ES2256852T3 - Utilizacion de arnm localizados en las neuritas para el diagnostico y la terapeutica medicos. - Google Patents

Utilizacion de arnm localizados en las neuritas para el diagnostico y la terapeutica medicos.

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ES2256852T3 ES95939944T ES95939944T ES2256852T3 ES 2256852 T3 ES2256852 T3 ES 2256852T3 ES 95939944 T ES95939944 T ES 95939944T ES 95939944 T ES95939944 T ES 95939944T ES 2256852 T3 ES2256852 T3 ES 2256852T3
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Marc Dichter
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Abstract

SE PROPORCIONA UN METODO DE IDENTIFICACION DE CLONES DE CADN DE NEURITA MEDIANTE LA DETERMINACION Y COMPARACION DE LA EXPRESION MARN EN NEURITAS SELECCIONADAS. TAMBIEN SE PROPORCIONAN CLONES DE CADN IDENTIFICADOS MEDIANTE ESTE METODO. ADEMAS, SE PROPORCIONAN METODOS DE PERFILAR LA EXPRESION DE MARN Y DE DIAGNOSTICAR Y TRATAR CONDICIONES ASOCIADAS A UN MODELO DE EXPRESION DE MARN MEDIANTE LA DETERMINACION DE UN PERFIL DE EXPRESION DE MARN. LA FIGURA ILUSTRA UN MODELO DE PRESENTACION DIFERENCIAL OBTENIDO EN NEURITAS UTILIZANDO EL OLIGONUCLEOTIDO OP-5 COMO EL INICIADOR 3''.

Description

Utilización de ARNm localizados en las neuritas para el diagnóstico y la terapéutica médicos.
Antecedentes de la invención
En años recientes ha habido un gran progreso en la comprensión de la base genética de los trastornos neuropsiquiátricos, incluyendo los asociados con el retardo mental. Aunque los defectos genéticos de dichos trastornos son distintos y cada mecanismo parece ser nuevo, el tema unificador que está detrás del desarrollo de estas enfermedades es el desarrollo cerebral y el mantenimiento de las redes neuronales.
Las redes neuronales están compuestas por neuronas individuales, constituyendo cada una de éstas una unidad celular funcional y estructural separada. Las neuronas tienen características especiales para la recepción de impulsos nerviosos de otras neuronas, el efecto de las cuales puede ser la excitación o la inhibición, y la conducción de impulsos nerviosos. Las neuronas presentan habitualmente largas prolongaciones citoplásmicas conocidas como neuritas que finalizan en una estrecha aposición con las superficies de otras células. Las terminaciones de estas neuritas se denominan terminales sinápticos y los contactos célula a célula que realizan, son conocidos como sinapsis. Las neuritas en los animales superiores están habitualmente especializadas para formar dendritas y axones, que conducen los impulsos hacia y desde el cuerpo celular, respectivamente. La llegada de un impulso a un terminal pone en marcha el proceso de la transmisión sináptica. Este suceso implica habitualmente la liberación de un compuesto químico a partir del citoplasma neuronal, dando lugar a una respuesta en la célula postsináptica. Las neuronas del sistema nervioso central están formadas por segmentos discretos que incluyen el cuerpo celular, las dendritas y el axón. Mientras que la mayoría de las células nerviosas conforman esta estructura básica, existe una amplia gama de diversidad estructural basada en la función específica de la célula en el interior del organismo.
Se ha mostrado que estas células polarizadas contienen diversas proteínas citoplásmicas y unidas a las membranas que se distribuyen de distinto modo a través del axón, dendritas y cuerpo celular de la neurona. Se cree que las neuronas del sistema nervioso central sintetizan proteínas localmente, en o cerca de los sitios postsinápticos, que son independientes del cuerpo celular. Estudios ultraestructurales han revelado que los polirribosomas se localizan preferentemente, bien por debajo de los sitios pos-sinápticos, o asociados ocasionalmente con especializaciones de la membrana en las dendritas. Se ha sugerido que estas estructuras anatómicas representan la maquinaria sintética proteica necesaria para traducir y modificar pos-translacionalmente distintos tipos de proteínas en las neuronas. Asimismo, se ha mostrado un mecanismo dependiente de la energía para el transporte selectivo de ARN en las neuronas. La naturaleza y distribución de los ARN que se encuentran en estas células, sin embargo, no se conoce claramente.
