WO2000071747A2 - Erkennungssystem zur auftrennung von probenbestandteilen, seine herstellung und verwendung - Google Patents

Erkennungssystem zur auftrennung von probenbestandteilen, seine herstellung und verwendung Download PDF

Info

Publication number
WO2000071747A2
WO2000071747A2 PCT/EP2000/002938 EP0002938W WO0071747A2 WO 2000071747 A2 WO2000071747 A2 WO 2000071747A2 EP 0002938 W EP0002938 W EP 0002938W WO 0071747 A2 WO0071747 A2 WO 0071747A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
component
region
bound
sample
detection system
Prior art date
Application number
PCT/EP2000/002938
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2000071747A3 (de
Inventor
Dirk BÖKENKAMP
Hans-Ulrich Hoppe
Petra Burgstaller
Original Assignee
Aventis Research & Technologies Gmbh & Co Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Research & Technologies Gmbh & Co Kg filed Critical Aventis Research & Technologies Gmbh & Co Kg
Priority to AU36591/00A priority Critical patent/AU3659100A/en
Publication of WO2000071747A2 publication Critical patent/WO2000071747A2/de
Publication of WO2000071747A3 publication Critical patent/WO2000071747A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a detection system comprising (a) a carrier (component (a)) and (b) at least one recognition unit (component (b)) bound to the carrier, preferably a nuclear acid, the said recognition unit (component (b )) contains a region (A) with a defined structure and a region (B) adjacent to region (A) with a randomized structure, on a method for separating individual components in a sample, in which at least one is attached to one Carrier-bound detection unit (component (b)) is bound under suitable conditions at least one component of the sample, and on the use of the detection system according to the invention and the method according to the invention for finding and / or
  • genes are active in a human cell, which characterize the current state of the cell.
  • the state of a cell can represent, for example, an increased cell division in the case of a cancer cell or generally changed metabolic activities in the disease state.
  • the activity of a gene can be determined, for example, via its mRNA as a transcription product or via the corresponding protein as a translation product.
  • the mRNA or protein profile of a cell therefore reflects its current state.
  • RNA profiles of several cell populations are compared using gel electrophoresis.
  • RNA transcripts are produced by the individual RNA transcripts and certain sections thereof by means of certain polymer
  • a further development of the "differential display” method is subtraction hybridization in order to be able to better detect weakly exposed transcripts.
  • single-stranded cDNA is produced by a first cell population and this is hybridized with the mRNA population of a second cell population. Only such cDNA molecules remain single-stranded back of the first cell population, of which no corresponding mRNAs are present in the second cell population. It is also possible to carry out a plurality of such hybridizations in succession so that the
  • Transcripts that are only contained in the first population are enriched.
  • the single-stranded cDNA is then separated by hydroxyapatite chromatography to which only double-stranded DNA can bind but not single-stranded DNA and then analyzed (see e.g. Konietzko, U &de, D (1998 ) Nucleic Acids Res 26 1359-1361 Perret X et al (1994) Nucleic
  • the cellular proteins must be separated from one another.
  • An efficient method is, for example, two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE).
  • IP isoelectric point
  • the proteins are then made visible by staining in the 2D gel, in which approximately 1,000-2,000 proteins are stained as spots in typical 2D gels.
  • the result is a protein pattern that is significant for each cell or profile that reflects the respective state of the cell at the protein level.
  • Each protein in a cell has a protein-specific position on the 2D gel so that a so-called proteome map can be created for the cell and consequently for the whole organism of cell changes e.g.
  • the protein profiles of healthy and diseased cells are compared in order to determine any differences.
  • This comparison can, for example, be carried out automatically using suitable computers (see e.g. Wilkins, MR et al (eds) Proteome Research New Frontiers in Functional Genomics Springer Verlag Heidelberg (1997) or Humphrey-Smith, I et al (1997) Electrophoresis 18 1216-1242)
  • MR et al eds
  • Humphrey-Smith I et al
  • Electrophoresis 18 1216-1242 Electrophoresis 18 1216-1242
  • arrays are arrays of immobilized recognition species that play an important role especially in analysis and diagnostics in the simultaneous determination of analytes. Examples are nucleic acid arrays (see e.g. B Southern et al Genomics
  • WO96 / 01836 describes in for example, an array of DNA molecules of different sequences is described, which was used for the detection of gene segments and thus led, for example, to the diagnosis of pathogenic bacteria.
  • nucleic acids are hybridized in a sample on a nucleic acid array on a semiconductor chip using an electrical field and then non- or unspecifically bound nucleic acids are removed by simply reversing the polarity of the electric field.
  • a mispairing of a single base pair can be identified by precise adjustment of the electric field strength
  • the object of the present invention was to provide a system with the aid of which a population of nucleic acids or proteins can be specifically separated and then analyzed
  • nucleic acids each containing a region (A) with a defined nucleic acid sequence and a region (B) adjacent to region (A) with a respectively different, usually randomized nucleic acid sequence is suitable by means of specific hybridization to nucleic acids of a population to characterize the nucleic acid and / or protein profile of this population
  • One object of the present invention is therefore a recognition system comprising (a) a carrier (component (a)) and (b) at least one recognition unit (component (b)) bound to the carrier, said recognition unit (component (b)) being a region (A) with a defined structure and a region (B) adjacent to region (A) with a randomized structure
  • the term recognition unit is understood to mean nucleic acids and their analogs or fusions, in particular in the form of a pentose, preferably a pentopyranose or pentofuranose.
  • the pentose is selected from a ribose, arabinose, lyxose or xylose.
  • RNA in particular mRNA or p-RNA (pyranosyl-RNA. see e.g. WO99 / 15539), ammocyclohexyl nucleic acids (CNA. see e.g. WO99 / 15509), peptidic nucleic acids (PNA, see e.g. WO92 / 20702 or Science ( 254), 1999, 1497-1500) or non-helical supramolecular nanosystems such as e.g. B. described in W098 / 25943.
  • nucleic acid fusions are nucleic acid protein acceptor derivatives, in particular
  • nucleic acid-puromycin derivatives or nucleic acid-protein fusions, in particular nucleic acid-puromycin-protein fusions.
  • nucleic acid-puromycin-protein fusions are DNAs and mRNAs, including their fusions, preferably with puromycin and / or with protein.
  • the term “defined structure” means a structure whose structure is known.
  • the defined structure of a nuclear acid is its known nucleic acid sequence.
  • the randomized structure of a nuclear acid is its nucleic acid sequence, which is the result of random events or permutation of the individual nucleotides.
  • the length of the region (A) and / or the region (B) is preferably independently of one another approximately 5 to approximately 80 nucleotides, preferably approximately 5 to approximately 30 nucleotides and in particular approximately 10 to approximately 30 nucleotides for the region (a) and especially about 7-8 nucleotides of the region (B), wherein the nucleotides are in a particularly preferred embodiment Desoxy ⁇ 'bonukleotide (d), ribonucleotides (r) or 2- Hydroxymethyl ⁇ bonukleotide (hmr).
  • the nucleotides are in a particularly preferred embodiment Desoxy ⁇ 'bonukleotide (d), ribonucleotides (r) or 2- Hydroxymethyl ⁇ bonukleotide (hmr).
  • RNAs according to the present invention can be constructed not only from ribonucleotides but also from 2-hydroxymethyl ⁇ bonucleotides
  • region (A) consists of a poly-T strand with, for example, 7-15 thymidine nucleotides (T 7 - 15 ), a nucleic acid limiter of known sequence, for example a poiy-T 27 GG strand, or a strand of the corresponding organism that is complementary to the ribosome binding site, such as, for example, a prokaryotic organism such as bacteria or in particular a eukaryotic organism such as plants For example, it was isolated from the corresponding cell to isolate or bind to the carrier of the recognition system.
  • each mRNA of a cell contains a poly-
  • the nuclear acid population is not restricted to naturally occurring nucleic acid populations but also includes artificially produced populations such as, for example, nucleic acid populations of combinatorial systems.
  • populations or substance libraries are described, for example, in WO93 / 20242 W097 / 43232 W098 / 25943 or W099 / 15541
  • a protein profile of a protein population can be characterized, for example, by selecting proteins by means of suitable nuclear acid-protein fusions.
  • WO98 / 31700 describes, for example, a system in which mRNA, A puromycin, for example, is bound via a suitable linker to the protein acceptor.
  • the synthesized protein covalently attaches to its coding protein mRNA can be bound and characterized in more detail.
  • the linker the sequence of which is known, is particularly advantageously suitable as a binding region to the region (A) of the nuclear acid according to the invention.
  • a poly T 27 GG strand can be used as region (A)
  • region (A) In order to bind to a linker with the sequence A 27 CC of a nuclear acid-protein fusion, comparable systems which can be used for the present invention are described, for example, in DE19646372C1 W098 / 16636 WO91 / 05058 US 5 843 701, WO93 / 03172 or WO94 / 13623
  • the present invention therefore also relates to a detection system in which the detection system described above contains at least one further detection unit (component (c)) which is specifically bound to the detection unit according to component (b).
  • Component (c) is preferably selected is from a nuclear acid and / or its analogs or fusions, such as. B. a nuclear acid with a protein acceptor and / or a nuclear acid protein
  • Region (B) represents a region with a randomized structure in order to be able to record all the different constituents of a population, such as nucleic acids.
  • the length of the randomized structure depends on the complexity of the population, which experience has shown in a prokaryotic cell is smaller and higher in a eukaryotic cell
  • about 30,000 genes are active in a human cell, so that in the case of a nuclear acid, a length of 7-8 nucleotides in permuted or randomized order is sufficient to record all active genes in a human cell
  • the permutation possibilities for an n-mer oligonucleotide are known to be 4 n, where n is the number of nucleotides of the oligonucleotide.
