Jede
lebende Zelle ist in der Lage auf Signale ihrer Umwelt zu reagieren.
Die Reaktionen der Zellen werden durch eine geordnete Regulation
der Genexpression realisiert, sodaß der Metabolismus von Zellen nicht
statisch sondern sehr dynamisch ist. Das menschliche Genom umfasst
nach jüngsten
Schätzungen
zwischen 30 000 und 140.000 Gene. Von diesem immensen Informationsangebot
verwendet jede Zelle jedoch lediglich einen kleinen, für sie spezifischen
Teil für
die Synthese von Proteinen, der sich im Genexpressionsmuster wiederspiegelt.
Exogene Signale werden von Zellen empfangen und führen, zum
Teil über
komplexe Signaltransduktionskaskaden, zu Veränderungen im Genexpressionsmuster.
Auf diese Weise reagiert jede Zelle auf Signale aus ihrer Umgebung
mit der Anpassung ihres Metabolismus.
Neben
dieser verhältnismäßig kurzfristigen
Veränderung
der Genexpression, unterliegt jede lebende Zelle dem Alterungsphänomen, ein
Prozess, der mit der langsamer Veränderung der Genexpression einhergeht.
Die
menschliche Haut ist das größte Organ
des menschlichen Körpers.
Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl
verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Die
meisten Zellen der Haut finden sich in der Epidermis und der Dermis.
Hautanhangsgebilde
wie z.B. Haarfollikel, Talgdrüsen,
Schweissdrüsen
etc. werden durch einen geringeren Anteil spezialisierter Zellen
gebildet. So sind z.B. nur weniger als 5% der Hautzellen an der
Haarfollikelstruktur beteiligt. Diese Tatsache verdeutlicht, dass
die Zellen bestimmter Hautanhangsgebilde nur schwer biologischen
Analysen, wie z.B. Genexpressionsanalysen unterzogen werden können. Für das Verständnis von
Reaktionen der Haut und insbesondere ihrer Anhangsgebilde auf exogene
Stimuli ist jedoch die Analyse der Genexpression von entscheidender
Bedeutung.
Eine
Isolation der Hautanhangsgebilde ist technisch schwer zu realisieren
und sehr zeitintesiv. Desweiteren ist es für eine realistische Darstellung
biochemischer Abläufe
in der Haut oder ihrer Anhangsgebilde unerlässlich, die Zellen in ihrer
natürlichen,
zellulären
Umgebung zu untersuchen. Jede Manipulation am Gewebe (z.B. zur Isolation
oder Anreicherung bestimmter Strukturen) wird von den Zellen bemerkt
und führt
zu einer angepassten Genexpression. Dieser Zustand ist nicht mehr
nativ und somit auch nicht mehr als repräsentativ zu betrachten.
Die
menschliche Haut trägt
bis auf die Lippen, die Handinnenflächen und die Fußsohlen
Haare. Die unscheinbaren Vellushaare unterscheiden sich dabei nicht
nur makroskopisch z.B. von den kosmetisch relevanten Haupthaaren
am Kopf. Mikroskopisch sind ebenso die Haarfollikel aber auch die
Haare selbst differenzierbar. Welche biochemischen und molekularbiolgischen
Mechanismen diesen Unterschieden zu Grunde liegen ist jedoch weitgehend
unbekannt.
Ein
relevantes Merkmal der Haare und ihrer Follikel ist, dass mit zunehmendem
Alter die Zellen ihre Fähigkeit,
verlieren die Homöostase
des Organs aufrecht zu erhalten. So nimmt z.B. im Verlauf der Zeit
die Anzahl der Haarfollikel pro Flächeneinheit ab. Ebenso verändert sich
die Struktur der Haare, indem z.B der Haardurchmesser geringer wird.
Oftmals produzieren bestimmte Zellen der Haarfollikel mit zunehmendem
Alter keine Haarpigmente mehr – die
Haare ergrauen. Welche molekularen Mechanismen dieser Entwicklung
zugrunde liegen ist bislang weitgehend unklar.
Effektive
kosmetische oder pharmazeutische Haarprodukte sollten ihre positive
Wirkung auf ein möglichst
breites Spektrum molekularer Abläufe
im Haarfollikel zeigen. Bisher sind jedoch nur wenige molekulare Reaktionsmechanismen
im Haarfollikel beschrieben worden, die somit als Target kosmetischer
Haarprodukte dienen können.