Estudios de hibridización in situ (ISH) han tenido éxito en la identificación de muy pocos ARNm en los procesos neuronales. Estudios que utilizaron la hibridización in situ y el análisis de transferencia Northern de fracciones de ARN sinaptosómico con subunidades de los receptores AMPA-GluR1, -GluR2, GluR3 y GluR-4 y las de los receptores GluR5 y GluR6 sensibles al cainato, no pudieron revelar los ARNm en localizaciones dendríticas. (Craig, A. et al., Neuron 1993, 10, 1055-1068; Chicurel, M. et al. J.Neurosci 1993, 13, 4054-4063).
La microdisección de neuritas individuales ha revelado ahora un gran número de ARNm, que incluyen miembros de la familia del receptor glutamato, componentes de segundos mensajeros, y componentes del aparato de control traduccional, que se encuentran en las neuritas del hipocampo. Se ha descubierto ahora que los perfiles de los ARNm que se expresan a partir de segmentos discretos de las mismas neuronas, tienen diferentes características. Estas diferencias en el ARNm expresado pueden utilizarse como medio para poner específicamente bajo el punto de mira segmentos discretos de la neurona, e identificar y diagnosticar trastornos neurológicos genéticos a nivel molecular.
Eberwine et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 189, pág 3010-3014, da a conocer un procedimiento para caracterizar ampliamente células únicas. Las células únicas pueden ser neuronas.
Miyashiro et al, Soc. for Neuroscience Abstracts vol 19, nº 1-3, 1993, pág 805, da a conocer que en una evaluación global, los ARNm pueden distribuirse diferencialmente en las neuritas.
Stryer, Lubert: "Biochemistry", 1990, Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft, Heidelberg, Alemania; página 747, da a conocer la utilización de actinomicina D, un inhibidor altamente específico de la síntesis del ARN en las células pro y eucarióticas, para el empleo en el tratamiento del cáncer.
Sumario de la invención
Un objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para identificar clones neuríticos de ADNc, que comprende la determinación de la expresión del ARNm en neuritas seleccionadas, la comparación de los niveles relativos de la expresión del ARNm, y la identificación de clones neuríticos de ADNc basándose en el nivel de la expresión del ARNm.
Otro objetivo de la exposición es proporcionar clones neuríticos de ADNc.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para perfilar la expresión de ARNm en una neurita seleccionada, que comprende la conversión de una población de ARNm en un soma o en una prolongación de una neurita seleccionada, en ADNc, haciendo a éste bicatenario, amplificando linealmente el ADNc bicatenario en ARNa, y utilizando el ARNa como una sonda en análisis Northern de fase inversa para producir un perfil de expresión del ARNm.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para diagnosticar una situación asociada con un patrón de expresión de ARNm, que comprende la determinación de los niveles relativos de expresión del ARNm en células seleccionadas, asociadas con una situación seleccionada, comparando los niveles relativos determinados con controles establecidos, y diagnosticando una situación basada en la comparación de los niveles de expresión del ARNm.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para identificar clones neuríticos de ADNc que comprende:
(a)
convertir una población de ARNm en neuritas seleccionadas, en ADNc;
(b)
determinar el patrón de expresión de ARNm de la población de ARNm en las neuritas seleccionadas;
(c)
comparar el patrón relativo de la expresión de ARNm con el patrón en un control;
(d)
identificar clones neuríticos de ADNc basados en el patrón de la expresión de ARNm.
Preferentemente, la expresión de ARNm se determina mediante un procedimiento de amplificación de ARNa.
Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para perfilar la expresión de ARNm en una neurita seleccionada, comprendiendo dicho procedimiento:
(a)
aislar las neuritas seleccionadas mediante transección a distancias varias a partir del cuerpo celular;
(b)
convertir una población de ARNm en las neuritas seleccionadas, en ADNc;
(c)
convertir el ADNc en bicatenario;
(d)
amplificar linealmente el ADNc bicatenario a ARNa; y
(e)
utilizar el ARNa como una sonda en un análisis Northern de fase inversa para producir un perfil de expresión del ARNm.