  • a nucleic acid with the following formula is therefore preferred
  • X denotes any nucleotide selected from adenosine, thymidine guanosm or cytosine
  • carrier is understood to mean material, in particular chip material made of semiconductors, in solid or gel-like form
  • Support materials for example, ceramic metal, in particular semiconductor, noble metal, glazers, plastics, crystalline materials or thin layers of the support, in particular of the materials mentioned, or (b ⁇ o) molecular filaments such as cellulose, scaffold protectors.
  • Support systems as in EP-A1-0543550 or are preferred W099 / 15893 and in particular as in
  • a particularly preferred embodiment of the Detection system according to the invention is therefore an electronic chip
  • the carrier is generally carried out covalently, quasi-covalently, supramolecularly or physically and magnetically (AR Shepard et al (1997) Nucleic Acids Res, 25, 3183-3185 No. 15), in an electric field or by means of a molecular sieve, preferably according to a method as in US 5 605 662 WO96 / 01836 US 5 632,957 WO97 / 12030 or W099 / 15893
  • the present invention also relates to a method for producing a recognition system according to the invention, in which a recognition unit (component (b)) containing a region (A) with a defined structure and one to that Region (A) adjacent region (B) with a randomized structure is bound to a carrier according to generally known methods
  • the present invention relates to a method for producing a recognition system, in which, on the one hand, a recognition unit (component (b)) containing a region (A) with a defined structure and a region adjacent to region (A) ( B) is bound to a carrier (component (a)) with a randomized structure and, on the other hand, at least one further recognition unit is specifically bound as component (c) to the recognition unit according to component (b)
  • more than one recognition unit as component (b) or as component (c) is spatially separated from the carrier (component (c)) or to the recognition unit according to component (b), for example bound in separate cells.
  • Special manufacturing processes are for example in EP-A1-0543550 or WO99 / 15893 and in particular in US5,605,662, WO96 / 01836, US5,632,957 or EP-B1-0373203 WO97 / 12030 or WO98 / 31700 in more detail
  • Another object of the present invention is a method for separating individual constituents in a sample, in which at least one recognition unit (component (b)) bound to a carrier (component (a)) has a region (A) with a defined structure and a region (B) adjacent to region (A) with a randomized structure contains, under suitable conditions, binding at least one component of the sample which is complementary to component (b) or component (c)
  • “Complementary” in the sense of the present invention means that the constituent of the sample specifically binds to component (b) or to component (c).
  • one nuclear acid specifically binds to another nuclear acid, provided the two nucleic acids have complementary sequences in order to - for example, to form AT or GC base pairs in the case of deoxyribonucleic acids.
  • the term complementary also means specific nucleic acid-protein or protein-protein bonds, for example a specific antigen-antibody bond, or the specific bond between a chemical Active ingredient and a nuclear acid or a protein
  • Preferred embodiments of the method according to the invention include an detection system, which has already been described in more detail above.
  • an electronic chip is used because the component of the sample, for example a nuclear acid and / or its
  • the component of the sample is, for example, a nuclear acid and / or its analogs or fusions, as already described in more detail above, and preferably a DNA, RNA, in particular an mRNA, an RNA puromycin derivative or a nucleic acid protein fusion, in particular an RNA protease. Fusion preferably an mRNA-puromycin-protein fusion, as described in more detail in WO98 / 31700, for example, or one or more chemical active substances
  • a suitable nuclear acid linker for example an A 27 CC, for example chemically or with the aid of a suitable ligase, for example a T4 DNA ligase, is fused to an mRNA population of a sample.
  • a second step the mRNA lamers Fusions to nucleic acids of the detection system according to the invention with, for example, the formula 3 - (X) 7 8 - (T 27 GG) -5 where X denotes any nucleotide selected from Ade ⁇ osm thymidine guanosine or cytosm, preferably bound with the aid of an electric field and if appropriate, non-or non-specifically bound nucleic acids are removed in a further step, preferably with the aid of a reversed polarized electric field of lower field strength than in the first step
  • the linker additionally contains a protein acceptor, such as, for example, Puromycm, and if a translation reaction is carried out in an intermediate step before or after the binding of the mRNA-linker fusions to the recognition system according to the invention, which leads to mRNA-linker-protein fusions, the procedure is followed the binding of the mRNA linker-protein fusions to the recognition system according to the invention a protein acceptor, such as, for example, Puromycm, and if a translation reaction is carried out in an intermediate step before or after the binding of the mRNA-linker fusions to the recognition system according to the invention, which leads to mRNA-linker-protein fusions, the procedure is followed the binding of the mRNA linker-protein fusions to the recognition system according to the invention a protein acceptor, such as, for example, Puromycm, and if a translation reaction is carried out in an intermediate step before or after the binding of the mRNA-linker fusions to the recognition system according
  • the method according to the invention can be used to analyze the nuclear acid of the sample bound to the detection system.
  • the state of various cells or tissue samples can be analyzed or compared via the nuclear acid and / or protein profile.
  • the bound nucleic acids or Proteins are detected directly or indirectly using suitable labeling methods
  • labeling methods of nucleic acids and / or proteins are chemical enzyme, protein, radioactive isotope, non-radioactive isotope, tox-chemical ninescent and / or fluorescent labeling
  • enzymes known to the person skilled in the art which are suitable for an enzyme labeling according to the invention are 'malathydrogenase staphylococcus nuclease, ⁇ -5-steroid idomerase alcohol dehydrogenase, ⁇ -glycerol phosphate dehydroge ⁇ ase t ⁇ ose phosphate isomerase, peroxidase alkaline phosphase, glucose oxidase -Galactosidase, urease, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase, luciferase or acetylcholmesterase
  • HIS Heptin-binding protein
  • FLAG FLAG
  • GST hamaglutenin glutathione transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • antibody or antigen-binding parts of antibodies eg Fv fragments
  • isotopes known to those skilled in the art which are suitable for radioactive isotope labeling according to the invention are 3 H 125 l, 131 l 32 P 33 P, 14 C, 51 Cr, 57 To, 58 COA 9 Fe ⁇ 5 Se 152 Eu, 90 Y 67 Cu 217 C ⁇ , 21 l At, 212 Pb, 47 Sc or 109 Pb
  • Examples of isotopes known to the person skilled in the art which are suitable for non-radioactive isotope labeling according to the invention are 2 H or 13 C
  • Examples of toxms known to those skilled in the art. which are suitable for a toxin marking according to the invention are: diphtheenetoxin, Ricm or cholera toxin
  • chemiluminescent substances known to the person skilled in the art which are suitable for a chemiluminescent marking according to the invention are:
  • fluorescent substances known to the person skilled in the art which are suitable for a fluorescence marking according to the invention are: 152 Eu. Fluorescein, isothiocyanate. Rhodam. Phycoeryth ⁇ n, phycocyanin. Allophycocyanin, o-phthaldehyde, Green Fluorescent Protein (GFP) or Fluorescamin.
  • Bound nucleic acids can also be further identified or characterized via EST (expressed sequence tags) databases, Northern blot on the recognition system according to the invention or by sequencing on the recognition system or after targeted release, preferably after prior amplification by means of PCR, RT-PCR or cloning.
  • EST expressed sequence tags
  • the nuclear acid bound to the detection system according to the invention can be translated either before or after detachment from the detection system and the translation products can then Binding again at equivalent positions either on the same recognition system or on a different recognition system.
  • the protein profile can preferably also be produced via RNA-protein fusions, as already described in more detail above
  • the physiological state of a cell and biological processes of a cell can thus be identified, characterized and monitored in a particularly advantageous manner
  • Protein profiles of populations are particularly suitable for locating and / or identifying cellular or artificial binding partners such as proteins, peptides, nucleic acids, chemical active substances, preferably organic compounds, pharmacologically active compounds, crop protection agents, toxins, such as poisons, carcinogens and / or teratogenic substances, herbicides, fungicides or pesticides.
  • Individual proteins can also be identified and characterized directly on the basis of their function, for example their enzymatic activity, on the recognition system.
  • bound proteins in the form of their mRNA-protein fusions can be sequenced, for example, by the mRNA described in more detail in WO98 / 31700
  • the present invention therefore also relates to the use of a detection system according to the invention, a method according to the invention or a detection unit according to the invention containing a region (A) with a defined structure and a region (B) adjacent to region (A) with a randomized structure for finding and / or to identify or characterize at least one component of a sample, in particular nucleic acids and / or proteins of a sample or to find and / or to identify cellular or artificial binding partners, preferably proteins, peptides, nucleic acids, chemical agents, preferably organic compounds, pharmacologically active compounds, plant protection agents, toxins in particular poisons, carcogenic and / or teratogenic substances, herbicides, fungicides or pesticides
  • 1 shows the nucleic acid sequences of DNA oligonucleotides bound to a carrier, which were derived from the ⁇ -actin gene or from S-9 RNA and the two fluorescent dye-labeled samples
  • Region A was either from the 3rd '-UTR region of the ⁇ -actm gene or derived from the S-9 RNA and either contained no mutation or the mutations marked in bold at the corresponding sites (see FIG. 1).
  • two oligonucleotides were synthesized which are derived from the ⁇ -actin gene or derived from S-9 RNA. These oligonucleotides contain regions complementary to the biotin-labeled oligonucleotides and were labeled with either a green (Cy3) or a red (CY5) fluorescent dye