Jeder
Zelltyp der Haut und ihrer Anhangsgebilde exprimiert ca. 15.000
verschiedene Gene und synthetisiert daraus entsprechend viele Proteine.
Welche Gene davon in Haarfollikeln eine Rolle spielen ist bisher jedoch
weitgehend unklar.
Die
Haut besteht aus mehreren verschiedenen Zelltypen (z. B. aus Fibroblasten,
Keratinozyten in verschiedenen Differenzierungszuständen, Melanozyten,
Merkelzellen, Langerhanszellen, einer Vielzahl unterschiedlicher
Zellen des Haarfollikels oder anderer Hautanhangsgebilde), sodass
die Komplexität
in der Haut exprimierter Gene sehr groß ist. Es ist bisher nicht
möglich
gewesen, aus dieser Komplexität
die Gene zu identifizieren, die mit dem Haarfollikel in Zusammenhang
stehen und als molekulare Marker der Haarbiologie dienen können. Erschwerend
kommt hinzu, dass in der Zelle mRNA-Moleküle in Konzentrationen zwischen
einigen wenigen und mehreren hundert Kopien vorkommen. Die schwach
exprimierten Gene sind bisherigen Analysetechniken nicht oder nur
sehr schwer zugänglich
gewesen, können
aber durchaus eine entscheidende Rolle im Haarfollikel spielen.
Bis
heute ist das Transkriptom, also die Gesamtheit aller transkribierten
Gene des humanen Haarfollikels, nicht beschrieben worden.
Transkriptom-Analysen
der Haut mittels verschiedener Verfahren, einschließlich der
SAGETM-Analyse, sind Stand der Technik.
Allerdings werden hierbei isolierte Keratinozyten (in vitro) oder
Epidermis-Explantate verwendet, die – wie oben erläutert – keine
für das
komplexe Geschehen in der Haut repräsentativen Modelle darstellen.
Velculescu,
V. E. beschreibt in „Analysing
uncharted transcriptomes with SA-GE", Trends Genet. (2000)
16 (10) 423-5 sowie in der US-B1-6 383 743 ein Verfahren zur Reihenanalyse
der Genexpression (SAGE) für
die Analyse einer Vielzahl von Transkripten durch die Herstellung
von Doppelmarker-Oligonucleotiden, die
mindestens zwei definierte Nucleotidsequenzmarker umfassen, wobei
die definierten Nucleotidsequenzmarker eine definierte Region eines
Transkripts umfassen, das einer Region des exprimierten Gens entspricht. Ziel
des Verfahrens ist die Identifizierung des Gesamtmusters der Genexpression
in verschiedenen Zelltypen oder dem gleichen Zelltyp unter verschiedenen
physiologischen, Entwicklungs- oder Krankheitsbedingungen. Dieses
Verfahren basiert auf der Identifizierung eines kurzen Nucleotidsequenzmarkers
an einer definierten Position in einer Messenger-RNA. Dieser Marker
wird verwendet, um das entsprechende Transkript und das Gen zu identifizieren,
von dem es transkribiert wurde. Durch Verwendung dimerisierter Marker,
die als ein "Doppelmacker" bezeichnet werden,
gestattet es das Verfahren, bestimmte Typen von Bias zu entfernen,
die während
der Klonierung und/oder der Amplifikation und möglicherweise während der
Auswertung der Daten auftreten können.
Lash,
A. E. u. a. stellen in "SAGEmap:
A Public Gene Expression Resource", Genome Res. Vol. 10, Issue 7, 1051–1060, July
2000, eine öffentlich
zugängliche
Datenbank für
mittels SAGE generierte Genexpressionsdaten vor, die außerdem online
Analysemöglichkeiten
zur Verfügung
stellt.
Kopan
R und Weintraub H beschreiben in "Mouse notch: expression in hair follicles
correlates with cell fate determination", J Cell Biol 1993, 121:631–641, die
Untersuchung der differentiellen Expression von Genen im Haarfollikel
der Maus.
Aus
der DE-A-101 00 127.4-41 der Anmelderin ist bekannt, Hautzellen
einer SAGETM-Analyse zu unterwerfen, um
das Gesamttranskriptom der Haut zu charakterisieren. Die DE-A-101
00 121.5-41 der Anmelderin offenbart die Ermittlung von Markern
gestreßter
bzw. gealterter Haut auf der Basis einer vergleichenden SAGETM-Analyse zwischen gestreßter bzw.
gealterter Haut und ungestreßter
bzw. junger Haut. Informationen über
spezifische Marker behaarter Haut sind diesen Schriften aber nicht
zu entnehmen.
Aus
J Invest Dermatol 2002 Ju1;119(1):3-13; „A serial analysis of gene
expression in sun-damaged human skin"; Urschitz J. et al.; ist bekannt, Marker
sonnengeschädigter
Haut mittels einer vergleichenden SAGETM-Analyse
von Vollhautexplantanten zu bestimmen, die vor der Ohrmuschel (sonnengeschädigt) bzw.
hinter der Ohrmuschel (geschützt
vor Sonnenstrahlung) entnommen wurden. Aus dieser Publikation lassen
sich gleichfalls keinerlei Kenntnisse über spezifische Marker behaarter
Haut gewinnen.
Es
besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise
aller, für
die Behaarung der Haut wichtigen Gene.
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, einen möglichst großen Teil der für die Behaarung
der Haut bedeutsamen Gene zu identifizieren. Außerdem sollen mittels der identifizierten
Gene Verfahren zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bereitgestellt
werden.
Diese
erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren (1) zur Identifizierung der für die Behaarung der Haut bedeutsamen
Gene bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) ein erstes Gemisch von in behaarter menschlicher
Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch
translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen,
mRNA-Molekülen
oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher
Haut, vorzugsweise aus behaarter Kopfhaut, gewinnt,
- b) ein zweites Gemisch von in unbehaarter menschlicher Haut
exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten
genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten
von Proteinen oder mRNA-Molekülen
aus unbehaarter menschlicher Haut, vorzugsweise aus unbehaarter
Gesichtshaut, gewinnt und
- c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse
der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert,
die in behaarter und unbehaarter Haut unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert
werden.
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter „unbehaart" auch die Behaarung mit den feinen und kaum
sichtbaren Vellushaaren. zu verstehen.
Durch
das erfindungsgemäße Verfahren
wird es vorteilhafterweise möglich,
den komplexen Prozess der Haarentstehung und die kausalen Zusammenhänge der
Veränderungen
am Haar zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische
Haar-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite
Spektrum der Genexpression im Haarfollikel ausüben. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens
durchgeführte
SAGETM-Analyse zeigt erstmals in einer sehr
umfassenden Weise, welche Gene in (mit Haupthaar) behaarter Kopfhaut
exprimiert werden, und welche Gene dort anders exprimiert werden
als in Haut mit Vellushaar.
Die
am Markt befindlichen kosmetischen Haar-Produkte üben i.d.R.
ihre Wirkungen auf den Haarschaft aus (z.B. Haar-Colorationen).
Erst die hier beschriebenen Untersuchungen erlauben ein Verständnis der komplexen
biologischen Prozesse im Haarfollikel. Die Identifikation geeigneter
Marker des Haarfollikels gestattet somit die gezielte Suche nach
Substanzen oder Kombinationen von Substanzen mit einem breiten Wirkspektrum
auf die Genexpression im Haarfollikel. Produkte dieser Art konnten
jedoch bis zu dem jetzigen Zeitpunkt nicht entwickelt werden, da
eine Vielzahl der Haarfollikelmarker noch nicht bekannt waren.
Zur
Erfassung des Transkriptoms der behaarten Haut wurde die Technik
der „Seriellen
Analyse der Genexpression" (SAGETM) eingesetzt. Diese Technik erlaubt gleichzeitig
die Identifikation und Quantifizierung aller in der behaarten Haut
exprimierten Gene. Die Analyse der Genexpression ist zwar auch mit
der Quantifizierung spezifischer mRNA-Moleküle möglich (z.B. Northern-Blot,
RNase-Schutzexperimente). Mit diesen Techniken können jedoch nur eine relativ
begrenzte Anzahl an Genen gemessen werden. Theoretisch könnten die
Techniken MPSS (Massive Parallel Signiture Sequencing) oder Techniken,
die auf Differential display beruhen, die SAGETM-Analyse
ersetzen. Praktisch ist die SAGETM-Technik
jedoch schneller und zuverlässiger
als Alternativmethoden und somit zu bevorzugen.
Der
Vergleich des Transkriptoms behaarter Haut, mit dem Transkriptom
unbehaarter Haut lässt
die Unterscheidung zwischen für
die Behaarung der Haut relevanten und nicht relevanten Genen zu.
Für die SAGETM-Analyse wurde humane Haut von gesunden
weiblichen Spendern verwendet. Die Durchführung der SAGETM-Analyse
erfolgte wie in der EP-A-0
761 822 und bei Velculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484–487, beschrieben.
Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung der
in behaarter Kopfhaut exprimierten Gene. Der Vergleich des Transkriptoms
behaarter Kopfhaut, mit dem Transkriptom von Gesichtshaut erlaubt
die Identifikation relevanter Gene für behaarte Kopfhaut. Dies können Gene
sein, die in behaarter Kopfhaut besonders stark exprimiert werden
oder auch Gene sein, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im
Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut nur gering exprimiert werden.
Die SAGETM-Analyse ist eine Technik mit
besonderer Sensitivität
und zeigt überraschender
Weise sogar interindividuelle Unterschiede im Genexpressionsprofil
auf. Zur Beschreibung des Transkriptoms behaarter Haut ist daher der
Vergleich zum Transkriptom unbehaarter Haut insbesondere effektiv,
wenn die analysierten Gewebe von einem Individuum also einem Spender
stammen. Somit fallen interindividuelle Unterschiede bei der Genexpression
nicht ins Gewicht. Im Rahmen von plastisch chirurgischen Operationen
wie z.B. „Unteren
Facelifts" fallen
von einer Patientin behaarte Gewebe aus dem Bereich über dem
Ohr und dem Bereich hinter dem Ohr an. Gleichzeitig wird Hautgewebe
vor dem Ohr entfernt, dass – zumindest
bei weiblichen Spendern – nur
Vellus-Haar trägt.
Die Analyse solcher Gewebeproben erlaubt daher die Beschreibung
der Transkriptome behaarter Kopfhaut und unbehaarter (bzw nur mit
Vellushaar besetzter) Gesichtshaut unter Ausschluß interindividueller
Genexpressionsunterschiede.
Für die SAGETM-Analyse wurde humane Haut von einer gesunden
weiblichen Spenderin (65 Jahre alt) verwendet. Die Durchführung der
SAGETM-Analyse erfolgte wie in der EP-A-0
761 822 und bei Velculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484–487, beschrieben.
Analysiert wurden zwei SAGETM-Libraries
aus verschieden lokalisierten Hautproben einer Patientin. Die erste
Probe stammte von einer Entnahmestelle über dem Ohr und lieferte Haut
mit Kopfhaar. Die zweite Probe stammte aus derselben Operation,
wurde vor dem Ohr entnommen und lieferte Haut mit lediglich Vellushaar.
Zur weiteren Analyse wurden beide SAGETM-Libraries
auf die durchschnittliche Tag-Anzahl normiert. Die beiden Libraries
wurden miteinander verglichen, um Gene mit einer haarspezifischen
Regulation zu identifizieren. Wie für zwei Libraries desselben
Gewebetyps erwartet, ist das Tag-Repertoire der beiden Haut- Libraries
weitgehend ähnlich.
Trotz der Ähnlichkeit
der Gewebe und der relativ geringen Tag-Zahl zeigen 74 Tags eine
signifikant differentielle Expression bei einem Signifikanz-Level von p>0,05.
Für die behaarte
Haut lässt
sich eine erhöhte
Tag-Zahl für
Gene zeigen, die im Haarfollikel oder in Haar-Anhangsgebilden exprimiert
werden.
Neben
einem erhöhten
Level der Haar- und Haarfollikel-typischen Keratine weist die behaarte
Haut zum Beispiel auch mehr FGF7, einen an der Haarentwicklung beteiligten
Transkriptionsfaktor, auf. Dermcidin und Cystatin, beide an der
Abwehr bakterieller und viraler Angriffe im Haarschaft beteiligt,
zeigen ebenfalls eine signifikant erhöhte Expression in der behaarten
Haut. Die Expression Differenzierungs-abhängiger Gene der interfollikularen
Epidermis ist in der unbehaarten Haut verstärkt, was sich in den Ergebnissen
der Untersuchung widerspiegelt. An der Spitze der differentiell
exprimierten Gene findet sich Keratin 10, ein typischer Marker für die Differenzierung
stratifizierter Epithelien. Keratin 1, der Partner von Keratin 10,
zeigt diese Expressionsunterschiede nicht. Die Analyse weiterer
Differenzierungs-abhängig
exprimierter Gene bestätigt
ebenfalls deren verstärkte
Expression in der unbehaarten Haut (Tab. 2). Ein weiteres Keratin,
Keratin 2e, wird laut Literatur vor allem in unbehaarter Haut exprimiert,
was in der durchgeführten
Analyse ebenfalls beobachtet wird. Die Expression der in der Basalschicht
der Epidermis und in den Haarfollikeln exprimierten Keratine 5,
14 und 15 ist wie erwartet in beiden Proben nahezu identisch (Tab.
2).
Tabelle
1 listet Marker, die nach Literaturkenntnis differentiell im Haarfollikel
im Vergleich zum Rest der Haut (interfollikuläre Haut) exprimiert werden.
Sie dienen als Positivkontrollen für das Experiment.
+H =
mit Haar (Hautquelle über
dem Ohr)
–H
= ohne Haar (Hautquelle vor dem Ohr)
Tabelle
2 zeigt Differenzierungs-abhängige
Gene der interfollikularen Epidermis.
HF = Haarfollikel
ORS
= Outer Root Sheath (Äussere
Wurzelscheide)
IRS = Inner Root Sheath (Innere Wurzelscheide)
+H
= mit Haar (Hautquelle über
dem Ohr)
–H
= ohne Haar (Hautquelle vor dem Ohr)
Zur
Beschreibung und Sicherung sub-signifikanter Genexpressionsunterschiede
(Tabellen 7 bis 12) wurden weitere SAGETM-Analysen
humaner Haut berücksichtigt.
So ist zu erwarten, dass ein haarspezifisches Gen nicht nur in unbehaarter
Gesichtshaut, sondern auch in anderer unbehaarter Körperhaut
gering exprimiert wird. Es wurden daher die sub-signifikanten Unterschiede
aus dem Vergleich des Transkriptoms behaarter Kopfhaut mit dem Transkriptom
unbehaarter Gesichtshaut mit dem Expressionsprofil unbehaarter Brusthaut verglichen.
Für die
SAGETM-Analyse von Brusthaut wurde Brusthaut
von einer gesunden weiblichen Spenderin (69 Jahre alt) verwendet.
Hierdurch konnten subsignifikante Unterschiede in der Genexpression
bestätigt
werden.
Die
Tabellen 3 bis 12 enthalten eine detaillierte Auflistung der mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
ermittelten, in behaarter und unbehaarter Haut differentiell exprimierten
Gene unter Angabe
- • einer laufenden Ordnungsnummer
in Spalte 1,
- • der
verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2,
- • des
Quotienten der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in behaarter
Kopfhaut (Scalp) und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz
in unbehaarter Gesichtshaut (Face) in Spalte 3,
- • der
Signifikanz der in Spalte 3 genannten Werte in Spalte 4,
- • des
Quotienten der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in behaarter
Kopfhaut (Scalp) und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz
in unbehaarter Körperhaut
(Breast) in Spalte 5,
- • der
Signifikanz der in Spalte 5 genannten Werte in Spalte 6,
- • der
UniGene-Accession-Number in Spalte 7,
- • einer
Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 8 und
- • in
den Tabellen 8, 10 und 12 des Quotienten (Scalp/Face)/(Scalp/Breast)
in Spalte 9.
Der
Quotient in Spalte 3 gibt die Stärke
der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige
Gen in behaarter Kopfhaut (Scalp) stärker exprimiert wird, als in
unbehaarter Gesichtshaut (Face), oder umgekehrt.
Der
Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke
der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige
Gen in behaarter Kopfhaut (Scalp) stärker exprimiert wird, als in
unbehaarter Körperhaut
(Breast), oder umgekehrt.
Unter
ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte
in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information
(NCBl) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender
Adresse zugänglich:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die
Gene bzw. Genprodukte sind außerdem
unter den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html
oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide direkt zugänglich.
In
Tabelle 3 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p>0,05
(Signif >1,3) mindestens
10-fach differentiell exprimiert werden.
In
Tabelle 4 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p>0,05
(Signif >1,3) mindestens
5-fach differentiell exprimiert werden.
In
Tabelle 5 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p>0,05
(Signif >1,3) mindestens
3-fach differentiell exprimiert werden.
In
Tabelle 6 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p>0,05
(Signif >1,3) mindestens
1,9-fach differentiell exprimiert werden.
In
Tabelle 7 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
5-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem
p-Value von p>0,05
(Signif >1,3) mindestens
5-fach differentiell exprimiert werden. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten
mit unabhängigen
SAGETM-Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die differentielle Genexpression
und validiert die Marker der behaarten Haut.
In
Tabelle 8 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
5-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
5-fach differentiell exprimiert werden, deren Expression sich um
weniger als eine Zehnerpotenz unterscheidet, dh., der Quotient (Scalp/Face)/(Scalp/Breast)
ist kleiner als 10 oder größer als
0,1. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGETM-Experimenten (Scalp/Breast)
bestätigt
die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten
Haut.
In
Tabelle 9 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
3-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem
p-Value von p>0,05
(Signif >1,3) mindestens
3-fach differentiell exprimiert werden. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten
mit unabhängigen
SAGETM-Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die differentielle Genexpression
und validiert die Marker der behaarten Haut.
In
Tabelle 10 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
3-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
3-fach differentiell exprimiert werden, deren Expression sich um
weniger als eine Zehnerpotenz unterscheidet, dh., der Quotient (Scalp/Face)/(Scalp/Breast)
ist kleiner als 10 oder größer als
0,1. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGETM-Experimenten (Scalp/Breast)
bestätigt
die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten
Haut.
In
Tabelle 11 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
1,9-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem
p-Value von p>0,05
(Signif >1,3) mindestens
1,9-fach differentiell exprimiert werden. Der Vergleich der subsignifikanten
Scalp/Face-Daten mit unabhängigen
SAGETM-Experimenten (Scalp/Breast) bestätigt die
differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten
Haut.
In
Tabelle 12 sind alle Gene aufgelistet, die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Gesichtshaut (Face) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
1,9-fach differentiell exprimiert werden und die in behaarter Kopfhaut
(Scalp) im Vergleich zu unbehaarter Körperhaut (Breast) mit einem
p-Value von p<0,05
(Signif <1,3) mindestens
1,9-fach differentiell exprimiert werden, deren Expression sich
um weniger als eine Zehnerpotenz unterscheidet, dh., der Quotient
(Scalp/Face)/(Scalp/Breast) ist ist kleiner als 10 oder größer als
0,1. Der Vergleich der subsignifikanten Scalp/Face-Daten mit unabhängigen SAGETM-Experimenten
(Scalp/Breast) bestätigt
die differentielle Genexpression und validiert die Marker der behaarten
Haut.
Die
zweite der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird
erfindungsgemäß gelöst durch ein
Verfahren (2) zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen,
insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß man
- a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder
Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher
Haut gewinnt,
- b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller
Analyse der Genexpression (SAGE) als in behaarter und unbehaarter
Haut differentiell exprimiert identifiziert werden,
- c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller
Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern
vergleicht und
- d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase
befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in behaarter Haut stärker exprimiert
werden als in unbehaarter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch
kranker bzw. in gestörter
Homeostase befindlicher behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut
stärker
exprimiert werden als in behaarter Haut.
Erkrankungen
bzw. Störungen
der Homeostase behaarter Haut sind beispielsweise: Pili torti (Torsionshaare,
gedrehte Haare), Monilethrix (Spindelhaar), Wollhaare (Kräuselhaar),
Haarschaftveränderungen
mit Brüchen
[Trichorrhexis nodosa, Trichorrhexis invaginata, Trichoschisis,
Trichoptilosis (Haarspliß)],
Haarschaftveränderungen
bei Stoffwechselstörungen,
Pili recurvati, Rollhaare, Veränderungen
der Haarfarbe [Heterochromie, Albinismus, Poliose (erworbene herdförmige Pigmentlosigkeit
der Haare), Canitis (physiologisches Ergrauen)], Hypertrichosen,
Hirsutismus, Alopezien (Irreversible Alopezie.: z.B. Androgenetische
Alopezie des Mannes und der Frau); Reversible Alopezie.: z.B. Sympto matische
diffuse Alopezien durch Infektionen, chem. Noxen und Arzneimittel,
hormonelle Störungen,
Krankheiten, etc.) sowie Alopezia areata.
Die
Gewinnung des Gemisches in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut kann aus Vollhautproben,
behaarten Hautäquivalenten,
isolierten Haafollikeln, Haarfollikeläquivalenten oder Zellen behaarter
Haut vorgenommen werden.
Es
kann in Schritt b) des Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase
behaarter Haut ausreichend sein, das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein
von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen
zu untersuchen, die mittels Serieller Analyse der Genexpression
(SAGE) als in behaarter und unbehaarter Haut differentiell exprimiert
identifiziert werden, wenn diese ausschließlich in behaarter oder ausschließlich in
unbehaarter Haut exprimiert werden. In allen anderen Fällen muß in Schritt
b) auch die Menge der differentiell exprimierten Moleküle untersucht
werden, d. h., die Expression muß quantifiziert werden.
In
Schritt d) des Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase behaarter
Haut wird das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut
zugeordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in behaarter Haut stärker exprimiert
werden als in unbehaarter Haut, d. h., daß das Gemisch entweder mehr
unterschiedliche typischerweise in behaarter Haut exprimierte Verbindungen
enthält,
als solche, die typischerweise in unbehaarter Haut exprimiert werden
(qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise
in behaarter Haut exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in unbehaarter
Haut vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu
kranker bzw. in gestörter
Homeostase befindlicher behaarter Haut wird in komplementärer Weise
verfahren.
Eine
bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den
Tabellen 11 und 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number
definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse
aus b) mit den in den Tabellen 11 und 12 in Spalte 3 und Spalte
5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt
d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet,
wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut
mindestens 1,9-fach
so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in
b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher
behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens
1,9-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den
Tabellen 9 und 10 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number
definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse
aus b) mit den in den Tabellen 9 und 10 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen
Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte
Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter
Haut mindestens 3-fach
so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in
b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher
behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut
mindestens 3-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den
Tabellen 7 und 8 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number
definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus
b) mit den in den Tabellen 7 und 8 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen
Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte
Gemisch gesunder behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter
Haut mindestens 5-fach
so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in
b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher
behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut
mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine
besonders bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden,
in
Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle
6 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht
und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter
Haut zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut
mindestens 1,9-fach
so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in
b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher
behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens
1,9-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine
weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden,
in
Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle
5 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht
und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter
Haut zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut
mindestens 3-fach
so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in
b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher
behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens
3-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine
weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden,
in
Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle
4 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht
und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter
Haut zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut
mindestens 5-fach
so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in
b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher
behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens
5-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Eine
ganz besonders bevorzugte Ausführungsform
des ertindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in
Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls
die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle
3 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden,
in
Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle
3 in Spalte 3 und Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht
und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder behaarter
Haut zuordnet, wenn es überwiegend
Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in gesunder behaarter Haut
mindestens 10-fach
so stark exprimiert werden wie in unbehaarter Haut, oder das in
b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher
behaarter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in unbehaarter Haut mindestens
10-fach so stark exprimiert werden wie in behaarter Haut.
Man
kann den Zustand der Haut auch dadurch beschreiben, daß mehrere
Marker (Expressionprodukte der für
behaarte Haut bedeutsamen Gene) quantifiziert werden, die dann untereinander
in einem charakteristischen Verhältnis
aktiv sein müssen,
um gesunde (in Homeostase befindliche) behaarte Haut zu repräsentieren,
bzw. in einem hiervon verschiedenen charakteristischen Verhältnis aktiv
sein müssen,
um kranke (in gestörter
Homeostase befindliche) Haut zu repräsentieren.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren
(3) zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen, insbesondere
bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder
Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher
Haut gewinnt,
- b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels
Verfahren (1) als für
behaarte Haut bedeutsam identifiziert werden,
- c) die Expressionsverhältnisse
der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen
zueinander bestimmt und den Expressionsquotienten bildet,
- d) die Expressionsverhältnisse
aus c) mit den Expressionsverhältnissen
vergleicht, die für
die in b) quantifizierten Moleküle
typischerweise in behaarter bzw. in unbehaarter Haut vorliegen,
insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den
Tabellen 3 bis 12, Spalten 3 bzw. 5 ergeben, und
- e) das in a) gewonnene Gemisch gesunder (in Homeostase befindlicher)
behaarter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse
der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in behaarter Haut
entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch kranker (in gestörter Homeostase
befindlicher) Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse
der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen unbehaarter Haut entsprechen.
Vorzugsweise
gewinnt man in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung
der Homeostase behaarter Haut das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere
aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe. Hierbei eröffnet die
Vollhautprobe umfassendere Vergleichsmöglichkeiten mit den gleichfalls
aus Vollhaut gewonnenen SAGE-Libraries. Die Epidermisprobe ist hingegen
leichter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes
auf die Haut und Abreißen
desselben, wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die hiermit in
vollem Umfang Bezug genommen wird.
In
einer weiteren Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut gewinnt man in Schritt
a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird
beispielsweise in „Microdialysis:
A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge
K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161:12 1735-8; sowie in „Cutaneous
microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et
al.; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231–244; und auch im Internet
unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf
hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bei
der Anwendung der Mikrodialyse führt
man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer
geeigneten Trägerlösung die
Sonde langsam zu spülen.
Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert
die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen,
die im extrazellulären
Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit,
dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist
weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber
nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender
Verbindungen beschränkt.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein
und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder
Prote infragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens
zweier Proteine oder Proteinfragmente, mittels einer Methode durchführt, die
ausgewählt
ist unter
- i. Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese
- ii. Affinitätschromatographie
- iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
- iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser
Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere
- v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen
dieser Methoden.
Diese
erfindungsgemäß einsetzbaren
Methoden sind in dem Übersichtsartikel
von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes
and genomes", Nature,
Volume 405, Number 6788, 837 – 846 (2000),
und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit
in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die
2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L.D. Adams, Two-dimensional
Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L.D. Adams & S.R. Gallagher,
Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols
in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1–10.4.13;
oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham
Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die
massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente
erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den
folgenden Literaturstellen beschrieben:
Methods in Molecular
Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor:
A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere:
Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487–512.
Carr, S. A. und
Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology;
Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1–10.21.27.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein
und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente;
bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente
mittels einer Methode durchführt,
die ausgewählt
ist unter
- i. Northern Blots,
- ii. Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
- iii. RNase-Schutzexperimente,
- iv. Dot-Blots,
- v. cDNA-Sequenzierung,
- vi. Klon-Hybridisierung,
- vii. Differential Display,
- viii. Subtraktive Hybridisierung,
- ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting,
- x. Total Gene Expression Analysis (TOGA),
- xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE),
- xii. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS®) und
insbesondere
- xiii. Einsatz von Nukleinsäurechips,
oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese
erfindungsgemäß einsetzbaren
Methoden sind in den Übersichtsartikeln
von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes
and genomes", Nature,
Volume 405, Number 6788, 837–846 (2000),
und „Genomics,
gene expression and DNA arrays",
Nature, Volume 405, Number 6788, 827–836 (2000), und den dort angegebenen
Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen
wird.
Das
TOGA-Verfahren ist in "J.
Gregor Sutcliffe et al, TOGA: An automated parsing technology for
analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol.
97, No. 5, pp. 1976–1981
(2000)" beschrieben,
worauf hiermit vollumfänglich
Bezug genommen wird.
Das
MPSS®-Verfahren
ist in der US-A-6,013,445 beschrieben, worauf hiermit in vollem
umfang Bezug genommen wird.
Es
können
jedoch erfindungsgemäß auch andere
dem Fachmann bekannte Methoden zur Untersuchung auf das Vorhandensein
und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine,
mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen eingesetzt werden.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Verfahren
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut ist dadurch gekennzeichnet,
daß man
in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge
von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa
10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt
etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa
50 der Proteine, mRNA-Moleküle
oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den
Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert
werden.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit
zur Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen in vitro,
umfassend Mittel zur Durchführung
der erfindungsgemäßen Verfahren zur
Bestimmung der Homeostase behaarter Haut.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur
Bestimmung der Homeostase behaarter Haut bei Menschen in vitro,
umfassend
- i. einen festen, d. h. starren oder
flexiblen Träger
und
- ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung
an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen
oder mRNA-Molekülen
befähigt
sind, die in den Tabellen 3 bis 12 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number
definiert werden.
Bei
einem Biochip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement
mit auf einer Oberfläche immobilisierten
Molekülen,
insbesondere Biomolekülen,
die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
Häufig weist
die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man
spricht dann von Chip"Arrays". Da tausende von
biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip
angeordnet sein können,
müssen
diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden.
Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere
in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten
können
z. B. Einzelstränge,
Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide,
Peptide, Proteine (z. B. Antikörper,
Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z.
B. organische Moleküle).
Im
allgemeinen haben Biochips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch
oder biochemisch funktionellen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise
auch von Wänden
einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein.
Zum
Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen
werden: Nature Genetics, Vol. 21, supplement (Gesamt), Jan. 1999
(Biochips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981–983, Okt.
1998 (Biochips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301–306, Jul.
1998 (Biochips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh
Pandey und Matthias Mann: „Proteomics
to study genes and genomes",
Nature, Volume 405, Number 6788, 837–846 (2000), und „Genomics,
gene expression and DNA arrays",
Nature, Volume 405, Number 6788, 827–836 (2000), und die dort angegebenen
Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Eine übersichtliche
Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA-Chiptechnologie
liefern die Bücher „DNA Microarrays:
A Practical Approach" (Editor:
Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und „Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena,
2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug
genommen wird.
