DE60222590T2

DE60222590T2 - Methoden zur feststellung von akute myeloischen leukämie

Info

Publication number: DE60222590T2
Application number: DE2002622590
Authority: DE
Inventors: Mitch San Diego RAPONI
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 2001-10-30
Filing date: 2002-10-30
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2022-10-31
Also published as: WO2003038129A3; WO2003038129A2; KR20040065524A; EP1478773B1; DE60222590D1; ATE373725T1; CA2451168A1; MXPA04004072A; EP1478773A2; JP2005522990A; US20070048782A1; US20040110792A1; BR0206251A

Description

HINTERGRUND
Diese Erfindung bezieht sich auf die Diagnostik, Prognostik und auf Behandlungen von Leukämie, basierend auf den Genexpressions-Profilen von Leukämiezellen.
Einige Moleküle, wie z.B. Ras, die mit Krebs in Verbindung gebracht werden, müssen durch die Farnesyltransferase-Enzyme farnesyliert werden, um mit der Innenseite der Plasmamembran der Zelle zu interagieren und in verschiedene Signalwege involviert zu werden. Ras ist nicht das einzige Protein, das mit Krebs in Verbindung gebracht wird, das eine CAAX-Box aufweist, die prenyliert wird. Farnesyltransferase-Inhibitoren (FTI's) sind therapeutische Mittel, die die kovalente Anknüpfung von Kohlenstoff-Farnesyl-Resten an das C-terminale CAAX-Motiv von verschiedenen Proteinen inhibieren. Sie finden Verwendung bei der Behandlung von Krebs und proliferativen Erkrankungen, wie z.B. Leukämie. Akute myelogene Leukämie (AML) gehört zu den Erkrankungen, die am günstigsten mit FTI's adressiert werden können.
Wie es im Fall vieler Behandlungskuren wahr ist, sprechen einige Patienten auf die Behandlung mit FTI's an und andere nicht. Das Verordnen der Behandlung an einen Patienten, der wahrscheinlich nicht auf diese ansprechen wird, ist nicht wünschenswert. Daher wäre es nützlich zu wissen, wie von einem Patienten erwartet werden kann, auf solch eine Behandlung anzusprechen, ehe ein Wirkstoff verabreicht wird, so daß nicht-ansprechende Patienten nicht unnötig behandelt werden, und daß diejenigen mit der besten Chance eines Nutzens aus dem Wirkstoff richtig behandelt und beobachtet werden. Weiterhin kann es bei denjenigen, die auf die Behandlung ansprechen, unterschiedliche Grade des Ansprechens geben. Die Behandlung mit anderen Therapeutika als FTI's oder die Behandlung mit Therapeutika zusätzlich zu den FTI's kann für diejenigen Patienten von Vorteil sein, die nicht auf FTI's ansprechen oder in denen die Antwort auf FTI's allein weniger als erwünscht ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient mit akuter myelogener Leukämie (ALM) auf eine Behandlung mit Farnesyl-Transferase-Inhibitor (FTI) ansprechen wird, mittels:

(a) Analyse einer kranken Zelle aus einer Knochenmarksprobe des Patienten auf eine nachweisbare Differenz in der Höhe der Expression eines Gens, umfassend SEQ ID NO: 846 (3434105F7) nach Behandlung mit einem FTI im Vergleich zu einer unbehandelten kranken Zelle als Bezugswert;
(b) Vergleich der nachweisbaren Differenz aus Schritt (a) mit solchen, die bei auf die Behandlung ansprechenden und nicht-ansprechenden Patienten festgestellt wurden; und
(c) Bestimmung, ob der Patient ein Genexpressionsmuster eines auf die Behandlung ansprechenden oder nicht-ansprechenden Patienten aufweist, um festzustellen, ob die Behandlung des Patienten mit einem FTI indiziert sein kann.

In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Beobachtung der Behandlungsreaktion eines Patienten mit akuter myelogener Leukämie, der mit einem FTI behandelt wird, zur Verfügung gestellt, mittels:

(a) Analyse einer kranken Zelle aus einer Knochenmarksprobe des Patienten auf eine nachweisbare Differenz in der Höhe der Expression eines Gens, umfassend SEQ ID NO: 846 (3434105F7) zu verschiedenen Zeitpunkten während des Behandlungsverlaufs;
(b) Vergleich des Genexpressionsmusters aus Schritt (a) mit solchen, die bei auf die Behandlung ansprechenden und nicht-ansprechenden Patienten festgestellt wurde; und
(c) Bestimmung, ob der Patient ein Genexpressionsmuster eines auf die Behandlung ansprechenden oder nicht-ansprechenden Patienten aufweist, um festzustellen, ob die Behandlung des Patienten fortgesetzt werden soll.