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Erkennungssystem enthaltend (a) einen Träger (Komponente (a)) und (b) mindestens eine an den Träger gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), vorzugsweise eine Nukleinsäure, wobei die genannte Erkennungseinheit (Komponente (b)) eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur enthält, auf ein Verfahren zur Auftrennung einzelner Bestandteile in einer Probe, bei dem an mindestens eine an einen Träger gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)) unter geeigneten Bedingungen mindestens ein Bestandteil der Probe gebunden wird, und auf die Verwendung des erfindungsgemässen Erkennungssystems und des erfindungsgemässen Verfahrens zum Auffinden und/oder zur Identifizierung bzw. Charakterisierung von Nukleinsäuren und/oder Proteinen einer Probe bzw. zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellulären oder künstlichen Bindepartnern.

Description

Erkennungssystem zur Auftrenπung von Probenbestaπdteilen. seine Herstellung und Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Erkenπungssystem enthaltend (a) einen Träger (Komponente (a)) und (b) mindestens eine an den Träger gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), vorzugsweise eine Nuklemsaure, wobei die genannte Erkennuπgseinheit (Komponente (b)) eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisier- ten Struktur enthalt, auf ein Verfahren zur Auftrennung einzelner Bestandteile in einer Probe, bei dem an mindestens eine an einen Trager gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)) unter geeigneten Bedingungen mindestens ein Bestandteil der Probe gebunden wird, und auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Erken- nungssystems und des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Auffinden und/oder zur
Identifizierung bzw. Charakterisierung von Nukleinsäuren und/oder Proteinen einer Probe bzw. zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellulären oder kunstlichen Bindepartnern
In einer menschlichen Zelle sind im allgemeinen bis zu ca. 30.000 Gene aktiv, welche den momentanen Zustand der Zelle cnarakteπsieren. Der Zustand einer Zelle kann beispielsweise eine erhöhte Zellteilung im Fall einer Krebszelle oder allgemein veränderte Stoffwechselaktivitäten im Krankheitszustand darstellen. Die Aktivität eines Gens kann beispielsweise über seine mRNA als Transkriptionsprodukt oder über das entsprechende Protein als Translationsprodukt bestimmt werden. Das mRNA- bzw. Protein-Profil einer Zelle spiegelt daher deren momentanen Zustand wider.
Die Charakterisierung einer gesunden oder kranken Zelle anhand ihres mRNA- bzw Protein-Profils ist für die Erforschung von Krankheiten und das Auffinden von phar- makologisch wirksamen Verbindungen in jüngster Zeit von großer Bedeutung ge- worden Es wurden bereits verschiedene Methoden entwickelt, die das mRNA-Profϊl einer Zelle charakterisieren sollen
Bei der sogenannten Differential Display '-Methode werden die RNA-Profile mehre- rer Zellpopulationen mittels Gelelektrophorese miteinander verglichen Die mRNA-
Population einer Zelle ist jedoch zu komplex um die verschiedenen RNA-Transknpte im Gel einzeln aufzutrennen Außerdem liegen die einzelnen RNA-Transknpte in sehr unterschiedlichen Mengen vor, so daß die unterreprasentierten Transkripte nur schwer nachzuweisen sind Deshalb werden cDNAs von den einzelnen RNA- Transkripten hergestellt und bestimmte Abschnitte davon mittels bestimmter Pπmer-
Kombinationeπ in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert Die PCR- Produkte werden anschließend auf Gelen aufgetrennt die Menge der einzelnen PCR-Produkte bestimmt und vorhandene Unterschiede auf dem Gel analysiert (siehe z B Liang, P & Pardee, A B (1992) Science 257, 967-972 oder Zhang, H et al (1996) Nucleic Acids Res 24, 2454-2455) Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist, daß nur kurze Bereiche der cDNA amplifiziert werden und eine hohe Fehlerrate an falsch-positiven Signalen erreicht wird
Eine Weiterentwicklung der .Differential Dιsplay"-Methode ist die Subtraktionshybπ- disierung, um schwach expnmierte Transkripte besser nachweisen zu können Dazu wird von einer ersten Zellpopulatioπ einzelstrangige cDNA hergestellt und diese mit der mRNA-Population einer zweiten Zellpopulation hybridisiert Es bleiben nur solche cDNA-Molekule der ersten Zellpopulation einzelstrangig zurück, von denen keine korrespondierenden mRNAs in der zweiten Zellpopulation vorhanden sind Man kann auch mehrere solcher Hybiπdisierungeπ nacheinander durchfuhren so daß die
Transkripte, die nur in der ersten Population enthalten sind angereichert werden Die einzelstrangig zurückgebliebene cDNA wird anschließend über Hydroxyapatit- Chromatographie an die nur doppelstrangige DNA aber nicht einzelstrangige DNA binden kann abgetrennt und anschießend analysiert (siehe z B Konietzko, U & Kühl, D (1998) Nucleic Acids Res 26 1359-1361 Perret X et al ( 1994) Nucleic
Acids Res 25 1335-1341 oder Herblot, S et al ( 1997) FEBS Lett 414 146-152) Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist daß immer nur zwei Populationen mit- einander verglichen werden können was zu einem noheπ Arbeits- und Zeitaufwand fuhrt
Zur direkten Charakterisierung des Protein-Profils in einer Zelle müssen die zellula- ren Proteine voneinander aufgetrennt werden Eine effiziente Methode ist beispielsweise eine zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2DE) In der ersten Dimension werden hierbei die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (IP) und in der zweiten Dimension nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt Anschließend werden die Proteine durch Färbung im 2D-Gel sichtbar gemacht wobei in typischen 2D-Gelen ca 1 000-2 000 Proteine als Flecke („spots") eiπgefarbt werden Als Ergebnis erhalt man ein für jede Zelle signifikantes Proteinmuster oder Profil das den jeweiligen Zustand der Zelle auf Proteinebene widerspiegelt Jedes Protein einer Zelle hat eine für das Protein spezifische Position auf dem 2D-Gel so daß man für die Zelle und folglich für den ganzen Organismus eine sogenannte Proteom-Karte erstellen kann Um die molekularen Ursachen von Zellveranderungen z B bei
Krankheitsprozessen zu bestimmen werden die Protein-Profile von gesunden und kranken Zellen verglichen um eventuelle Unterschiede festzustellen Dieser Vergleich kann beispielsweise automatisiert mittels geeigneter Computer durchgeführt werden (siehe z B Wilkins, M R et al (eds ) Proteome Research New Frontiers in Fuπctional Genomics Springer Verlag Heidelberg (1997) oder Humphrey-Smith, I et al (1997) Electrophoresis 18 1216-1242) Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist jedoch daß für eine weitere Analyse der detektierten Proteine diese auf Proteinebene sequenziert werden müssen was derzeit noch zeit- und kostenintensiv
Alternative Methoden zur Bestimmung eventueller Unterschiede im mRNA- oder Protein-Profil einer Zelle benutzen sogenannte Arrays d h Matrixsysteme Arrays sind Anordnungen immobilisierter Erkennungsspezien die speziell in der Analytik und Diagnostik eine wichtige Rolle bei der simultanen Bestimmung von Analyten spielen Beispiele sind Nukleinsaure-Arrays (siehe z B Southern et al Genomics