Convenientemente, la población de ARNm en el soma o en la prolongación de la neurita seleccionada, se convierte a ADNc utilizando un cebador oligo-dT-T7.
En las formas de realización preferidas, el ADNc bicatenario se amplifica linealmente a ARNa utilizando la T7 ARN polimerasa.
En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para diagnosticar una enfermedad neurológica asociada con un patrón de expresión del ARNm, comprendiendo dicho procedimiento:
(a)
aislar neuritas seleccionadas mediante transección a distancias variables a partir del cuerpo celular;
(b)
determinar el patrón de expresión de ARNm en las neuritas asociadas con la enfermedad;
(c)
comparar el patrón determinado de la expresión de ARNm con el patrón de la expresión de ARNm de controles establecidos; y
(d)
diagnosticar la enfermedad basándose en la comparación del patrón de expresión del ARNm.
Preferentemente, el estado es un trastorno neuropsiquiátrico o un síndrome X frágil.
Descripción breve de los dibujos
La Figura 1 es una muestra diferencial de tres células representativas. Un oligonucléotido único, OPA-5, sirvió como el 3'-cebador. En combinación con tres distintos cebadores oligo dT_{11} modificados (oligo A, 5'-T_{11}AC-3'; oligo B, 5'-T_{11}CA-3'; oligo C, 5'-T_{11}GC-3'), se llevaron a cabo reacciones de muestra diferenciales en neuritas separadas (HP3-7, HP3-8 y HP3-9) (cuadro a que se muestra en la Figura 1A), en segmentos próximos (HP2-10) y distales (HP2-12) de la misma prolongación, así como en otra prolongación separada (HP2-11) (cuadro b que se muestra en la Figura 1B) y en puntos distales de una ramificación (HP3-5 y HP3-6) de la misma prolongación (cuadro c que se muestra en la Figura 1C) de las células únicas del hipocampo. Cada una de estas neuritas se aislaron tal como se describe en el Ejemplo 1. En los cuadros a y b (Figuras 1A y 1B, se aislaron los somas correspondientes (HP 3-9 en el cuadro a; y HP2-13 en el cuadro b). Además del gran número de ARNm que se expresó en algunas neuritas (por ejemplo, carril 5 en el cuadro a que se muestra en la Figura 1A), existen algunos productos PCR habitualmente compartidos entre las neuritas o los segmentos neuríticos y entre las neuritas y sus cuerpos celulares. Estos datos se reprodujeron un mínimo de tres veces. En cada cuadro, se muestran una fotomicrografía de contraste de fase de las célula y de las neuritas de interés antes del aislamiento. Las franjas oscuras perpendiculares a cada prolongación, representan el punto aproximado de corte.
Descripción detallada de la invención
Regiones distintas del sistema nervioso central están pobladas por conexiones sinápticas distintas anatómica y funcionalmente. Durante la construcción, mantenimiento y remodelación de las sinapsis, se cree que las proteínas se transportan selectivamente a estas distintas conexiones. Como resultado, la especificidad del sistema nervioso se establece y modifica, por lo menos en parte, por estos mecanismos de localización de las proteínas. Se ha descubierto ahora que los perfiles de expresión del ARNm son específicos para los mensajes que se aprecian en las neuritas. Se ha desarrollado ahora un procedimiento para identificar los clones neuríticos de ADNc determinando la expresión del ARNm en neuritas seleccionadas, comparando los niveles relativos de la expresión del ARNm, e identificando los clones neuríticos de ADNc basándose en el nivel de la expresión del ARNm.
