesteigertes oder vermindertes Expressionsniveau. Das Genexpressioinsmuster in Neointima zeigte die erwartete proliferative Antwort mit Induktion von Genen, hauptsächlich in der G1/S-Phase exprimiert, Änderungen des glatten Muskel-Phänotyp von kontraktilen zu synthetischen SMCs und Änderungen in Synthese von extrazellulären Matrix-Proteinen. Zusätzlich wurde ein pro-inflammatorisches Expressionsmuster, charakterisiert durch die Anwesenheit von Markern für Makrophagen und T-Lymphozyten und durch die Expression von zahlreichen Genen mit bekannten Funktionen in der Zellantwort auf IFN-γ beobachtet. Das IRF-1-Protein, ein entscheidender Transkriptionsfaktor bei IFN-γ-Signalwirkung, wurde in SMCs von menschlicher Neointima überexprimiert gefunden.
Die klinischen Merkmale der Patienten in der Studiengruppe von diesem Beispiel werden in Tabelle 7 präsentiert.
Tabelle 7 Klinische Daten von 13 Patienten
Alle Atherektomie-Proben wurden unmittelbar nach Debulking der Läsion in flüssigem Stickstoff eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis eine mRNA-Herstellung durchgeführt wurde, wie vorstehend beschrieben.
Die Kontrollgruppe bestand aus 5 Proben von Muskelarterien des Darms von fünf Patienten und 6 Proben aus Kranzarterien von drei Patienten, die sich einer Herztransplantation unterzogen. Die Kontrollexemplare wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren. Vor der mRNA-Präparation wurden Media und Intima der Arterien präpariert. Ein kleines Stück der Probe (ca. 1 mm³) wurde unmittelbar lysiert, während der Rest auf atherosklerotische Änderungen histologisch untersucht wurde. Wenn es keine nachweisbaren atherosklerotischen Änderungen der Gefäßmorphologie gab, wurden die Proben als „gesunde" Kontrollproben verwendet und mRNA- und cDNA-Präparation wurden, wie beschrieben, durchgeführt.
Das neointimale Gewebe von der Halsschlagader (n=3) und der Oberschenkelschlagader (n=3) wurde durch Atherektomie innerhalb der Restenose hergestellt und unmittelbar nach Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur histologischen Auswertung und Immunhistochemie des In-Stent-restenotischen Gewebes aus Kranzarterien (n=3) und der Neointima von restenotischen peripheren Arterien (n=6) wurden die Proben in 4% Paraformaledehyd fixiert und in Paraffin eingebettet, wie beschrieben.
Blutproben wurden unmittelbar nach Revaskularisierung des restenotischen Gefäßes erhalten. Acht ml Blutproben wurden in 35 ml TriReagent Blood (MBI Fermentas, Deutschland) gesammelt und nachfolgend bei –80°C eingefroren, bis eine RNA-Präparation durchgeführt wurde, wie im Hersteller-Protokoll beschrieben. 1 μg der gesamten RNA von Blutzellen wurde in 1000 μL Lyse/Bindungspuffer aufgelöst und mRNA- und cDNA-Synthese wurde präpariert, wie vorstehend beschrieben.
Die Zellkultur wurde ausgeführt, wie folgt:
Primäre glatte Muskelzellen von menschlicher Kranzarterie (CASMCs) wurden von CellSystems (St. Katharinen, Deutschland) erhalten und wurden in Smooth Muscle Cell Growth Medium (CellSystems, St. Katherinen, Deutschland), das 5% fötales Kälberserum (CellSystems, St. Katherinen, Deutschland) enthielt, bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ gezüchtet. CASMCs wurden in Experimenten zwischen Passagen 2 und 4 verwendet. Zur cDNA-Synthese von sich vermehrenden CASMCs wurden dreimal gewaschen mit eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und 1 × 10⁴ Zellen wurden nachfolgend in 1000 μL Lyse/Bindungspuffer lysiert, bevor mRNA präpariert wurde, wie vorstehend beschrieben.
Die Bestimmung des Genexpressionsmusters wurde ausgeführt, wie folgt:
Proben-mRNA-Präparation, cDNA-Synthese, PCR-Amplifizierung und Sondenmarkierung, cDNA-Array-Hybridisierung und Datenanalyse wurden ausgeführt, wie hierin vorstehend beschrieben, insbesondere in Beispiel V. Die erhaltenen cDNA-Sonden wurden mit menschlichen 1.2, Krebs- 1.2, kardiovaskulären und Stress-cDNA-Arrays (Clontech, Heidelberg, Deutschland) hybridisiert mit insgesamt 2,435 Genen von bekannter Funktion. Es gab eine circa 20%ige Redundanz von Genen unter cDNA-Arrays. Zur Analyse von mikroskopischen menschlichen Gewebeproben herunter zu einer Einzelzelle wurde das hier beschriebene neue Verfahren der cDNA-Synthese und PCR-Amplifizierung verwendet (s. Beispiele I bis V).
Die Quantifizierung von Arraydaten wurde durch Scannen der Filme und Analyse mit Array-Visionssoftware (Imaging Research Inc. St. Catherines, Canada) durchgeführt. Der Hintergrund wurde subtrahiert und Signale wurden auf neun Haushaltsgene, die auf jedem Filter anwesend waren, normalisiert, wobei der Durchschnitt der Haushaltsgenexpressionsignale auf 1 gesetzt und der Hintergrund auf 0 gesetzt wurde. Zur logarithmischen Darstellung, gezeigt in 1, wurden Werte mit 1000 multipliziert. Ein Mittelwert ≥0,05 im Durchschnitt aller Proben in einer Gruppe wurde als positives Signal betrachtet. Unterschiede im mittleren Expressionsniveau durch um einen Faktor ≥2.5fach zwischen der Studien- und der Kontrollgruppe wurden weiter statistisch analysiert.
Ergebnisse der experimentellen Analyse werden als mittlere Expressionswerte der zehn untersuchten Exemplare der Studiengruppe oder der elf untersuchten Exemplare der Kontrollgruppe gegeben. Unterschiede zwischen den Patienten- und Spendergruppen wurden durch den Wilcoxon-Test (SPSS Version 8.0) analysiert.
Gene wurden nur als unterschiedlich exprimiert betrachtet, wenn ihre p-Werte im Wilcoxon-Test <0.03 waren, und wenn eine unterschiedliche Expression bei mindestens 5 von 10 Proben innerhalb einer Studiengruppe beobachtet wurde, während es 0 von 10 innerhalb der anderen Gruppe gab; oder mindestens 7 von 10 Proben innerhalb einer Gruppe, während es maximal 3 von 10 innerhalb der anderen Gruppe gab.
Immunhistochemie wurde ausgeführt, wie folgt:
Immunhistochemie wurde auf Paraffin-eingebetteten Schnitten aus 3 Neointima-Proben aus koronarer In-Stent-Restenose, 3 Neointima-Proben aus A. femoralis und 3 Neointima-Proben aus einer Neointima-Probe der Halsschlagader durchgeführt. Drei μm-Serienschnitte wurden auf DAKO ChemMate^TM Capillary Gap Microscope-Objektträger (100μm) aufgebracht, bei 65°C über Nacht gebacken, deparaffiniert und gemäß Routineprotokollen entwässert. Zur Antigen-Auffindung wurden Proben 4 Minuten in einem Druckkocher in Citratpuffer (10 mMol, pH 6.0) gekocht. Endogene Peroxidase wurde durch 1% H₂O₂/Methanol für 15 Minuten blockiert. Eine unspezifische Bindung des primären Antikörpers wurde durch Vorinkubation der Objektträger mit 4% getrockneter Magermilch in Antibody Diluent (DAKO, Dänemark) reduziert. Immunfärbung wurde durch die Streptavidin-Peroxidase-Methode durchgeführt, unter Verwendung des Dako ChemMate Detection Kit HRP/Red Rabbit/Mouse (DAKO Dänemark) gemäß der Hersteller-Beschreibung durchgeführt. Die Prozeduren wurden in einem DAKO TechMate^TM 500 plus automatisiertem Färbesystem ausgeführt. Primäre Antikörper gegen Actin von glattem Muskel (M0635, DAKO, Dänemark; 1:300), CD3 (A0452, DAKO, Dänemark; 1:80), MAC387 (E026, Camon, Deutschland; 1:20) und IRF-1 (sc-497, Santa Cruz, U.S.A.) wurden in Antibody Diluent verdünnt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Kerngegenfärbung mit Hematoxylin wurden die Objektträger entwässert und mit Pertex (Medite, Deutschland) abgedeckt.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
(a) Unferschiedliche Genexpression in menschlicher Neointima
Insgesamt ergaben 1,186 Gene (48.7%) von 2,435 nachweisbaren Hybridisierungssignalen auf cDNA-Arrays mit Neointima- und Kontrollproben einen über 20fachen Bereich von Expressionsniveau (13A). Davon schienen 352 Gene (14.5%) um einen Faktor >2.5fach zwischen restenotischen und Kontrollproben unterschiedlich exprimiert zu werden. Jedoch schwankten die Expressionsniveaus wesentlich unter den einzelnen Proben (s. z.B. 15). Deswegen wurde eine statistische Analyse angewendet, um jene Gene zu identifizieren, die zwischen Studien- und Kontrollgruppen mit hoher Signifikanz unterschiedlich exprimiert werden (s. Methoden). Auf diese Weise wurden 224 Gene (9.6%) identifiziert, die um einen Faktor von mindestens 2.5fach zwischen der Restenose-Studiengruppe und der Kontrollgruppe mit einer Signifikanz von p<0.03 im Wilcoxon-Test unterschiedlich exprimiert wurden. 167 (75%) Gene davon wurden in der Restenose-Studiengruppe, verglichen zur Kontrollgruppe überexprimiert und 56 Gene (25%) unterexprimiert gefunden (13B).
Zusätzlich zur statistischen Signifikanz wurde die Gültigkeit der Expressionsdaten durch eine 20%ige Redundanz von cDNA-Elementen auf den vier verwendeten Arrays gestützt. Auf diese Weise wurde eine beträchtliche Zahl von Hybridisierungssignalen in Duplikat oder Triplikat bei unabhängigen Hybridisierungsexperimenten bestimmt. Vier Beispiele von Duplikatbestimmungen werden in 16 (oben) gezeigt, welche alle einen hohen Grad von Reproduzierbarkeit zeigten. Als eine weitere Validierung von Hybridisierungssignalen wurden 38 der unterschiedlich exprimierten Gene für PCR-Analyse von cDNA-Proben ausgewählt, unter Verwendung genspezifischer Primer. Hybridisierungssignale für 35 (92%) von 38 Genen konnten durch genspezifische PCR verifiziert werden, was Signale von der vorhergesagten Größe und relativen Menge ergab (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigen, dass die verwendete cDNA-Array-Herangehensweise hinsichtlich Qualität und Empfindlichkeit vergleichbar mit genspezifischer PCR ist. Schließlich wurde für 112 unter den 224 abweichend exprimierten Genen in Neointima früher in der Literatur beschrieben, dass sie in Neointima, SMCs, Fibroblasten, Endothelzellen oder Mesenchym exprimiert werden (14, markiert mit ,#').
Bezogen auf die Neointima-Expression fielen die 224 abweichend regulierten Gene in vier Untergruppen (14). Gruppe I listet 62 Gene auf, die in Neointima überexprimiert wurden und nicht stark oder nachweisbar in Kontrollgefäßen, CASMCs oder Blutzellen exprimiert wurden (14A). In Gruppe II wurden 43 Gene aufgelistet, die in Neointima und CASMCs gleichermaßen exprimiert wurden, was darauf hinweist, dass dieses Gencluster in Neointima durch sich vermehrende SMCs beigetragen wurde (14B). In Gruppe III wurden 62 Gene aufgelistet, die in Neointima und Blutzellen gleichermaßen exprimiert wurden, was darauf hinweist, dass dieses Gencluster zu dem der Neointima durch infiltrierte Blutzellen beigetragen wurde (14C). Diese Ansicht wird gestützt durch Expression in Gruppe III der größten Zahl von Genen bezogen auf Entzündung in allen vier Gruppen. Schließlich werden in Gruppe IV 56 Gene aufgelistet, die in Neointima herunterreguliert werden, verglichen zur Kontrollgruppe (14D). Im Folgenden wird die abweichende Expression von ausgewählten Genen in Neointima im Kontext der Genfunktion diskutiert werden.
Als Zusammenfassung wurden die folgenden unterschiedlich exprimierten Gene in menschlicher Neointima exprimiert:
Zum Beispiel wurde gefunden, dass 17 der in menschlicher Neointima unterschiedlich exprimierten Gene für Transkriptionsregler codieren. mRNA-Niveaus für 14 Transkriptionsfaktoren wurden in Neointima induziert und 3 zeigten eine verminderte Expression (15). Einige Transkriptionsfaktoren der vorigen Gruppe wurden früher auf Proliferation und Apoptose von SMCs bezogen, wie HMG-1, E2F1, IRF-1, Fli-1, und mit pro-inflammatorischer Signalwirkung in menschlicher Neointima, wie IRF-1, IRF-7 und RelB. Die folgenden Transkriptionsfaktoren wurden hochreguliert: E2F1, Östrogen-bezogener Rezeptor alpha, Ets-Domäne-Protein elk-3, fli-1-Onkogen, HMG-1, Interferon-regulatorischer Faktor 1, Interferon-regulatorischer Faktor 7, ISGF3-gamma, Kernrezeptor-bezogenes 1, RELB, Transkriptionsfaktor Spi-B, vav-Onkogen, v-erbA-bezogenes Protein, Vitamin D3-Rezeptor; während die folgenden herunterreguliert wurden: Homeobox-Protein HOXB7, Frühes-Wachstums-Antwort-Protein 1, Serum-Antwort-Faktor.
Auffallende Änderungen scheinen bei der Expression der Transkriptionsfaktoren der Ets-Familie stattzufinden. Während Spi-B, das fli-Onkogen, und der Ets-Repressor Elk-3 in Neointima induziert wurden, wurde der Ets-Transkriptionsfaktor Egr-1 unterdrückt (14 und 15).
Darüber hinaus wurde eine Anzahl von Genen, die an Kontrolle oder Vermittlung von proliferativen Antworten beteiligt sind, zwischen Neointima und Kontrollgruppen unterschiedlich exprimiert. Der aus Plättchen stammende Wachstumsfaktor (PDGF)-A und Angiotensinogen-Gene, deren Produkte auf SMCs als Mitogene wirken, wurden ausschließlich in Neointima exprimiert (14). Von Angiotensin ist es bekannt, dass es durch Insulin hochreguliert wird und die Expression von PDGF-A in SMCs induziert. Als Zeichen der laufenden Proliferation wurde für mehrere Gene, von denen bekannt ist, dass sie mit dem G1/S-Übergang exprimiert werden, gefunden, dass sie in Neointima hochreguliert werden. Jene beinhalten Transkriptionsfaktor E2F1, 70-kDa-Replikationsprotein A, Onkogen-Produkt Pim-1 und Geranylgeranyl-Transferase. Des Weiteren wurde Hochregulation des Zellzyklus-regulierten Histons H4 beobachtet, welches in der G/S1- und S-Phase des Zellzyklus exprimiert wird, was laufende Proliferation in menschlicher Intima anzeigt.
Die Umprogrammierung des Zellwachstums in Neointima führte offenbar zur Induktion von mehreren Genen in Neointima, die für Proteine mit Funktionen in unterschiedlichen Signaltransduktionswegen codieren, einschließlich der Zelloberflächenrezeptoren EDG-1, EDG-4, Insulinrezeptor und P2X-Purinoceptor 5 und andere signalwirkende Proteine wie die ribosomale Protein S6-Kinase II alpha 1, Farnesyltransferase, Phospholipase C beta 2, Wachstumsfaktor-Rezeptorgebundenes Protein 2 und die kleinen G-Proteine CDC42, RhoG, p21-Rac2 und RalB. Das Enzym Farnesyltransferase katalysiert die wesentliche post-translationale Lipidierung von Ras und mehreren anderen Signal-umwandelnden G-Proteinen. G-Proteine wie p21-Rac, CDC42 und RhoG spielen Schlüsselrollen bei Signal-Transduktionswegen, die zu Zellmigration und Zellproliferation führen. Gleichfalls erfordert die Agonist-stimulierte 1,4,5-Triphosphat(IP3)-Produktion durch Phospholipase C beta 2 im glatten Muskel G-Protein-Aktivierung und aktiviertes Rac und Cdc42 assoziierten mit PI 3-Kinase, die eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der p70 S6-Kinase spielt. Die p70 S6-Kinase (p70S6K) ist ein wichtiger Regler der Zellzyklus-Progression, um in die G1-Phase einzutreten und als Antwort zu Wachstumsfaktoren und Mitogenen zur S-Phase fortzuschreiten. Sie ist an mit dem multiplen Wachstumsfaktor in Zusammenhang stehenden Signaltransduktionswegen beteiligt, von denen bekannt ist, dass sie Schlüsselrollen bei der Neointimabildung spielen, wie Angiotensin, Endothelin und PDGF. In Übereinstimmung mit Hochregulation von p70 S6-Kinase wurde eine signifikante Hochregulation des FK506 bindenden Proteins (FKBP) 12 auf dem mRNA- (14) und Proteinniveau in Neointima gefunden.
Es wurde beobachtet, dass eine Anzahl von Genen, die für Inhibitoren der Zellzyklusprogression codieren, in ruhender Media exprimiert wurden, aber in Neointima signifikant herunterreguliert wurden (14). Jene beinhalten CIP1, p16-INK4, Metallothionein, TGF-beta3, aus Brust stammenden Wachstumsinhibitor, FrzB, und die beta- und gamma-Untereinheiten von Gadd45.
Zusätzlich wurde Hochregulation von Genen in menschlicher Neointima, die für Proteine mit pro-apoptotischer Funktion wie Caspase-1, DAP-1 und APO-2-Ligand codieren, sowie Hochregulation von Genen, die für Proteine mit anti-apoptotischer Funktion wie BAG-1, BCL-2-bezogenes Protein A1 und der Trail-Rezeptor 3 codieren (14), gefunden.
Schließlich zeigte das Transcriptom der menschlichen Neointima Hochregulation von 32 Genen, bezogen auf IFN-γ-Signalwirkung (16). Der IFN-γ-Rezeptor alpha wurde in Neointima, sich vermehrenden CASMCs und – zu einem geringeren Grad – in Blutzellen exprimiert; während der IFN-γ-Rezeptor beta hauptsächlich in Neointima-Proben exprimiert wurde. Desgleichen wurde eine Hochregulation von Pyk2 beobachtet.
Die Hochregulation der IFN-γ-regulierten Gene für Caspase-1, Caspase-8 und DAP-1 wurde in menschlicher Neointima gefunden. Jedoch wurden mRNAs für die anti-apoptotischen Proteine BAG-1, Pim-1 (beide von IFN-γ reguliert) und BCL-2-bezogenes Protein A1 auch in Neointima gegenüber der Kontrolle hochreguliert (14).
Zahlreiche Gene mit Funktionen in inflammatorischer Antwort wurden in menschlicher Neointima aktiviert gefunden. Pro-inflammatorische Genmuster kamen von infiltrierenden inflammatorischen Zellen wie Makrophagen und T-Lymphocyten (z.B. CD11b, CD3) (14C) oder aus neointimalen SMCs (z.B. Prostaglandin G/H-Synthase 1, Phospholipase A2, Hitzeschock-Protein 70, C5a Anaphylatoxin-Rezeptor, IFN-γ-Rezeptor) (14A und B).
Die selektive Expression von CD40 in Neointima verdient Aufmerksamkeit (14A). CD40 ist ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie, die zuerst auf der Oberfläche von B-Zellen beschrieben wurde.
Die folgenden Zytoskelett-, extrazelluläre Matrix- und Zelladhesionsänderungen in Neointima wurden beobachtet:
Eine Hochregulation von Connexin43 und Cytokeratin-18 in Neointima, wie bei sich vermehrenden CASMC (14B, obere Tafel) gesehen wird, während die Expression von Desmin in Neointima stark vermindert war (14D, obere Tafel).
Während die Transkription von unterschiedlichen Kollagen-Subtypen und Tenascin in Neointima vermindert war (14D, obere Tafel), wurde die Expression von Thrombospondin-1 und Versican hochreguliert (14B, obere Tafel).
Eine Anzahl von Genen, die für Adhesionsmoleküle, einschließlich P-Selectin, ICAM2 und Cadherin16, codieren, wurden stark exprimiert in Neointima gefunden, aber nicht in SMCs, Blutzellen oder Kontrollgefäßen (14A, obere Tafel). Eine Anzahl von anderen Adhesionsmolekülen wurden gleichermaßen in Neointima, gezüchteten SMCs (14B) und Blutzellen (14C) exprimiert. Die Neointima scheint die Expression von gewissen Adhesionsmolekülen herunterzuregulieren, die normalerweise in Media/Intima von Arterien exprimiert werden, wie Integrine α7B, α3 oder MUC18.
Beispiel VII: Hochregulierte Gene des IFN-γ-Signalwirkungsweg
Wie hier vorstehend gezeigt, wurde die Expression von 2,435 Genen von bekannter Funktion in Atherektomie-Proben von 10 Patienten mit In-Stent-Restenose, Blutzellen von 10 Patienten, Proben von normalen Kranzarterien von 11 Spendern und gezüchteten glatten Muskelzellen von menschlichen Kranzarterien erforscht und 224 Gene, die mit hoher statistischer Signifikanz (p<0.03) zwischen Neointima und Kontrollgewebe unterschiedlich exprimiert wurden, wurden identifiziert. Insbesondere wurden 32 hochregulierte Gene, die auf Interferon-γ-Signalwirkung bezogen werden, in Neointima identifiziert.
Der IFN-γ-Rezeptor alpha wurde in Neointima, sich vermehrenden CASMCs und – zu einem geringeren Grad – in Blutzellen exprimiert; während der IFN-γ-Rezeptor beta hauptsächlich in Neointima-Proben exprimiert wurde.
IFN-γ signalisiert über einen Rezeptor hoher Affinität, der eine α- und β-Rezeptorkette enthält. Interessanterweise verwenden TH1-Zellen eine Rezeptormodifikation, um einen IFN-γ-resistenten Zustand zu erreichen (Pernis, Science 269 (1995), 245-247). Der Subtyp-spezifische Unterschied bei der Aktivierung des IFN-γ-Signalwirkungswegs von Typ1- und Typ 2-T-Helferzellen beruht auf einen Mangel an IFN-γ-Rezeptor b in Typ 1-T-Zellen. Deswegen weisen die hier präsentierten Daten darauf hin, dass ein IFN-γ-Rezeptor von hoher Affinität, der beide Ketten enthält, hauptsächlich in glatten Muskelzellen der Neointima exprimiert wird.
Einheitlich mit einer Aktivierung von IFN-γ-Signalwirkung wurde Hochregulation von zwei Transkriptionsfaktoren in Neointima, die wesentlich für IFN-Signalwirkung sind, gefunden: IRF-1 und ISGF3γ (p48). Diese Transkriptionsfaktoren sind dafür bekannt, dass sie von IFN-γ transcriptionell hochreguliert werden (Der, Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1998), 15623-15628), und beide sind Schlüsselakteure bei IFN-γ-Signalwirkung (Matsumoto, Biol. Chem. 380 (1999), 699-703; Kimuar, Genes Cells 1 (1996), 115-124; Kirchhoff, Nucleic Acids Res. 21 (1993), 2881-2889; Kano, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257 (1999), 672-677). Desgleichen wurde Hochregulation der Tyrosinkinase Pyk2 beobachtet, von welcher gezeigt wurde, dass sie eine Rolle bei der Signaltransduktion durch Angiotensin in SMCs spielt (Sabri, Circ. Res. 83 (1998), 841-851). Pyk2 wird von IFN-γ selektiv aktiviert und Hemmung von Pyk2 in NIH 3T3-Zellen ergibt eine starke Hemmung der IFN-γ-induzierten Aktivierung von MAPK und STAT1 (Takaoka, EMBO J. 18 (1999), 2480-2488.
Ein Schlüsselereignis bei der IFN-γ-induzierten Wachstumshemmung und Apoptose ist die Induktion von Caspasen (Dai, Blood 93 (1999), 3309-3316). Es wurde gezeigt, dass IRF-1 die Expression von Caspase-1 induziert, was zur Apoptose bei vaskularen SMCs führt (Horiuchi, Hypertension 33 (1999), 162-166), und dass apoptotische SMCs und Makrophagen mit Caspase-1 bei Atherosklerose colokalisieren (Geng, Am. J. Pathol. 147 (1995), 251-266). In dieser Studie wurde Hochregulation von IFN-γ-zugehörigen Genen für Caspase-1, Caspase-8 und DAP-1 in menschlicher Neointima gefunden. Jedoch wurden mRNAs für die anti-apoptotischen Proteine BAG-1, Pim-1 (beide von IFN-γ reguliert) und BCL-2-bezogenes Protein A1 auch in Neointima gegenüber der Kontrolle hochreguliert (16), was die Vorstellung stützt, dass Proliferation und Apoptose gleichzeitig in menschlicher Neointima geschehen mit einem Übergewicht der Proliferation.
Koordinierte Regulation von Genen, deren Produkte bei unterschiedlichen Schritten im Neointima-Prozess wirken, war ein wiederkehrendes Thema unserer Genexpressionsanalyse. Bezugnehmend auf den IFN-γ-Weg wurden nicht nur die Gene für den vollständigen Rezeptor, die Haupttranskriptionsfaktoren, Komponenten des Signaltransduktionswegs (Dap-1, BAG-1, Pim-1, IFN-γ-induzierbares Protein, IFN-induzierbares Protein 9-27) induziert, sondern auch mehrere Zielgene des IFN-γ-Wegs wie CD40, CD13 und Thrombospondin-1 (16).
Das IFN-γ-regulierte Gencluster wurde in der Neointima-Probe exprimiert, aber einige der relevanten Gene, wie IRF-1, wurden auch in Blutproben exprimiert. Um den Zelltyp zu identifizieren, der überwiegend zum IFN-γ-regulierten Muster beitrug, wurden Gefrierschnitte von Neointima-Proben aus koronarer In-Stent-Restenose (n=3) und aus Restenose von peripheren Arterien (n=6) mit Antikörpern, spezifisch für IRF-1, gefärbt. Dieses Protein wurde gewählt, weil es eine wesentliche Komponente des IFN-γ-Signaltransduktionswegs ist (Kimura, a. a. O.) und koordiniert mit den anderen Genen im Cluster exprimiert wurde (16). Eine immunhistochemische Analyse zeigte starke Kern- und zytoplasmatische Färbung von IRF-1 in neointimalen SMCs einer Restenose der Halsschlagader (17) und von koronarer In-Stent-Restenose (18), wie durch ihre spindelförmigen Kerne identifiziert und durch Färbung mit dem glatten Muskelzellmarker alpha-Actin (18). Die Kernfärbung von IRF-1 bei In-Stent-Restenose (18) zeigte, dass der IRF-1-Transkriptionsfaktor auch aktiviert wird. SMCs in Kontrollmedia von Halsschlagadern zeigten keine IRF-1-Färbung (17). CD3-positive Zellen waren in der Probe viel weniger vorhanden (18) als SMCs (18), was anzeigt, dass SMCs größtenteils zur gesteigerten IRF-1-Expression in menschlicher Neointima beitrugen.
Die Anwesenheit von IFN-γ bei menschlichen atherosklerotischen Läsionen ist bekannt (Ross, N. Engl. J. Med. 340 (1999), 115-126), obwohl seine Rolle unklar bleibt. Während IFN-γ bei SMCs in vitro-Proliferation hemmt und Apoptose induziert (Horiuchi, a. a. O.; Warner, J. Clin. Invest. 83 (1989), 1174-1182), vermindert die Abwesenheit von IFN-γ Intima-Hyperplasie bei Mausmodellen von Atherom und Transplantationsarteriosklerose (Gupta, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2752-2761; Raisanen-Sokolowski, Am. J. Pathol. 152 (1998), 359-365). In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung wurde gezeigt, dass IFN-γ Arteriosklerose bei Abwesenheit von Leukozyten in Schweine- und menschlichen Arteriengewebe durch ihre Einfügung in die Aorta von immunodefizienten Mäusen induziert (Tellides, Nature 403 (2000), 207-211).
Die Rolle von infiltrierenden T-Lymphocyten in Neointima von In-Stent-Restenose wurde noch nicht untersucht. In dieser Studie wurde gezeigt, dass CD3-positive Zellen durch Immunobiochemiker in 3 von 4 Neointima-Proben nachgewiesen werden kann (s. 18) und ein CD3-spezifisches Hybridisierungssignal auf cDNA-Arrays mit 7 von 10 Neointima-Exemplaren wurde erhalten (18). IFN-γ-bezogene Expressionsmuster wurden auch bei für CD3 negativen Proben beobachtet, wie durch eines der beiden Verfahren untersucht, was darauf hinweist, dass das Cytokin auf die Neointima in einer parakrinen Art und Weise über einigen Abstand ohne Bedarf für massive T-Zellinfiltration wirken könnte.
Während es für T-Zellen und das pro-inflammatorische Cytokin IFN-γ bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei Atherosklerose spielen (Ross, a. a. O.), ist ihre Rolle bei der Entwicklung von Neointima weitgehend unerforscht. Die hier bereitgestellten Daten weisen auf eine wichtige Rolle von IFN-γ bei der Pathophysiologie von neointimaler Hyperplasie hin.
Beispiel VIII: Präparation einer Surrogat-Zelllinie
Eine Surrogat-Zelllinie für eine pathologisch modifizierte Zelle und/oder ein pathologisch modifiziertes Gewebe kann durch folgende Schritte hergestellt werden:
a) Definition des Transcriptoms/Genexpressionsmusters des kranken Gewebes
Mikroskopische Proben von krankem Gewebe können erhalten werden entweder durch Atherektomie, Debulking, Biopsie, Resektion von krankem Gewebe mit Laser oder durch makroskopische chirurgische Resektion des kranken Gewebes. Nach Beschaffung werden mikroskopische Proben unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis eine mRNA-Präparation durchgeführt wird, um den in vivo-Zustand der Proben-Transcriptome zu bewahren.
Die Zellen in solchen Proben exprimieren einen besonderen Satz von Genen, welcher durch die Anwesenheit von ausgeprägten mRNA-Molekülen widergespiegelt wird, die bei verschiedenen Konzentrationen auftreten. Die Gesamtheit von mRNA-Molekülen und ihrer relativen Mengen in einer gegebenen klinischen Probe wird als das Transcriptom bezeichnet. Es wird erwartet, dass das Transcriptom eines kranken Gewebes unterschiedlich von dem eines gesunden Gewebes ist. Die Unterschiede beziehen sich auf hoch- und herunterregulierte Expression von Genen, die bei Verursachung, Aufrechterhaltung oder Anzeige des kranken Zustands des Gewebes beteiligt sind. Die Analyse des Transcriptoms wird üblicherweise durch die Zahl der cDNA-Elemente, die ein besonderer Array trägt, begrenzt.
mRNA-Präparation und Amplifizierung wird gemäß dem Verfahren der Erfindung ausgeführt und ist hier vorstehend beschrieben.
Insbesondere werden mikroskopische Proben von krankem Gewebe schnell gefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis eine mRNA-Präparation und cDNA-Synthese durchgeführt werden, wie hier vorstehend beschrieben. Gefrorenes Gewebe wird in flüssigem Stickstoff zermahlen und das gefrorene Pulver in Lyse-Puffer gelöst gemäß dem Verfahren der RNA-Präparation. Das Lysat wird für 5 min bei 10,000 g bei 4°C zentrifugiert, um Zelltrümmer zu beseitigen. Die RNA kann als gesamte RNA oder als mRNA präpariert werden, wie beschrieben in (Schena, Science 270 (1995), 467-470), in Current Protocols, im Clontech-Handbuch für die Atlas cDNA Expression Arrays oder wie beschrieben in (Spirin, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40 (1999), 3108-3115), wie beschrieben in (Chee, Science 274 (1996), 610-614; Alon, Proc. Natl. Acad. Sci. 96 (1999), 6745-6750; Fidanza, Nucleosides Nucleotides 18 (1999), 1293-1295; Mahadevappa, Nat. Biotechnol. 17 (1999), 1134-1136; Lipshutz, Nat. Genet. 21 (1999), 20-24) für die Affymetrix-Arrays oder wie von Qiagen beschrieben.
cDNA-Präparation und Markierung können durchgeführt werden wie von Clontech oder Affymetrix im Benutzerhandbuch für die Arrays-Hybridisierungskits beschrieben oder wie beschrieben in (Spirin, a. a. O.; Chee, a. a. O.; Alon, a. a. O.; Fidanza, a. a. O.; Mahadevappa, a. a. O.; Lipshutz, a. a. O.). Zusätzlich kann amplifizierte cDNA verwendet werden. Die Präparation von cDNA-Amplifikaten oder die Markierung von amplifizierter cDNA können durchgeführt werden, wie hier vorstehend oder von Spirin (a. a. O.) beschrieben.
Erhaltene, markierte cDNA kann bei Hybridisierungsassays verwendet werden. Hybridisierung von markierter cDNA und Datenanalyse können durchgeführt werden unter Bedingungen wie beschrieben im Benutzerhandbuch aus Clontech's AtlasTM cDNA Expression Arrays User Manual oder im Hersteller-Handbuch von Aftymetrix oder wie beschrieben von (Spirin, a. a. O.; Chee, a. a. O.; Alon, a. a. O.; Fidanza, a. a. O.; Mahadevappa, a. a. O.; Lipshutz, a. a. O.):
b) Definition des Transcriptoms/Genexpressionsmusters von Kontrollgewebe
Um krankheitsspezifische Genexpressionsmuster zu identifizieren, kann das Genexpressionsmuster des kranken Gewebes mit Kontrollmaterial von gesunden Spendern verglichen werden. Im Fall von Atherektomie kann dieses Material gesunde Media und Intima von nicht-elastischen, d.h. Muskelarterien, sein. Im Fall von Herzmuskelbiopsien oder Nierenbiopsien kann gesundes Kontrollgewebe verwendet werden, das im Verlauf der Operation gesammelt wird. Zusätzlich kann das Genexpressionsmuster von Zellen von benachbartem unbetroffenen Gewebe oder infiltrierende Zellen, wie Blutzellen, analysiert werden. Bezogen auf die Zellcharakterisierung eines Gewebes durch immunhistochemische Analyse unter Verwendung von Antikörpern zu Zellmarkerproteinen, kann das Transcriptom aus kultivierten menschlichen Zelllinien desselben Typs bestimmt werden. (Beispiel: Arterien färben positiv für glatte Muskelzellen und Endothelzellen; konsequenterweise werden Transcriptome aus kultivierten menschlichen glatten Muskelzellen und Endothelzellen erhalten.
Die mRNA-Präparation und Amplifizierung kann ausgeführt werden, wie hier vorstehend beschrieben und in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Erhaltene (markierte) cDNA kann bei Hybridisierungsassays verwendet werden, wie hier vorstehend beschrieben.
c) Bestimmung eines relevanten Satzes von krankheitsspezifischen Genen
Um krankheitsspezifische Genexpressionsmuster zu bestimmen, sollte zuerst das Genexpressionsmuster des kranken Gewebes mit dem Genexpressionsmuster von gesundem Kontrollgewebe verglichen werden. Zum Vergleich sollte der mittlere Expressionswert bei einer ausreichenden Zahl von kranken Proben (z.B. 10) und derselben Zahl von Kontrollexemplaren verglichen werden. Gene mit einem Expressionsverhältnis >2.5fach zwischen den beiden Gruppen sollten auf ihre relative Expression in einer Gruppe analysiert werden: es sollte >5/10 positive in einer Gruppe geben, wenn es 0/10 in der anderen gibt oder mindestens 7/10 in einer Gruppe, wenn es maximal 3/10 positive in der anderen Gruppe gibt. Zusätzlich sollten diese Daten statistisch analysiert werden, um Gene mit einem p<0.05 mit z.B. dem Wilcoxon-Test zu definieren, wie im Handbuch von SPSS 8.0 beschrieben.
Ausgewählte Gene bezogen auf ihre signifikante Über- und Unterexpression um einen Faktor von 2.5 werden als abweichend reguliert im kranken Gewebe oder als Krankheits-bezogene Gene bezeichnet. Krankheits-bezogene Gene werden dann nach den Funktionen ihrer codierten Protein gruppiert, z.B. Gene, die für Proteine des Signalwirkungswegs, Cytokine, Chemokine, Hormone, ihre Rezeptoren, spezifische Proteine oder infiltrierende Zellen oder Proteine, beteiligt an extrazellulärer Matrix, Zelladhesion, Migration, Zellteilung, Zellzyklus-Arretierung, codieren. Desgleichen können Gene von unbekannter Funktion, wie durch öffentliche EST-Datenbanken erhältlich, als Krankheits-bezogen identifiziert werden.
d) Screenen für eine Zelllinie mit einem Transcriptom, das am meisten dem von krankem Gewebe gleicht
Arzneistoffe, die möglicherweise die Expression von kranken Genen regulieren, können durch Screenen von großen Bibliotheken von chemischen oder biologischen Stoffen entdeckt werden. Um solche Arzneistoffe zu identifizieren, muss eine Screening-Zelllinie verfügbar sein, die genau das Transcriptom des kranken Gewebes widerspiegelt und in großen Mengen zur Durchführung eines umfangreichen Arzneistoff-Screenings verfügbar ist. Zudem wird Information benötigt, wie der Arzneistoffkandidat das Transcriptom der Zelllinie ändern sollte, die Merkmale des Transcriptoms des kranken Gewebes hat. Diese Information wird aus dem Transcriptom des gesunden Kontrollgewebes erhalten. Der Arzneistoff sollte Merkmale eines „gesunden" Transcriptoms wiederhergestellen können.
Eine menschliche Zelllinie, welche am meisten ähnlich zum zellulären Ursprung des kranken Gewebes ist, z.B. glatte Muskelzellen von Kranzarterien für Atherektomie, HepG2-Zellen für Leberkrankheiten, Nierenzellen für Nierenkrankheiten oder Kardiomyoblasten für Herzmuskelkrankheit, sollte verwendet werden. Zellen sollten unter Standardbedingungen gezüchtet werden, wie im Hersteller-Handbuch wie die von ATCC beschrieben.
Eine Transcriptomanalyse/Genexpressionsmusteranalyse kann durchgeführt werden, wie für das kranke und das Kontrollgewebe beschrieben, und das Genexpressionsmuster sollte mit dem Genexpressionsmuster des kranken und des gesunden Gewebe verglichen werden. Zur Herstellung einer Surrogat-Screening-Zelllinie sollte die Zelllinie ausgewählt werden, welche ein dem kranken Transcriptom am meisten ähnliches Transcriptom zeigt.
e) Anpassung einer Zelllinie, um krankes Transcriptom/Genexpressionsmuster nachauahmen
Um eine Surrogat-Screening-Zelllinie für das kranke Gewebe herzustellen, kann es notwendig sein, das Transcriptom der ausgewählten Zelllinie dem Transcriptom des kranken Gewebes anzupassen. Dies kann einerseits erreicht werden durch Inkubation der Zelllinie mit Verbindungen wie Cytokinen oder Hormonen, von denen gezeigt wurde, dass sie eine wichtige Rolle beim Genexpressionsmuster des kranken Gewebes spielen. Desgleichen können solche Verbindungen durch Transcriptomanalyse von krankem Gewebe identifiziert werden, wie veranschaulicht mit Neointima, wo Beweise für eine Rolle von Interferon-gamma erhalten wurden. Anstatt der Zugabe von Verbindungen mit Relevanz für die Krankheit kann die Screening-Zelllinie durch Co-Kultur mit anderen für die Pathophysiologie der Krankheit relevanten Zelltypen bestimmt werden. Solche Zellen können zum Beispiel inflammatorische Zellen, wie Makrophagen oder T-Zellen, sein, die in das kranke Gewebe wandern und durch freigesetzte Faktoren oder Zell-Zell-Kontakt zum Krankheits-spezifischen Genexpressionsmuster beitragen. In jedem Fall muss die Transcriptom-Analyse der Surrogat-Linie die optimale Zugabe identifizieren, um ein Krankheits-spezifisches Expressionsmuster zu erzeugen.
Verbindungen, die zur Anpassung des Transcriptoms einer Surrogat-Zelllinie an den kranken Zustand verwendet werden können, umfassen Cytokine, Wachstumsfaktoren, kleine Molekülverbindungen (Arzneistoffe), oder Peptide und Peptidmimetika. Zelllinien, die für solch eine Anpassung verwendet werden können, umfassen menschliche Monozyten-Zelllinien wie U937, THP-1 oder Monomac-6 oder menschliche T-Zelllinien wie Jurkat.
Die Co-Kultur/Behandlungsbedingungen, die in der Surrogat-Zelllinie zu einem Zustand führen, der dem kranken Transcriptom am nächsten kommt, werden für Drug-Screening ausgewählt.
Im Folgenden sollte ein spezifisches Beispiel die Herstellung eines Surrogats illustrieren. Insbesondere wird eine Surrogat-Zell(lini)e für restenotisches Gewebe bei den folgenden Schritten hergestellt:
a) Beschaffung von In-Stent restenotischem Gewebe
Patienten
Die Gruppe der In-Stent-Restenose-Studie bestand aus 13 Patienten, die sich separaten Atherektomie-Prozeduren durch X-Sizer innerhalb des wieder eingeengten Stents zwischen 4-23 Monaten nach primärer Stent-Implantation unterzogen. Alle Patienten gaben nach Information ihre Zustimmung zur Prozedur und erhielten 15,000 Einheiten Heparin vor dem Eingriff, gefolgt von intravenöser Heparin-Infusion, 1,000 Einheiten/h für die ersten 12 h nach Entfernung des Sheats als Standardbehandlung. Alle Patienten erhielten Aspirin, 500 mg intravenös, vor der Katheterisierung, und postinterventionelle antithrombotische Behandlung, die aus Ticlopidin (250 mg bds) und Aspirin (100 mg bds) bestand während der ganzen Studie.
Probenpräparation
Atherektomie-Proben wurden nach Debulking der Läsion unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis die mRNA-Präparation durchgeführt wurde, wie beschrieben. Für Histologie und Immunhistochemie des In-Stent-restenotischen Gewebes aus Kranzarterien (n=3), wurden die Proben in 4% Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet, wie beschrieben.
Morphologische Charakterisierung des restenotischen Gewebes
Immunhistochemie zur Zelltypisierung wurde an Paraffin-eingebetteten Schnitten von drei Neointima-Proben aus koronarer In-Stent-Restenose und zum Nachweis von FKBP12 an Gefrierschnitten von vier Neointima-Proben von einer Restenose der Halsschlagader durchgeführt. Drei μm-serielle Schnitte wurden auf DAKO ChemMateTM Capillary Gap Microcope Objektträger (100 μm) aufgebracht, die über Nacht bei 65°C gebacken, deparaffiniert und gemäß Standardprotokollen entwässert wurden. Zum Auffinden von Antigen wurden die Proben 4 min in einem Druckkocher in Citratpuffer (10 mM, pH 6.0) gekocht. Endogene Peroxidase wurde durch 1% H₂O₂/Methanol für 15 Minuten blockiert. Unspezifische Bindung des primären Antikörpers wurde durch Vorinkubation der Objektträger mit 4% getrockneter Magermilch in Antibody Diluent (DAKO, Dänemark) reduziert. Immunfärbung wurde durch die Streptavidin-Peroxidase-Technik unter Verwendung des ChemMate Detection Kits HRP/Red Rabbit/Mouse (DAKO, Dänemark) gemäß der Hersteller-Beschreibung durchgeführt. Die Prozeduren wurden in einem DAKO TechMateTM 500 Plus-automatisierten Färbesystem ausgeführt. Primäre Antikörper gegen Actin aus glattem Muskel (M0635, DAKO, Dänemark; 1:300), CD3 (A0452, DAKO, Dänemark; 1:80), MAC387 (E026, Camon, Deutschland; 1:20) und FKB12 (SA-218, Biomol, Deutschland, 1:20) wurden in Antibody Diluent verdünnt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Kerngegenfärbung mit Hematoxylin wurden die Objektträger entwässert und mit Pertex (Medite, Deutschland) abgedeckt.
Die zelluläre Zusammensetzung von In-Stent-restenotischem Material nach Debulking-Behandlung
Repräsentative Proben, erhalten aus X-Sizer-Behandlung einer neointimalen Hyperplasie, wurden durch Immunhistochemie analysiert, um ihre zelluläre Zusammensetzung zu bestimmen. 7A zeigt eine E.-van-Giesson-Färbung eines Schnitts, geschnitten von einer kleinen Probe von restenotischem Material nach Debulking-Behandlung. Mit diesem Färbeverfahren färben Kollagenfasern rot, Fibrin färbt gelb und Zytoplasma von glatten Muskelzellen färbt dunkel-gelb-braun. Der Hauptanteil des Volumens von Material nach Debulking-Behandlung war aus losen extrazelluläre Matrix-ähnlichen Kollagenfasern, gefärbt in hellrot, zusammengesetzt. Gelbe Fibrinfärbung war kaum nachweisbar. Zellen mit spindelförmigen Kernen und einem gelb/braun-gefärbten Zytoplasma waren häufig. Ihre Identität als glatte Muskelzellen und ihre hohe Häufigkeit in restenotischem Material wurde durch Immunfärbung mit einem Antikörper gegen α-Actin von glatten Muskelzellen gestützt (7B). Dort wird das Färbemuster eines Schnitts von einer ganzen Probe gezeigt, wie für Genexpressionsanalyse verwendet. Wie nachstehend beschrieben, führten solche Proben auch zu einem starken glatten Muskel-spezifischen α-Actin-mRNA-Signal (s. 8). Diese Ergebnisse stützen Befunde aus früheren Studien (Kearney, Circulation 95 (1997), 1998-2002; Komatsu, Circulation 98 (1998), 224-233; Strauss, J. Am. Coll. Cardiol. 20 (1992), 1465-1473), die zeigen, dass der in Neointima gefundene Hauptzelltyp aus glatten Muskelzellen stammt. Wie in der Literatur beschrieben (Kearney, a. a. O.; Komatsu, a. a. O.; Strauss, a. a. O.), konnten mononukleare Infiltrate in einigen Bereichen von restenotischem Gewebe-Exemplar nach Debulking-Behandlung auch identifiziert werden. Diese Infiltrate bestanden hauptsächlich aus Makrophagen und zu einem geringeren Grad aus T-Lymphozyten. Keine B-Lymphozyten waren im restenotischen Gewebe unter Verwendung eines Antikörpers gegen CD20 zur immunhistochemischen Färbung nachweisbar.
b) Transcriptom-Analyse von restenotischem Material
Transcriptom-Analyse von Neointima wurde unter Verwendung des Verfahrens zur mRNA-Amplifizierung durchgeführt, wie hier vorstehend beschrieben.
mRNA-Präparation
Mikroskopische Proben von krankem Gewebe wurden schnell eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis die mRNA-Präparation und cDNA-Synthese durchgeführt wurden. Gefrorenes Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff zermahlen und das gefrorene Pulver in Lyse/Bindungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 1% LiDS, 5 mM Dithiothreit (DTT)) gelöst und homogenisiert, bis vollständige Lyse erhalten wurde. Das Lysat wurde für 5 min bei 10,000 g bei 4°C zentrifugiert, um Zelltrümmer zu beseitigen. mRNA wurde unter Verwendung des Dynbeads^® mRNA Direct KitTM (Dynal, Deutschland) in Anlehnung an die Empfehlung des Herstellers präpariert. Kurz, das Lysat wurde zu 50 μL vorgewaschenen Dynabeads Oligo (dT)₂₅ pro Probe zugegeben und mRNA wurde unter Rotieren auf einem Mixer für 30 min bei 4°C anneliert. Der Überstand wurde entfernt und der Dynabeads Oligo (dT)₂₅/mRNA-Komplex wurde zweimal mit Waschpuffer, der Igepal enthielt (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 025% Igepal), gewaschen und einmal mit Waschpuffer, der Tween-20 enthielt (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 0.5% Tween-20).
Präparation von amplifizierter cDNA
cDNA wird durch PCR amplifiziert unter Verwendung des Verfahrens von Klein et al. (C. Klein et al.). Die cDNA-Synthese des ersten Strangs wird als Festphasen-cDNA-Synthese durchgeführt. Eine Zufalls-Initialreaktion mit Hexanucleotid-Primern wird für die reverse Transkriptionsreaktion verwendet. mRNAs werden jeweils revers transkribiert in einem 20 μL-Reaktionsvolumen, das 1 × First Strand Buffer (Gibco); 0.01 M DTT (Gibco), 0.25% Igepal, 50 μM CFL5c-Primer [5'-(CCC)5 GTC TAG A (NNN)2-3'] jeweils 0.5 mM dNTPs (MBI Fermentas) und 200 U Superscript II (Gibco) enthielt, und bei 44°C für 45 min inkubiert. Eine nachfolgende Verlängerungsreaktion wird in einem Reaktionsvolumen von 10 μL durchgeführt, das 4 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT, 0.2 mM dGTP, 10 mM KH₂PO₄ und 10 U terminale Desoxynucleotid-Transferase (MBI Fermentas) enthielt. Die Mischung wird für 24 min bei 37°C inkubiert.
cDNA wird amplifiziert durch PCR in einem Reaktionsvolumen von 50 μL, das 1 × Puffer 1 (Expand^TM Long Template PCR Kit, Boehringer Mannheim), 3% deionisiertes Formamid, 120 μM CP2-Primer [5'-TCA GAA TTC ATG (CCC)5-3'], 350 μM dNTP und 4.5 U DNA-Polymerase-Mix (Expand^TM Long Template PCR Kit, Roche Diagnostics, Mannheim) enthielt. Die PCR-Reaktion wird für 20 Zyklen mit den folgenden Zyklusparametern durchgeführt: 94°C für 15 s, 65°C für 0:30 min, 68°C für 2 min; weitere 20 Zyklen mit: 94°C für 15 s, 65°C für 30 s, 68°C für 2:30 + 0:10/Zyklus min; 68°C 7 min; andauernd 4°C.
Expression von spezifischen Genen in mikroskopischen menschlichen Gewebeproben
Um die in situ mRNA-Niveaus optimal zu bewahren, wurden restenotische und Kontrollproben unmittelbar nach der Ernte in flüssigem Stickstoff eingefroren und sorgfältig lysiert, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Nach PCR-Amplifizierung der synthetisierten cDNA wurde die Menge der amplifizierten cDNA durch einen Dot-Blot-Assay gemessen und gefunden, dass sie zwischen 200-300 ng/μl ist. Die Qualität jeder amplifizierten cDNA-Probe wurde durch genspezifische PCR getestet unter Verwendung von Primern, die cDNAs für β-Actin, α-Actin aus glatten Muskelzellen und den ubiquitären Elongationsfaktor EF-1α nachweisen. 8 zeigt ein repräsentatives Ergebnis mit Material aus Patient B und Kontrollmedia aus Spender b. Bei beiden Exemplaren waren PCR-Signale von korrekter Größe der Haushaltsgene β-Actin und EF-1a in equivalenten Mengen nachweisbar (vgl. Spuren 1 und 2 mit Spuren 4 und 5). Zusätzlich wurden α-Actin-Signale als Marker für glatte Muskelzellen aus jeder Probe erhalten (Spuren 3 und 6). Diese Ergebnisse zeigen, dass mRNA-Präparation, cDNA-Synthese und PCR-Amplifizierung von cDNA mit mikroskopischen menschlichen Restenose-Proben durchführbar ist.
Dig-dUTP-Markierung von cDNA-Sonden
25 ng von jeder cDNA wird mit Digoxigenin-11-dUTP (Dig-dUTP) (Roche Diagnostics) während PCR markiert. PCR wurde in einer 50 μL-Reaktion mit 1 × Puffer 1, 120 μM CP2-Primer, 3% deionisiertes Formamid, 300 μM dTTP, 350 μM dATP, 350 μM dGTP, 350 μM dCTP, 50 μM Dig-dUTP, 4.5 U DNA-Polymerase-Mix durchgeführt. Zyklusparameter sind: ein Zyklus: 94°C für 2 min; 15 Zyklen: 94°C für 15 s, 63°C für 15 s, 68°C für 2 min; 10 Zyklen: 94°C für 15 s, 68°C für 3 min + 5 s/Zyklus; ein Zyklus: 68°C, 7 min, andauernd 4°C.
Hybridisierung von Clontech-cDNA-Arrays mit dUTP-markierten cDNA-Sonden
cDNA-Arrays werden vorhybridisiert in DigEASYHyb-Lösung (Roche Diagnostics), die 50 mg/L DNAsel (Roche Diagnostics) verdaute genomische E. coli-DNA, 50 mg/L pBluescript-Plasmid-DNA und 15 mg/L Heringssperma-DNA (Life Technologies) enthielt, für 12h bei 44°C, um durch Blockierung von nicht-spezifischen Nucleinsäure-Bindungsstellen Hintergrund auf der Membran zu verringern. Die Hybridisierungslösung wird mit kommerziell erhältlichen cDNA-Arrays mit ausgewählten Genen, relevant für Krebs, kardiovaskularer und Stressreaktion (Clontech), hybridisiert. Jede cDNA-Matrize wird denaturiert und zur Vorhybridisierungslösung bei einer Konzentration von 5 μg/ml Dig-dUTP markierter cDNA zugegeben. Die Hybridisierung wurde für 48 Stunden bei 44°C durchgeführt.
Blots werden nachfolgend einmal in 2 × SSC/0.1% SDS und einmal in 1 × SSC/0.1% SDS bei 68°C gespült, gefolgt von Waschung für 15 min einmal in 0.5 × SSC/0.1% SDS und zweimal für 30min in 0.1 × SSC/0.1% SDS bei 68°C. Zum Nachweis von Dig-markierter cDNA, hybridisiert mit dem Array, wurde der Dig Luminescent Detection Kit (Boehringer, Mannheim) verwendet, wie im Benutzerhandbuch beschrieben. Zum Nachweis des Chemilumineszenz-Signals werden Arrays Chemilumineszenz-Filmen für 30 min bei Raumtemperatur ausgesetzt. Die Quantifizierung der Array-Daten wurde durch Scannen der Filme und Analyse mit Array-Visionssoftware (Imaging Research Inc., St. Catherines, Canada) durchgeführt. Der Hintergrund wurde subtrahiert und Signale wurden auf neun Haushaltsgene, anwesend auf jedem Filter, normalisiert, wobei der Durchschnitt der Haushaltsgen-Expressionssignale auf 1 gesetzt und der Hintergrund auf 0 gesetzt wurde.
Jede markierte Sonde wurde mit drei unterschiedlichen kommerziellen cDNA-Arrays hybridisiert, welche die Expressionsanalyse von insgesamt 2,435 bekannten Genen ermöglichte. 9 zeigt ein repräsentatives Hybridisierungsmuster, erhalten mit einem Array unter Verwendung der Sonden, präpariert aus restenotischem Gewebe von Patient B (Tafel A) und Media von Spender b (Tafel B). Im Einklang mit der in 8 gezeigten genspezifischen Analyse wurden vergleichbare Hybridisierungssignale erhalten mit der Positivkontrolle von menschlicher genomischer cDNA, getüpfelt auf die rechten und unteren Spuren des Arrays und mit cDNA-Flecken von verschiedenen Haushaltsgenen (s. zum Beispiel Fleck D). Wenn eine biologische Probe von der cDNA-Synthese und den PCR-Amplifizierungsreaktionen ausgelassen wurde, wurden fast keine Hybridisierungssignale erhalten (9, Tafel C), was zeigt, dass Hybridisierungssignale fast ausschließlich von zugegebenen Proben stammten und nicht aus DNA-Verunreinigungen in verwendeten Reagenzien oder Materialien.
Datenanalyse
Die Quantifizierung von Arraydaten wurde durch Scannen der Filme und Analyse mit Array-Visionssoftware (Imaging Research Inc., St. Catherines, Canada) durchgeführt. Der Hintergrund wurde subtrahiert und Signale wurden auf neun Haushaltsgene normalisiert, anwesend auf jedem Filter, wobei der Durchschnitt der Haushaltsgenexpressionssignale auf 1 gesetzt und der Hintergrund auf 0 gesetzt wurde. Zur logarithmischen Darstellung, gezeigt in 13A und 13B, wurden Werte mit 1000 multipliziert. Ein Mittelwert >0,05 im Durchschnitt aller Proben in einer Gruppe wurde als positives Signal betrachtet. Unterschiede im mittleren Expressionsniveau um einen Faktor >2.5fach zwischen der Studien- und der Kontrollgruppe wurden weiter statistisch analysiert.
c) Wahl des Kontrollgewebes
Da die hauptsächliche Zellkomponente von Neointima aus glatten Muskelzellen besteht, wurden Media/Intima von gesunden Kranzarterien genommen oder da Kranzarterien zu den nicht-elastischen aber Muskelarterien gehören, wurde Muskelarterien als Kontrollgewebe genommen.
Die Kontrollgruppe bestand aus 6 Proben von Kranzarterien von drei verschiedenen Patienten, die sich einer Herztransplantation unterzogen. Zusätzlich wurden 5 Proben von Muskelarterien des Gastrointestinaltrakts aus fünf verschiedenen Patienten als Kontrolle genommen, weil Kranzarterien histologisch zu den Muskelarterien gehören. Die Kontrollproben wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren. Vor der mRNA-Präparation wurden Media und Intima der Kontrollarterien präpariert und durch Immunhistochemie auf atherosklerotische Änderungen untersucht. Wenn es keine atherosklerotischen Änderungen der Gefäßmorphologie gab, wurden die Proben (ca. 1×1 mm) als gesunde Kontrollproben verwendet und mRNA- und cDNA-Präparation und Transcriptom-Analyse wurden, wie vorstehend für neointimales Gewebe beschrieben, durchgeführt.
d) Definition des Neointima-spezifischen Genexpressionsprofil
Insgesamt 1,186 Gene (48.7%) von 2,435 ergaben nachweisbare Hybridisierungssignale auf cDNA-Arrays mit Neointima- und Kontrollproben über einen 20fachen Expressionsniveaubereich (13A). Davon schienen 352 Gene (14.5%) um einen Faktor >2.5fach zwischen restenotischen und Kontrollproben unterschiedlich exprimiert zu werden. Jedoch schwankten die Expressionsniveaus wesentlich unter den einzelnen Proben (s. z.B. 9). Deswegen wurde eine statistische Analyse angewendet, um jene Gene zu identifizieren, die zwischen Studien- und Kontrollgruppen mit hoher Signifikanz unterschiedlich exprimiert werden (s. hier vorstehend). Auf diese Weise wurden 224 Gene (9.6%) identifiziert, die um einen Faktor von mindestens 2.5fach zwischen der Restenose-Studiengruppe und der Kontrollgruppe mit einer Signifikanz von p<0.03 im Wilcoxon-Test unterschiedlich exprimiert wurden. 167 (75%) Gene davon wurden in der Restenose-Studiengruppe verglichen zur Kontrollgruppe überexprimiert und 56 Gene (25%) unterexprimiert gefunden (13B).
e) Wahl der Surrogat-Zelllinie
Menschliche Neointima besteht aus einer heterogenen Zellpopulation. Es wurde deswegen versucht, die unterschiedlichen, statistisch relevanten Genexpressionsmuster, gefunden mit Neointima, zu Mustern, die beigetragen werden von peripheren Blutzellen der Patienten und von kultivierten menschlichen CASMCs, d.h. Zellen, die am häufigsten in restenotischem Gewebe angetroffen werden (Komatsu, a. a. O.), in Beziehung zu bringen. Hinsichtlich der Neointima-Expression fielen die 224 abweichend regulierten Gene in vier Untergruppen (14). Gruppe I listet 62 Gene auf, die in Neointima überexprimiert wurden und nicht stark oder nachweisbar in Kontrollgefäßen, CASMCs oder Blutzellen exprimiert wurden (14A). In Gruppe II werden 43 Gene aufgelistet, die in Neointima und CASMCs gleichermaßen exprimiert werden, was darauf hinweist, dass dieses Gencluster in Neointima durch sich vermehrende SMCs beigetragen wurde (14B). In Gruppe III werden 62 Gene aufgelistet, die in Neointima und Blutzellen gleichermaßen exprimiert werden, was darauf hinweist, dass dieses Gencluster zu dem der Neointima durch infiltrierte Blutzellen beigetragen wurde (14C). Diese Ansicht wird gestützt durch Expression in Gruppe III der größten Zahl von Genen, bezogen auf Entzündung, in allen vier Gruppen. Schließlich werden in Gruppe IV 56 Gene aufgelistet, die in Neointima herunterreguliert werden, verglichen zur Kontrollgruppe (14D).
Hochregulation von γ-IFN-bezogenen Genen in Neointima
Ein überraschendes Merkmal des menschlichen Neointima-Transcriptoms war die offensichtlich gleichrangige Hochregulation von 32 Genen, bezogen auf IFN-γ-Signalwirkung (16). Der IFN-γ-Rezeptor alpha wurde in Neointima, sich vermehrenden CASMCs und – zu einem geringeren Grad – in Blutzellen exprimiert, während der IFN-γ-Rezeptor beta hauptsächlich in Neointima-Proben exprimiert wurde. Einheitlich mit einer Aktivierung von IFN-γ-Signalwirkung wurde eine Hochregulation von zwei Transkriptionsfaktoren in Neointima gefunden, die wesentlich für die IFN-Signalwirkung sind: IRF-1 und ISGF3g (p48) (14, 15, 16). Von diesen Transkriptionsfaktoren ist bekannt, dass sie von IFN-γ transkriptionell hochreguliert werden, und beide sind Schlüsselakteure bei der IFN-γ-Signalwirkung. Desgleichen wurde Hochregulation der Tyrosinkinase Pyk2 beobachtet (16), von welcher gezeigt wurde, dass sie eine Rolle bei der Signaltransduktion durch Angiotensin in SMCs spielt (Sabri, Circ. Res. 83 (1998), 841-851). Pyk2 wird von IFN-γ selektiv aktiviert und Hemmung von Pyk2 in NIH 3T3-Zellen resultiert in einer starken Hemmung der IFN-γ-induzierten Aktivierung von MAPK und STAT1.
Ein Schlüsselereignis bei der IFN-γ-induzierten Wachstumshemmung und Apoptose ist die Induktion von Caspasen (Dai, Blood 93 (1999), 3309-3316). In der hier präsentierten Analyse der Hochregulation von IFN-γ-regulierten Genen für Caspase-1, Caspase-8 und DAP-1 in menschlicher Neointima. Jedoch wurden mRNAs für die anti-apoptotischen Proteine BAG-1, Pim-1 (beide von IFN-γ reguliert) und BCL-2-bezogenes Protein A1 auch in Neointima gegenüber der Kontrolle hochreguliert (16), was die Ansicht stützt, dass Proliferation und Apoptose gleichzeitig in menschlicher Neointima geschehen, mit einem Übergewicht der Proliferation.
Die koordinierte Regulation von Genen, deren Produkte bei unterschiedlichen Schritten im Neointima-Prozess wirken, war ein wiederkehrendes Thema unserer Genexpressionsanalyse. Bezugnehmend auf den IFN-γ-Weg wurden nicht nur die Gene für den vollständigen Rezeptor, die Haupttranskriptionsfaktoren, Komponenten des Signaltransduktionswegs (Dap-1, BAG-1, Pim-1, IFN-γ-induzierbares Protein, IFN-induzierbares Protein 9-27) induziert, sondern auch mehrere Zielgene des IFN-γ-Wegs wie CD40, CD13 und Thrombospondin-1 (16).
Das IFN-γ-regulierte Gencluster wurde in Neointima-Proben exprimiert, aber einige der relevanten Gene, wie IRF-1, wurden auch in Blutproben exprimiert. Um den Zelltyp zu identifizieren, der überwiegend zum IFN-γ-regulierten Muster beitrug, wurden Gefrierschnitte von Neointima-Proben aus koronarer In-Stent-Restenose (n=3) und aus Restenose von peripheren Arterien (n=6) mit Antikörpern, spezifisch für IRF-1, gefärbt. Dieses Protein wurde gewählt, weil es eine wesentliche Komponente des IFN-γ-Signaltransduktionswegs ist (Kimura, Genes Cells 1 (1996), 115-124) und koordiniert mit den anderen Genen im Cluster exprimiert wurde (17). Immunhistochemische Analyse zeigte starke Kern- und zytoplasmatische Färbung von IRF-1 in neointimalen SMCs einer Restenose der Halsschlagader (17B) und von koronarer In-Stent-Restenose (18C), wie durch ihre spindelförmigen Kerne identifiziert und durch Färbung mit dem glatten Muskelzellmarker alpha-Actin (18B). Die Kernfärbung von IRF-1 bei In-Stent-Restenose (18C) zeigte an, dass der IRF-1-Transkriptionsfaktor auch aktiviert wird. SMCs in Kontrollmedia der Halsschlagader zeigten keine IRF-1-Färbung (17B). CD3-positive Zellen waren in der Probe viel weniger vorhanden (18C) als SMCs (18D), was anzeigt, dass SMCs größtenteils zur gesteigerten IRF-1-Expression in menschlicher Neointima beitrugen.
Definition von Züchtungsbedingungen, um das Transcriptom-Profil dem von restenotischem Gewebe anzupassen: IFN-γ
Um das transkriptionelle Profil von glatten Muskelzellen von gezüchteten menschlichen Kranzarterien (CASMC) (Clonetics) dem von Neointima anzupassen, wurden CASMC mit IFN-γ stimuliert und eine Transcriptom-Analyse durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. CASMC wurden in Wachstumsmedium, wie im Hersteller-Handbuch beschrieben, gezüchtet, bis 50% Konfluenz erreicht wurde. Danach wurden Zellen mit 1000U/ml IFN-γ (R&D, Deutschland) für 16 Stunden bei 37°C stimuliert. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und RNA-Präparation, cDNA-Synthese und Amplifizierung und Transcriptom-Analyse wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben.
Wie in 19 gezeigt, konnte das Neointima-spezifische IFN-γ-Genexpressionsmuster durch Inkubation von CASMCs mit 1000 U/ml IFN-γ erzeugt werden.
Definition des Transcriptom/Genexpressionsmusters von Neointima nach Inkubation mit einem IFN-Antagonisten
Mikroskopische Proben des In-Stent-restenotischen Gewebes wurden mit einem Antagonisten für IFN-γ für unterschiedliche Zeiten inkubiert und eine Transcriptom-Analyse wurde durchgeführt, wie beschrieben. Das Transcriptom von behandelter Neointima wurde verglichen mit dem Transcriptom von unbehandelter Neointima und gesundem Kontrollgewebe, um den therapeutischen Effekt von IFN-γ-Antagonisten zu messen.
Definition des Transcriptom/Genexpressionsmusters von Neointima nach Inkubation mit Rapamycin
In der Literatur wurde gezeigt, dass Rapamycin, ein Ligand des intrazellulären Proteins FKBP12 Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen hemmt und neointimale Hyperplasie in einem Schweinemodell von Restenose vermindern kann. Ebenso wurde signifikante Hochregulation von FKBP12 im Neointima-spezifischen Transcriptom gefunden, um den therapeutischen Effekt von Rapamycin auszuwerten.
Da sich vermehrende CASMC FKBP12 wie Neointima überexprimieren, kann diese Zelllinie als mögliche Surrogat-Zelllinie für Neointima hinsichtlich therapeutischer Effekte von Rapamycin verwendet werden. Deswegen wurden in einem ersten Schritt CASMC mit 100ng/ml Rapamycin (Sigma) für 24 Stunden inkubiert und eine Transcriptom-Analyse wurde durchgeführt, um den therapeutischen Effekt zu überwachen. Danach werden mikroskopische Exemplare von In-Stent-restenotischem Gewebe mit Rapamycin inkubiert und eine Transcriptom-Analyse wurde durchgeführt, wie hier vorstehend beschrieben. Das Transcriptom/Genexpressionsmuster von Rapamycin-behandelten CASMC wurde mit dem Transcriptom von Rapamycin-behandelter Neointima verglichen, um Effektivität von CASMC als Surrogat-Zelllinie für Neointima zu messen. Tumorsuppressor-Gene und Proliferation-inhibierende Gene haben in den CASMCs hochreguliert; deswegen können die CASMCs als ein wahres Surrogat für Neointima betrachtet werden.
Beispiel IX: Hochregulierte Proteinexpression von Emmprin und Transferrin-Rezeptor auf Tumorzellen
Transcriptom-Analyse von mikrometastatischen Einzelzellen, die von Patienten mit unterschiedlichen Tumor- und Krankheitsstadien stammten, offenbarten eine hochregulierter Expression von Genen, die bei Zellzyklusregulation, Zytoskelett-Organisation, Adhesion und proteolytischer Aktivität beteiligt sind. Gesteigerte mRNA-Expression von Emmprin wurde durch Array-Hybridisierung in 10 von 26 mikrometastatischen Zellen aus Knochenmark von Brust- und Prostatakrebspatienten gefunden, was einen invasiven Phänotyp dieser Zellen anzeigt. EMMPRIN (extrazellulärer Matrix-Metalloproteinase-Induktor, CD147) ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, das auf der Oberfläche von Tumorzellen anwesend ist und angrenzende Fibroblasten stimuliert, um Matrix-Metalloproteinasen zu produzieren (MMPs, Guo, J. Biol. Chem. 272 (1997), 24-27 und Sameshima, Cancer Lett. 157 (2000), 177-184 und Li, J. Cell Physiol. 186 (2001), 371-379). Die Ergebnisse wurden durch genspezifische PCR kontrolliert, die eine ähnliche Empfindlichkeit offenbaren, verglichen zur Array-Hybridisierung. Unter Verwendung einer unterschiedlichen Emmprin-spezifischen Sonde zur Array-Hybridisierung, wurde die Emmprin-Botschaft sogar in 16/26 (61%) Proben nachgewiesen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Empfindlichkeit des Array-Aufbaus, um die Transkripte einer Zufalls-geprimten Einzelzell-cDNA nachzuweisen.
Um die Hochregulation von Emmprin-Expression auf Tumorzellen nicht nur auf mRNA- sondern auch auf Proteinniveau zu korrelieren, wurden Objektträger aus Knochenmarkszellen von Krebspatienten präpariert, wie vorher beschrieben (Pantel, Lancet 347 (1996), 649-653). Die Objektträger wurden unter Verwendung von 10% menschlichem AB-Serum in PBS für 20 min geblockt. Aus jeder Probe wurden eine Million Knochenmarkszellen auf die Anwesenheit von Cytokeratin-positiven Zellen, welches ein Marker für Epithelzellen ist, gescreent. Eine doppelte Färbeprozedur unter Verwendung des EMMPRIN-spezifischen Antikörpers MEM 6/2 (Koch, Int. Immunol. 11 (1999), 777-86) und eines Biotin-konjugierten A45B/B3-Antikörpers, der mit verschiedenen Cytokeratin-Familienmitgliedern reagiert, wurde durchgeführt. Antikörper-Inkubationen waren wie folgt: MEM 6/2, 45 min., 5 μg/ml; Z259 und APAAP-Komplex gemäß den Hersteller-Anleitungen (DAKO). Die Objektträger wurden zwischen allen Antikörper-Inkubationen 3 × 3min. in PBS gewaschen. Bevor das A45 B/B3-Biotin-F(ab)₂-Fragment zugegeben wurde, wurde ein zusätzlicher Blockierungsschritt mit 10% Mäuseserum in PBS für 20 min durchgeführt. Das A45 B/B3-Biotin-Konjugat (2 μg/ml; 45 min.) wurde durch Streptatvidin-Cy3 nachgewiesen (1.2 μg / ml; 15 min; Jackson laboratories). Nach dem Waschen wurde FAST-BLUE (Sigma) als Substrat für die alkalische Phosphatase (10-30 min.) verwendet. Für alle Objektträger wurde die Prozedur identisch mit Isotyp-Kontrollen durchgeführt. EMMPRIN wurde auf 82% von 140 Cytokeratin-positiven Tumorzellen nachgewiesen, die aus 68 Patienten mit Brust-, Prostata- und Lungenkrebs stammten (Tab. 8 und 20). In nur zwei Aspiraten waren alle nachgewiesenen Cytokeratin-positiven Zellen (n=4) negativ für EMMPRIN.
Tabelle 8. EMMPRIN (EMM)-Proteinexpression von disseminierten Cytokeratinpositiven (CK+) Tumorzellen im Knochenmark
Neben Emmprin wurde auch die Expression des Transferrin-Rezeptors (CD71) auf Tumorzellen auf Proteinniveau ausgewertet. Die Transcriptom-Analyse von sechs kleinen aus nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom stammenden Biopsien und fünf Biopsien aus der Kontrollschleimhaut von Patienten mit chronischer Bronchitis zeigten, dass die Signalintensität für CD71 sich außerordentlich zwischen normalen und Tumorgewebe unterschied (Tabelle 9).
Tabelle 9. Signalintensitäten für die Transferrin-Rezeptor-cDNA bei Array-Hybridisierung
Unterschiedliche Expression wurde an Kryoschnitten von Tumorbiopsie Bio10 und einer Biopsie von normaler Schleimhaut (Bio6G) getestet. Unspezifische Bindung wurde mit 10% AB-Serum in PBS für 20 Minuten blockiert und Inkubation mit CD71-PE (Phycoerythrin)-konjugierten Antikörper (Caltag) wurde für 45 Minuten durchgeführt. Zur Kontrolle wurde ein Anti-CD4-PE-Antikörper verwendet. Keine Färbung des CD4-Antikörpers wurde an beiden Gewebeproben beobachtet. Der CD71-PE-Antikörper färbte selektiv die Epithelregionen der Tumorbiopsie, während die normale Schleimhaut negativ für Transferrin-Rezeptorexpression war (21).
Beispiel X: Anti-apoptotische Wirkung von IFNγ auf glatte Muskelzellen
Die Wirkung von IFNγ auf das Überleben von gezüchteten sich vermehrenden SMCs wurde durch Durchflusszytometrie analysiert. Für diesen Grund wurden primäre menschliche koronare glatte Muskelzellen von CellSystems (Deutschland) erhalten und in Glattem Muskel-Zellwachstumsmedium (CellSystems), das 5% fetales Kälberserum (CellSystems) enthielt, bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ gezüchtet. SMCs wurden zwischen Passagen 2 und 4 verwendet. Die Behandlung mit 1000U/ml rh-IFNγ (R&D Systems) wurde für 16h durchgeführt. Zur Induktion des Zelltods wurden SMCs bei 37°C für 1 h in HBSS inkubiert, das 100 μmol/l H₂O₂ und 100 μmol/l Eisensulfat enthielt. Danach wurden die Zellen in frisch präpariertem Kulturmedium für 8h weiter gezüchtet. Zellen wurden mit FITC-markiertem Annexin V (Roche Diagnostics) und Propidiumiodid (PI) markiert gemäß der Hersteller-Instruktionen. 10⁴ Ereignisse wurden mit einem Durchflusszytomer (Becton Dickinson) analysiert.
Die durchflusszytometrische Analyse offenbarte einen anti-apoptotischen Effekt von IFNγ auf SMCs (22). FACS-Analyse nach Doppelfärbung mit PI und FITC-markiertem Annexin V zeigte eine Verringerung von spontaner Apoptose von 10% auf 6% nach Behandlung mit IFNγ. Der Effekt wurde bedeutender nach Induktion der Apoptose in SMCs mit H₂O₂. Die Behandlung mit IFNγ verringerte die Zahl von apoptotischen Zellen von 54% auf 27%. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass IFNγ einen anti-apoptotischen Effekt auf SMCs ausübt.
Beispiel XI: Inhibitorischer Effekt von IFNγ auf Neointima-Bildung in einem Mausmodell für Restenose
Um die vaskulare proliferative Remodellierung nach Halsschlagaderligatur zu untersuchen, wurde ein Maus-Blutfluss-Stillstand-Modell (Kumar, Circulation 96 (1997), 4333-4342) verwendet. Dieses Modell wird durch vaskulare Proliferation von SMCs als Antwort auf die Ligatur der gemeinsamen Halsschlagader nahe der Gabelung charakterisiert. Um den Effekt einer IFN-γ-Rezeptor-Nullmutation auf die Entwicklung von Neointima in einem Mausmodell von Restenose zu untersuchen, wurden IFN-γR^-/-Knockout-Mäuse verwendet. Erwachsene männliche 129/svJ-Mäuse (N=16) und IFN-γR^-/--Mäuse (n=11) wurden durch intraperitoneale Injektion einer Lösung von Xylazin (5 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert und die linke gemeinsame Kopfschlagader wurde nahe der Gabelung abgebunden. Nach 4 Wochen wurden die Tiere wieder anästhesiert, geopfert und für 3 min durch Perfusion mit 4% Paraformaldehyd in 0.1 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7.3) fixiert. Nach dem Ausschneiden der linken Halsschlagadern wurden die Gefäße durch Eintauchen in 70% Ethanol fixiert. Die Halsschlagadern wurden in Paraffin eingebettet und Serienschnitte (%μm dick) wurden geschnitten.
Eine morphometrische Analyse wurde auf v.-Giesson-gefärbten Querschnitten bei einem Abstand von 600 μm von der Ligaturstelle durchgeführt. Digitalisierte Bilder der Gefäße wurden unter Verwendung der Bildanalysesoftware SCION image 4.0.2 analysiert. Die Media-Dicke wurde als die Differenzen im Durchmesser zwischen der äußeren und der inneren elastischen Lamina erhalten, und die Neointima-Dicke als Differenz zwischen innerer elastischer Lamina und Lumendurchmesser. Daten aus morphometrischen Analysen wurden als Mittelwert ± SEM für die zwei Mäusegruppen berichtet und durch den t-Test für ungepaarte Proben getestet. Ein p-Wert < 0.05 wurde als signifikant betrachtet. Alle Analysen wurden mit der Anwendung des SPSS statistischen Pakets (Version 8.0) durchgeführt.
Eine beachtliche Wandverdickung auf Grund von Media-Proliferation und Neointima-Bildung wurde bei 16 Wildtyp-Mäusen 4 Wochen nach der Ligatur (23) beobachtet. Bei 11 IFN-γR^-/--Mäusen war die mediale plus neointimale Verdickung signifikant reduziert wie als Mittelwert ± SEM gezeigt und analysiert durch den t-Test für ungepaarte Proben. Entsprechend der Verringerung in proliferativen Antworten hatten 11 IFN-yR^-/--Mäuse einen signifikant größeren Lumendurchmesser des behandelten Halsschlagadersegments als die Wildtyp-Mäuse (108±15 um gegenüber 91±24 um und p=0.033).
Beispiel XII: Suppressions-subtraktive Hybridisierungs (SSH)-Analyse
SSH ist ein neues und hoch effektives Verfahren zur Herstellung von subtrahierten cDNA-Bibliotheken. Subtraktive cDNA-Hybridisierung war eine leistungsfähige Herangehensweise, um cDNAs auf unterschiedlich exprimierten Genen zu identifizieren und zu isolieren (Duguin Nucl. Acid. Res. 18 (1990), 2789-2792 und Hara Nucl. Acid. Res. 19 (1991), 7097-7104 und Hendrick Nature (London) 308 (1984), 149-153). Allgemein werden Hybridisierung von cDNA aus einer Population (Tester) zu einem Überschuss an mRNA (cDNA) aus einer anderen Population (Treiber) und nachfolgende Trennung des unhybridisierten Anteils (Ziel) von den hybridisierten gemeinsamen Sequenzen durchgeführt. SSH wird verwendet, um selektiv Ziel-cDNA-Fragmente (unterschiedlich exprimiert) zu amplifizieren und gleichzeitig Nicht-Ziel-DNA-Amplifizierung zu unterdrücken. Das Verfahren basiert auf Suppressions-PCR: lange invertierte terminale Wiederholungen, wenn an DNA-Fragmente angeheftet, können selektiv die Amplifizierung von unerwünschten Sequenzen bei der PCR-Prozedur unterdrücken. Das Problem der Unterschiede bei mRNA-Häufigkeit wird durch einen Hybridisierungsschritt bewältigt, der Sequenzhäufigkeit während des Ablaufs der Subtraktion abgleicht. Eine subtraktive Hybridisierungsrunde ist erforderlich, die zu einer 1000fachen Anreicherung für unterschiedlich exprimierte cDNAs führt (für Review s. Diatchenko Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 6025-30 und Diatchenko Methods Enzymol. 303 (1999), 349-80).
Mehrere Modifikationen wurden in das Standard-SSH-Protokoll zur unterschiedlichen Genexpressionsanalyse einer sehr kleinen Zahl von Zellen eingeführt (24). 1) mRNA-Amplifikate, hergestellt gemäß dem in dieser Patentanmeldung beschrieben Verfahren, waren revers transkribiert und unter Verwendung von CP2-Primern amplifiziert worden; 2) mRNA-Amplifikate, hergestellt gemäß dem in dieser Patentanmeldung beschrieben Verfahren, bilden selbst Pfannen-ähnliche Strukturen; 3) Einführung einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle (z.B. EcoRI) in den CP2-Primer.
a) Materialien und Methoden
Oligonucleotide

cDNA-Synthese-Primer: CP2: 5'-TCA GAA TTC ATG CCC CCC CCC CCC CCC C-3' (SEQ ID NO:14)

Adapter Adapter 1 (A1)
Adapter 2 (A2)
PCR-Primer:
Treiber-Präparation
Zum Nachweis von in mikrometastatischen Tumorzellen verglichen zu normalen Knochenmarkszellen unterschiedlich exprimierten Transkripten wurde der Treiber aus Knochenmarksproben präpariert, die aus gesunden Spendern stammten. Aus drei Knochenmarksspendern wurde unter Verwendung von Standardprotokollen die gesamte RNA isoliert. RNA entsprechend 300.000 Knochenmarkszellen wurde dann zu 30 μl Dynal-Kügelchen zugegeben und das Prokoll der mRNA-Amplifizierung wurde durchgeführt.
Hybridisierungskinetiken wurden durch Verdauung von 5 μg Treiber mit 50 Einheiten von Restriktionsenzym Rsa I in einer 50 μl-Reaktion, die 0,75 × Puffer NEB1 (New England Biolabs) enthielt, für 90 min verbessert. Die Probe wurde mit einer Microcon 10-Säule (Millipore) entsalzt.
Tester-Präparation
Eco RI-verdauter Tester wurde in 50 μl unter Verwendung von 50 U EcoRI präpariert. Als Tester wurde eine Mischung von vier Einzelzellen, isoliert aus vier verschiedenen Brustkrebspatienten, ausgewählt. Nach Verdauung mit EcoRI wurde der Tester zu einer 100 ng/μl-Konzentration in Wasser verdünnt. Anschließend wurde eine Sonde zu 5 μl Adapter A1 (SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32) und eine zu Adapter A2 (SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34) (50 μM) in zwei unabhängigen 10 μl-Ligationsreaktionen bei 15°C über Nacht ligiert unter Verwendung von 5 Einheiten T4-DNA-Ligase (Roche). Die Ligationsreaktion wurde durch Zugabe von 2 μl 0.1 M EDTA und Erhitzen für 5 min bei 70°C inaktiviert.
Subtraktive Hybridisierung
1 μl Treiber (500 ng) wurde zu jedem der zwei Röhrchen zugegeben, die 2 μl von Tester-cDNA (etwa 18 ng) ligiert an Adapter A1 (SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32) und an Adapter A2 (SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34) in Hybridisierungspuffer (1M NaCl, 50 mM Hepes, 1 mM CTAB) enthielten. Die Lösung wurde mit Mineralöl überschichtet, 1 min bei 98°C denaturiert und dann für 10-14 Stunden bei 68°C ein Annealing ermöglicht.
Nach der ersten Hybridisierung wurden beide Proben zusammen gemischt und etwa 150 ng Hitze-denaturierter Treiber in 1.5 μl Hybridisierungspuffer wurden zugegeben. Der Probe wird ermöglicht, für 10-14 Stunden zu hybridisieren. Die Hybridisierung wurde durch Zugabe von 200 μl Verdünnungspuffer (20 mM Hepes, pH 8.3, 50 mM NaCl, 0.2 mM EDTA) und durch Erhitzen bei 68°C für 7 min gestoppt.
PCR-Amplifizierung
Zwei PCR-Amplifizierungsreaktionen wurden für jede Subtraktion in einem Volumen von 25 μl ausgeführt. Die erste PCR wurde in Taq lange-Matrize-Puffer 1 (Roche) mit 1 μl verdünnter subtrahierter cDNA, 1 μl PCR-Primer P1-30 (SEQ ID NO:35) (8 μM) und 1 μl Primer P2-30 (SEQ ID NO:36) (8 μM) und 0.4 mM dNTPs durchgeführt. Taq-Polymerase wurde bei einer Heißstartprozedur zugegeben. Der PCR-Cycler wurde auf 75°C für 7 min gesetzt (auffüllend an den Enden), 27 Zyklen wurden durchgeführt (94°C, 30 s; 66°C, 30 s; 72°C, 1.5 min) und ein letzter Anbau bei 72°C für 7 min. PCR-Produkte wurden 10fach in Wasser verdünnt und 1 μl wurde für eine sekundäre PCR verwendet, durchgeführt gemäß dem vorstehend beschriebenen Protokoll; aber unter Verwendung von PCR-Primern PN1-30 (SEQ ID NO:39) und PN2-30 (SEQ ID NO:40) und 12 Zyklen (94°C, 30 s.; 68°C, 30 s; 72°C, 1.5 min) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese auf einem 1.5%igen Agarosegel analysiert.
Clonierung und Analyse von subtrahierter cDNA
Produkte aus sekundärer PCR wurden in das pGEM-Teasy, einem T/A-Klonierungssystem (Promega) ligiert. Nach Auswahl von Clonen mit X-Gal/IPTG/Ampicillin wurden Inserts durch PCR gescreent unter Verwendung von PN1-30 (SEQ ID NO:39)- und PN2-30 (SEQ ID NO:40)-Primern. Unterschiedliche Expression wurde durch Southern-Blot-Analyse der amplifizierten Inserts überprüft, unter Verwendung markierter Tester und Treiber als Sonden. Die Markierung der Treiber- und Testerproben war identisch zur Markierung für Array-Analyse.
Unterschiedlich hybridisierende Clone wurden einer Plasmidpräparation unterworfen unter Verwendung von QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) und sequenziert. Nucleinsäurehomologie-Suche wurde unter Verwendung des BLAST-Programms (NCBI) durchgeführt.
Ergebnisse
PCR-Amplifizierung wurde mit Primersätzen von unterschiedlicher Länge durchgeführt (30 Nucleotide: P1-30 (SEQ ID NO:35), P2-30 (SEQ ID NO:36) und 33 Nucleotide: P1-33 (SEQ ID NO:37) und P2-33 (SEQ ID NO:38)), die beide zu vergleichbaren Ergebnissen führten. Am meisten bevorzugt waren Primer, die aus 30 Nucleotiden bestehen (P1-30 (SEQ ID NO:35) und P2-30 (SEQ ID NO:36)). Kleinere Primer mit 22 Nucleotiden (Clontech), wie von Diatchenko (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) funktionierten nicht in der PCR-Reaktion. Nach Subtraktion wurden Kolonien durch PCR gescreent und die Produkte einer Gelelektrophorese und Blotting unterworfen. Markierte Tester und Treiber wurden an den Blot hybridisiert, wie für ein Beispiel in 25 gezeigt. Kolonie #4 wurde identifiziert als ein Transkriptionsfaktor, beschrieben als Epithel-spezifisches Gen (Oettgen Genomics 445, (1997) 456-457 und Oettgen Mol. Cell. Biol. 17 (1997), 4419-4433) und Oettgen Genomics 55 (1999), 358-62. Das Ergebnis wurde durch PCR bestätigt unter Verwendung der Proben, aus welchen Treiber und Tester präpariert worden waren (26).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Amplifizierung von mRNA einer Probe, umfassend die Schritte: i. Herstellung von cDNA aus polyadenylierter RNA, wobei mindestens ein Primer verwendet wird, der an die polyadenylierte RNA hybridisiert und eine 5'-Poly(C)- oder eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst, wobei die Konzentration des mindestens einen Primers im Bereich von 10 μM bis 60 μM liegt; ii. (aa) Beseitigung von nicht-hybridisiertem, überschüssigem Primer/nicht hybridisierten, überschüssigen Primern und/oder überschüssigen dNTPs, falls anwesend; (ab) 3'-Verlängerung der hergestellten cDNA mit einem Poly(G)-Schwanz, wenn in Schritt i.(a) (ein) Primer, welche(r) eine Poly(C)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), oder einem Poly(C)-Schwanz, wenn in Schritt i.(a) (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n); oder (b) 3'-Verlängerung der hergestellten cDNA mit einem Poly(G)-Schwanz, wenn in Schritt i.(a) (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(C)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), oder einem Poly(C)-Schwanz, wenn in Schritt i.(a) (ein) Primer, welche(r) eine 5'-Poly(G)-Flanke umfasst/umfassen, verwendet wurde(n), unter Verwendung einer RNA-Ligase, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von überschüssigem Primer/überschüssigen Primern und/oder überschüssigen dNTPs; und iii. Amplifizierung der verlängerten cDNA mit einem Primer, welcher an die in Schritt ii.(ab) oder ii.(b) erzeugten Verlängerungen hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Primer in Schritt „i" ein Zufalls-Primer, ein Oligo(dT)-Primer oder eine Kombination davon ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Zufalls-Primer ein Zufalls-Hexamer- oder ein Zufalls-Octamer-Oligonucleotid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Zufalls-Primer eine Sequenz, wie in SEQ ID NO:1 oder 7 bis 9 gezeigt, besitzt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Oligo(dT)-Primer die Sequenz, wie in SEQ ID NO:10 gezeigt, besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Primer in Schritt „iii" eine Spanne von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 12, mehr bevorzugt mindestens 15 Nucleotiden umfasst, welche in der Lage sind, mit der (den) Verlängerung(en), welche in Schritt „ii.(ab)" oder „ii.(b)" erzeugt wurde(n), zu hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Primer die Sequenz, wie in SEQ ID NO:11, 12, 13, 14 oder 15 gezeigt, besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die polyadenylierte RNA an einen festen Träger gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der feste Träger ein Kügelchen, eine Membran, ein Filter, eine Vertiefung, ein Chip oder ein Röhrchen ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Kügelchen ein magnetisches Kügelchen, ein Latexkügelchen oder ein Kügelchen aus kolloidalem Metall ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Kügelchen eine Oligo(dT)-Spanne umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die mRNA aus einem Gewebe, einer geringen Zahl von Zellen oder einer Einzelzelle stammt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die geringe Zahl von Zellen in einem Bereich von 10⁶ bis 2 Zellen liegt.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Gewebe, die Zellen oder die Einzelzelle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Tier ein Mensch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei das Gewebe, die geringe Zahl von Zellen oder die Einzelzelle ein chemisch fixiertes Gewebe, eine chemisch fixierte geringe Zahl von Zellen oder eine chemisch fixierte Einzelzelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Gewebe, die geringe Zahl von Zellen oder die Einzelzelle aus einer Körperflüssigkeit oder aus festem Gewebe stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, weiterhin umfassend einen Schritt „iv", wobei die hergestellte, amplifizierte cDNA weiter modifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Modifizierung die Einführung eines Nachweismittels umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Nachweismittel die Einführung eines Nucleotidanalogons umfasst, welches an (ein) Chromophor(e), (einen) fluoreszierende(n) Farbstoff(e), (ein) Radionucleotid(e), Biotin oder DIG gekoppelt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die erhaltene, amplifizierte cDNA an einen festen Träger gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei alle oder einzelne Schritte in einem Nicht-Cacodylatpuffer ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Nicht-Cacodylatpuffer ein Phosphatpuffer ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Phosphatpuffer ein KH₂PO₄-Puffer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Probe aus einer Zelle und/oder einem Gewebe stammt, deren/dessen genetische Identität durch vergleichende Genomhybridisierung definiert wurde.
Verfahren zur Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen in einer Testprobe, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen einer Testprobe und einer Kontrollprobe, wobei jede polyadenylierte RNA umfasst; (b) Anwenden der Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25 auf die Test- und Kontrollprobe; und (c) Vergleichen der erhaltenen amplifizierten cDNA der Testprobe mit der erhaltenen amplifizierten cDNA der Kontrollprobe.
Verfahren zur Identifizierung eines Arzneistoffkandidaten zur Verhinderung oder Behandlung eines pathologischen Zustandes oder einer pathologischen Störung, umfassend die Schritte (a) Inkontaktbringen einer Probe, welche polyadenylierte RNA umfasst, mit dem Arzneistoffkandidat; (b) Anwenden der Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25 auf die Probe; und (c) Nachweis der Anwesenheit, der Abwesenheit, der Steigerung oder der Verminderung von bestimmten exprimierten Genen in der Probe, wobei die Korrelation dieser Anwesenheit, Abwesenheit, Steigerung oder Verminderung mit der Anwesenheit des Arzneistoffkandidaten den Arzneistoffkandidaten als Arzneistoff qualifiziert.
Verfahren für den in-vitro-Nachweis eines pathologischen Zustandes oder der Anfälligkeit für einen pathologischen Zustand in einem Individuum, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen einer Probe, welche polyadenylierte RNA des Individuums umfasst; (b) Anwenden der Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 25 auf die Probe; und (c) Nachweis eines pathologischen Zustandes oder einer Anfälligkeit für einen pathologischen Zustand basierend auf der Anwesenheit, der Abwesenheit, der Steigerung, der Verminderung oder der Menge des/der exprimierten Gens/Gene in der Probe.
Kit, umfassend mindestens einen Primer, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID NOs:1 und 7 bis 15.