DE69534802T2

DE69534802T2 - Verfahren von in Neuriten lokalisierten mRNAs zur medizinischen Diagnose und Therapie

Info

Publication number: DE69534802T2
Application number: DE69534802T
Authority: DE
Inventors: James Philadelphia EBERWINE; Marc Penn Valley DICHTER; Kevin Philadelphia MIYASHIRO
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1994-11-03
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2015-11-04
Also published as: CA2204433A1; JPH10508490A; US5723290A; EP0787206B1; JP4382159B2; DE69534802D1; JP2006068021A; EP0787206A4; WO1996014435A1; EP0787206A1; ES2256852T3; CA2204433C; ATE318326T1

Description

Hintergrund der Erfindung
In den letzten Jahren wurden beim Verständnis der genetischen Grundlage von neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich denen, die mit Geistesstörung in Zusammenhang stehen, große Fortschritte erzielt. Während die genetischen Defekte solcher Störungen disparat sind und jeder Mechanismus neuartig erscheint, ist das zusammenfassende Thema hinter der Entwicklung dieser Krankheiten die Gehirnentwicklung und das Aufrechterhalten neurologischer Netzwerke.
Neurologische Netzwerke bilden sich aus einzelnen Neuronen, wobei jedes Neuron eine separate strukturelle und funktionelle Zelleinheit bildet. Neuronen haben spezielle Eigenschaften für den Empfang von Nervenimpulsen von anderen Neuronen, wobei deren Effekt entweder Exzitation oder Inhibition sowie das Weiterleiten von Nervenimpulsen sein kann. Neuronen weisen häufig lange zytoplasmische Prozesse auf, die als Neuriten bekannt sind, die in naher Apposition zu den Oberflächen anderer Zellen enden. Die Enden dieser Neuriten werden synaptische Nervenenden genannt, und die Zell-zu-Zell-Kontakte, die sie hervorrufen, sind als Synapsen bekannt. Die Neurite in höheren Tieren sind normaler weise spezialisiert, um Dendriten und Axone zu bilden, welche die Impulse zum Zellkörper bzw. von ihm weg leiten. Das Ankommen eines Impulses an einem Nervenende löst den Prozess der synaptischen Transmission aus. Dieses Ereignis beinhaltet normalerweise die Freisetzung einer chemischen Verbindung aus dem neuronalen Zytoplasma, was eine Reaktion in den postsynaptischen Zellen hervorruft. Die Neuronen des zentralen Nervensystems bestehen aus diskreten Abschnitten, einschließlich dem Zellkörper, den Dendriten und dem Axon. Während die meisten Nervenzellen dieser Grundstruktur entsprechen, ist ein breiter Bereich struktureller Vielfalt vorhanden, der auf der spezifischen Funktion der Zelle im Körper basiert.
Es wurde gezeigt, dass diese polarisierten Zellen eine Vielzahl an zytoplasmischen- und membrangebundenen Proteinen enthalten, die unterschiedlich über das Axon, die Dendriten und den Zellkörper des Neurons verteilt sind. Es wird angenommen, dass Neuronen des zentralen Nervensystems lokal an oder in der Nähe postsynaptischer Stellen, welche vom Zellkörper unabhängig sind, Proteine synthetisieren. Ultrastrukturelle Studien haben gezeigt, dass Polyribosome bevorzugt entweder unterhalb der postsynaptischen Stellen lokalisiert oder gelegentlich mit Membranspezialisierungen auf den Dendriten verbunden sind. Es wurde vorgeschlagen, dass diese anatomischen Strukturen die synthetische Proteinmaschinerie darstellen, die erforderlich ist, um die verschiedenen Proteinklassen in Neuronen zu translatieren und nach der Translation zu modifizieren. Ein energieabhängiger Mechanismus für den selektiven RNA-Transport in Neuronen wurde auch gezeigt. Die Natur und die Verteilung der RNAs, die in diesen Zellen vorhanden sind, werden jedoch kaum verstanden.
In situ-Hybridisierungs(ISH)-Untersuchungen waren erfolgreich beim Identifizieren einiger weniger mRNAs in neuronalen Prozessen. Untersuchungen, die die in-situ-Hybridisierung und Northern Blot-Analysen von synaptosomalen RNA-Fraktionen mit den AMPA-GluR1, -GluR2, GluR3- und GluR-4 und Kainat-sensitiven GluR5- und GluR6-Rezeptoreinheiten verwendeten, hatten keinen Erfolg, mRNAs an den Dendritenstellen nachzuweisen. (Craig, A. et al., Neuron 1993, 10, 1055–1068; Chicurel, M. et al. J. Neurosci 1993, 13, 4054–4063).