Células hipocámpicas aisladas, libres de prolongaciones que se solapan a partir de las células vecinas, se identificaron en cultivos de baja densidad. Bajo estas condiciones, las neuronas crecen como células aisladas o en pequeños grupos de 2 a 4 células, directamente sobre el sustrato, o sobre células gliales. Las neuronas se identifican mediante criterios morfológicos que implican interacciones sinápticas. Las neuritas individuales próximas y distales, se recolectaron seccionándolas transversalmente a varias distancias a partir del cuerpo celular, y aspirándolas en una micropipeta que contenía los reactivos necesarios para la primera etapa en el procedimiento de amplificación del ARN antisentido (ARNa). En algunos casos, se aislaron múltiples prolongaciones a partir de una célula única, seguido por la aspiración del cuerpo celular. Las neuronas individuales o los cuerpos celulares se procesaron mediante el siguiente procedimiento de amplificación del ARNa para producir un perfil de expresión del ARNm. La población de ARNm en el soma celular o en la prolongación celular se convirtió en un ADN complementario (ADNc) utilizando un cebador oligo-dT-T7. Después de que el ADNc se convirtiera en bicatenario, se amplificó linealmente a ARNa utilizando la T7 ADN polimerasa. Para el análisis Northern inverso, los ARNa sirvieron como una sonda para los perfiles de expresión del ARNm. En experimentos subsiguientes, los ARNa se transformaron en ADNc bicatenarios y se utilizaron como matrices para experimentos que utilizaran la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La población de los ARNm en las neuritas se evaluó inicialmente mediante el perfil de expresión del ARNm. Transferencias Southern que contenían ADNc clonados que codificaban miembros de la familia de los receptores de glutamato inotrópico, se sondearon con el ARNa marcado radioactivamente de las neuritas individuales o de los cuerpos celulares. Los receptores de glutamato, clasificados en el N-metil-D-aspartato (NMDA), el \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propionato (AMPA; GluR1-4) y los subtipos cainato (GluR5-7) son los primeros mediadores de la transmisión sináptica en el cerebro. Estos receptores juegan asimismo un papel en los sucesos bioquímicos asociados con la excitotoxicidad y la potenciación a largo plazo (LTP), una forma especializada de plasticidad sináptica. Se examinó la expresión de ARNm cualitativa de los múltiples miembros de la familia del receptor glutamato. Todas las neuritas expresaron GluR1, GluR2, GluR4 y NMDAR1 ARNm. En la mayoría de las neuritas, se observó la expresión de ARNm de GluR3 (15/19), GluR5 (14/19); mientras que la expresión para GluR6 ARNm fue detectable en la mitad, aproximadamente, de las neuritas estudiadas. La presencia de estas subunidades se confirmó mediante PCR específico de la subunidad. Al contrario, sólo una neurita mostró señales detectables de hibridización para NR2a y NR2c ARNm. De este modo, los clones neuríticos de ADNc pueden ser identificados determinando la expresión del ARNm para los receptores glutamato. Ejemplos de receptores preferidos de glutamato incluyen, pero no se limitan a GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6, GluR7, NR2a y NR2b.
Diversos clones neuríticos de ADNc se han identificado ahora según los procedimientos de la presente invención. Se ha descubierto que dos de estos clones corresponden a la ARNm farnesil difosfato sintasa (FPP), identificados en dos prolongaciones distales separadas. Como parte de la vía biosintética del isopreno, la FPP sintasa genera la fracción farnesilo que se transfiere finalmente al motivo CaaX COOH-terminal de las proteínas ras de los mamíferos. Se ha descubierto que otros dos ADNc presentan una similitud secuencial con los ARNm para la subunidad g del receptor de la interleuquina-2 y la proteína A20 inducible del factor de necrosis tumoral. Los clones ADNc restantes presentan una pequeña similitud secuencial con cualquiera de las secuencias génicas publicadas. Secuenciando los clones de ADNc que corresponden a los ARN completos, es posible identificar el papel que la secuencia primaria y las características estructurales secundarias del ARNm juegan como elementos de reconocimiento en el transporte y focalización del ARNm. Los clones de ADNc de la presente exposición se identifican en la Tabla 1 como desde la SEC ID nº: 1 a la SEC ID nº: 28.