( 1992) 13 1008 U S Patent Nr 5 632 957 W097/27317 oder EP-A1 -0 543 550) oder Peptid-Arrays (Fodor et al Nature 1993 364 555) In WO96/01836 wird bei- spieisweise ein Array von DNA-Molekulen unterschiedlicher Sequenz beschrieben, der zur Detektioπ von Genabschnitten diente und so beispielsweise zur Diagnose pathogener Bakterien führte In den Patentpublikationen U S 5 605,662, WO96/01836 U S 5 632.957 und WO97/12030 werden Halbleiter-Chips und Ver- fahren beschrieben mit deren Hilfe elektronisch kontrollierbar spezifische Bindereaktionen von biologischen Verbindungen, wie Nukleinsäuren oder Proteinen, an spezifische adressierbare Stellen in Form eines Arrays durchgeführt werden können Beispielsweise werden Nukleinsäuren in einer Probe an einem Nukleinsaure- Array auf einem Halbleiter-Chip mit Hilfe eines elektrischen Feldes hybridisiert und anschließend nicht- oder unspezifisch-gebundene Nukleinsäuren durch eine einfache Umkehrung der Polarität des elektrischen Feldes entfernt Hierbei kann durch eine genaue Einstellung der elektrischen Feldstarke eine Fehlpaarung eines einzigen Basenpaares erkannt werden
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war ein System bereitzustellen, mit dessen Hilfe eine Population an Nukleinsäuren bzw Proteinen spezifisch aufgetrennt und anschließend analysiert werden kann
Es wurde nun überraschenderweise gefunden daß eine entsprechende Ansamm- lung von Nukleinsäuren enthaltend jeweils eine Region (A) mit einer definierten Nu- kleinsauresequenz und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer jeweils unterschiedlichen üblicherweise randomisierten Nukleinsauresequenz geeignet ist, mittels spezifischer Hybridisierung an Nukleinsäuren einer Population das Nuklemsaure- und/oder Protemprofil dieser Population zu charakterisieren
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Erkennungssystem enthaltend (a) einen Trager (Komponente (a)) und (b) mindestens eine an den Trager gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)) wobei die genannte Erkennungseinheit (Komponente (b)) eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur enthalt Unter dem Begriff Erkennungseinheit versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren und deren Analoga bzw. Fusionen, insbesondere in Form einer Pentose, vorzugsweise eine Pentopyranose oder Pentofuranose. Im allgemeinen ist die Pentose ausgewählt aus einer Ribose, Arabinose, Lyxose oder Xylose. Beispiele von geeigneten Nukleinsäuren bzw. deren Analoga sind DNA. RNA. insbesondere mRNA oder p-RNA (Pyranosyl-RNA. siehe z.B. WO99/15539), Ammocyclohexyl- Nukleinsäuren (CNA. siehe z. B. WO99/15509), peptidische Nukleinsäuren (PNA, siehe z. B. WO92/20702 oder Science (254), 1999, 1497-1500) oder nicht-helikale supramolekulare Nanosysteme wie z. B. in W098/25943 beschrieben. Beispiele von Nukleinsäurefusioπen sind Nukleinsäure-Proteinakzeptor-Derivate, insbesondere
Nukleinsäure-Puromycin-Deπvate, oder Nukleinsaure-Protein-Fusionen, insbesondere Nukleinsaure-Puromycin-Protein-Fusionen. Besonders bevorzugte Nukleinsäuren sind DNAs und mRNAs einschließlich deren Fusionen vorzugsweise mit Puromycin und/oder mit Protein.
Unter dem Begriff „definierte Struktur' versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Struktur, deren Aufbau bekannt ist. Beispielsweise ist die definierte Struktur einer Nuklemsaure ihre bekannte Nukleinsäuresequenz.
Unter dem Begriff „randomisierte Struktur' versteht man gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Struktur, deren genauer Aufbau nicht bekannt ist. Beispielsweise ist die randomisierte Struktur einer Nuklemsaure ihre durch Zufallsereigπisse bzw. Per- muation der einzelnen Nukleotide entstandene Nukleinsäuresequenz.
Die Länge der Region (A) und/oder der Region (B) ist vorzugsweise unabhängig voneinander ca. 5 bis ca. 80 Nukleotide, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 30 Nukleotide und insbesondere ca. 10 bis ca. 30 Nukleotide für die Region (A) und insbesondere ca. 7-8 Nukleotide für die Region (B), wobei die Nukleotide in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Desoxyπ'bonukleotide (d), Ribonukleotide (r) oder 2- Hydroxymethylπbonukleotide (hmr) sind. In den weiteren Ausführungen werden die
Nukleinsäuresequenzeπ ohne deren spezielle Rückgrade angegeben. Die angege- beneπ Nukleinsauresequenzen umfassen daher in jedem Fall die Ausfuhrungsformen (d), (r) und (hmr) Zudem können RNAs gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur aus Ribonukleotiden sondern auch aus 2-Hydroxymethylπbonukleotιden aufgebaut sein
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform besteht die Region (A) aus einem poly-T-Strang mit beispielsweise 7-15 Thymidin-Nukleotiden (T7-15), einem Nuklemsaure-Lmker bekannter Sequenz beispielsweise einem poiy-T27GG- Strang, oder einem zu der Ribosomenbindestelle komplementären Strang des ent- sprechenden Organismus, wie z B eines prokaryotischen Organismus wie Bakterien oder insbesondere eines eukaryotischen Organismus wie Pflanzen Tiere vorzugsweise Sauger insbesondere Mensch Mit Hilfe der Region (A) gelingt es alle unterschiedlichen Nukleinsäuren einer Nuklemsaure-Population die z B aus der entsprechenden Zelle isoliert wurde, zu isolieren bzw an den Trager des Erken- nungssystems zu binden Beispielsweise enthalt jede mRNA einer Zelle einen poly-
A-Schwanz, an den der poly-T-Strang der an den Trager gebundenen Nuklemsaure unter geeigneten Bedingungen hybridisiert
Die Nuklemsaurepopulation ist jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf natürlich vorkommende Nukleinsaurepopulationen Deschrankt sondern umfaßt auch künstlich hergestellte Populationen wie z B Nukleinsaurepopulationen kombinatorischer Systeme Derartige Populationen bzw Substanzbibliotheken sind beispielsweise in WO93/20242 W097/43232 W098/25943 oder W099/15541 beschrieben
Die Charakterisierung eines Protein-Profils einer Protein-Population beispielsweise einer Protein-Population einer Zelle gelingt z B über die Selektion von Proteinen mittels geeigneter Nuklemsaure-Protem-Fusionen In WO98/31700 ist beispielsweise ein System beschrieben, bei dem an die Nuklemsaure vorzugsweise mRNA, über einen geeigneten Linker em Proteinakzeptor beispielsweise ein Puromycin gebun- den ist Hierdurch wird erreicht daß kurz vor dem Ende der Translation der mRNA in das entsprechende Protein das synthetisierte Protein kovalent an ihre kodierende mRNA gebunden und so naher charakterisiert werden kann Der Linker, dessen Sequenz bekannt ist, eignet sich in besonders vorteilhafter Weise als Binderegion an die Region (A) der erfindungsgemaßen Nuklemsaure Beispielsweise kann ein poly- T27GG-Strang als Region (A) verwendet werden, um an einen Linker mit der Sequenz A27CC einer Nuklemsaure-Protem-Fusion zu binden Vergleichbare Systeme, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in DE19646372C1 W098/16636 WO91/05058 U S 5 843 701 , WO93/03172 oder WO94/13623 beschrieben
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf ein Erkennungssystem, bei dem das oben beschriebene Erkenπungssystem mindestens eine weitere Erken- πungsemheit (Komponente (c)) enthalt die an die Erkennungseinheit gemäß Komponente (b) spezifisch gebunden ist Vorzugsweise ist die Komponente (c) ausgewählt ist aus einer Nuklemsaure und/oder deren Analoga oder Fusionen, wie z. B. einer Nuklemsaure mit einem Proteinakzeptor und/oder einer Nuklemsaure-Protein-
Fusion, insbesondere aus einem Nukleinsaure-Puromycm-Deπvat und/oder einer Nukleinsaure-Puromycin-Protein-Fusion, wie z B oben bereits naher beschrieben
Die Region (B) stellt eine Region mit einer randomisierten Struktur dar, um alle un- terschiedlichen Bestandteile einer Population, wie z B Nukleinsäuren erfassen zu können Die Lange der randomisierten Struktur hangt hierbei von der Komplexität der Population ab, die erfahrungsgemäß bei einer prokaryotischen Zelle geringer und bei einer eukaryotischen Zelle hoher ist Beispielsweise sind in einer menschlichen Zelle ca 30 000 Gene aktiv so daß im Fall einer Nuklemsaure eine Lange von 7-8 Nukleotiden in permutierter bzw randomisierter Reihenfolge ausreicht, um alle aktiven Gene einer menschlichen Zelle zu erfassen Die Zahl der Permutationsmog- lichkeiten für ein n-mer-Oligonukleotid betragt bekannterweise 4n wobei n die Zahl der Nukleotide des Oligonukleotids bedeutet Für die Auftrennung aller aktiven Gene einer menschlichen Zelle ist daher eine an einen Trager gebundene Nuklemsaure mit folgender Formel bevorzugt