Die Mikrodissektion einzelner Neurite hat nun eine große Anzahl an mRNAs, einschließlich Mitgliedern der Glutamatrezeptorfamilie, der sekundären Messenger-Komponenten, sowie Komponenten des Translations-Kontrollapparats, die in Hippocampus-Neuriten vorhanden sind, aufgezeigt. Es wurde nun festgestellt, dass die Profile von exprimierten mRNAs aus diskreten Abschnitten der gleichen Neuronen unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. Diese Unterschiede in der exprimierten mRNA können als Möglichkeit verwendet werden, um diskrete Abschnitte des Neurons spezifisch zu treffen und genetische neurologische Störungen auf molekularen Ebene zu identifizieren und diagnostizieren.
Eberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 89 S. 3010–3014 beschreiben ein Verfahren zum weitgehenden Charakterisieren einzelner Zellen. Die einzelnen Zellen können Neuronen sein.
Miyashiro et al., Soc. for Neuroscience Abstracts Bd. 19, Nr. 1–3, 1993, Seite 805 beschreiben, dass bei einer globalen Untersuchung mRNAs in Neuriten unterschiedlichl verteilt sein können.
Stryer, Lubert: "Biochemistry", 1990, Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft, Heidelberg, Deutschland, Seite 747, beschreibt die Verwendung von Actinomycin D, eines hochspezifischen Inhibitors der RNA-Synthese in pro- und eukaryotischen Zellen, zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Identifizieren von Neurit-cDNA-Klonen, das das Bestimmen der mRNA-Expression in ausgewählten Neuriten, das Vergleichen der relativen Werten der mRNA-Expression und das Identifizieren von Neurit-cDNA-Klonen, basierend auf den Werten der mRNA-Expression, umfasst.
Ein anderer Gegenstand der Beschreibung ist das Bereitstellen von Neurit-cDNA-Klonen.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Profilieren der mRNA-Expression in einem ausgewählten Neuriten, welches das Konvertieren einer mRNA-Population im Soma oder Verarbeiten eines ausgewählten Neuriten zu cDNA, das Doppelsträngigmachen der cDNA, das lineare Amplifizieren der doppelsträngigen cDNA zu aRNA und das Verwenden der aRNA als Sonde in einer Umkehrphasen-Northern-Analyse, um ein mRNA-Expressionsprofil zu erzeugen, umfasst.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Diagnostizieren einer Erkrankung, die mit einem mRNA- Expressionsmuster zusammenhängt, das das Bestimmen der relativen Werte der mRNA-Expression in ausgewählten Zellen, die mit einer ausgewählten Krankheit zusammenhängen, Vergleichen der bestimmten relativen Werte mit festgesetzten Kontrollwerten und Diagnostizieren einer Krankheit auf der Grundlage des Vergleichs der mRNA-Expressionswerte umfasst.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Neurit-cDNA-Klonen zur Verfügung gestellt, das umfasst:

(a) Konvertieren einer mRNA-Population in ausgewählten Neuriten zu cDNA;
(b) Bestimmen des Musters der mRNA-Expression der mRNA-Population in ausgewählten Neuriten;
(c) Vergleichen der relativen Muster der mRNA-Expression mit dem Muster in einer Kontrollprobe; und
(d) Identifizieren von Neurit-cDNA-Klonen auf der Grundlage des Musters der mRNA-Expression.

Vorzugsweise wird die mRNA-Expression durch ein aRNA-Amplifikationsver fahren bestimmt.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Profilieren der mRNA-Expression in einem ausgewählten Neuriten zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Isolieren ausgewählter Neurite durch Durchschneiden in verschiedenen Abständen vom Zellkörper;
(b) Konvertieren einer mRNA-Population in ausgewählten Neuriten zu cDNA;
(c) Doppelsträngigmachen der cDNA;
(d) lineares Amplifizieren der doppelsträngigen cDNA zu aRNA; und
(e) Verwenden der aRNA als Sonde in einer Umkehrphasen-Northern-Analyse, um ein mRNA-Expressionsprofil zu erzeugen.