TABLA 1
CLON SEC ID nº:
57-3 SEC ID nº: 1
59-3 SEC ID nº: 2
60-3 SEC ID nº: 3
63-3 SEC ID nº: 4
64-3 SEC ID nº: 5
65-3 SEC ID nº: 6
66-3 SEC ID nº: 7
67-3 SEC ID nº: 8
68-3 SEC ID nº: 9
70-3 SEC ID nº: 10
71-3 SEC ID nº: 11
72-3 SEC ID nº: 12
73-3 SEC ID nº: 13
76-3 SEC ID nº: 14
78-3 SEC ID nº: 15
60-7 SEC ID nº: 16
63-7 SEC ID nº: 17
64-7 SEC ID nº: 18
66-7 SEC ID nº: 19
67-7 SEC ID nº: 20
68-7 SEC ID nº: 21
69-7 SEC ID nº: 22
70-7 SEC ID nº: 23
71-7 SEC ID nº: 24
72-7 SEC ID nº: 25
74-7 SEC ID nº: 26
78-7 SEC ID nº: 27
100-7 SEC ID nº: 28
Los clones de ADNc de la presente exposición pueden utilizarse en el diagnóstico de enfermedades neuropsiquiátricas. Los genes humanos que contienen repeticiones triplete inestables, se asocian con varias enfermedades neuropsiquiátricas que incluyen, pero no se limitan a la enfermedad de Huntington, atrofia muscular bulbar y espinal y ataxia espinocerebelosa de tipo 1. Estas enfermedades muestran diversos síntomas clínicos que las hacen difícil de diagnosticar. Sin embargo, una comprensión de estas enfermedades al nivel molecular proporciona el diagnóstico de laboratorio con la capacidad de ensayar directamente si el ADN de un individuo contiene la mutación causante de la enfermedad, bien como confirmación de un diagnóstico clínico o previamente a cualquier síntoma. Por ejemplo, los cromosomas X frágiles, que se asocian con retardo mental en la mayoría de los individuos que la presentan y, en un grado menor, en alguna de las hembras heterocigóticas para él, pueden identificarse utilizando clones ADNc de la presente exposición que tienen SEC ID nº: 1 a 15. Los clones ADNc de la presente exposición, pueden utilizarse asimismo en el rastreo prenatal.
Utilizando el análisis de transferencia Northern inversa, se han identificado asimismo distintas variaciones relativas en la expresión de ARNm. Se han observado diferencias en los niveles relativos de los ARNm del receptor glutamato que se expresan entre una prolongación o prolongaciones neuronales a partir de la misma célula y de su cuerpo celular. En diversas células, los patrones de expresión cualitativa fueron muy parecidos, pero sin embargo, la intensidad relativa de la señal de hibridización fue más profunda para subunidades específicas. Por ejemplo, niveles relativos de NMDAR1 y GluR5 ARNm estaban claramente elevados en HP9a, la neurita apical, respecto a HP9b, la neurita basal, o el soma. Esta tendencia se cumplimentó en otras células que mostraron un patrón cualitativo más diferenciado de la expresión ARNm del receptor glutamato. Este patrón diferenciado de la expresión de ARNm contribuye a la función fisiológica de una sinapsis. Estas diferencias en los niveles relativos de la expresión de ARNm dan lugar a que tengan lugar distintos procesos neuronales en la misma célula. Además de los receptores de glutamato, la expresión de otros varios ADNc se ha evaluado mediante el análisis de la transferencia Northern inversa. Informes previos demostraron la lo-
calización dendrítica de las \alpha-subunidades del ARNm proteína quinasa dependiente de Ca^{+2}/calmodulina (CaMK II).
Se ha descubierto ahora que la expresión del ARNm en los segmentos distales y proximales de neuritas aisladas, es intensamente positiva para CaMK II. Así, segmentos específicos y procesos de una neurona pueden focalizarse determinando el perfil de la expresión del ARNm implicado en el proceso, identificando un ARNm con un alto nivel de expresión y focalizando un agente en este ARNm.
La enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington y la epilepsia, constituyen todas ejemplos de trastornos que implican la degeneración de grupos específicos de neuronas en regiones discretas del sistema nervioso. Parece que regiones distintas del sistema nervioso, y específicamente, distintos tipos de neuronas poseen sensibilidades diferentes para los agentes. Por tanto, para evaluar la neurotoxicidad de un agente, éste debe evaluarse en neuronas aisladas de regiones distintas, ya que parece que algunos tipos de neuronas son más sensibles que otros. Sin embargo, se ha descubierto ahora que pueden identificarse tipos de neuronas determinando la expresión del ARNm en neuronas seleccionadas, comparando los niveles de la expresión del ARNm en las neuronas seleccionadas, con los niveles en neuronas conocidas, e identificar el tipo de neurona basándose en el nivel de la expresión del ARNm. Así, la neurotoxicidad de un agente para una neurona específica, puede evaluarse en un cultivo de tipos mezclados de neuronas. En este procedimiento, se prefiere que la expresión del ARNm se determine mediante un procedimiento de amplificación del ARNa.
La complejidad de la expresión del ARNm en las neuronas se investigó además utilizando un ensayo basado en la PCR, exposición diferencial desarrollada por Liang P. et al., Science 1993, 257,967-970. En estos experimentos, un cebador único de 10 unidades metaméricas (OPA-5; 5'-AGGGGTCTTG-3', SEC ID nº: 29) que sirve como 5'-cebador y un cebador de politimidina modificado que contiene una prolongación de dos bases, se utilizaron para amplificar poblaciones específicas del conjunto del ARN poliadenilado. En cada una de estas reacciones, se observaron patrones de bandas únicos para el soma o su prolongación y la combinación de los cebadores utilizados. La exposición diferencial (DD) de los ARNm de tres conjuntos celulares, se muestran en la Figura 1. El complemento del perfil DD de las neuritas mostró una gran cantidad de tipos de ARNm. Estos patrones de productos PCR indican que los ARNm están distribuidos de modo diferencial. Por ejemplo, en una célula típica en la que dos neuritas se seccionan transversalmente y se aíslan, existen transcritos que migran a tamaños moleculares similares entre las neuritas individuales. Esta circunstancia se aprecia repetidamente en los segmentos proximales y distales de la misma prolongación y en los puntos distales de la ramificación de una prolongación única. Mientras que existen algunos productos que se han encontrado de forma concomitante en una o más neuritas y entre las neuritas y sus correspondientes cuerpos celulares, existen numerosos transcritos que son únicos para las neuritas individuales o los segmentos de las neuritas individua-
les. Muestras de los medios y de ARNt no mostraron ningún patrón de bandas, utilizando la exposición diferencial.
La contaminación de las neuritas con la glia que las rodea o con las prolongaciones astrogliales, se evaluó mediante el ARNm de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Se determinó que las preparaciones neuríticas y de los somas utilizadas en estos experimentos, estaban libres de ARNm GFAP. La existencia de múltiples ARN en las prolongaciones neuronales sugiere que el transporte de ARNm y la síntesis proteica local juega un papel en la regulación de la fisiología, desarrollo y regeneración neuronales.
En la presente invención, los patrones de expresión del ARNm pueden utilizarse para diagnosticar situaciones relacionadas con la presencia o ausencia de proteínas sintetizadas. En años recientes, se han identificado varias enfermedades neurológicas humanas que provienen de la expansión de repeticiones trinucleótidas. Estas repeticiones triplete son normalmente polimórficas y exónicas, aunque no siempre llevan a cabo una codificación. En estados patológicos, se convierten en muy inestables, y pueden extenderse moderadamente o por miles de repeticiones en una única generación, alterando por eso la expresión génica, la estabilidad de los mensajes o la estructura proteica. De este modo, en un estado de enfermedad, se esperarían alteraciones en los patrones o perfiles normales de expresión del ARNm. Los procedimientos relacionados con el diagnóstico de una situación asociada con un patrón de expresión del ARNm, comprenden determinar los niveles relativos de la expresión del ARNm en células seleccionadas asociadas con una situación seleccionada; comparar los niveles relativos determinados con controles establecidos; y diagnosticar una situación basada en la comparación de los niveles de expresión del ARNm. En este procedimiento, se prefiere que las células seleccionadas sean neuronas.