3'-(X)8-Regιoπ (A)-5' wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosin Thymidin Guanosm oder Cytosin bedeutet
Unter dem Begriff Trager versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung Mate- πal, insbesondere Chipmateπal aus Halbleiter das in fester oder auch gelartiger
Form vorliegt Als Tragermatenalien eignen sich beispielsweise Keramik Metall, insbesondere Halbleiter Edelmetall Glaser Kunststoffe kristalline Materialien bzw dünne Schichten des Tragers insbesondere der genannten Materialien, oder (bιo)molekulare Filamente wie Cellulose, Gerustproteme Bevorzugt sind Tragersy- steme wie in EP-A1 -0543550 oder W099/15893 und insbesondere wie in
U S 5,605 662 WO96/01836 U S 5 632 957 oder WO97/12030 beschrieben da hiermit Halbleiter-Chips hergestellt werden können mit deren Hilfe elektronisch kontrollierbar spezifische Bindereaktionen von Nukleinsäuren an spezifische, adressierbare Stellen in Form eines Arrays durchgeführt werden können Hierdurch kann in besonders vorteilhafter Weise die spezifisch aufzutrennende Nuklemsaure-
Population einer Probe an einem Nuklemsaure-Array mit den erfindungsgemaßen Nukleinsäuren auf dem Halbleiter-Chip mit Hilfe eines elektrischen Feldes hybridisiert und anschließend nicht- oder unspezifisch-gebundene Nukleinsäuren durch eine einfache Umkehrung der Polarität des elektrischen Feldes entfernt werden Ei- ne besonders bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Erkenπungssy- stems ist daher ein elektronischer Chip
Die Tragerung erfolgt im allgemeinen kovalent quasi-kovalent supramolekular oder physikalisch wie magnetisch (A R Shepard et al ( 1997) Nucleic Acids Res , 25, 3183-3185 Nr 15), im elektrischen Feld oder durch einen Molekularsieb vorzugsweise gemäß einem Verfahren wie in U S 5 605 662 WO96/01836 U S 5 632,957 WO97/12030 oder W099/15893 beschrieben
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemaßen Erkennungssystems bei dem eine Erkennungseinheit (Komponente (b)) enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur an einen Trager nach allgemein bekannten Verfahren gebunden wird
Des weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstel- lung eines Erkennungssystems, bei dem zum einen eine Erkennungseinheit (Komponente (b)) enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur an einen Trager (Komponente (a)) gebunden wird und zum anderen mindestens eine weitere Erkennungseinheit als Komponente (c) an die Erkennungseinheit gemäß Kompo- nente (b) spezifisch gebunden wird
Bei dem erfindungsgemaßen Verfahren werden vorzugsweise mehr als eine Erkennungseinheit als Komponente (b) bzw als Komponente (c) raumlich getrennt an den Trager (Komponente (c)) bzw an die Erkennungseinheit gemäß Komponente (b) beispielsweise in separaten Zellen gebunden Spezielle Herstellungsverfahren sind beispielsweise in EP-A1 -0543550 oder W099/15893 und insbesondere in U.S.5,605, 662, WO96/01836, U S 5,632.957 bzw EP-B1 -0373203 WO97/12030 oder WO98/31700 naher beschrieben
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Auftrennung einzelner Bestandteile in einer Probe, bei dem an mindestens eine an einen Trager (Komponente (a)) gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), die eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur enthalt, unter geeigneten Bedingungen mindestens ein Bestandteil der Probe gebunden wird, der zu der Komponente (b) bzw. zu der Komponente (c) komplementär ist
„Komplementär' im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß der Bestandtei der Probe spezifisch an die Komponente (b) oder an die Komponente (c) bindet Beispielsweise bindet eine Nuklemsaure spezifisch an eine andere Nuklemsaure, sofern die beiden Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen besitzen, um bei- spielsweise A-T bzw G-C Basenpaare im Fall von Desoxyribonukleinsäuren zu bilden Unter αem Begriff komplementär' versteht man jedoch auch spezifische Nu- kleinsaure-Protem- oder Protem-Protein-Bindungen, beispielsweise eine spezifische Antigeπ-Antikorper-Bmdung, oder die spezifische Bindung zwischen einem chemischen Wirkstoff und einer Nuklemsaure oder einem Protein
Bevorzugte Ausfuhruπgsformen des erfindungsgemaßen Verfahrens beinhalten ein Erkenπungssystem, das oben bereits naher beschrieben wurde In einem besonders bevorzugten erfindungsgemaßen Verfahren wird ein elektronischer Chip verwendet, da der Bestandteil der Probe, beispielsweise eine Nuklemsaure und/oder deren
Analoga oder Fusionen mit Hilfe eines elektrischen Feldes an die an einen Trager gebundene Erkennungseinheit beispielsweise eine komplementäre Nuklemsaure, in vorteilhafter Weise gebunden wird Eine genaue Beschreibung eines derartigen elektronischen Chips sowie seine Anwendung wird beispielsweise in EP-A1 - 0543550 oder W099/15893 und insbesondere in U S 5,605.662 WO96/01836
U.S.5, 632, 957 oder W097/12030 beschrieben
Der Bestandteil der Probe ist beispielsweise eine Nuklemsaure und/oder deren Analoga bzw Fusionen wie bereits oben naher beschrieben und vorzugsweise eine DNA, RNA insbesondere eine mRNA ein RNA-Puromycin-Deπvat oder eine Nu- kleinsaure-Protein-Fusioπ insbesondere eine RNA-Protem-Fusion vorzugsweise eine mRNA-Puromycin-Protein-Fusion, wie beispielsweise in WO98/31700 naher beschrieben, oder ein oder mehrere chemische Wirkstoffe
Beispielsweise wird in einer bevorzugten Ausfuhrungsform in einem ersten Schπtt eine mRNA-Population einer Probe an Nukleinsäuren des erfindungsgemaßen Erkennungssystems mit beispielsweise der Formel 3'-(X)7-8-(T7 15)- 5 wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosm Thymidin Guanosm oder Cytosin bedeutet vorzugsweise mit Hilfe eines elektrischen Feldes gebunden und gegebe- nenfalls in einem weiteren Schritt nicht- oder nicht-spezifisch gebundene Nuklem- sauren vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektrischen Feldes geringerer Feldstarke als im ersten Schritt entfernt
in einer anderen bevorzugten Ausfuhruπgsform wird in einem ersten Schritt an eine mRNA-Populatioπ einer Probe ein geeigneter Nuklemsaure-Liπker beispielsweise ein A27CC beispielsweise chemisch oder mit Hilfe einer geeigneten Ligase beispielsweise einer T4 DNA Ligase fusioniert in einem zweiten Schritt werden die mRNA-Lmker-Fusionen an Nukleinsäuren des erfindungsgemaßen Erkennuπgssy- stem mit beispielsweise der Formel 3 -(X)7 8-(T27GG)-5 wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adeπosm Thymidin Guanosin oder Cytosm bedeutet, vorzugsweise mit Hilfe eines elektrischen Feldes gebunden und gegebenenfalls werden in einem weiteren Schritt nicht- oder nicht-spezifisch gebundene Nukleinsäuren, vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektnscnen Feldes geringerer Feldstarke als im ersten Schritt, entfernt
Enthalt der Linker zusätzlich einen Proteinakzeptor, wie z B Puromycm, und wird in einem Zwischenschritt vor oder nach der Bindung der mRNA-Linker-Fusionen an das erfindungsgemaße Erkennungssystem eine Translationsreaktion durchgeführt, die zu mRNA-Linker-Protem-Fusionen fuhrt, so wird nach der Bindung der mRNA- Linker-Protein-Fusionen an das erfindungsgemaße Erkennungssystem ein Protein-
Profil der entsprechenden Population erhalten das weiter analysiert werden kann Einzelheiten zur Herstellung geeigneter Nukleiπsaure-Linker-Protem-Fusionen sind beispielsweise in WO98/31700 offenbart