Ein Patient kann behandelt werden, wenn das Genexpressionsprofil die Aufregulation von einem oder mehreren bestimmten Genen, die indikativ für FTI ansprechende Patienten ist, zeigt.
Genexpressionsprofile indikativ für FTI ansprechende Patienten sind bevorzugterweise solche, welche mindestens eine 1,5-fache, 1,7-fache oder 2-fache Differenz relativ zu den FTI nicht-ansprechenden Patienten zeigt.
Ein Patient kann behandelt werden, wenn das Genexpressionsprofil die Herabregulation von einem oder mehreren bestimmten Genen, die indikativ für FTI ansprechende Patienten sind, zeigt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verfügung, wobei Schritt (a) die Analyse der Höhe der Expression einer Kombination von Genen beinhaltet, die in (i) Tabellen 1–3 oder (ii) Tabelle 1 gezeigt sind.
Bevorzugterweise ist der FTI ein Chinolin oder ein Chinolinderivat.
Bevorzugterweise ist der FTI (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl)-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolin).
Artikel, die zum Ausüben der Verfahren verwendet werden, schließen Genexpressionsprofile oder Repräsentationen dieser ein, die in computerlesbaren Medien fixiert sind. Andere Artikel schließen Nukleinsäure-Arrays ein, die verwendet werden, um die Genexpressionsprofile der Erfindung zu bestimmen.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines FTI zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines AML-erkrankten Patienten zur Verfügung, wobei der Patient mit einem Verfahren der Erfindung als ein auf die Behandlung ansprechendes Individuum identifiziert wurde.
Das Medikament kann eine weitere therapeutische Zusammensetzung umfassen. Bevorzugterweise moduliert die besagte weitere therapeutische Zusammensetzung einen MAPK/ERK-Signalweg, TGFβ-, WNT- oder einen apoptotischen Weg.
Das Medikament kann einen FTI und eine therapeutische Zusammensetzung umfassen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tyrosinkinaseinhibitoren, MEK-Kinaseinhibitoren, PI3K-Kinaseinhibitoren, MAP-Kinaseinhibitoren, Apoptose-Modulatoren und Kombinationen davon.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist ein Beispiel einer graphischen Anzeige von Genexpressionsmustern, die verwendet werden, um die Genexpressionsprofile dieser Erfindung zu analysieren.
2 ist ein schematisches Diagramm des MAPK/ERK-Weges.
3 ist ein schematisches Diagramm des TGFβ- und WNT-Weges.
4 ist ein schematisches Diagramm des apoptotischen Weges.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die therapeutischen Mittel, auf die sich in dieser Beschreibung bezogen wird, sind FTI's. Sie nehmen eine Vielzahl von Formen an, aber teilen die essentielle inhibitorische Funktion des Interferierens mit der Farnesylierung oder der Verringerung der Farnesylierung von Proteinen, die mit Krebs und proliferativen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Bevorzugterweise sind die FTI's diejenigen, die für die Behandlung von Leukämien, wie z.B. AML, angegeben werden. Ein Patient, der auf ein FTI anspricht, ist einer in welchem eine Reduktion von mehr als 50% Blastenzellen im Knochenmark nach der Behandlung mit dem FTI gesehen wird.
Zahlreiche FTI's sind innerhalb des Umfanges der Erfindung und schließen diejenigen ein, die in den US-Patenten: 5,976,851 von Brown et al.; 5,972,984 von Anthony et al.; 5,972,966 von deSolms; 5,968,965 von Dinsmore et al.; 5,968,952 von Venet et al.; 6,187,786 von Venet et al.; 6,169,096 von Venet et al.; 6,037,350 von Venet et al.; 6,177,432 von Angibaud et al.; 5,965,578 von Graham et al.; 5,965,539 von Sebti et al.; 5,958,939 von Afonso et al.; 5,939,557 von Anthony et al.; 5,936,097 von Commercon et al.; 5,891,889 von Anthony et al.; 5,889,053 von Baudin et al.; 5,880,140 von Anthony; 5,872,135 von deSolms; 5,869,682 von deSolms; 5,861,529 von Baudoin; 5,859,015 von Graham et al.; 5,856,439 von Clerc; 5,856,326 von Anthony et al.; 5,852,010 von Graham et al.; 5,843,941 von Marsters et al.; 5,807,852 von Doll; 5,780,492 von Dinsmore et al.; 5,773,455 von Dong et al.; 5,767,274 von Kim et al.; 5,756,528 von Anthony et al.; 5,750,567 von Baudoin et al.; 5,721,236 von Bishop et al.; 5,700,806 von Doll et al.; 5,661,161 von Anthony et al.; 5,602,098 von Sebti et al.; 5,585,359 von Breslin et al.; 5,578,629 von Ciccarone et al.; 5,534,537 von Ciccarone et al.; 5,532,359 von Marsters et al.; 5,523,430 von Patel et al.; 5,504,212 von deSolms et al.; 5,491,194 von deSolms et al.; 5,420,245 von Brown et al. und 5,238,922 von Graham et al. beschrieben werden. Nicht-peptidische, sogenannte „kleines Molekül" („small molecule") Therapeutika werden bevorzugt. Weiter bevorzugte FTI's sind Chinoline oder Chinolinderivate, wie z.B.:
7-(3-Chlorphenyl)-9-[(4-chlorphenyl)-1H-imidazol-1-ylmethyl]-2,3-dihydro-1H,5H-benz[ij]chinolizin-5-on;
7-(3-Chlorphenyl)-9-[(4-chlorphenyl)-1H-imidazol-1-ylmethyl]-1,2-dihydro-4H-pyrrolo[3,2,1-ij]chinolin-4-on;
8-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-6-(3-chlorphenyl)-1,2-dihydro-4H-pyrrolo[3,2,1-ij]chinolin-4-on; und
8-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-6-(3-chlorphenyl)-2,3-dihydro-1H,5H-benz[ij]chinolizin-5-on.
Der am meisten bevorzugte FTI ist (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolinon).
Für die Behandlung von Leukämie mit FTI's und anderen therapeutischen Mitteln, sind die therapeutischen Mittel, auf die sich in dieser Beschreibung bezogen wird, diejenigen, die einen Effekt auf den biologischen Weg aufweisen, der durch die Genexpressionsanalyse von leukämischen Zellen, die der Behandlung mit Chinolin-basierten FTI's ausgesetzt wurden, erklärt wird.
Die bloße Anwesenheit von Nukleinsäuresequenzen, die das Potential aufweisen, Proteine oder Peptide (Gene) innerhalb des Genoms zu exprimieren, ist nicht bestimmend darüber, ob ein Protein oder Peptid in einer gegebenen Zelle exprimiert wird. Ob ein gegebenes Gen das zur Expression von Proteinen oder Peptiden in der Lage ist, dieses tut oder nicht und in welchem Ausmaß solch eine Expression auftritt, wenn überhaupt, wird durch eine Vielfalt von komplexen Faktoren bestimmt. Ohne Rücksicht auf die Schwierigkeiten bei dem Verstehen und Untersuchen dieser Faktoren kann die Untersuchung der Genexpression eine nützliche Information über die zelluläre Antwort auf einen gegebenen Stimulus, wie z.B. die Einführung eines Wirkstoffes oder eines anderen therapeutischen Mittels, zur Verfügung stellen. Relative Anzeigen des Grades, in welchem Gene aktiv oder inaktiv sind, kann in Genexpressionsprofilen gefunden werden. Die Genexpresisonsprofile dieser Erfindung werden verwen det, um Patienten zu identifizieren und zu behandeln, welche wahrscheinlich von einer gegebenen Therapie profitieren werden, oder um Patienten von einer gegebenen Therapie auszuschließen, wo der Patient wahrscheinlich geringes oder kein vorteilhaftes Ansprechen auf den Wirkstoff oder die Therapie erfahren würde.
Bevorzugte Verfahren zum Etablieren von Genexpressionsprofilen (einschließlich derjenigen, die verwendet werden, um zur Erklärung der relevanten biologischen Wege zu gelangen) schließen das Bestimmen der Menge der RNA ein, die von einem Gen produziert wird, das für ein Protein oder Peptid kodieren kann. Dies wird erreicht durch reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR), kompetitive RT-PCR, real time RT-PCR, differentielle Display RT-PCR, Northern Blot-Analyse und andere verwandte Tests. Während es möglich ist, diese Techniken unter der Verwendung individueller PCR-Reaktionen auszuführen, ist es das Beste, die Copy-DNA (cDNA) oder Copy-RNA (cRNA), die aus der mRNA produziert wird, zu amplifizieren und diese mittels Mikroarray zu analysieren. Eine Reihe von verschiedenen Array-Konfigurationen und Methoden für deren Produktion sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und werden in US-Patenten beschrieben, z.B.: 5,445,934 ; 5,532,128 ; 5,556,752 ; 5,242,974 ; 5,384,261 ; 5,405,783 ; 5,412,087 ; 5,424,186 ; 5,429,807 ; 5,436,327 ; 5,472,672 ; 5,527,681 ; 5,529,756 ; 5,545,531 ; 5,554,501 ; 5,561,071 ; 5,571,639 ; 5,593,839 ; 5,599,695 ; 5,624,711 ; 5,658,734 und 5,700,637 .
Mikroarray-Technologie erlaubt die Messung von stationären Zustand-, mRNA-Spiegeln von Tausenden von Genen simultan und repräsentiert dabei ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Identifizierung der Effekte von FTI auf die Zellbiologie und den möglichen Effekt der Behandlung basierend auf der Analyse solcher Effekte. Zwei Mikroarray-Technologien sind derzeit in breiter Anwendung. Die erste sind cDNA-Arrays und die zweite sind Polynukleotid-Arrays. Obwohl Unterschiede bei der Konstruktion beider Chips existieren, sind im wesentlichen die gesamte Downstream-Datenanalyse und das Ergebnis („output") dieselben. Das Produkt dieser Analysen sind typischerweise Messungen der Intensität des Signals, welches von einer markierten Sonde erhalten wird, die verwendet wird, um eine cDNA-Sequenz aus der Probe zu detektieren, die mit einer Nukleinsäuresequenz an einer bekannten Stelle auf dem Mikroarray hybridisiert. Typischerweise ist die Intensität des Signals proportional zur Quantität der cDNA und daher der mRNA, die in den Probenzellen exprimiert wird. Eine große Zahl solcher Techniken sind erhältlich und nützlich. Bevorzugte Methoden für die Bestimmung der Genexpression können in den US-Patenten 6,271,002 von Linsley et al.; 6,218,122 von Friend et al.; 6,218,114 von Peck et al. und 6,004,755 von Wang et al. gefunden werden.
Die Analyse der Expressionsspiegel wird durch Vergleich solcher Intensitäten ausgeführt. Dies wird am besten durchgeführt durch das Generieren einer Verhältnismatrix der Expressionsintensitäten der Gene in einer Testprobe versus derjenigen einer Kontrollprobe. Zum Beispiel können die Genexpressionsintensitäten aus einem Gewebe, das mit einem Wirkstoff behandelt wurde, mit den Expressionsintensitäten verglichen werden, die aus demselben Gewebe generiert wurden, das nicht mit dem Wirkstoff behandelt wurde. Ein Verhältnis dieser Expressionsintensitäten zeigt die x-fache Veränderung in der Genexpression zwischen der Test- und der Kontrollprobe an.
Genexpressionsprofile können auch auf eine Reihe von Arten und Weisen angezeigt werden. Die üblichste Methode ist es, eine Verhältnismatrix in einem graphischen Dendogramm zu arrangieren, wo die Säulen Testproben angeben und die Reihen Gene angeben. Die Daten werden arrangiert, so daß Gene, die ähnliche Expressionsprofile aufweisen, einander nahe sind (z.B. 1). Das Expressionsverhältnis für jedes Gen wird als eine Farbe visualisiert. Zum Beispiel kann ein Verhältnis von weniger als 1 (was Herabregulation anzeigt) im blauen Bereich des Spektrums erscheinen, wohingegen ein Verhältnis von größer als 1 (was Aufregulierung anzeigt) als eine Farbe im roten Bereich des Spektrums erscheinen. Kommerziell erhältliche Computersoftwareprogramme sind erhältlich, um solche Daten anzuzeigen, einschließlich Software „OMNIVIZ PRO" von Batelle und Software „TREE VIEW" von Stanford.