La medición de los patrones de expresión del ARNm, tal como se da a conocer en la presente invención, puede utilizarse asimismo en procedimientos para tratar una situación asociada con un patrón de expresión del ARNm. Los niveles de expresión del ARNm en células seleccionadas, asociados con una situación seleccionada, se determinan y comparan con los niveles normales en el mismo tipo de células. Si el nivel de la expresión del ARNm es anormal, se administra una cantidad efectiva de un agente capaz de alterar la expresión del ARNm. En este procedimiento, se prefiere que los niveles de expresión del ARNm se midan en neuronas. Ejemplos de agentes capaces de alterar la expresión del ARNm incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos antisentido y agentes farmacológicos tales como dopamina, seronina y AMP cíclico. Dichos agentes se administran en una cantidad efectiva, solos o conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable apropiado. Por "cantidad efectiva" quiere significarse una concentración de un agente que vaya a administrarse que sea suficiente para modular la expresión del ARNm. Dichas concentraciones pueden determinarse rutinariamente por el experto en la materia con respecto a esta exposición, y dependerá de la edad, peso y situación de un paciente. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Gennaro, Alfonso, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, un texto de referencia estándar en este campo. Los portadores farmacéuticos pueden seleccionarse según la vía de administración que tenga la intención de utilizarse y la práctica farmacéutica estándar.
Los siguientes ejemplos no limitativos, se proporcionan con propósitos ilustrativos.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de neuritas
Se sometieron a disección hipocampos de fetos de ratas ED20-21, se disociaron en tripsina y se sembraron a razón de entre 30.000 y 100.000 células viables/ml de medio, sobre cubreobjetos recubiertos con polilisina mantenidos en discos de petri de cultivo tisular de 35 mm. Un día después de la siembra, 0,5 ml de medio se reemplazaron con medio que contenía 20 mM de potasio. Se suministró a continuación a los cultivos, una vez a la semana, una gota de medio con un alto contenido en K^{+}. Se llevaron a cabo experimentos después de 21 a 28 días de cultivo. A partir de células cultivadas de distintos animales, se tomaron cuerpos celulares y sus neuritas, en tres días distintos bajo situaciones similares. Durante cada una de estas sesiones, se aspiró asimismo una muestra de medio de cultivo, y se procesó mediante el
procesamiento de ARNa para evaluar la presencia posibles de ARNm en el medio de cultivo de las células moribundas.
Ejemplo 2 Determinación de los patrones de bandas del ARNm
Se llevaron a cabo reacciones en volúmenes de 25 \mul utilizando la técnica de inicio caliente (Perkin Elmer, producto N808-0100 (catálogo 1993), con una proporción superior-inferior de 1,5 a 1. Las reacciones contenían 200 \muM de dATP, dGTP y TTP, 4 \muM dCTP, 5 \muCi de ^{33}P-dCTP ó 4 \muCi de ^{32}P-dCTP o 18,75 \muCi de ^{35}S-dATP (NEN/Dupont), 0,4 \muM de OPA-5 u otros cebadores de 10 unidades metaméricas (Operon Technologies), 0,6 \muM de oligo A, B o C, 2,5 mM MgCl_{2}, 1,25 unidades de polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer), y 1 \mul de una dilución 1:10 de ADN procesado previamente mediante una ronda única de amplificación ARNa. Bajo estas condiciones, los cebadores están en un gran exceso respecto a la cantidad de matriz utilizada para la reacción. Las reacciones se sometieron a 35 rondas de ciclación a 94ºC durante 30 segundos, a 40ºC durante 90 segundos y a 72ºC durante 45 segundos, seguido por un alargamiento final de 5 minutos a 72ºC en un termociclador Biosycler. Aproximadamente, 5 \mul de la reacción se cargaron en un gel de acrilamida al 6%/7M de urea. Los geles se secaron al vacío y se expusieron a una película XAR. Los geles que se muestran en la Figura 1 utilizaron ^{33}P-dCTP. Las reacciones mostraron un patrón único de bandas para una muestra.
Ejemplo 3 Síntesis del ADNc
Micropipetas que contenían reactivos para la síntesis del ADNc monocatenario contenían asimismo 5 \muM de ditiotreitol y RNAsin® (Promega, Madison, WI) a 0,5 unidades/\mul. La eficiencia de la amplificación, basada en los contajes precipitados por el ácido tricloroacético y en el análisis de transferencia Northern para evaluar la distribución del tamaño de los ARNm, no difirió con o sin digitonina. ARN antisentido procesado a través de dos rondas de amplificación, se añadió a transferencias Southern que contenían cantidades iguales (500 ng) de ADNc del receptor glutamato linearizados con el enzima de restricción apropiado y aplicados al vacío en un aparato de transferencia de ranura. Un clon ADNc vectorial cebado al azar, pBluescript SK (Stratagene, la Jolla, CA), se añadió a transferencias desmontadas para demostrar la presencia de ADN en cada ranura. Se llevó a cabo el análisis de la densitometría de rastreo en autoradiografías, utilizando un Densitómetro de Láser de Rastreo (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Las señales de hibridización se normalizaron para el ARN ribosómico para cada neurita o soma estudiado.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: James Eberwine, Marc Dichter, Kevin Miyashiro
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UTILIZACIÓN DE ARNm LOCALIZADOS EN LAS NEURITAS PARA EL DIAGNÓSTICO MÉDICO Y TERAPÉUTICO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN/DESTINATARIO: Jane Massey Licata, Esq.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 210 Lake Drive East, Suite 201
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Cherry Hill
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 08002
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquete, 3,5 pulgadas, 1.44 Mb de capacidad
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM 486
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: WINDOWS FOR WORKGROUPS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WORDPERFECT 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: todavía no asignado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: con la presente
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Jane Massey Licata
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32.257
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO/ETIQUETA: PENN-0028
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (609) 779-2400
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: (609) 779-8488
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 200
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 434
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 404
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 261
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 141
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 141
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 489
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 422
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 136
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 427
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 286
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 305
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 136
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 143
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 511
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
15
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 370
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 261
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 169
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 386
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
20
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 395
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 20
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 136
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 237
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 383
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 23
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 305
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 24
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 306
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 25
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 446
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 26
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 396
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 27
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 136
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: ÚNICO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 28
\vskip1.000000\baselineskip
30

Claims (7)

1. Procedimiento para la identificación de clones neuríticos de ADNc que comprende:
(a)
aislar las neuritas seleccionadas mediante transección a distancias variables del cuerpo celular;
(b)
convertir una población de ARNm en las neuritas seleccionadas en ADNc;
(c)
determinar el patrón de expresión de ARNm de la población de ARNm en las neuritas seleccionadas;
(d)
comparar el patrón relativo de la expresión de ARNm con el patrón en un control; e
(e)
identificar clones neuríticos de ADNc basados en el patrón de la expresión de ARNm.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la expresión de ARNm se determina mediante un procedimiento de amplificación RNAa.
3. Procedimiento para perfilar la expresión de ARNm en una neurita seleccionada, comprendiendo dicho procedimiento:
(a)
aislar las neuritas seleccionadas mediante transección a distancias variables del cuerpo celular;
(b)
convertir una población de ARNm en las neuritas seleccionadas en ADNc;
(c)
realizar el ADNc bicatenario;
(d)
amplificar linealmente el ADNc bicatenario a ARNa; y
(e)
utilizar el ARNa como una sonda en un análisis Northern de fase inversa para producir un perfil de expresión del ARNm.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la población de ARNm en el soma o en la prolongación de la neurita seleccionada, se convierte en ADNc utilizando un cebador oligo-dT-T7.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que el ADNc bicatenario se amplifica linealmente a ARNa utilizando la T7 ARN polimerasa.
6. Procedimiento para diagnosticar una enfermedad neurológica asociada con un patrón de expresión del ARNm, comprendiendo dicho procedimiento:
(a)
aislar las neuritas seleccionadas mediante transección a distancias variables a partir del cuerpo celular;
(b)
determinar el patrón de expresión de ARNm en las neuritas asociadas con la enfermedad;
(c)
comparar el patrón determinado de la expresión de ARNm con el patrón de la expresión de ARNm de controles establecidos; y
(d)
diagnosticar la enfermedad basándose en la comparación del patrón de expresión del ARNm.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el estado es un trastorno neuropsiquiátrico o un síndrome X frágil.
ES95939944T 1994-11-03 1995-11-03 Utilizacion de arnm localizados en las neuritas para el diagnostico y la terapeutica medicos. Expired - Lifetime ES2256852T3 (es)

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