Vorteilhafterweise wird die mRNA-Population im Soma oder im Prozess der ausgewählten Neurite unter Verwendung eines Oligo-dT-T7-Primers in cDNA umgewandelt.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die doppelsträngige cDNA unter Verwendung von T-RNA-Polymerase linear zu aRNA amplifiziert.
In einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Diagnostizieren einer neurologischen Erkrankung, die mit einem mRNA-Expressionsmuster zusammenhängt, zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Isolieren ausgewählter Neurite durch Durchschneiden in verschiedenen Abständen vom Zellkörper;
(b) Bestimmen des Musters der mRNA-Expression in Neuriten, das mit der Krankheit zusammenhängt;
(c) Vergleichen des bestimmten Musters der mRNA-Expression mit dem Muster der mRNA-Expression bekannter Kontrollproben; und
(d) Diagnostizieren der Krankheit auf der Grundlage des Vergleichs des mRNA-Expressionsmusters.

Vorzugsweise ist die Erkrankung eine neuropsychiatrische Störung oder ein Fragiles-X-Syndrom.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Differentialdisplay von drei repräsentativen Zellen. Ein einzelnes Oligonukleotid, OPA-5, diente als 3'-Primer. In Kombination mit drei verschiedenen, modifizierten Oligo-dT₁₁-Primern (Oligo A, 5'-T₁₁-AC-3'; Oligo B, 5'-T₁₁CA-3'; Oligo C, 5'-T₁₁GC-3') wurden Differentialdisplayreaktionen auf separaten Neuriten (HP3-7, HP3-8 und HP3-9) (Feld a, in 1A gezeigt), proximalen (HP2-10) und distalen (HP2-12) Segmenten des gleichen Prozesses sowie einem anderen separaten Prozess (HP2-11) (Feld b, in 1B gezeigt) sowie distalen Verzweigungspunkten (HP3-5 und HP3-6) des gleichen Prozesses (Feld c, in 1C gezeigt) aus einzelnen Hippocampus-Zellen aufgetragen. Jeder dieser Neurite wurde wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. In den Feldern a und b (1A und 1B) wurde das entsprechende Soma (HP3-9 in Feld a; und HP2-13 in Feld b) wurden isoliert. Zusätzlich zu der großen Anzahl an mRNAs, die in einigen Neuriten (beispielsweise Bande 5 in Feld a, gezeigt in 1A) exprimiert wurden, befanden sich einige häufig gemeinsame PCR-Produkte zwischen den Neuriten oder Neuritsegmenten und zwischen den Neuriten und ihren Zellkörpern. Diese Daten wurden mindestens dreimal reproduziert. In jedem Feld ist eine Phasen-Kontrastphotomikrographie der Zelle und der interessierenden Neuriten vor der Isolierung gezeigt. Dunkle Balken senkrecht zu jedem Prozess stellen den ungefähren Schnittpunkt dar.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Verschiedene Regionen des zentralen Nervensystems sind von funktionell und anatomisch unterschiedlichen synaptischen Verbindungen besiedelt. Es wird angenommen, dass während der Konstruktion, der Aufrechterhaltung und dem Wiederaufbau der Synapsen die Proteine selektiv zu diesen verschiedenen Verbindungen transportiert werden. Im Ergebnis wird die Spezifität des Nervensystems etabliert und mindestens teilweise durch diese Protein-Zielmechanismen modifiziert. Es wurde nun festgestellt, dass mRNA-Expressionsprofile spezifisch für Informationen sind, die in Neuriten beobachtet werden. Ein Verfahren zur Identifizierung von Neurit-cDNA-Klonen wurde entwickelt, indem die mRNA-Expression in ausgewählten Neuriten bestimmt wurde, mit den relativen Werten der mRNA-Expression verglichen wurde und Neurit-cDNA-Klone auf der Grundlage der Werte der mRNA-Expression identifiziert wurden.