Das erfindungsgemaße Verfahren kann zur Analyse der an das Erkennungssystem gebundenen Nuklemsaure der Probe verwendet werden Beispielsweise kann über das Nuklemsaure- und/oder Protein-Profil der Zustand verschiedener Zellen oder Gewebeproben analysiert bzw verglichen werden Zudem kann nachgewiesen werden, ob eine spezifische Nuklemsaure oder ein spezifisches Protein in einer Popula- tion vorhanden ist Auch können mögliche Expressionszustande verschiedener Zellen identifiziert werden Des weiteren können die gebundenen Nukleinsäuren oder Proteine mittels geeigneter Markieruπgsmethoden direkt oder indirekt nachgewiesen werden
Beispiele von Markieruπgsverfahren von Nukleinsäuren und/oder Proteinen sind chemische Enzym- Protein- radioaktive Isotopen- nicht-radioaktive Isotopen-, To- xm- Chemiiumineszens und/oder Fluoreszensmarkierung
Beispiele von dem Fachmann bekannten chemischen Substanzen, die sich für eine erfindungsgemaße chemische Markierung eignen sind Biotm Fluoresceinisothiocy- anat (FITC) oder Streptavidm
Beispiele von dem Fachmann bekannten Enzymen, die sich für eine erfindungsgemaße Enzymmarkierung beispielsweise in Form eines ELISA eignen, sind' Malathy- drogenase Staphylokokkennuklease, Δ-5-Steroιdιsomerase Alkoholdehydrogenase, α-Glycerolphosphat-dehydrogeπase Tπosephosphatisomerase, Peroxidase alkalische Phosphatase, Asparagmase, Glucoseoxidase, ß-Galactosidase, Urease, Kata- lase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase, Luciferase oder Ace- tylcholmesterase
Beispiele von dem Fachmann bekannten Proteinen oder Proteinfragmenten, die sich für eine erfindungsgemaße Proteinmarkierung eignen sind ein N- oder C-termmales
(HIS)6, ein Myc, ein FLAG, ein Hamaglutenin Glutathion-Transferase (GST), Intern mit einem Chitin, Maltosebmdendes Protein (MBP) oder Antikörper bzw Antigen- bmdende Teile von Antikörper z B Fv-Fragmente
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen die sich für eine erfindungsgemaße radioaktive Isotopenmarkierung eignen, sind 3H 125l, 131 l 32P 33P, 14C, 51Cr, 57To, 58CθA9Fe ^5Se 152Eu, 90Y 67Cu 217Cι, 21 lAt, 212Pb, 47Sc oder 109Pb
Beispiele von dem Fachmann bekannten Isotopen die sich für eine erfindungsge- maße nicht-radioaktive Isotopenmarkierung eignen sind 2H oder 13C Beispiele von dem Fachmann bekannten Toxmen. die sich für eine erfindungsgemäße Toxiπmarkierung eignen, sind: Diphtheπetoxin, Ricm oder Choleratoxm.
Beispiele von dem Fachmann bekannten chemilumiπeszenten Substanzen, die sich für eine erfindungsgemaße Chemilumineszensmarkierung eignen, sind: Luminal-
Markierung, Isolummal-Markierung. aromatische Acπdmester-Markierung, Oxalester- Markierung, Lucifeπn-Markierung, Acπdinsalz-Markierung. Imidazol-Markierung oder Aequoπn-Markierung
Beispiele von dem Fachmann bekannten fluoreszierenden Substanzen, die sich für eine erfindungsgemaße Fluoreszeπsmarkieruπg eignen, sind: 152Eu. Fluorescein, Isothiocyanat. Rhodam . Phycoerythπn, Phycocyanin. Allophycocyanin, o- Phthaldehyd, Green Fluorescent Protein (GFP) oder Fluorescamin.
Dem Fachmann sind weitere hier nicht aufgeführte Markierung bzw. Anaiyseverfah- ren, wie z. B. die Massenspektroskopie, bekannt, die auch im Sinne dieser Erfindung zur Markierung eingesetzt werden können.
Beispiele von dem Fachmann bekannten erfindungsgemaßen chemischen Modifika- tionen sind die Übertragung von Acetyl-, Phosphat-, und/oder Moπosachaπdgruppen
Gebundene Nukleinsäuren können auch über EST(expressed sequence tags)- Datenbanken, Northern Blot auf dem erfindungsgemaßen Erkennungssystem oder durch Sequenzierung an dem Erkennuπgssystem oder nach gezielter Freisetzung vorzugsweise nach vorheriger Amplifikation mittels PCR, RT-PCR oder Klonierung weiter identifiziert bzw. charakterisiert werden.
Zur Herstellung eines Protein-Profils einer Population kann die an das erfindungsgemaße Erkennungssystem gebundene Nuklemsaure entweder vor oder nach dem Ablösen vom Erkennungssystem translatiert und die Translationsprodukte anschlie- ßend entweder an demselben Erkennungssystem oder an einem anderen Erkeπ- nungssystem erneut an äquivalenten Positionen gebunden werden Das Protein- Profil kann vorzugsweise auch wie oben bereits naher beschrieben über RNA- Protem-Fusionen hergestellt werden
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung kann somit in besonders vorteilhafter Weise der physiologische Zustand einer Zelle und biologische Prozesse einer Zelle identifiziert, charakterisiert und überwacht werden
Protein-Profile von Populationen eignen sich insbesondere zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellularen oder künstlichen Bindepartner wie z B Proteinen Peptiden, Nukleinsäuren chemischen Wirkstoffen, vorzugsweise organischen Verbindungen, pharmakologisch wirksamen Verbindungen Pflanzenschutzwirkstoffen, Toxinen, wie z B Giften, carzmogenen und/oder teratogenen Substanzen, Herbizi- den, Fungiziden oder Pestiziden Einzelne Proteine können auch anhand ihrer Funktion, z B ihrer enzymatischen Aktivität, direkt am Erkennungssystem identifiziert und charakterisiert werden Desweiteren können gebundene Proteine in Form ihrer mRNA-Protein-Fusioneπ über die Sequenzierung der mRNA wie beispielsweise in WO98/31700 naher beschrieben charakterisiert werden
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung eines erfindungsgemaßen Erkennungssystems eines erfindungsgemaßen Verfahrens oder einer erfindungsgemaßen Erkennungseinheit enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisier- ten Struktur zum Auffinden und/oder zur Identifizierung bzw Charakterisierung von mindestens einem Bestandteil einer Probe insbesondere von Nukleinsäuren und/oder Proteinen einer Probe bzw zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellularen oder künstlichen Bindepartnern vorzugsweise von Proteinen Peptiden Nukleinsäuren chemischen Wirkstoffen vorzugsweise organischen Verbindungen pharmakologisch wirksamen Verbindungen Pflanzeπschutzwirkstoffen Toxinen insbesondere Giften, carzmogenen und/oder teratogenen Substanzen, Herbiziden, Fungiziden oder Pestiziden
Die Figur und das Beispiel sollen die Erfindung naher beschreiben ohne sie zu beschranken
Beschreibung der Figur
Fig 1 zeigt die Nukiemsauresequenzen von an einen Trager gebundenen DNA- Oligonukleotiden, die vom ß-Actin-Gen oder von S-9 RNA abgeleitet wurden und die beiden Fluoreszenzfarbstoff-markierten Proben
Beispiel
Es wurden zwei Satze von jeweils acht Biotin-markierten Oligonukleotiden hergestellt, die einen 13 Nukleotide-Iangen Thymidmschwanz (Region A) und einen je- weils unterschiedlichen Bereich von 7 Oligonukleotiden (Region B) gemäß Fig. 1 enthielten Die Region B wurde entweder vom 3'-UTR-Bereιch des ß-Actm-Gens oder von der S-9 RNA abgeleitet und enthielt entweder keine Mutation oder die an den entsprechenden Stellen fett gekennzeichneten Mutationen (siehe Fig 1 ) Zusätzlich wurden zwei Oligonukleotide synthetisiert die vom ß-Actin-Gen oder von der S-9 RNA abgeleitet wurden Diese Oligonukleotide enthalten komplementäre Bereiche zu den Biotin-markierten Oligonukleotiden und wurden entweder mit einem grünen (Cy3) oder mit einem roten (CY5) Fluoreszenzfarbstoff markiert
Zur Auftrennung der beiden Fluoreszenzfarbstoff-markierten Proben wurde ein 2x8- Positionen enthaltender Chip aus Halbleitermateπal verwendet, auf dem die Biotm- markierten Oligonukleotide fixiert wurden Nach erfolgter Hybridisierung der beiden Fluoreszenzfarbstoff-markierten Proben konnte nachgewiesen werden, daß die Bindung an den Chip in beiden Fallen am besten an der Position erfolgte, an der jeweils das Ohgonukleotid fixiert war, das eine perfekte Hybridisierung erlaubte