Die Gene, die unterschiedlich exprimiert werden, sind entweder aufreguliert oder herabreguliert in erkrankten Zellen nachfolgend der Behandlung mit einem FTI. Aufregulierung und Herabregulierung sind relative Begriffen, die bedeuten, daß eine detektierbare Differenz (über dem Beitrag des Rauschens in dem System, das verwendet wird, um zu messen) in der Höhe der Expression der Gene relativ zu irgendeiner Grundlinie gefunden wird. In diesem Fall ist die Grundlinie oder der Bezugswert die gemessene Genexpression der unbehandelten erkrankten Zelle. Die Gene von Interesse in der behandelten erkrankten Zelle sind dann entweder aufreguliert oder herabreguliert relativ zum Grundlinienspiegel unter der Verwendung derselben Meßmethode. Bevorzugterweise werden die Spiegel der Auf- und Herabregulation basierend auf Veränderungen in den Intentitätsmessungen der hybridisierten Mikroarrayson den unterschieden. Eine 1,5-fache Differenz wird bevorzugt, um solche Unterscheidungen zu machen. Das heißt, ehe von einem Gen gesagt wird, daß es unterschiedlich in behandelten versus unbehandelten erkrankten Zellen exprimiert wird, wird von der behandelten Zelle gefunden, daß sie mindestens 1,5 mal mehr oder 1,5 mal weniger Intensität erreicht als die unbehandelten Zellen. Eine 1,7-fache Differenz wird weiter bevorzugt, und eine 2-fache oder weiter-fache Differenz in der Genexpressionsmessung wird am meisten bevorzugt. Tabelle 3 führt Gene auf, die üblicherweise quer durch alle Zellinien und in den Proben der ansprechenden Patienten moduliert waren.
Ein Portfolio von Genen ist ein Satz der Gene, die gruppiert sind, so daß die Information, die über diese erhalten wird, die Basis für eine klinisch relevante Beurteilung, wie z.B. eine Diagnose, Prognose oder Behandlungswahl, zur Verfügung stellt. In diesem Fall schließen die Beurteilungen, die durch die Portfolios unterstützt werden, die Behandlung von Leukämien mit FTI's ein. Portfolios von Genexpressionsprofilen, können Kombinationen der Gene, die in den Tabellen 1–3 gezeigt werden, umfassen.
Eine Methode der Erfindung schließt den Vergleich von Genexpressionsprofilen für verschiedene Gene ein, um zu bestimmen, ob eine Person wahrscheinlich auf die Anwendung eines FTI's anspricht. Nach dem Etablieren der Genexpressionsprofile, die ansprechende von nicht-ansprechenden Patienten unterscheiden, werden die Genexpressionsprofile von jedem in einem Medium fixiert, wie z.B. einem computerlesbaren Medium, wie unten beschrieben. Eine Patientenprobe wird erhalten, die erkrankte Zellen (z.B. hämatopoetische Blastenzellen im Falle von AML) enthält. Proben-RNA wird dann erhalten und von der erkrankten Patientenzelle amplifiziert und ein Genexpressionsprofil wird erhalten, bevorzugterweise via Mikroarray, für Gene in den geeigneten Portfolios. Die Expressionsprofile der Proben werden dann verglichen mit denjenigen, die zuvor als ansprechend oder nicht-ansprechend bestimmt wurden. Wenn die Probenexpressionsmuster mit einem Expressionsmuster eines FTI-ansprechenden Individuums konsistent sind, dann kann die Behandlung mit einem FTI angezeigt sein (bei Abwesenheit von entgegenwirkenden medizinischen Abwägungen). Wenn die Probenexpressionsmuster mit einem Expressionsmuster von FTI nicht-ansprechenden Individuen konsistent sind, dann wird die Behandlung mit einem FTI nicht angezeigt sein. Bevorzugterweise wird die Konsistenz der Expressionsmuster basierend auf Intensitätsmessungen von Mikroarray-Lesungen, wie oben beschrieben, bestimmt.
In ähnlicher Weise kann die Analyse von Genexpressionsprofilen ausgeführt werden, um das Ansprechen auf die Behandlung zu beobachten. In einem Aspekt dieser Methode wird Genexpressionsanalyse, wie oben beschrieben, an einem Patienten, der mit einem FTI behandelt wird, zu verschiedenen Zeitpunkten während des Behandlungsverlaufs ausgeführt. Wenn die Genexpressionsmuster mit einem ansprechenden Individuum konsistent sind, dann wird die Therapie des Patienten fortgesetzt. Wenn dies nicht der Fall ist, dann wird die Therapie des Patienten verändert, wie mit zusätzlichen Therapeutika, wie z.B. mit Tyrosinkinase-Inhibitor, Veränderungen der Dosierung oder Eliminierung der FTI-Behandlung. Eine solche Analyse erlaubt die Intervention und Therapieanpassung vor detektierbaren klinischen Anzeichen oder in Anbetracht von andererweise mehrdeutigen klinischen Anzeichen.
Es ist möglich, mehrdeutige Ergebnisse zu erhalten, in welchen einige Genexpressionsprofile aufgezeichnet werden, die in einigen Beziehungen indikativ sind für einen ansprechenden und in anderen Beziehungen für einen nicht-ansprechenden Patienten. Zum Beispiel können die Profile zeigen, daß drei Gene heraufreguliert sind, was konsistent mit einem ansprechenden Patienten ist, aber daß ein anderes Gen nicht aufreguliert ist, wie es gewöhnlicherweise der Fall für einen ansprechenden Patienten wäre. In solch einem Fall können statistische Algorithmen angewendet werden, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmten, ob der Patient auf den Wirkstoff ansprechen wird oder nicht ansprechen wird. Statistische Algorithmen, die für diesen Zweck geeignet sind, sind bekannt und erhältlich.
Genexpressionsprofile können digital aufgezeichnet werden, so daß sie mit Genexpressionsdaten von Patientenproben verglichen werden können. Alternativ dazu können die Profile in einem verschiedenen Repräsentationsformat aufgezeichnet werden. Eine graphische Aufzeichnung ist ein solches Format. 1 zeigt ein Beispiel der graphischen Anzeige einer solchen Aufzeichnung. Clustering-Algorithmen, wie diejenigen, die in die Computerprogramme „OMNIVIZ" und „TREE VIEW", die oben erwähnt werden, eingefügt sind, können am besten bei der Visualisierung solcher Daten assistieren.
Zusätzliche Artikel, die in der Erfindung verwendet werden, sind Nukleinsäure-Arrays (z.B. cDNA- oder Oligonukleotid-Arrays), wie oben beschrieben, die konfiguriert werden, um die Genexpressionsprofile der Erfindung zu erkennen.
Unter der Verwendung von Clustering-Analyse (einschließlich der Algorithmen, wie oben erwähnt) kann man die Expressionsspiegel von Patientenproben vergleichen, um regulatorische Beziehungen unter den Genen mit einem bestimmten statistischen Vertrauen zu etablieren. Eine dynamische Karte wurde konstruiert, basierend auf solchen Expressionsdaten. Solch eine genetische Netzwerkkarte ist nützlich für die Entdeckung von Wirkstoffen. Zum Beispiel wurde, nachdem elementare Gene von Interesse identifiziert wurden, eine Liste von potentiellen stromauf regulatorischen Genen unter der Verwendung einer solchen genetischen Netzwerkkarte gefunden. Die so identifizierten Gene oder deren Expressionsprodukte wurden dann auf ihre Verwendung als Wirkstoffziele analysiert. In einigen Ausführungsformen wurde die regulatorische Funktion der bestimmten identifizierten Gene verwendet, um Therapeutika für die Verwendung bei der Behandlung von Leukämie zu identifizieren.
Die Regulation der Transkription, des RNA-Processing und des RNA-Editing werden alle von Proteinen ausgeführt, die durch ihre eigenen Gene kodiert werden. Zusätzlich können DNA-Sequenzen lange Bereich-Kontrolle („long range control") über die Expression anderer Gene durch positionelle Effekte ausüben. Daher wird die Expression von Genen oftmals durch die Expression anderer Gene reguliert. Diese regulatorischen Gene werden stromauf Gene genannt, relativ zu den regulierten oder stromab Genen. In einem einfachen regulatorischen Weg:
A++>B-->C++>D
wobei: A, B, C, D Gene sind,
++ aufreguliert,
-- abreguliert.
Gen A ist ein stromauf Gen von Gen B und B ist ein stromauf Gen von C. Ein Fachmann auf dem Gebiet würde erkennen, daß das Netzwerk häufig Schleifen bildet und inter-verknüpft ist. In einigen Fällen ist die Expression eines Genes durch sein eigenes Produkt entweder in Form einer positiven oder einer negativen Rückkopplung reguliert.
Cluster-Analyse-Verfahren wurden verwendet, um Gene in Gruppen einzuteilen, deren Expressionsspiegel korreliert wird. Verfahren für die Cluster-Analyse werden im Detail in Harfigan (1975) Clustering Algorithms, NY, John Wile and Sons, Inc, und Everritt, (1980) Cluster Analysis 2nd. Ed. London Heineman Educational books, Ltd. beschrieben. Pfad-Analyse wurde verwendet, um Beziehungen zwischen Variablen aufzuschließen und für das Testen von Kausalmodellen für die genetischen Netzwerke. Multiple primäre Ziele eines Wirkstoffes in leukämischen Zellen wurden identifiziert sowie Wirkstoffe/Wirkstoffklassen, die nützlich für die Behandlung solcher Zellen sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Wirkstoffe jede Verbindung mit irgendeinem Grad an Komplexität, die ein biologisches System stören.
Der biologische Effekt eines Wirkstoffes kann die Folge von Wirkstoff-vermittelten Änderungen in der Rate der Transkription oder Degradation einer oder mehreren Spezies von RNA, der Rate oder des Ausmaßes der Translation oder des post-translationalen Processing von einem oder mehreren Polypeptiden, der Rate oder des Ausmaßes der Degradation von einem oder mehreren Proteinen, der Inhibierung oder Stimulierung der Wirkung oder der Aktivität von einem oder mehreren Proteinen und so weiter sein. Zusätzlich zu den FTI's, die bevorzugt werden, sind die bevorzugten Wirkstoffe dieser Erfindung, diejenigen, die die MAPK/ERK-Signalwege, TGFβ-, WNT- oder apoptotische Wege modulieren. Diese schließen ein, ohne Limitierung, Tyrosinkinase-Inhibitoren, MEK-Kinaseinhibitoren, P13K-Kinaseinhibitoren, MAP-Kinaseinhibitoren, Apoptosemodulatoren und Kombinationen davon. Beispielhafte Wirkstoffe, die unter diesen am meisten bevorzugt werden, sind der „GLEEVEC"-Tyrosinkinase-Inhibitor von Novartis, U-0126 MAP-Kinaseinhibitor, PD-098059 MAP-Kinaseinhibitor, SB-203580 MAP-Kinaseinhibitor und Antisense-, Ribozym- und DNAZym Bcl-XL Anti-Apoptotika. Beispiele für andere nützliche Wirkstoffe schließen ein, ohne Limitation, die Kalanolide von US-Patent Nr. 6,306,897 ; die substituierten Bizyklischen von US-Patent Nr. 6,284,764 ; die Indoline von US-Patent Nr. 6,133,305 und die Antisense-Oligonukleotide von US-Patent Nr. 6,271,210 .
Die Erfindung wird weiterhin illustriert durch die folgenden nicht-limitierenden Beispiele.
Beispiel 1: Zellkultur
Die AML-ähnlichen Zellinien HL-60 (promyelozytisch) und U-937 (promonozytisch) wurden von der ATCC erhalten. AML-193 (monozytisch) und THP-1 (monozytisch) Zellen wurden vom RW Johnson Pharmaceutical Research Center, San Diego erhalten. Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) aufgezogen. AML-193 wurde auch mit Granolozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) (10 ng/ml), Insulin (0,005 mg/ml) und Transferrin (0,005 mg/ml) supplementiert.
Beispiel 2: Toxischer Dosis-Assay
Die Zellen von Beispiel 1 wurden in 6-Well-Platten in einer Anfangskonzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml geimpft. (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolin) wurde in Konzentrationen im Bereich von 0,5 bis 500 nM in 300 μl DMSO direkt zu dem Kulturmedium addiert. Kontrollzellen von Beispiel 1 wurden in Medium allein oder in Medium, das mit Vehikel (0,1% DMSO) supplementiert ist, aufgezogen. Die Zellzahlen wurden am Tag 4 und 7 in einem Hämozytometer gezählt und die Zelllebensfähigkeit wurde mittels Trypanblau Exklusions-Assay bestimmt. Der IC₅₀ wurde definiert als die Dosis, bei welcher die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der behandelten Probe 50% der Anzahl in der Kontrolle am Tag 7 beträgt. Berechnungen wurden durchgeführt basierend auf Doppeldurchführungen des Experiments. Der IC₅₀ der vier Zellinien wurde berechnet nach sieben Tagen Behandlung mit FTI. AML-193 hatte einen IC₅₀ von 134 nM, HL-60 hatte einen IC₅₀ von 24 nM, THP-1 hatte einen IC₅₀ von 19 nM und U-937 hatte einen IC₅₀ von 44 nM. Das zeigt an, daß die vier AML-ähnlichen Zellinien sensitiv für FTI-Behandlung waren.