Isolierte Hippocampus-Zellen, die frei von Überlappungsprozessen von Nachbarzellen waren, wurden in Kulturen mit niedriger Dichte identifiziert. Unter diesen Bedingungen wachsen Neuronen als isolierte Zellen oder in kleinen Gruppen von 2–4 Zellen entweder direkt auf dem Substrat oder auf Gliazellen. Neuronen werden durch morphologische Kriterien unter Beteiligung von synaptischen Wechselwirkungen identifiziert. Individuelle proximale und distale Neurite wurden gewonnen, indem sie in verschiedenen Abständen vom Zellkörper durchschnitten wurden und in einer Mikropipette mit den Reagentien, die für den ersten Schritt im Antisense-RNA(aRNA)-Amplifikationsverfahren erforderlich sind, aspiriert wurden. In einer Anzahl von Fällen wurden mehrere Prozesse aus einer einzigen Zelle nach Aspiration des Zellkörpers isoliert. Einzelne Neurite oder Zellkörper wurden durch den anschließenden aRNA-Amplifikationsprozess verarbeitet, um ein mRNA-Expressionsprofil zu erhalten. Die mRNA-Population im Zellsoma oder Zellprozess wurde unter Verwendung eines Oligo-dT-T7-Primers in eine komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt. Nachdem die cDNA doppelsträngig gemacht worden war, wurde sie unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase linear zu aRNA amplifiziert. aRNAs dienen als Sonde für die mRNA-Expressionsprofile bei der reversen Northern-Blott-Analyse. In nachfolgenden Experimenten wurden die aRNAs in doppelsträngige cDNAs umgewandelt und als Template für Experimente eingesetzt, die die Polymerase-Chain-Reaction (PCR) verwenden.
Die Population der mRNAs in Neuriten wurde zunächst durch Bestimmung des mRNA-Expressionsprofils bewertet. Southern Blots mit klonierten cDNAs, die Mitglieder der ionotropischen Glutamatrezeptorfamilie kodieren, wurden mit radiomarkierter aRNA aus einzelnen Neuriten oder Zellkörpern untersucht. Glutamatrezeptoren, eingeteilt in N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-, α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionat (AMPA; GluR1-4)- und Kainat (GluRS-7)-Unterarten, sind die hauptsächlichen Mediatoren der erregenden synaptischen Transmission im Gehirn. Diese Rezeptoren spielen auch eine Rolle in biochemischen Ereignissen, die in Zusammenhang stehen mit Exzitotoxizität und Langzeitpotenzierung (long-term potentiation (LTP)), einer spezialisierten Form der synaptischen Plastizität. Die qualitative mRNA-Expression vieler Mitglieder der Glutamatrezeptorfamilie wurde untersucht. Alle Neurite exprimieren GluR1, GluR2, GluR4 und NMDAR1-mRNA. Bei der Mehrheit der Neuriten wurde mRNA-Expression von GluR3 (15/19), GluR5 (14/19) beobachtet, während die Expression für GluR6-mRNA in ungefähr der Hälfte der untersuchten Neuriten nachweisbar war. Die Gegenwart dieser Untereinheiten wurde durch untereinheitenspezifische PCR bestimmt. Im Gegensatz dazu zeigte nur ein Neurit nachweisbare Hybridisierungssignale für NR2a- und NR2c-mRNA. Somit können Neurit-cDNA-Klone durch Bestimmung der mRNA-Expression für Glutamatrezeptoren identifiziert werden. Beispiele für bevorzugte Glutamatrezeptoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6, GluR7, NR2a und NR2b. Eine Anzahl von Neurit-cDNA-Klonen wurde nun nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert. Bei zwei dieser Klone wurde festgestellt, dass sie Farnesyldiphosphat (FPP)-Synthase-mRNA entsprechen, die in zwei getrennten distalen Prozessen identifiziert wurde. Als Teil des Isopren-biosynthetischen Weges erzeugt die FPP-Synthase die Farnesyl-Einheit, die schließlich zum COOH-endständigen CaaX-Motiv der Säugetier-ras-Proteine transferiert wird. Bei zwei anderen cDNAs wurde festgestellt, dass sie Sequenzgleichheit mit mRNAs bei der γ-Untereinheit von Interleukin-2-Rezeptor und dem Tumor-Nekrose-Faktor-induzierbaren Protein A20 aufweisen. Die restlichen cDNA-Klone weisen wenig Sequenzgleichheit mit irgendwelchen veröffentlichten Gensequenzen auf. Bei dem Sequenzieren der cDNA-Klone, die den RNAs mit voller Länge entsprechen, ist es möglich, die Rolle zu identifizieren, welche die Primärsequenz und die sekundären strukturellen Eigenschaften der mRNA als Erkennungselemente beim Zielen und Transportieren der mRNA spielen. Die cDNA-Klone der vorliegenden Beschreibung sind in Tabelle 1 als SEQ.-ID.-NR: 1 bis SEQ.-ID.-NR: 28 identifiziert.
Tabelle 1
Die cDNA-Klone der vorliegenden Beschreibung können in der Diagnose von neuropsychiatrischen Erkrankungen verwendet werden. Humane Gene mit instabilen Triplett-Wiederholungen stehen in Zusammenhang mit einigen neuropsychiatrischen Erkrankungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Chorea Huntington, spinaler und bulbärer Muskelatrophie und spinozerebellärer Ataxie Typ 1. Diese Krankheiten zeigen eine Vielzahl von klinischen Symptomen, was eine Diagnose erschwert. Das Verstehen dieser Erkrankungen auf molekularer Ebene ermöglicht es jedoch dem diagnostischen Labor, direkt zu testen, ob die DNA eines Einzelnen die krankheitverursachende Mutation enthält, entweder als Bestätigung einer klinischen Diagnose oder bevor irgendwelche Symptome auftreten. Beispielsweise können die Fragilen-X-Chromosomen, die mit Geisteskrankheit in den meisten Männern, die sie haben, und im geringeren Ausmaß einigen Frauen, die dafür heterozygot sind, im Zusammenhang stehen, unter Verwendung von cDNA-Klonen der vorliegenden Beschreibung als diejenigen mit der SEQ.-ID.-NR: 1 bis 15 identifiziert werden. Die cDNA-Klone der vorliegenden Veröffentlichung können auch beim pränatalem Screening verwendet werden.
Verschiedene relative Variationen in der mRNA-Expression wurden auch unter Verwendung der reversen Northern-Blot-Analyse identifiziert. Unterschiede bei den relativen Werten der Glutamatrezeptor-mRNAs, die zwischen einem neuronalen Prozess oder Prozessen der gleichen Zelle und ihrem Zellkörper exprimiert werden, wurden beobachtet. In einer Anzahl von Zellen waren die qualitativen Expressionsmuster sehr ähnlich, wobei jedoch die relative Intensität des Hybridisierungssignals bei spezifischen Untereinheiten profunder war. Beispielsweise waren die relativen Werte von NMDAR1 und GluR5-mRNA in HP9a, dem Apikalneurit, gegenüber HP9b, dem Basalneurit, oder dem Soma deutlich erhöht. Diese Tendenz wurde in anderen Zellen ergänzt, die ein differenzierteres qualitatives Muster von Glutamatrezeptor-mRNA-Expression zeigten. Dieses differenzierte Muster der mRNA-Expression trägt zur physiologischen Funktion einer Synapse bei. Diese Unterschiede in den relativen Werten der MRNA-Expression führen zum Auftreten von verschiedenen neuronalen Prozessen in der gleichen Zelle. Zusätzlich zu den Glutamatrezeptoren wurde die Expression einiger anderer cDNA mit der reversen Northern-Blot-Analyse untersucht. Frühere Berichte zeigten die dendritische Lokalisierung der α-Untereinheiten der Ca²⁺/Calmodulinabhängigen Proteinkinase (CaMK II)-mRNA.
Es wurde nun festgestellt, dass die mRNA-Expression in distalen und proximalen Abschnitten von isolierten Neuriten für CaMK II stark positiv ist. Somit können spezifische Segmente und Prozesse eines Neurons getroffen werden, indem das Profil der mRNA-Expression bestimmt wird, die am Prozess beteiligt ist, wobei eine mRNA mit einem hohen Expressionswert identifiziert und ein Mittel für diese mRNA bestimmt wird. Alzheimer-Krankheit, amyotrophische Lateralsklerose, Chorea Huntington und Epilepsie sind alle Beispiele für Störungen, bei denen die Degenerierung spezifischer Gruppen von Neuronen in diskreten Regionen des Nervensystems eine Rolle spielt. Es scheint, dass verschiedene Regionen der Nervensysteme und spezifisch verschiedene Neuronenarten verschiedene Empfindlichkeiten gegenüber Wirkstoffen aufweisen. Um somit die Neurotoxizität eines Mittels zu untersuchen, sollte somit der Wirkstoff in Neuronen untersucht werden, die aus verschiedenen Regionen isoliert wurden, da einige Neuronenarten offenbar empfindlicher sind als andere. Es wurde nun jedoch festgestellt, dass die Neuronenarten identifiziert werden können, indem die mRNA-Expression in ausgewählten Neuronen bestimmt wird, die Werte der mRNA-Expression in ausgewählten Neuronen mit den Werten in bekannten Neuronen verglichen werden, und die Neuronenart auf der Grundlage des mRNA-Expressionswerts identifiziert wird. Die Neurotoxizität eines Wirkstoffs für eine spezifische Neuronenart kann somit in einer Kultur aus gemischten Neuronenarten untersucht werden. Bei diesem Verfahren ist es bevorzugt, dass die mRNA-Expression durch ein aRNA-Amplifikationsverfahren bestimmt wird.
Die Komplexität der mRNA-Expression in Neuronen wurde weiterhin unter Verwendung eines PCR-basierten Assays, differentialer Display, entwickelt von Liang P. et al., Science 1993, 257, 967–970, untersucht. In diesen Experimenten wurde ein einzelnes 10-mer (OPA-5;5'-AGGGGTCTTG-3', SEQ.-ID.-NR: 29), das als 5'-Primer dient, und ein modifizierter Polythymidin-Primer mit zwei Basenextensionen verwendet, um die spezifischen Populationen des polyadenylierten RNA-Pools zu amplifizieren. In jeder dieser Reaktionen wurden Bandenmuster, die für Soma oder den Prozess oder die Kombination von Primern eindeutig sind, beobachtet. Differentialdisplay (DD) von mRNAs aus drei Zellensätzen sind in 1 gezeigt. Das Komplement des DD-Profils von Neuriten zeigte eine große Anzahl an mRNA-Spezies. Diese Muster der PCR-Produkte zeigen, dass die mRNAs differentiell verteilt sind. In einer typischen Zelle, in der zwei Neurite durchschnitten und isoliert sind, sind beispielsweise Transkripte vorhanden, die bei gleichen Molekülgrößen zwischen einzelnen Neuriten wandern. Dieser Umstand wird wiederholt in proximalen und distalen Abschnitten des gleichen Prozesses und in den distalen Verzweigungspunkten eines einzelnen Prozesses beobachtet. Während einige Produkte gleichzeitig in einem oder mehreren Neuriten und zwischen Neuriten und ihren entsprechenden Zellkörpern gefunden werden, sind zahlreiche Transkripte vorhanden, die auf einzelne Neurite oder Segmente der einzelnen Neurite beschränkt sind. Proben von Medien und tRNA zeigten keine Bandenmuster bei Verwendung von Differentialdisplay.
Die Kontaminierung von Neuriten mit umgebenden Glia- oder Astrogliaprozessen wurde durch gliafibrilläre saure Protein(GFAP/glias fibrillary acicic protein)-mRNA untersucht. Es wurde bestimmt, dass Neurit- und Somapräparate, die in diesen Experimenten verwendet wurden, frei von GFAP-mRNA sind. Das Vorhandensein mehrerer mRNAs in neuralen Prozessen legt nahe, dass der mRNA-Transport und die lokale Proteinsynthese eine Rolle bei der Regulierung von neuronaler Physiologie, Entwicklung und Regenerierung spielen. In der vorliegenden Erfindung können mRNA-Expressionsmuster verwendet werden, um Krankheiten zu diagnostizieren, die mit der Gegenwart oder Abwesenheit von synthetisierten Proteinen in Zusammenhang stehen. In den letzten Jahren wurden einige menschliche neurologische Erkrankungen identifiziert, die sich aus der Ausbreitung von Trinukleotid-Wiederholungen ergeben. Diese Triplett-Wiederholungen sind normalerweise polymorph und exonisch, obgleich nicht immer kodierend. In den Krankheitszuständen werden sie erheblich instabil und können mäßig oder durch Tausende von Wiederholungen in einer einzigen Generation expandieren, wodurch die Genexpression, die Informationsstabilität oder Proteinstruktur verändert werden. In einem Krankheitszustand würden somit Veränderungen in normalen mRNA-Expressionsmustern oder -profilen zu erwarten sein. Verfahren, die sich auf das Diagnostizieren einer Krankheit, die mit einem mRNA- Expressionsmuster in Zusammenhang steht, beziehen, umfassen das Bestimmen der relativen Werte der mRNA-Expression in ausgewählten Zellen, die mit einer ausgewählten Krankheit verbunden sind; Vergleichen der bestimmten relativen Werte mit bekannten Kontrollproben; und Diagnostizieren einer Krankheit auf der Grundlage des Vergleichs der mRNA-Expressionswerte. Bei diesem Verfahren ist es bevorzugt, dass die ausgewählten Zellen Neuronen sind.
Das Messen der mRNA-Expressionsmuster, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, kann auch in Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, die mit einem mRNA-Expressionsmuster zusammenhängt, verwendet werden. Die Werte der mRNA-Expression in ausgewählten Zellen, die mit einer ausgewählten Krankheit verbunden sind, werden bestimmt und mit normalen Werten im gleichen Zelltyp verglichen. Wenn der Wert der mRNA-Expression anormal ist, wird eine wirksame Menge eines Wirkstoffs verabreicht, der in der Lage ist, die mRNA-Expression zu verändern. Bei diesem Verfahren ist es bevorzugt, dass die mRNA-Expressionswerte in Neuronen gemessen werden. Beispiele für Wirkstoffe, die in der Lage sind, die mRNA-Expression zu verändern, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Antisense-Oligonukleotide und pharmakologische Wirkstoffe, wie beispielsweise Dopamin, Serotonin und zyklisches AMP. Solche Wirkstoffe werden in einer wirksamen Menge entweder allein oder zusammen mit einem passenden pharmazeutisch geeigneten Träger verabreicht. "Effektive Menge" bedeutet die Konzentration eines Wirkstoffs, der verabreicht werden soll, die ausreicht, um die Expression von mRNA zu modulieren. Solche Konzentrationen können von den Fachleuten auf dem Gebiet nach dieser Beschreibung routinemäßig bestimmt werden und sind abhängig vom Alter, Gewicht und Zustand eines Patienten. Passende pharmazeutisch geeignete Träger sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und beispielsweise in Gennaro, Alfonso, Herausg., Remington's Pharmaceutical Science, 18te Ausgabe 1990, beschrieben. Mack Publishing Co., Easton, PA, ein Standardreferenztext auf diesem Gebiet. Pharmazeutische Träger können gemäß dem beabsichtigten Verabreichungsweg und der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt werden. Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele dienen der Veranschaulichung.
BEISPIELE
Beispiel 1: Präparation von Neuriten
Hippocampus-Zellen wurden aus ED20-21-Rattenföten herausgeschnitten, in Trypsin aufgetrennt und mit 30000–100000 lebenden Zellen/ml Medium auf Polylysin-beschichtete Deckgläsern, die in Petrischalen mit 35 mm Gewebekultur gehalten wurden, als Plattenkultur angelegt. Einen Tag nach dem Anlegen der Plattenkultur wurden 0,5 ml Medium durch Medium mit 20 mM Kalium ersetzt. Die Kulturen wurden anschließend einmal wöchentlich mit einem Tropfen des Hoch-K⁺-Medium versetzt. Die Experimente wurden 21–28 Tage nach Kultivieren durchgeführt. Die Zellkörper und ihre Neurite wurden aus den gezüchteten Zellen aus verschiedenen Tieren an drei verschiedenen Tagen unter gleichen Bedingungen entnommen. Während dieser Behandlungen wurde auch eine Probe des Kulturmedums aufgenommen und durch einen aRNA-Prozess verarbeitet, um die mögliche Gegenwart von mRNAs in Kulturmedium aus sterbenden Zellen zu untersuchen.
Beispiel 2: Bestimmung der mRNA-Bandenmuster
Reaktionen wurden in 25 μl-Volumen unter Verwendung der Hot Start-Technik (Perkin Elmer, (1993 Katalog) Produkt Nr. N808-0100) mit einem Ober-Unter-Verhältnis von 1,5 bis 1 durchgeführt. Die Reaktionen enthielten 200 μm dATP, dGTP und TTP, 4 μM dCTP, 5 μCi von ³³P-dCTP oder 4 μCi ³²P-dCTP oder 18,75 μCi ³⁵S-dATP (NEN/Dupont), 0,4 μM OPA-5 oder andere 10-mere (Operon Technologies), 0,6 μM Oligo A, B oder C, 2,5 mM MgCl₂, 1,25 Einheiten AmpliTaqPolymerase (Perkin Elmer), und 1 μl 1:10 Verdünnung der DNA, die vorher durch einen einzigen Durchlauf einer aRNA-Amplifikation verarbeitet worden war. Unter diesen Bedingungen sind die Primer in einem hohen Überschuss zur Menge des Templats, das für die Reaktion verwendet wurde, vorhanden. Die Reaktion wurde 35 Runden 30 Sekunden bei 94°C, 90 Sekunden bei 40°C und 45 Sekunden bei 72°C, gefolgt von einer endgültigen 5-minütigen Verlängerung bei 72°C in einem Biosycler-Thermozirkulationsreaktor, zirkuliert. Etwa 5 μl der Reaktion wurden auf 6% Acrylamid/7 M Harnstoffgel aufgetragen. Die Gele wurden vakuumgetrocknet und auf einen XAR-Film gebracht. Die Gele, die in 1 gezeigt sind, verwendeten ³³P-dCTP. Die Reaktionen zeigten ein Bandenmuster, das für eine Probe eindeutig war.
Beispiel 3: cDNA-Synthese
Mikropipetten mit Reagentien für die Synthese des ersten Stranges der cDNA enthielten auch 5 μM Dithiothreitol und RNAsin^® (Promega, Madison, WI) bei 0,5 Einheiten/μl. Die Effizienz der Amplifikation, bezogen auf Trichloressigsäure-ausgefällte Zähleinheiten, und Northern Blot-Analyse, um die Größenverteilung der mRNAs zu untersuchen, war mit oder ohne Digitonin nicht verschieden. Antisense-RNA, die durch zwei Amplifikationsrunden verarbeitet worden war, wurde zu Southern Blots zugegeben, die gleiche Mengen (500 ng) Glutamatrezeptor-cDNAs enthielten, die mit dem geeigneten Restriktionsenzym linearisiert waren und mittels eines Vakuums auf einem Slot-Blot-Apparat aufgebracht waren. Ein Random-Primed-Vektor-cDNA-Klon, pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, CA) wurde zu gestrippten Blots zugegeben, um die Gegenwart von DNA in jeder Spalte zu zeigen. Scanning Densitometrie-Analyse wurde auf Autoradiographen unter Verwendung eines Scanning-Laserdensitometers (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) durchgeführt. Die Hybridisierungssignale wurden auf ribosomale RNA für jedes untersuchte Neurit oder Soma normalisiert.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Identifizieren von Neurit-cDNA-Klonen, umfassend: (a) Isolieren ausgewählter Neurite durch Durchschneiden in verschiedenen Abständen vom Zellkörper; (b) Konvertieren einer mRNA-Population in ausgewählten Neuriten zu cDNA; (c) Bestimmen des Musters der mRNA-Expression der mRNA-Population in ausgewählten Neuriten; (d) Vergleichen der relativen Muster der mRNA-Expression mit dem Muster in einer Kontrollprobe; und (e) Identifizieren von Neurit-cDNA-Klonen auf der Grundlage des Musters der mRNA-Expression.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mRNA-Expression durch ein aRNA-Amplifikationsverfahren bestimmt wird.
Verfahren zum Profilieren der mRNA-Expression in einem ausgewählten Neuriten, wobei das Verfahren umfasst: (a) Isolieren ausgewählter Neurite durch Durchschneiden in verschiedenen Abständen vom Zellkörper; (b) Konvertieren einer mRNA-Population in ausgewählten Neuriten zu cDNA; (c) Doppelsträngigmachen der cDNA; (d) lineares Amplifizieren der doppelsträngigen cDNA zu aRNA; und (e) Verwenden der aRNA als Sonde in einer Umkehrphasen-Northern-Analyse, um ein mRNA-Expressionsprofil zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die mRNA-Population im Soma oder im Prozess des ausgewählten Neuriten unter Verwendung eines Oligo-dT-T7-Primers in cDNA umgewandelt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 3 oder 4, worin die doppelsträngige cDNA unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase in aRNA umgewandelt wird.
Verfahren zum Diagnostizieren einer neurologischen Erkrankung, die mit einem mRNA-Expressionsmuster zusammenhängt, wobei das Verfahren umfasst: (a) Isolieren ausgewählter Neurite durch Durchschneiden in verschiedenen Abständen vom Zellkörper; (b) Bestimmen des Musters der mRNA-Expression in Neuriten, die mit der Krankheit zusammenhängen; (c) Vergleichen des bestimmten Musters der mRNA-Expression mit dem Muster der mRNA-Expression bekannter Kontrollproben; und (d) Diagnostizieren der Krankheit auf der Grundlage des Vergleichs der mRNA-Expressionsmuster.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der Zustand eine neuropsychiatrische Störung oder Fragiles-X-Syndrom ist.