Claims

Patentansprüche
1 Erkenπungssystem enthaltend
(a) einen Trager (Komponente (a)) und (b) mindestens eine an den Trager gebundene Erkennungseinheit (Komponente (b)), dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Erkennungseinheit (Komponente (b)) eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur enthalt
2 Erkennungssystem nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Lange der Region (A) und/oder der Region (B) unabhängig voneinander ca 5 bis ca 80 Nukleotide vorzugsweise ca 5 bis ca 30 Nukleotide und insbesondere ca 10 bis ca 30 Nukleotide für die Region (A) und insbesondere ca 7-8 Nu- kleotide für die Region (B) ist
3 Erkennungssystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Region (A) aus einem poly-T-Strang, vorzugsweise einem T7 10-Strang, einem Nukleinsaure-Linker bekannter Sequenz vorzugsweise einem poly- T27GG-Strang, oder einem zu der Ribosomenbindestelle komplementären
Strang besteht
Erkennungssystem nach einem der Ansprüche 1 -3, dadurch gekennzeichnet, daß das Erkennungssystem mindestens eine weitere Erkennungseinheit (Komponente (c)) enthalt, die an die Erkennungseinheit gemäß Komponente
(b) spezifisch gebunden ist
Erkennungssystem nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (c) ausgewählt ist aus einer Nuklemsaure und/oder deren Analoga oder Fusionen einer Nuklemsaure mit einem Proteinakzeptor und/oder einer Nuklemsaure-Protem-Fusion, insbesondere aus einem Nuklemsaure- Puromycm-Deπvat und/oder einer Nukleinsaure-Puromycin-Protein-Fusion.
6 Erkennungssystem nach einem der Ansprüche 1 -5, dadurch gekennzeichnet, daß der Trager aus Keramik. Metall, insbesondere Halbleiter, Edelmetall, Glaser, Kunststoffe, kristalline Materialien bzw dünne Schichten des Tragers, insbesondere der genannten Materialien, oder (bιo)molekuiare Filamente wie Cellulose, Gerustproteme, oder aus einer Kombination der genannten Mate- nahen aufgebaut ist
7 Erkennungssystem nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß das Erkennungssystem ein elektronischer Chip ist
8. Verfahren zur Herstellung eines Erkennungssystems gemäß einem der An- spruche 1 -4 oder 6-7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Erkennungseinheit
(Komponente (b) enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur an einen Trager (Komponente (a)) gebunden wird
9 Verfahren zur Herstellung eines Erkennungssystems gemäß einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß zum einen eine Erkennungseinheit (Komponente (b)) enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur an einen Trager (Komponente (a)) gebunden wird und zum anderen mindestens eine weitere Erkennungseinheit als Komponente (c) an die Erkennungseinheit gemäß Komponente (b) spezifisch gebunden wird
10 Verfahren zur Herstellung eines Erkennungssystems nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als eine Erkennungsemheit als Kompo- nente (b) bzw als Komponente (c) räumlich getrennt an den Trager (Kompo- nente (c)) bzw an die Erkenπungsemheit gemäß Komponente (b) gebunden werden
Verfahren zur Auftrenπung einzelner Bestandteile in einer Probe, dadurch ge- kennzeichnet, daß an mindestens eine an einen Trager (Komponente (a)) gebundene Erkennuπgseinheit (Komponente (b)), die eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur enthalt, oder an mindestens eine an eine Komponente (b) spezifisch gebundene Erkenπungsemheit (Komponente (c)) unter geeigneten Bedingungen mindestens ein Bestandteil der Probe gebunden wird, der zu der Komponente (b) bzw zu der Komponente (c) komplementär
Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Lange der Region (A) und/oder der Region (B) unabhängig voneinander ca 5 bis ca 80
Nukleotide, vorzugsweise ca 5 bis ca 30 Nukleotide und insbesondere ca 10 bis ca 30 Nukleotide für die Region (A) und insbesondere ca 7-8 Nukleotide für die Region (B) ist
Verfahren nach Anspruch 1 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet daß die Region (A) aus einem poly-T-Strang, vorzugsweise einem T7 15-Strang, einem Nu- klemsaure-Linker bekannter Sequenz, vorzugsweise einem poly-T27GG- Strang, oder einem zu der Ribosomenbindestelle komplementären Strang besteht
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 -13, dadurch gekennzeichnet, daß der Trager aus Keramik, Metall, insbesondere Halbleiter, Edelmetall, Glaser, Kunststoffe kristalline Materialien bzw dünne Schichten des Tragers insbesondere der genannten Materialien, oder (bιo)molekulare Filameπte wie Cel- lulose, Gerustproteine oder aus einer Kombination der genannten Mateπalien aufgebaut ist Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 -14, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Verfahren an einem elektronischen Chip durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 -15, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil der Probe mit Hilfe eines elektrischen Feldes an die an einen Trager gebundene Erkennungseinheit als Komponente (b) oder als Komponente (c) gebunden wird
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 -16, dadurch gekennzeichnet, daß als Bestandteil der Probe eine Nuklemsaure und/oder deren Analoga oder
Fusionen, vorzugsweise eine DNA, RNA, insbesondere eine mRNA, ein RNA- Puromycm-Deπvat eine Nuklemsaure-Protem-Fusion, vorzugsweise eine RNA-Protein-Fusion, insbesondere eine mRNA-Puromycin-Protein-Fusion, bzw ein chemischer Wirkstoff verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt mindestens eine mRNA einer mRNA-Population einer Probe an mindestens eine an einen Trager gebundene Nuklemsaure der Formel 3'-(X)7-8-(T7 )-5', wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosm, Thymidin, Guanosm oder Cytosin bedeutet, vorzugsweise mit Hilfe eines elektrischen Feldes gebunden wird, und gegebenenfalls in einem weiteren Schritt nicht- oder nicht-spezifisch gebundene Nukleinsäuren, vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektrischen Feldes geringerer Feldstarke als im ersten Schritt, entfernt werden
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 -17, dadurch gekennzeichnet, daß in einem ersten Schritt an eine mRNA-Population einer Probe ein geeigneter Nuklemsaure-Lmker, vorzugsweise ein dA27dCdC-Lιnker, chemisch oder mit Hilfe einer geeigneten Ligase vorzugsweise einer T4 DNA Ligase fusioniert wird in einem zweiten Schritt die mRNA-Linker-Fusionen an Nukleinsäuren des erfindungsgemaßen Erkennungssystem mit vorzugsweise der Formel 3'- (X)7-8-(T27GG)-5', wobei X jedes beliebige Nukleotid ausgewählt aus Adenosm, Thymidiπ, Guanosm oder Cytosin bedeutet, vorzugsweise mit Hilfe eines elektrischen Feldes gebunden, und gegebenenfalls in einem weiteren Schπtt nicht- oder nicht-spezifisch gebundene Nukleinsäuren, vorzugsweise mit Hilfe eines umgepolten elektrischen Feldes geringerer Feldstarke als im zweiten Schπtt, entfernt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Zwischenschritt vor oder nach der Bindung der mRNA-Lmker-Fusionen an die an einen Trager gebundenen Nukleinsäuren eine Translationsreaktion durchgeführt wird, die zu mRNA-Linker-Protein-Fusionen fuhrt
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-20, dadurch gekennzeichnet, daß in einem weiteren Schritt die gebundene Nuklemsaure der Probe bzw. das durch die gebundene Nuklemsaure kodierte Protein bzw. der chemische Wirkstoff analysiert wird
22. Verwendung eines Erkennungssystems gemäß einem der Ansprüche 1-7, eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 11-21 oder einer Erkennungs- einheit enthaltend eine Region (A) mit einer definierten Struktur und eine zu der Region (A) benachbarte Region (B) mit einer randomisierten Struktur zum Auffinden und/oder zur Identifizierung bzw Charakterisierung von mindestens einem Bestandteil einer Probe, insbesondere von Nukleinsäuren und/oder Proteinen einer Probe bzw. zum Auffinden und/oder zur Identifizierung von zellularen oder kunstlichen Bindepartner, vorzugsweise von Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, chemischen Wirkstoffen, vorzugsweise organischen Verbindungen, pharmakologisch wirksamen Verbindungen Pflanzenschutzwirkstoffen, Toxinen, insbesondere Giften, carz ogenen und/oder teratogenen Substanzen. Herbiziden, Fungiziden oder Pestiziden
PCT/EP2000/002938 1999-05-25 2000-04-01 Erkennungssystem zur auftrennung von probenbestandteilen, seine herstellung und verwendung WO2000071747A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU36591/00A AU3659100A (en) 1999-05-25 2000-04-01 Detection system for separating constituents of a sample and production and use of the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19923966A DE19923966C2 (de) 1999-05-25 1999-05-25 Erkennungssystem zur Auftrennung von Probenbestandteilen, seine Herstellung und Verwendung
DE19923966.5 1999-05-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2000071747A2 true WO2000071747A2 (de) 2000-11-30
WO2000071747A3 WO2000071747A3 (de) 2001-06-14