Beispiel 3: Zeitverlauf-Assay
Duplikatkulturen der Zellen von Beispiel 1 wurden in 6-Well-Platten mit einer anfänglichen Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml geimpft. (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolin) wurde bei einer Konzentration von 100 nM in 3 μl DMSO direkt in das Kulturmedium supplementiert. Die Konzentration von 100 nM wurde für die nachfolgenden Zeitverlauf-Experimente ausgewählt, um das Behandlungsprotokoll basierend teilweise auf den Ergebnissen von Beispiel 2 zu normalisieren. Duplikat-Kontrollkulturen wurden in Medium, das 0,1% DMSO enthält, aufgezogen. Duplikatkulturen wurden täglich für insgesamt 6 Tage geerntet. Die Zellen wurden gezählt, auf Lebensfähigkeit untersucht und die Gesamt-RNA wurde gemäß des Protokolls des Her stellers (Qiagen RNeasy) isoliert. Die Analyse zeigte, daß die Zellen von verschiedenen Zellinien zu verschiedenen Zeiten beeinflußt wurden. RNA wurde mit DNase1 (Qiagen DNase1 Kit) behandelt, um jegliche restliche genomische DNA zu entfernen. Lineare Amplifizierung von RNA wurde gemäß der Prozedur ausgeführt, die in US-Patent 5,545,522 von Van Gelder et al. beschrieben wurde. Aliquote von 5 μg aRNA wurden dann für die Hybridisierung mit cDNA-Arrays präpariert.
Beispiel 4: Knochenmarks-Aufbereitung („processing")
Knochenmarksaspiration-Präparate wurden von zwei Patienten erhalten, die mit AML diagnostiziert wurden und welche mit FTI behandelt wurden. Diesen AML-Patienten wurde 600 mg (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolin) zweimal täglich über eine Zeitspanne von 21 Tagen verabreicht. Knochenmarkaspiration-Präparate wurden an der Grundlinie und einmal in der Woche für die drei Wochen der Behandlung entnommen. Einer dieser Patienten sprach nicht auf FTI an (RH), während der andere auf FTI ansprach (BS). Das Ansprechen wurde bestimmt als eine Reduktion von mehr als 50% der Blastenzellen in Knochenmarkaspiration-Präparaten. Die Aspiration-Präparate wurden auf 15 ml mit PBS verdünnt und einer Ficoll-Dichte Zentrifugation unterzogen. Weiße Blutzellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, in FBS mit 10% DMSO resuspendiert und sofort bei –80°C gefroren. Die Zellen wurden kryogen aufbewahrt, um die Zelllebensfähigkeit aufrecht zu erhalten. Die Proben wurden bei 37°C aufgetaut und 10 × Volumen an RPMI mit 20% FBS wurde tropfenweise über einen Zeitspanne von 5 min addiert. Die Zellen wurden bei 1600 U/min für 10 min zentrifugiert und in 10 ml PBS mit 2 mM EDTA und 0,5% BSA resuspendiert. Die Proben wurden dann durch einen 70 μM Filter passiert, um jegliche Zellklumpen zu entfernen. Die Zellfähigkeit wurde mittels Trypan Blau-Assay bestimmt. Wenn die Probenlebensfähigkeit geringer als 50% war, dann wurde ein Miltenyi Dead Cell Removal Kit verwendet, um die lebende Zellfraktion anzureichern. 2 × 10⁵ lebensfähige Zellen wurden dann mit CD33-FITC und CD34-PE-Antikpörpern (Pharminigen) doppelt markiert und FACS-Analyse wurde durchgeführt. Knochenmarksproben nach der Behandlung mit (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolin) wurden auf leukämische Zellen durch magnetische Bead Cell Separation unter der Verwendung von entweder CD33 oder CD34-Antikörpern (Miltenyi) angereichert. Den extrahierten Zellen wurde RNA extrahiert, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Beispiel 5: Sondenpräparation
RNA-Proben, die in den Beispielen 3 und 4 erhalten wurden, wurden für die Hybridisierung mit cDNA-Mikroarrays gemäß der folgenden Prozedur präpariert. Ein bis zwei Runden an linearer Amplifizierung wurden an Gesamt-RNA durchgeführt, in Abhängigkeit von der Menge des Ausgangsmaterials. Anfänglich wurden 1–10 μg Gesamt-RNA revers transkribiert unter der Verwendung des Superscript cDNA Transcription Kit (Gibco BRL). Zehn μl Gesamt-RNA wurde zuerst gemischt mit 1 μl 0,5 mg/ml T7-OligodT-Primer, bei 70°C 10 min inkubiert und dann auf Eis gekühlt. Als nächstes wurden 8 µl 5 × Erststrang-Reaktionspuffer, 0,1M DTT, 10 mM dNTP's, und 1 µl Rnase Block addiert und die Lösung wurde bei 42°C für 5 min inkubiert. Ein µl Superscript II wurde danach addiert und die Reaktion wurde bei 42°C für zwei Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde dann bei 70°C für 10 min Hitze-deaktiviert und 1 µl wurde für die PCR entfernt. Als nächstes wurden 92 µl Rnase-freies Wasser, 30 µl 5 × Zweitstrang-Reaktionspuffer, 3 µl 10 mM dNTP, 4 μl DNA-Polymerase 1, 1 µl E. coli Rnase H, 1 µl E. coli DNA-Ligase addiert und die Mischung wurde bei 16°C für zwei Stunden inkubiert. cDNA wurde unter der Verwendung des Ampliscribe T7-Transcription Kit (Epicenter) linear amplifiziert. Wenn erforderlich wurde eine zweite Runde der RNA-Amplifizierung mittels des Random Hexamer Approach-Ansatzes durchgeführt. Fluoreszenzmarkierte cDNA-Sonden wurden durch Priming aRNA mit Zufalls-Hexameren und einschließlich Cy3-dCTP im Nukleotid-Mix synthetisiert. Die Reaktionen wurden unter der Verwendung eines QIAquick PCR-Purification Kit (Qiagen) gereinigt, die Volumen der Sonde wurden unter der Verwendung relativer Fluoreszenz (Cytorfluor) normalisiert und in 50 µl Version 2 Hybridisierungspuffer (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mit 50% Formamid und humaner Cotl DNA (Life Technologies) resuspendiert.
Beispiel 6: Array-Hybridisierung und Analyse
Die Arrays enthielten 7452 cDNAs aus den IMAGE-Consortium (Integrated Molecular Analysis of Genome and their Expression: Research Genetics, Huntsville, AL) und Incyte-Bibliotheken. Die Mikroarrays wurden wie folgt generiert und die Sonden wurden hybridisiert, wie in Beispiel 5 beschrieben. cDNAs wurden auf Aminosilan-beschichtete Objekträger (Corning) mit einem Generation III Microarray-Spotter (Molecular Dynamics) gedruckt („printed"). Die cDNAs wurden mittels PCR amplifiziert, gereinigt (Qiagen PCR Purification Kit) und 1:1 mit 10 M NaSCN-Druckpuffer gemischt. Vor der Hybridisierung wurden die Mikroarrays in Isopropanol bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Die Sonden wurden bei 95°C für 2 min, bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert und dann auf 3 Replikat-Objektträger aufgebracht. Deckgläschen wurden auf die Objektträger mit DPX (Fluka) versiegelt und bei 42°C über Nacht inkubiert. Die Objektträger wurden danach bei 55°C für 5 min in 1 × SSC/0,2% SDS und 0,1 × SSC/0,2% SDS gewaschen, in 0,1 × SSC eingetaucht und getrocknet bevor sie mit einem GenIII Array Scanner (Molecular Dynamics) ge-scannt wurden. Die Fluoreszenzintensität für jeden Spot wurde mit der Software AUTOGENE (Biodiscovery, Los Angeles) analysiert.
Der Intensitätsspiegel jedes Mikroarrays wurde normalisiert, so daß der 75. Perzentil der Expressionsspiegel gleich über die Mikroarrays war. Klone, die einen Koeffizienten der Varianz (VC) von größer als 50% des Durchschnitts zeigten, wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Weil die Hintergrundintensität ein Maximum von 32 Einheiten für alle Experimente hatte, wurde ein Schwellenwert von 32 für alle Klone festgesetzt, die einen Expressionsspiegel aufzeigten der niedriger als dieser Wert war. Eine Verhältnismatrix wurde dann basierend auf paarweiser Analyse von behandelten und Kontroll-Proben generiert; und hierarchisches Clustering wurde unter der Verwendung einer euklidischen metrischen und Durchschnitt-Verbindung („euclidean metric and average linkage") (Omniviz Pro^TM) durchgeführt.
Jede Probe wurde mit drei identischen Arrays hybridisiert und die durchschnittliche Signalintensität wurde mittels Scatter-Plot-Analyse verglichen. Hohe Korrelations-Koeffizienten wurden auch beobachtet, wenn die Kontrollproben mit den behandelten Proben desselben Tages verglichen wurden. Dies zeigt an, daß keine groben Veränderungen bei der Genexpression aufgrund der Behandlung mit (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolin) auftraten. Zusätzlich wurde die Variation von Kontrollproben von verschiedenen Tagen untersucht. Zellen wurden pseudo-behandelt und RNA wurde isoliert nach 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Tagen. Nach der Markierung und Hybridisierung wurden die durchschnittliche Intensität der Duplikat-Proben und der Koeffizient der Varianz (CV) jedes Klons (3 Spots pro Klon) berechnet. Datenpunkte, welche einen CV von mehr als 50% anzeigten, wurden aus der weiteren Analyse entfernt.
Beispiel 7: Differentielle Genexpression in behandelten Zellinien-Proben
Hierarchisches Clustering wurde an den Zeitverlauf-Datensätzen unter der Verwendung der Software OmniViz Pro^TM (Battelle) durchgeführt. Anfänglich wurden 1,5-fache, 1,7-fache und 2,0-fache Veränderungen als Filter für die Verhältnisse der Intensität der behandelten versus Kontroll-Proben für jeden Tag des Zeitverlaufs verwendet. Die Genexpressionsprofile der Gene, die über diese Schwellenwerte moduliert waren, wurden analysiert, um diejenigen Gene zu untersuchen, welche üblicherweise zwischen den drei Datensätzen moduliert waren, und um Gencluster zu identifizieren, die ähnliche Expressionsprofile teilen. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 1–3 unten gezeigt.
Die Gene, die gemäß dieser Erfindung analysiert wurden, werden in den Tabellen unten durch Referenz der Gen ID Nummern (intern generiert) und Zugangsnummern in der Genbank-Datenbank identifiziert, wenn solche Gene in die Genbank-Datenbank eingetragen waren. Das angehängte Sequenzprotokoll, das hierin durch Referenz eingefügt wird, zeigt Sequenzen korrespondierend zu den Gen-ID Nummern und werden mit diesen Gen-ID Nummern benannt. In einigen Fällen sind die aufgeführten Sequenzen die Vollängen-Nukleinsäuresequenzen, die für die Produktion eines Proteins oder Peptides kodieren. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß die Identifizierung der Vollängen-Sequenzen von einem analytischen Standpunkt aus nicht notwendig ist. Das heißt, Teile der Sequenzen oder EST's können gemäß bekannter Prinzipien ausgewählt werden, für welche Sonden konzipiert werden können, um die Genexpression der korrespondierenden Gene zu untersuchen. Weiterhin sollte notiert werden, daß einige der Sequenzen im Protokoll den Buchstaben „N" anstelle einer Nukleotid-Bezeichnung enthalten. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß „N" angibt, daß jedes Nukleotid an dieser Stelle der Sequenz plaziert werden kann.
Beispiel 8: Identifizierung von Gennetzwerken
Gene, die in zwei oder mehr Zellinien um mindestens das 1,5-fache in Wirkstoff-behandelten Zellinien reguliert waren (Tabelle 1), wurden identifiziert, wie oben beschrieben. Die Liste dieser Gene wurde verwendet, um größere Genwege zu identifizieren, welche durch den am meisten bevorzugten FTI, (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolin), moduliert werden. Wenn Klone nicht perfekt mit einem bekannten Gen übereinstimmten, wurden die Notierungen des besten BLAST-Ergebnisses der Klonsequenz verwendet. Weil das Ausmaß der Regulation dieser Gene über den Verlauf der Behandlung der Zellinien variierte, wurden die Genexpressionsprofile von dem primären AML-Gewebe, das auf diesen FTI ansprach, bestimmt.

Es wurde gefunden, daß viele Gene in MAPK/ERK (2)-Signalwegen herabreguliert waren und daß Gene in den TGFβ (3) und WNT (3)-Signalwegen im allgemeinen heraufreguliert waren, wohingegen apoptotische Wege auch aktiviert waren (4). Dies erlaubte die Identifizierung anderer Genziele, die sensitiv für die Behandlung mit bekannten oder neuen Wirkstoffverbindungen sind. Zum Beispiel kann vorteilhafte Behandlung resultieren aus FTI's, die in Zusammenhang mit Tyrosinkinase-, MEK-Kinase-, PI3K- und/oder MAP-Kinase-Inhibitoren verwendet werden, um einen weiter potenten Effekt zu erreichen. Angesichts des Befundes, daß apoptotische Wege in FTI-behandelten Zellen aktiviert werden, kann von Wirkstoffen, die Apoptose modulieren erwartet werden, daß sie einen vorteilhaften Effekt aufweisen, wenn sie in Zusammenhang mit einem FTI verwendet werden. Beispiele für diese Typen an Verbindungen schließen ein, Tyrosinkinase-Inhibitoren (z.B. Gleevec, Novartis), MAP-Kinaseinhibitoren (z.B. U-0126, PD-098059, SB-203580) und Inhibitoren der antiapoptotischen Gene, wie z.B. Bcl-XL (z.B. Antisense, Ribozyme, DNAZyme). Tabelle 1: Gene (durch Genbank-Zugangsnummer), die mindestens 1,5-fach in zwei oder mehreren der Zellinien über einen Zeitraum von 6 Tagen moduliert werden.

Gen-ID	Zugangs-Nr.

3434105F7	AB026898
3881595H1	AC000134
AI939481	AC005155
AA961061	AC005670
3918104H1	AC006023
AI025519	AC008427
5543360F8	AC009220
AA744682	AC009289
AA932129	AC009756
AI148008	AC011473
Y00052	AC013722
R52476	AC021078
AA864819	AC022087
AI815593	AC022150
AI141943	AC026448
AI300541	AC073585
2515486H1	AF161372
1731618H1	AJ003147
BE222911	AJ400879
R13802	AK022901
AI656222	AL021155
AI553823	AL022313
AA010251	AL034397
AA237071	AL035420
2445101F6	AL049824
AI638342	AL122004
AA779424	AL136980
H81171	AL137073
R77754	AL137790
AI209040	AL139082
6421806H1	AL139396
H61066	AL161787
R59209	AL355136
AA486141	AL355352
AI339252	AP001630
AW023438	BC009732
914979H1	BC013834
AA455969	D00015
T64335	D00017
X02308	D00596
X67098	D00596
X01023	D10493
D10493	D10493
Y00396	D10493
X69292	D10667
AA736561	D11094
S68252	D11139
M25315	D12592
AI186110	D13118
H84153	D13639
AA598561	D14043
D14695	D14695
2206642T6	D16889
AI878943	D17004
U38846	D17080
J03801	D21235
AI762926	D23660
D25215	D25215
U41078	D26512
AA485961	D30648
AA456408	D38441
AI311090	D38616
1869911H1	D42084
D43950	D43950
AW006368	D44467
U29092	D45050
D45887	D45887
W68193	D49489
3633286H1	D63874
N76967	D66904
AA985407	D82326
AI962797	D83260
M59829	D85730
3107995H1	D86322
AA279906	D86550
AI016874	D86586
556963H1	D86955
AI810687	D86997
AF045581	D87462
U41070	D89078
D90209	D90209
AA812265	D90767
2135769H1	J02763
1876511H1	J03072
J04088	J04088
AI590075	J04973
H30357	J05451
K00558	K03460
L10413	L00634
L01087	L01087
AI027898	L02426
L06139	L06139
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M86400	L07955
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R78541	L10717
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T87908	L12387
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AI278029	L16862
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M60278	L17032
M65128	L18980
W49672	L20861
L22005	L22005
AI380522	L23822
AA988469	L25591
L26336	L26336
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M63175	L35233
2470939H1	L35848
AA190648	L36055
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L39833	L39833
M97347	L41415
2005142H1	L42324
M11723	L43615
U04045	L47574
AA284067	L76938
M13142	M13142
W68291	M15395
5560880H1	M19483
3171275H1	M20199
M22489	M22489
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H39560	M24736
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M27492	M27492
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M84739	M32294
M84739	M32294
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M63904	M63904
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M69215	M69215
M74782	M74782
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M80647	M80647
M84526	M84526
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2526581H1	U90904
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X07036	X04408
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M20566	X12830
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M31626	X14768
M30816	X14768
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X15606	X15606
K03515	X16539
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X51416	X51416
M23699	X51439
AA455222	X51675
X51757	X51757
X52195	X52195
U06434	X53682
J03198	X54048
M32304	X54533
AA487812	X56134
X56134	X56134
M16985	X56257
N31660	X56257
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X57522	X57522
X57830	X57830
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X58528	X58528
M81182	X58528
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X65921	X65921
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X70070	X70070
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X87212	X87212
756477	X87212
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X96427	X96427
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AA043102	Z35102
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U62027	Z73157
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R22977	Z98946
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AI435052
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2398102H1
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335737H1
4539942F8
6300669H1
938765H1

Tabelle 2: Gene (durch Genbank-Zugangsnr.), die mindestens 1,7-fach in der primären AML-Probe moduliert sind.

Gen-ID	Zugangs-Nr
T94331	AB026898
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T95173	AC005071
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5825251H1	AC005306
N36113	AC005670
1700438H1	AC005682
R48756	AC005757
5538589F6	AC005839
3918104H1	AC006023
AA443719	AC007240
AI867297	AC007883
R63067	AC008073
AW022174	AC008382
5537789F6	AC008525
H00249	AC008733
1436240H1	AC008860
2668191F6	AC008949
5543360F8	AC009220
AA737674	AC009892
5104579H1	AC009892
3335217F6	AC010311
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AA926944	AC012377
3100089H1	AC012454
Y00052	AC013722
R52476	AC021078
N45149	AC021106
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2914934H1	AC055707
AA621370	AC064807
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AI698737	AC074331
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N20072	AC096579
5911413H1	AC096667
AI458182	AF042782
2291436H1	AF074333
W32067	AF136745
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2397317F6	AF235100
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3123232H1	AJ003147
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AI366098	AJ276674
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BE222911	AJ400879
AI400473	AK017738
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AI656222	AL021155
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3332309H1	AL031728
R61661	AL032821
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AA237071	AL035420
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4019605F6	AL356489
U29607	AL356801
AA861429	AL359512
AA767859	AL359915
1362587H1	AL391122
R09122	AL391194
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M80436	D10202
M80436	D10202
M80436	D10202
M80436	D10202
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D13626	D13626
AA682625	D13641
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AF245447	D28468
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AF245447	NM_020126
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H96170	NM_030779
1540906H1	NM_030779
AI824146	NM_030811
W90438	NM_032127
AA430653	NM_032177
3495438F6	NM_032294
AW612141	NM_033050
AA417237	NM_033225
AI740538	NM_033280
M57703	S63697
780099H1	S63912
AA714835	S67156
AA777347	S76736
AA521213	S77359
U39231	S79852
N77754	S79873
AA984230	S80071
U00672	U00672
U02478	U02478
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2457652H1	U12465
U39318	U13175
U13666	U13666
U13695	U13695
AA056652	U14176
AA456616	U14970
U18242	U18242
U18300	U18300
AA465444	U18422
U20537	U20536
U25128	U25128
U35237	U26174
AI884916	U29171
AA481076	U31278
NM_002411	U33147
1671033F6	U33429
AA664389	U35048
6313632H1	U43030
R09288	U43522
AA488645	U47007
U47077	U47077
5801413H1	U48449
2405358R6	U48729
AA186542	U50078
U51586	U51586
1355140F1	U51586
AA455800	U55206
U56390	U56390
U83410	U58088
AA121261	U58675
AF027964	U59911
U60519	U60519
2836805T6	U62293
U62433	U62433
3188135H1	U66673
3188135H1	U66673
3188135H1	U66673
3188135H1	U66673
1360938T6	U66679
809631T6	U66684
AA454652	U67058
AI214335	U68755
U69883	U69883
R98589	U81375
5695322H1	U82671
AA745989	U82979
AA188256	U83661
2526581H1	U90904
AA434064	U95000
AA773114	U95740
AA514978	U96776
Y07503	V00510
X96754	V00557
N67917	V01512
V01514	V01514
X87344	X00369
N53169	X00567
X02910	X01394
X01451	X01451
X01451	X01451
X01451	X01451
X01451	X01451
AA401046	X02592
5537736F6	X02592
X87344	X03066
M10901	X03225
M54894	X04403
M54894	X04403
M54894	X04403
M54894	X04403
X07036	X04408
X07036	X04408
N75719	X04744
M19507	X04876
Y00816	X05309
M11233	X05344
AA479102	X05972
N24824	X06182
R33755	X06547
N41062	X06820
M86511	X06882
X07549	X07549
1686702H1	X07730
X07979	X07979
X14723	X08004
J03561	X12510
J03561	X12510
J03561	X12510
J03561	X12510
M20566	X12830
M20566	X12830
M20566	X12830
M20566	X12830
U76549	X12882
M21304	X13709
X00351	X13839
X14830	X14830
X52882	X14983
AA598758	X15187
H27564	X15729
W15277	X15940
AA393214	X15949
M23502	X16166
K03515	X16539
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2403512H1	X16674
AA868186	X17093
J03236	X51345
X51416	X51416
AA411440	X51521
AA058828	X51602
AA455222	X51675
X51804	X51804
T72877	X52015
X52195	X52195
X52947	X52947
U06434	X53682
3081284F6	X53702
M36821	X53799
AA490256	X54048
J03198	X54048
M60761	X54228
M11025	X55283
M33294	X55313
M33294	X55313
M31627	X55543
X55544	X55544
AA487812	X56134
X56134	X56134
X56777	X56777
H27379	X57198
M83652	X57748
X58528	X58528
M81182	X58528
S60489	X60111
X60592	X60592
R76314	X61587
M83665	X62534
R11490	X62947
AI436567	X63422
X63465	X63465
AA083577	X63527
X63547	X63546
2159360H1	X63692
X64074	X63926
X63926	X63926
X64083	X63926
2535659H1	X69168
AA187162	X69654
X69819	X69711
AI310990	X71491
T53775	X71874
3285272H1	X73568
U11087	X75299
X75299	X75299
AA454585	X75755
X75821	X75821
X75918	X75918
X76029	X76029
R43734	X76939
AI189206	X77303
H17504	X80692
R26434	X80910
AI521155	X81892
AA088861	X83228
U10440	X84849
407169H1	X84909
3576337H1	X85030
T55802	X85117
4407508H1	X85337
AA025432	X85373
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X89576	X89576
X89576	X89576
R83270	X89750
917064H1	X91249
X91809	X91809
X92106	X92106
AA187458	X92396
AJ000519	X92962
X94991	X94991
X96427	X96427
R85213	X98022
X98296	X98296
X99585	X99585
R48796	XM_008099
R50354	XM_009915
W15172	XM_016514
AK000599	XM_027140
7157414H1	XM_031246
AA044653	XM_031608
L16953	XM_032556
1266202T6	XM_033674
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H86407	XM_037453
778372H1	XM_040459
AA016239	XM_041087
AI580830	XM_042041
AI732875	XM_042637
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3038910H1	XM_046691
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1483347H1	XM_056259
AI307255	XM_058135
H74265	Y00062
Y00064	Y00064
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L02932	Y07619
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AA516206	Y12851
000527H1	Y13829
059476H1	Y13829
Y13834	Y13834
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3141315H1	Y17803
551234R6	Y17803
AA426103	Y18000
H97778	Z13009
AA402431	Z15005
L07555	Z22576
U51278	Z23115
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Z29090	Z29090
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M29871	Z82188
AI808621	Z82214
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AA460801	Z98749
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2673259F6	Z98752
R22977	Z98946
AA007595
AA188574
AA280754
AA283874
AA460392
AA508510
AA515469
AA526772
AA576785
AA634241
AA663307
AA663482
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AA714520
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AI061445
AI086865
AI264420
AI378131
AI440504
AI567491
AI693066
AI709066 AI766478 AI821337 AI949694 AW439329 AW630054 H24679 H29257 1151856 H66015 H72339 N57580 N54592 W07570 T75463 R88730 R91509 T56441 T77711 W92423 1274737F6 1338107F6 1508571F6 1548205H1 1594182F6 1594701F6 1879290H1 1902928H1 194370H1 195337H1 198381H1 2021568H1 205203T6 2194064H1 224922R6 2398102H1 2531082H1 2630745F6 264639H1 2704982H1 2716787H1 2798810F6 2832401H1 2894096F6 2919406F6 2937644F6 2950021H1 3010621F6 3123948H1 3253054R6 3290073H1 3330472H1 335737H1 3674358H1 3749346F6
3820429H1
3978404F6
4031124H1
4056384H1
4097060H1
4288779H1
4301823H1
4558488F6
4570377H1
5058893F9
5541621H1
5546249F6
5546336H1
5771839H1
5804485H1
5849807H1
6530555H1
656258H1
6591535H1
859993H1
930273R6
938765H1

Tabelle 3: Gene (durch Genbank-Zugangsnummer), die mindestens 1,5-fach in allen Zellinien und mindestens 1,7-fach in der Probe des Patienten, der anspricht, moduliert waren.

Gen-ID	Zugangs-Nr.
5543360F8	AC009220
AA237071	AL035420
AA455969	D00015
M25315	D12592
U41078	D26512
L10413	L00634
AA464627	L09604
2470939H1	L35848
M84526	M84526
AI921879	NM_002287
AF204944	NM_012105
W77977	NM_022336
AA449040	NM_024116
AA521213	577359
AA984230	S80071
AA456616	U14970
AI884916	U29171
U60519	U60519
X00351	X13839
AA868186	X17093
H27379	X57198
AA454585	X75755
X89576	X89576
AI580830	XM_042041
U49083	Z49148
2398102H1
2531082H1

Claims

Verfahren zur Bestimmung, ob ein Patient mit akuter myelogener Leukämie (AML) auf eine Behandlung mit einem Farnesyltransferaseinhibitor (FTI) ansprechen wird, mittels: (a) Überprüfung einer kranken Zelle aus einer Knochenmarksprobe des Patienten auf eine nachweisbare Differenz in der Höhe der Expression eines Gens, umfassend SEQ ID NO: 846 (3434105F7) nach Behandlung mit einem FTI im Vergleich mit einer unbehandelten kranken Zelle als Bezugswert, (b) Vergleich der nachweisbaren Differenz aus Punkt (a) mit solchen, die bei auf die Behandlung ansprechenden und nicht-ansprechenden Patienten festgestellt wurden, und (c) Bestimmung, ob der Patient ein Genexpressionsmuster eines auf die Behandlung ansprechenden oder nicht ansprechenden Patienten aufweist, um festzustellen, ob die Behandlung des Patienten mit einem FTI indiziert sein kann.
Verfahren zur Beobachtung der Behandlungsreaktion eines Patienten mit akuter myelogener Leukämie, der mit einem FTI behandelt wurde, mittels: (a) Überprüfung einer kranken Zelle aus einer Knochenmarksprobe des Patienten auf eine nachweisbare Differenz in der Höhe der Expression eines Gens, umfassend SEQ ID NO: 846 (3434105F7) zu verschiedenen Zeitpunkten während des Behandlungsverlaufs, (b) Vergleich des Genexpressionsmusters aus Schritt (a) mit solchen, die bei auf die Behandlung ansprechenden und nicht-ansprechenden Patienten festgestellt wurden, und (c) Bestimmung, ob der Patient ein Genexpressionsmuster eines auf die Behandlung ansprechenden oder nicht-ansprechenden Patienten aufweist, um festzustellen, ob die Behandlung des Patienten mit einem FTI fortgesetzt werden soll.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die kranken Zellen hämatopoietische Blastenzellen sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt (a) die Analyse der Expressionshöhe einer Kombination von Genen beinhaltet, die in (i) Tabellen 1–3 oder (ii) Tabelle 1 verzeichnet sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Analyse von Schritt (a) mit Hilfe eines Nukleinsäureassays durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die nachweisbare Differenz mindestens das 1,5-fache im Vergleich zum Bezugswert beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die nachweisbare Differenz mindestens das 1,7-fache beträgt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die nachweisbare Differenz mindestens das 2-fache beträgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem FTI um ein Chinolin oder ein Chinolinderivat handelt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem FTI um eine der folgenden Verbindungen handelt: 7-(3-Chlorphenyl)-9-[(4-chlorphenyl)-1H-imidazol-1-ylmethyl]-2,3-dihydro-1H,5H-benz[ij]chinolizin-5-on; 7-(3-Chlorphenyl)-9-[(4-chlorphenyl)-1H-imidazol-1-ylmethyl]-1,2-dihydro-4H-pyrrolo[3,2,1-ij]chinolin-4-on; 8-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-6-(3-chlorphenyl)-1,2-dihydro-4H-pyrrolo[3,2,1-ij]chinolin-4-on; 8-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-6-(3-chlorphenyl)-2,3-dihydro-1H,5H-benz[ij]chinolizin-5-on; oder (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolinon).
Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem FTI um (B)-6-[Amino(4-chlorphenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorphenyl)-1-methyl-2(1H)-chinolinon) handelt.
Verwendung eines FTI zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines an AML erkrankten Patienten, wobei der Patient mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1–11 als ein auf die Behandlung ansprechendes Individuum identifiziert wurde.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Medikament eine andere therapeutische Zusammensetzung beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die besagte andere therapeutische Zusammensetzung einen MAPK/ERK-Signalweg, TGFβ-, WNT- oder einen apoptotischen Signalweg beeinflußt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich bei der besagten anderen Zusammensetzung um einen Tyrosinkinaseinhibitor, einen MEK-Kinaseinhibitor, einen PI3-Kinaseinhibitor, einen MAP-Kinaseinhibitor, einen Apoptosemodulator oder eine Kombination davon handelt.