Family

ID=7909147

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/002938 WO2000071747A2 (de) 1999-05-25 2000-04-01 Erkennungssystem zur auftrennung von probenbestandteilen, seine herstellung und verwendung
PCT/EP2000/004791 WO2000071749A2 (de) 1999-05-25 2000-05-25 Erkennungssystem zur untersuchung von molekülwechselwirkungen, seine herstellung und verwendung

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/004791 WO2000071749A2 (de) 1999-05-25 2000-05-25 Erkennungssystem zur untersuchung von molekülwechselwirkungen, seine herstellung und verwendung

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1185704A2 (de)
JP (1) JP2003500066A (de)
CN (1) CN1413262A (de)
AU (2) AU3659100A (de)
CA (1) CA2374438A1 (de)
CZ (1) CZ20014210A3 (de)
DE (1) DE19923966C2 (de)
EE (1) EE200100616A (de)
IL (1) IL146371A0 (de)
WO (2) WO2000071747A2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000056921A2 (de) * 1999-03-22 2000-09-28 Paul Cullen Nukleinsäurekombination

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040161741A1 (en) 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
JP2003299489A (ja) * 2002-02-08 2003-10-21 Mitsubishi Chemicals Corp 核酸構築物
WO2005012902A1 (ja) * 2003-07-31 2005-02-10 Genefield, Inc. 有用タンパク質のスクリーニング方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993017126A1 (en) * 1992-02-19 1993-09-02 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
WO1997027317A1 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis techniques
WO1997031256A2 (en) * 1996-02-09 1997-08-28 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
WO1998031700A1 (en) * 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US5795714A (en) * 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
US5849486A (en) * 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
DE19741716A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Adressierbares modulares Erkennungssystem, seine Herstellung und Verwendung
WO1999023492A1 (en) * 1997-10-31 1999-05-14 Sarnoff Corporation Method for enhancing fluorescence
WO1999051773A1 (en) * 1998-04-03 1999-10-14 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
WO2001016352A1 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Phylos, Inc. Methods for encoding and sorting in vitro translated proteins

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993017126A1 (en) * 1992-02-19 1993-09-02 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
US5795714A (en) * 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
US5849486A (en) * 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
WO1997027317A1 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis techniques
WO1997031256A2 (en) * 1996-02-09 1997-08-28 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
WO1998031700A1 (en) * 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
DE19741716A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Adressierbares modulares Erkennungssystem, seine Herstellung und Verwendung
WO1999023492A1 (en) * 1997-10-31 1999-05-14 Sarnoff Corporation Method for enhancing fluorescence
WO1999051773A1 (en) * 1998-04-03 1999-10-14 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
WO2001016352A1 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Phylos, Inc. Methods for encoding and sorting in vitro translated proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NIEMEYER C M ET AL: "OLIGONUCLEOTIDE-DIRECTED SELF-ASSEMBLY OF PROTEINS: SEMISYNTHETIC DNA-STREPTAVIDIN HYBRID MOLECULES AS CONNECTORS FOR THE GENERATION OF MACROSCOPIC ARRAYS AND THE CONSTRUCTION OF SUPRAMOLECULAR BIOCONJUGATES" NUCLEIC ACIDS RESEARCH,GB,OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, Bd. 22, Nr. 25, 1994, Seiten 5530-5539, XP000645135 ISSN: 0305-1048 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000056921A2 (de) * 1999-03-22 2000-09-28 Paul Cullen Nukleinsäurekombination
WO2000056921A3 (de) * 1999-03-22 2002-03-14 Paul Cullen Nukleinsäurekombination

Also Published As

Publication number Publication date
EP1185704A2 (de) 2002-03-13
AU3659100A (en) 2000-12-12
JP2003500066A (ja) 2003-01-07
WO2000071747A3 (de) 2001-06-14
WO2000071749A2 (de) 2000-11-30
EE200100616A (et) 2003-02-17
IL146371A0 (en) 2002-07-25
CN1413262A (zh) 2003-04-23
WO2000071749A3 (de) 2001-09-07
AU5676000A (en) 2000-12-12
CA2374438A1 (en) 2000-11-30
CZ20014210A3 (cs) 2002-06-12
DE19923966C2 (de) 2003-04-24
DE19923966A1 (de) 2000-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69535428T2 (de) Verfahren zum Auffinden von differentiel exprimierte Gene
DE68926302T2 (de) Nucleinsäuresonden, welche verbesserte molekularschalter enthalten, und analysemethoden und kits, bei welchen die sonden verwendet werden
EP0925373B1 (de) Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren unter ermittlung der masse
DE10296990B4 (de) Verwendung eines Biochips zur Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichem Syndrom
WO2002053773A2 (de) Verfahren zur bestimmung des hautstress oder der hautalterung in vitro
EP1018007B1 (de) Adressierbares modulares erkennungssystem, seine herstellung und verwendung
DE10155600B4 (de) Nukleinsäure-Array
DE19819889A1 (de) Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren
DE10149947A1 (de) Mikrofluidisches Extraktionsverfahren
DE60133321T2 (de) Methoden zur Detektion des mecA Gens beim methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus
DE10234524A1 (de) Nukleinsäurearray
WO2000071747A2 (de) Erkennungssystem zur auftrennung von probenbestandteilen, seine herstellung und verwendung
DE60221964T2 (de) Verfahren und testkit zur quantitativen bestimmung von variationen der polynukleotidmengen in zell- oder gewebeproben
DE19612356A1 (de) Optischer Nachweis von Hybridisierungs-Signalen
DE4317414C1 (de) Mittel zur komplexen Diagnostik der Genexpression und Verfahren zur Anwendung für die medizinische Diagnostik und die Genisolierung
WO2004059002A2 (de) Verfahren zur bestimmung der homeostase behaarter haut
DE102011056606B3 (de) Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen
EP1234056B1 (de) Dynamische bestimmung von analyten durch arrays auf inneren oberflächen
DE69918260T2 (de) Methoden zur Identifizierung und Validierung von funktionellen Zielen mittels Intrameren oder in vivo Selektion
DE10215367B4 (de) Verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen
EP1658380A2 (de) Verfahren zur bestimmung von haarzyklus-markern
DE19945765A1 (de) Nukleinsäurekombination
DE10033091A1 (de) Polymer-Chip
EP1208224A2 (de) Nukleinsäurekombination
DE10208794A1 (de) Verfahren zum Sortieren einsträngiger Nucleinsäuren

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AU BR CA JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AU BR CA JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP