CZ20014210A3

CZ20014210A3 - Detekční systém pro frakcionaci a identifikaci komponent vzorku, způsob jeho výroby a způsob frakcionace a identifikace komponent vzorku

Info

Publication number: CZ20014210A3
Application number: CZ20014210A
Authority: CZ
Inventors: Dirk Bökenkamp; Hans-Ulrich Hoppe; Petra Burgstaller; Dirk Konz; Uwe Wölk; Marc Pignot
Original assignee: Xzillion Gmbh & Co. Kg
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2002-06-12
Also published as: JP2003500066A; WO2000071747A3; DE19923966C2; WO2000071747A2; AU5676000A; IL146371A0; EP1185704A2; CA2374438A1; CN1413262A; DE19923966A1; WO2000071749A2; AU3659100A; WO2000071749A3; EE200100616A

Description

Detekční systém pro frakcionaci a identifikaci komponenn vzorku, způsob jeho výroby a způsob frakcionace a identifikace komponent vzorku

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká detekčního systému systém (viz obr. 1), který obsahuje nosič (komponenty (a)) a komponentu (b) detekční jednotky, která je vázaná na nosič a která obsahuje konstantní úsek (A) a sousední variabilní úsek (Β) , a komponentu (c), která obsahuje úsek komplementární k úseku (A) a (B) a na něj navázanou efektorovou jednotku, pokud je třeba, pak vhodným linkerem. Vynález se dále týká způsobu přípravy takového detekčního systému a také způsobu sledování molekulárních interakcí užitím takového detekčního systému.

Dosavadní stav techniky

V lidských buňkách je přibližně aktivních až 30 000 genů, které charakterizují daný stav buňky. Stav buňky může býr reprezentován např. zvýšeným buněčným dělením v případě rakovinné buňky nebo obecně v případě nemoci změnami metabolických aktivit. Aktivitu genu je možné stanovit na základě odpovídající mRNA jakožto transkripčního produktu nebo odpovídajícího proteinu jakožto translačního produktu. Takže profil mRNA nebo protein charakterizuje aktuální stav buňky.

Zcela nedávno se charakterizace zdravé a patologické buňky na základě jejího proteinového profilu stala velmi důležitým postupem pro výzkum nemocí a pro vyhledávání farmakologicky

Ί účinných sloučenin. Různé způsoby, které umožňují charakterizovat proteinový profil buněk již byly vyvinuty.

Aby bylo možné přímo charakterizovat proteinový profil v buňce, buněčné proteiny musí být frakcionovány. Účinným způsobem frakcionace je např. dvojrozměrná elektroforéza(2DE) na polyakrylamidovém gelu. Při této metodě se proteiny rozdělí v prvním rozměru podle jejich isoelektrického bodu (IP) a ve druhém rozměru podle jejich melekulové hmotnosti. Proteiny se pak vizualizují na 2D gelu barvením, např. typicky je na 2D gelu 1000 až 2000 proteinů jakožto skvrny. Tento výsledek je proteinový vzorec nebo profil, který je charakteristický pro každou buňku a který odráží konkrétní stav dané buňky z hlediska proteinů. Každý protein buňky má na 2D gelu polohu specifickou pro daný protein, takže je možné vytvořit proteomovou mapu buňky a tudíž i celého organizmu. Aby bylo možné stanovit molekulární příčiny buněčných modifikací, např. v průběhu nemoci, srovnají se proteinové profily zdravých a nemocných buněk, aby se detekovaly možné rozdíly. Takové srovnání může být provedeno např. automatickým způsobem pomocí vhodných počítačů (viz např. Wilkins, M.R. a kol. (ed.) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics. Springer Verlag, Heidelberg (1997) nebo Humphrey-Smith, I, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1216-1242). Tyto způsoby však mají podstatné nevýhody, neboť pro další analýzy detekovaných protein je třeba proteiny sekvencovat, avšak tato procedura je dosud stále velmi časově náročná a finančně nákladná.

Alternativním způsobem stanovení možných rozdílů v proteinovém profilu buňky je užití uskupení molekul (matrice), tj. matricových systémů, matric. Matrice (matrice) jsou tedy uspořádání imobilizovaný detekčních molekul, které jsou důležité pro simultánní stanovení analytů v analytických a diagnostických postupech. K příkladům patří matrice nukleových • · • · • · · · « • · • · I • · · · kyselin (viz např. Southern a kol. Genomics (1992) 13, 1008; U.S. Patent No. 5,632,957, WO97/27317 nebo EP-A1-0 543 550) nebo peptidové matrice (Fodor a kol., Nátuře 1993, 364, 555). Dokument WO96/01836 např. popisuje matrici DNA molekul s různými sekvencemi, která slouží k detekci genových úseků a tak umožňuje diagnostiku patogenních baktérií. Dokumenty U.S. 5,605,662, WO96/01836, U.S.5,632,957 a W097/12030 popisují polovodičové čipy a způsoby pro provádění specifických vazebných reakcí biologických sloučenin, jako jsou např. nukleové kyseliny nebo proteiny, na specificky adresovatelná místa ve formě matrice, a to elektronicky kontrolovatelným způsobem. Např. nukleové kyseliny ve vzorku jsou hybridizovány s matrici nukleových kyselin na polovodičovém čipu pomocí elektrického pole a nukleové kyseliny, které nejsou navázány nebo se váží nespecificky jsou snadno odstraněny jednoduše změnou polarity elektrického pole. Takto je možné detekovat neshodu (mismatch) v jediném páru baží precisním nastavením intenzity elektrického pole.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je proto detekční systém, který je sestaven z populace párujících fúzních molekul systém-efektor, a který může pomoci při identifikaci a charakterizaci této populace. Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob výzkumu interakcí efektor-vazebný partner.

Překvapivě bylo nyní zjištěno, že vhodný soubor detekčních jednotek, který obsahuje v každém případě úsek (A) mající konstantní sekvenci a úsek (B) přilehlý k úseku (A) a mající variabilní sekvenci je vhodný, užitím specifické hybridizace k párování fúzních molekul systém-efektor, pro charakterizaci efektorového profilu a pak identifikaci interakce efektorvazebný partner.

Předkládaný vynález se týká detekčního systému (Obr. 1) který obsahuje i) nosič (komponenta (a)) a ii) alespoň jednu detekční jednotku (komponenta (b) ) , výhodně pérovací systém navázaný na nosič, přičemž detekční jednotky obsahuje úsek (A) mající konstantní sekvenci a úsek (B) sousedící s úsekem (A) mající variabilní sekvenci, a iii) pérovací systém - efektorová fúzní molekula (komponenta (c) ) k nim navázaný, který obsahuje sekvenci komplementární k detekční jednotce (komponenta (b)).

Výhodně množství detekčních jednotek (komponent (b) ) vytváří na nosiči (komponenta (a)) matrici, kde každá poloha v matrici může být přiřazena definovanému variabilnímu úseku B komponenty (b). Při užití různých detekčních jednotek na povrchu nosiče lze sestavit speciální polohově-specifické detekční systémy (komponenty (a) až (c) ) .

Termín detekční jednotka (komponenta (b)) znamená podle předkládaného vynálezu nukleové kyseliny nebo jejich analogy, které zejména obsahují pentózy, výhodně pentopyranózu nebo pentofuranózu. Obecně je pentóza je vybrána ze skupiny obsahující: ribózu, arabinózu, lyxózu a xylózu. Příklady vhodných nukleových kyselin nebo jejich analogů jsou DNA, RNA, zejména mRNA nebo p-RNA (pyranosylofvá RNA, víz např. WO99/15539), aminocyklohexylová nukleové kyselina (CNA, viz např. W099/15509), peptidová nukleové kyselina (PNA, viz např. W092/20702 nebo Science (254), 1999, 1497-1500) nebo supramolekulární nanosystémy bez šroubovicové struktury, jak jsou popsány např. v dokumentu WO98/25943.

V této souvislosti detekční jednotka (komponenta (b) ) hybridizuje specificky s úseky komponenty (c) , které jsou komplementární k jejím úseků A a B. Příklady komponenty (c) • · ···· ·· ···· ·· · ♦ • · · · · · ·*·* ··· · · · ·· · «·· ««« ···· 4 • · ··«« · · ♦ · · · » · ·»··*· jsou zejména nukleová kyselina-derivát proteinového akceptoru, výhodně nukleová kyselina- derivát puromycinu, nebo tzv. fuzageny jako jsou např. fúzni molekuly nukleová kyselina protein, zejména fúzni molekuly nukleová kyselina-puromycinprotein. Zvláště výhodné jsou fúzni molekuly připravené z RNA a DNA, výhodně fúzované s puromycinem a proteinem. Termín protein podle předkládaného vynálezu zahrnuje proteiny a proteinové struktury, které jsou syntetizovány z posttranslačně nebo chemicky modifikovaných aminokyselin jako jsou např. glykosylované, fosforylované, halogenované nebo lipidem esterifikované aminokyseliny, a další, a také kratší peptidové aminokyselinové sekvence.

Termín konstantní sekvence (úsek A) znamená podle předkládaného vynálezu sekvenci, výhodně sekvenci nukleové kyseliny na bázi RNA, DNA nebo cDNA, nebo i jiné sekvence analogů nukleových kyselin jako jsou např. sekvence p-RNA, CNA nebo PNA, které jsou identické ve všech detekčních jednotkách (komponenta (b)).

Termín variabilní sekvenci (region B) znamená podle předkládaného vynálezu sekvenci, výhodně sekvenci nukleové kyseliny, jejíž sekvence v jednotlivých úsecích B jsou různé, ale známé. Variabilní sekvence nukleové kyseliny je např. sekvence nukleové kyseliny připravená náhodným způsobem nebo permutacemi jednotlivých nukleotidů.

Délka úseku (A) a/nebo úseku (B) jsou výhodně navzájem nezávislé a jsou přibližně 5 až přibližně 80 nukleotidů, výhodně přibližně 5 až přibližně 30 nukleotidů, a zejména přibližně 10 až přibližně 30 nukleotidů pro úsek (A) a zejména přibližně 7 až 8 nukleotidů pro úsek (B), přičemž zvláště výhodné nukleotidy jsou deoxyribonukleotidy (d), ribonukleotidy (r) nebo 2-hydroxymethylribonukleotidv (hmr). V provedeních vynálezu uvedených níže jsou sekvence nukleových kyselin bez jejich specifických koster, takže uvedené sekvence nukleových kyselin v každém případě provedení (c), (d) a (hmr). Navíc RNA podle předkládaného vynálezu mohou být syntetizovány syntetizovány nejen z ribonukleotidů, ale také z 2-hydroxymethylribonukleotidů.

Proteinový profil populace proteinů, např. populace proteinů buňky, je např. úspěšně charakterizován např. selekcí proteinů pomocí vhodných fúzí nukleová kyselina-protein. Dokument W098/31700 např. popisuje systém, ve kterém je proteinový akceptor, např. puromycin, vázaný na nukleovou kyselinu, výhodně výhodně mRNA, prostřednictvím vhodného linkeru (spojovacího členu). To umožňuje krátce před tím, než je ukončena translace mRNA do odpovídajícího proteinu, navázat kovalentně syntetizovaný protein na jeho kódující mRNA a tak ho podrobněji charakterizovat, linker, jeho sekvence je známa, je zvláště výhodný jako vazebný úsek k úseku (A) nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. Je tedy možné užít polyTi₅ řetězec jakožto úsek (A) pro navázání k linkeru fúze nukleové kyselina-protein, který má např. sekvenci A27CC. Pro přípravu fúze nukleová kyselina-protein linker obsahuje proteinový akceptor, např. tRNA aminokyselinový analog jako je např. puromycin, který je zvláště vhodný. Příklady srovnatelných systémů, které mohou být využity v předkládaném vynálezu jsou popsány v dokumentech DE19646372C1, WO98/16636, W091/05058, U.S.5,843,701, WO93/03172 nebo WO94/13623.

Aby bylo možné zahrnout všechny možné různé komponenty populace párujících fúzních molekul systém-efektor jako jsou např. fúze nukleových kyselin, zejména zejména fúze nukleová kyselina-puromycin-protein (fuzageny), variabilní sekvenci úseků (B) detekčních jednotek (komponenta (b) ) musí obsahovat všechny možné permutace. Výhodně užitá délka variabilní sekvence (úsek B) závisí v takovém případě na komplexitě * · ···· · · ··β · ·· fc · populace, která je, jak ukazuje zkušenost, relativně nízká u prokaryotických buněk a relativně vysoká u eukaryotických buněk. V lidské buňce je např. aktivních přibližně 30 000 genů, takže v takovém případě matrice obsahující všechny párující fúzní molekuly systém-efektor sekvence nukleové kyseliny úseku B mající délku 7 až 8 nukleotidů v permutované sekvenci je dostatečná k tomu, aby pokryla všechny geny lidské buňky. Počet možných permutací pro n-merní oligonukleotid je, jak známo, 4ⁿ, kde n je počet nukleotidů v oligonukleotidu. Pro identifikaci všech aktivních genů v lidské buňce je výhodná nukleová kyselina vázaná na nosič, která má následující vzorec: 3 ' - (X) ₇-8~úsek (A)-5 ’, kde X je jakýkoliv nukleotid vybraný z adenosinu, guanosinu cytosinu, thymidinu nebo uracilu.

patří keramika, skla, plasty,

Termín nosič znamená podle vynálezu materiál, zejména materiál čipu vytvořeného z polovodičů, který je v pevné nebo gelovité formě. K příkladům vhodných nosičových materiálů kovy, zejména polovodiče, ušlechtilé kovy, krystalický materiál nebo tenké vrstvy nosičového materiálu, zejména výše zmíněných materiálů, nebo (bio)molekulární vlákna jako je celulóza a strukturní proteiny. Výhodné jsou nosičové systémy popsané v EP-A10543550 nebo WO99/15893 a zejména v patentu U.S. 5,605,662, WO96/01836, Patentu U.S. 5,632,957 nebo W097/12030, jelikož mohou být užity pro výrobu polovodičových čipů, které lze užít k provádění specifických vazebných reakcí nukleových kyselin na specifická adresovatelná místa ve formě matrice, a to způsobem, který je elektronicky kontrolovatelný. To dovoluje zvláště výhodným způsobem provádět hybridizaci populace nukleových kyselin ve vzorku, který má být specificky frakcionován, k matrici nukleových kyselin s nukleovými kyselinami podle vynálezu na polovodičovém čipu za pomoci elektrického pole, a nukleové kyseliny, které se nenaváží nebo se váží nespecificky, jednoduše odstranit změnou polarity elektrického pole. Zvláště výhodným provedením detekčního systému podle vynálezu je tudíž elektronický čip.

Nosič je obecně nasycen (loaded) kovalentně, více či méně kovalentně, supramolekulárně nebo fyzikálně nebo také magneticky (A.R. Shepard a kol. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 3183-3185, No. 15), v elektrickém poli nebo prostřednictvím molekulového síta, výhodně způsoby popsanými v patentech U.S. 5,605,662, U.S. 5,632,957 a mezinárodních přihláškách WO96/01836, W097/12030 a WO99/15893.

Vynález se dále týká způsobu přípravy fúzních molekul systém-efektor, např. kterýžto způsob obsahuje následující kroky matrice párujících matrice fuzaqenů,

i) připraví se matrice tak, že se detekční jednotky (komponenty (b) ) obsahující úsek (A) mající konstantní sekvenci a úsek (B) přilehlý k úseku (A) a mající variabilní sekvenci přichytí na nosič (komponenta (a)), přičemž každá poloha v matrici může být přiřazena detekční jednotce mající specifický úsek B, a ii) detekční jednotky (komponenty (b) ) se s párujícími fúzními molekulami systém-efektor (c) ) které obsahují sekvence komplementární jednotce (komponenta (b)).

hybridizuj i (komponenty k detekční

Příprava komponent (c), např. generace fuzagenové knihovny (komponenty (c)), se provádí např. postupem podle mezinárodní přihlášky W098/31700 nebo podle publikace Roberts and Szostak (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1997).

Ve způsobu podle vynálezu se matrice připraví navázáním více než jednoho detekčního systému, který obsahuje komponentu (b) a komponentu (c) prostorově odděleně na nosič (komponentu • · « · • · · · β * (a)), např. v oddělených buňkách. V této souvislosti, detekční jednotky (komponenty (b) ) se mohou nanášet na povrch nosiče povrch přímo, např. prostřednictvím adsorpce nebo prostřednictvím oddělovačů (spacerů) , které jsou odborníkům známy. Specifické způsoby přípravy jsou popsány podrobně v publikacích např. EP-Al-0543550 nebo WO99/15893 a zejména U.S. 5, 605,662, WO96/01836, U.S. 5,632,957,EP-B 1-0373203, W097/12030 a W098/31700.

Výhodné jsou matrice, které zahrnují všechny možné permutace v úseku B detekčních jednotek (komponent (b) ) .

K výhodným provedením způsobů podle vynálezu patří detekční systémy, které již byly výše popsány. Ve zvláště výhodném způsobu podle vynálezu je detekční systém sestaven na elektronickém čipu, vzorková komponenta, např. fúzní nukleová kyselina, je výhodně vázána za pomoci elektrického pole k detekční jednotce (komponenta (b) ) navázané na nosič, např. úseku nukleové kyseliny komponenty (c) s komplementární sekvencí. Podrobný popis elektronického čipu takového typu je uveden např. v patentových dokumentech EP-Al-0543550 nebo WO99/15893, a zejména v U.S. 5,605,662, W096/01836, U.S.

5,632,957 a W097/12030.

Ve výhodném provedení je např. vhodná spojovací nukleová kyselina (linker), např. A27CC, v prvním kroku fúzována se vzorkem populace mRNA. Výhodně chemickým způsobem nebo pomocí vhodné ligázy, např. T4 DNA ligázy, ve druhém kroku se fúze mRNA-linker naváží na nukleové kyseliny detekční jednotky (komponenta (b) výhodně pomocí mající napr.

vzorec 3 (X) ₇_₈- (T₁₅)-5 ’, a to elektrického pole. Přitom X je jakýkoliv nukleotid vybraný z adenosinu, thymidinu, uracilu, guanosinu a cytosinu. V dalším kroku, pokud je to vhodné, se nukleové kyseliny, které nejsou navázány nebo jsou navázány nespecificky, odstraní, a to výhodně pomocí elektrického pole s opačnou polaritou a nižší intenzitou než v prvním kroku.

Vynález se dále týká způsobu frakcionace a identifikace párujících fúzních molekul systém-efektor, výhodně v komplexní směsi (Obr. 2), kterýžto způsob obsahuje následující kroky:

i) připraví se knihovna párujících fúzních molekul systémefektor (knihovna komponent (c) ) , výhodně fuzagenová knihovna, systém-efektor (komponenty (c)) se která obsahuje komponentu (a) a úsek (B) zahrnuje všechny možné permutace je specificky přiřazena ii) párující fúzní molekuly hybridizují na matrici, komponenty (b), jejichž permutace, přičemž každá jedné pozici v matrici, iii) identifikuje se pozice matrice, ve které se vytvořil komplex komponenty (b) a komponenty (c), iv) charakterizují se komplexy komponenty (b) a komponenty (c) identifikované podle bodu iii).

Příprava komponent (c)), např. generace fuzagenové knihovny (komponenty (c)) se provádí např. podle W098/31700 nebo Roberts and Szostak (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1997).

Zvláštní výhodou tohoto způsobu je to, že specifická konstrukce detekčních jednotek (komponenty (b) ) umožňuje identifikovat také párující molekuly systém-efektor, zejména fuzageny, ve kterých je úsek komplementární ke komponentě (b) neznámy. Toho je dosaženo na jedné straně délkou párujícího systému, která dovoluje stringentní hybridizaci, a na druhé straně délkou úseku B, kterou lze nastavit specifičnost hybridizace (která je ekvivalentní frakcionaci komponent (c)).

Komplexy vytvořené v průběhu v průběhu hybridizace detekčních jednotek (komponenta (b) ) a konkrétních komponent (c) mohou být detekovány prostřednictvím značení komponent (c) . Navíc pokud je užíván elektronický čip (komponenta (a)), pak mohou být komplexy identifikovány prostřednictvím redoxních procesů v blízkosti elektrody nebo na elektrodě nebo prostřednictvím fyzikálních vlastností jako je měření impedance a přímo proudu nebo např. v případě zlatých čipů prostřednictvím měření povrchové plasmonové resonance.

Obecně párující fúzní molekuly systém-efektor (komponenty (c)) jsou eluovány postupně z jednotlivých identifikovaných komplexů zrušením hybridizace s komponentou (b) např. tím, že se zvyšuje teplota nebo se mění lokální koncentrace solí, nebo se výhodně moduluje elektronické vazebné parametry. Takové fuzageny se pak dále charakterizují metodami molekulární biologie, které jsou odborníkům známy, jako je např. RT-PCR, a následné DNA sekvencování.

Tento způsob se výhodně užívá pro analýzu fuzagenových knihoven. Je tedy možné např. analyzovat a/nebo porovnávat, prostřednictvím takto stanoveného profilu nukleových kyselin a/nebo proteinů stav různých buněk nebo tkání ve vzorku. Navíc je možné detekovat, zda je ve sledované populaci přítomna specifická nukleová kyselina nebo specifický protein. Mohou být také identifikovány možné expresní stavy různých buněk.

Vynález se dále týká způsobu identifikace interakce jednoho nebo více vazebných partnerů (komponenty (d)), kteří mají afinitu ke specifickým efektorovým jednotkám komponent (c) (Obr. 3).

Termín afinita podle předkládaného vynálezu znamená, že efektorovou je zejména komponenta jednotkou vzorku specificky interaguje s komponenty (c) . Taková interakce specifická vazba typu protein-protein a/nebo protein-nukleová kyselina anebo také specifická vazba mezi chemicky aktivní látkou a proteinovým efektorem. Způsob podle vynálezu obsahuje následující kroky:

• 9 fúzních molekul systém-efektor se směsí látek, která obsahuje alespoň

i) matrice párujících inkubuje s analyzovanou jednu komponentu (d) , ii) identifikuje se poloha v matrici, ve které se vytvořil komplex komponenty (b) , komponenty (c) a komponenty (d), iii) charakterizují se komplexy komponenty (b), komponenty (c) a komponenty (d) identifikované podle bodu ii).

Obecně se vytvořený komplex detekuje prostřednictvím značení komponent (d). Kromě toho při užití elektronického čipu (komponenta (a)), mohou být komplexy např. identifikovány prostřednictvím redoxních procesů v blízkosti elektrody nebo na elektrodě nebo prostřednictvím fyzikálních vlastností jako je měření impedance a přímo proudu nebo např. v případě zlatých čipů prostřednictvím měření povrchové plasmonové resonance.

Obecně subkomplexy komponenty (c) a komponenty (d) jsou eluovány postupně z jednotlivých identifikovaných komplexů zrušením hybridizace s komponentou (b) např. tím, že se zvyšuje teplota nebo se mění lokální koncentrace solí, nebo se výhodně modulují elektronické vazebné parametry. Komponenty (d) se pak dále charakterizují analytickými metodami, které jsou odborníkům známy.

K příkladům způsobů značení nukleových kyselin, proteinů a/nebo chemicky aktivních látek patří chemické a/nebo fyzikálněchemické nebo enzymatické značení, značení s využitím proteinů, radioaktivních izotopů, neradioaktivnícxh izotopů, toxinů, a také chemiluminescenční a/nebo fluorescenční značená.

K příkladům chemických látek, které jsou odborníkovi známy, vhodných pro chemické značení podle vynálezu jsou např.: biotin, fluoresceinisothiokyanát (FITC) a streptavidin.

• •Μ • ·

K příkladům chemických modifikací podle vynálezu patří přenosy methylových, acetylových, fosfátových a/nebo monosacharidových skupin.

K příkladům odborníkovi známých enzymů, vhodných pro enzymatické značení podle vynálezu, např. ve formátu ELISA, patří např. maláthydrogenáza, stafylokoková nukleáza, Δ-5-steroidní izomeráza, alkoholdehydrogenáza, a-glycerolfosfátdehydrogenáza, triózafosfátisomeráza, peroxidáza, alkalická fosfatáza, asparagináza, glukózaoxidáza, β-galaktosidáza, ureáza, kataláza, glukóza-6-fosfátdehydrogenáza, glukoamyláza, luciferáza a acetylcholinesteráza.

K příkladům proteinů nebo proteinových fragmentů, které jsou odborníkům známy a jsou vhodné pro proteinové značení podle vynálezu, např. N- nebo C-koncový (HIS)6, myc, FLAG, E značka (E tag), Střep značka (Střep tag), hemagglutinin, glutathiontransferáza (GST), intein s chitinem, protein vázající maltózu (MBP) nebo protilátky a části protilátek vázající antigen, např. fragmenty Fv.

K příkladům izotopů, které jsou odborníkům známy a jsou vhodné pro radioaktivní značení podle vynálezu, patří např. ³H, ¹²⁵I; ¹³¹I, ³²P, ³³P, ³⁵S ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc a ¹⁰⁹Pb.

K příkladům izotopů, které jsou odborníkům známy a jsou vhodné pro neradioaktivní značení podle vynálezu, patří např. ²H nebo ¹³C.

K příkladům toxinů, které jsou odborníkům známy a jsou vhodné pro značení pomocí toxinů podle vynálezu, patří např. difterický toxin, ricin cholerový toxin.

K příkladům chemiluminescenčních látek, které jsou odborníkům známy a jsou vhodné pro chemiluminescenční značení podle • » · · · · · ··· ·· · · · · · ······ vynálezu, patří např. značení užitím luminolu, isoluminolu, aromatických akridinových esterů, esterů kyseliny oxalové, luciferinu, akridinových solí, imidazolu nebo ekvorinu.

K příkladům fluorescenčních látek, které jsou odborníkům známy a jsou vhodné pro fluorescenční značení podle vynálezu, patří např. ¹⁵²Eu, fluorescein, isothiokyanát, rhodamin, fykoerytrin, fykokyanin, allofykkcyanin, o-ftalaldehyd, Cy3, CyS, zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho varianty (YFP, RFP) nebo fluorescamin.

Navázané nukleové kyseliny mohou být identifikovány nebo charakterizována dále prostřednictvím databází EST klonů (expressed sequence tags), Northern přenosem na detekční systém podle vynálezu nebo sekvencováním na detekčním systému nebo po specifickém uvolnění, výhodně po předchozí amplifikaci s využitím PCR, RT-PCR nebo klonování.

Odborníkovi jsou známy další metody značení nebo analytické metody zde zmiňované, jako je např. hmotová spektrometrie, spektrometrie NMR, kalorimetrie nebo potenciometrie, které mohou být také využity pro značení podle vynálezu.

Pomocí předkládaného vynálezu je zvláště výhodné identifikovat, charakterizovat a monitorovat fyziologický stav buňky a biologické procesy probíhající v buňce.

Předkládaný vynález se tudíž týká také užití detekčního systému podle vynálezu a způsobu užití detekční jednotky, která obsahuje úsek (A) mající konstantní strukturu a úsek (B) přiléhající k úseku (A) a mající variabilní strukturu, pro vyhledání a/nebo identifikaci a/nebo charakterizaci alespoň jedné komponenty vzorku (komponenta (d) ) , zejména nukleových kyselin nebo proteinů vzorku, nebo pro nalezení a/nebo identifikaci buněčných nebo arteficiálních vazebných partnerů, výhodně proteinů, peptidů, nukleových kyselin chemicky aktivních látek, výhodně organických sloučenin, farmakologicky • · účinných sloučenin, agens účinných pro ochranu rostlin, toxinů, zejména jedů, karcinogenních a/nebo teratogenních látek, herbicidů, fungicidů nebo pesticidů.

V této souvislosti se jeví jako velmi zajímavá možnost zkoumat interakce transkripčních faktorů, represorů nebo enhancerů, nebo zkoumat interakce enzymů jako jsou např. kinázy, fosfatázy, GTPázy, esterázy, glykosylázy, lipázy, oxidázy, reduktázy, hydrolázy, isomerázy nebo ligázy s jejich substráty nebo jejich regulátory jako např. induktory nebo druhými posly (second messengers) jako cAMP nebo cGMP. Dalšími předměty takového zkoumání jsou receptory a jejich vazební partneři, jako např. hormony a cytokiny.

Jestliže je např. celá populace genů exprimovaných v buňce jednoho typu je reprezentována na matrici detekčního systému podle vynálezu jejich fuzageny (jako komponenta (c)), vazební partneři jednotlivých proteinů (komponenta (d)) mohou být identifikováni jako skvrny na matrici prostřednictvím přímého značení, např. značení pomocí izotopu ³⁵S.

Dále je možné identifikovat vazebné partnery komponenty (d) , výhodně proteinu, pomocí značené protilátky komponenty (d) v sendvičovém uspořádání (sandwich assay). Zvláštní výhodou tohoto způsobu je fakt, že je tak možné specificky identifikovat specifické interakce komponenty (d) z celého poolu (velké skupiny) interagujicích látek, např. v buněčném extraktu.

Navíc je také možné zkoumat působení kofaktorů, aktivátorů a inhibitorů na interakce efektorů a komponent (d) tím, že se postupně přidávají jednotlivé faktory.

Další důležitou aplikační oblastí matric detekčních systémů je analýza profilů enzymatické aktivity. Tak např. je možné identifikovat jednoduchým způsobem pomocí takové matrice ve • « • · · · vorku substráty kinázy, která užívá AT³²P jako donor fosfátové skupiny.

Jestliže matrice obsahují např. fuzageny s glykogensyntázou a/nebo kinázou fosforylázy jako efektorem, je možné zkoumat v in vitro testu na matrici působení efektorů jako substrátu, např. pro proteinkinázu, která představuje důležitou část metabolizmu glykogenu. Pomocí takového testu in vitro je možné ukázat např. to, že proteinkináza je aktivována přidáním cAMP, s ohledem na fosforylaci obou dvou efektorů. Navíc je možné zkoumat odstranění odpovídajících fosfátových skupin u jednotlivých efektorů, např. přidáním proteinfosfatázy 1.

Vynález déle se týká konjugátů, které systém, který zahrnuje komponenty (a) až komponentu (d) a pokud je to vhodné, obsahují detekční (c), alespoň jednu dále látky např.

interagující s komponentou (d) , výhodně protilátky komponenty (d) .

Výhodné jsou to konjugáty, které obsahují fuzageny jakožto komponentu (c).

Konjugáty obsažené v komponentě (d) jsou výhodně proteiny, peptidy, zejména transkripční faktory, receptory, enzymy a/nebo chemicky aktivní látky, výhodně organické sloučeniny, farmakologicky účinné sloučeniny, hormony, agens účinná k ochranně rostlin, toxiny, zejména jedy, karcinogenní a/nebo teratogenní látky, herbicidy, fungicidy a/nebo pesticidy.

Popis obrázků

Následující obrázky slouží k podrobnějšímu popisu vynálezu, aniž by jakkoliv omezovaly jeho rozsah.

Obr. 1 popisuje schématicky detekční systém podle vynálezu, který obsahuje nosič ((1) komponenta (a)) a komponentu (b) , detekční jednotku (2) vázanou na nosič, která může být vázána » * « · • * • · · · ··· ···· · ♦ · • · · · · · · ······ na povrch nosiče prostřednictvím spaceru (3), a která dále obsahuje konstantní úsek (A) (4) a sousední variabilní úsek (B) (5), a dále komponentu (c) (6), která obsahuje úsek, který je komplementární k úseku (A) (4) a (B) (5) a který je vytvořen z částí, a sice z vhodného linkeru, např. linkeru (8) nukleové kyseliny obsahující puromycinu (7), a nukleové kyseliny, zde RNA (9), vázané k linkeru. Efektorová jednotka (10) je vázána na linker nukleová kyselina-puromycin (7, 8).

Obr. 2 popisuje schématicky identifikaci komplexu, který obsahuje komponenty (a) až (c), pomocí značky (11), která je součástí komponenty (c).

Obr. 3 popisuje schématicky identifikaci komplexu, který obsahuje komponenty (a) až (d) , pomocí značky, která je např. součástí komponenty (d) (12), která je zde ukázána pro příklad jako protilátka k efektoru.

Dále je předkládaný vynález podrobněji popsán a vysvětlen formou příkladů, které však nijak neomezují jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava fúzního FLAG, MYC, STŘEP skleněného čipu

Povrch skleněného čipu byl silanizován nejdříve tím, že se standardní podložní sklíčko odmastilo v acetonu v ultrazvukové lázni 5 minut (pomůckou byl držák sklíček pro barvení mikrobiologických preparátů). Po usušení na vzduchu byla sklíčka ošetřena roztokem 0,1 M NaOH v ultrazvukové lázni opět 5 minut.

* » · t « ·

9 9 99 9

99

Pak následovalo omytí v destilované vodě opět v ultrazvukové lázni po dalších 5 minut. Poslední zbytky NaOH byly odstraněny opakováním mytí v destilované vodě. Pak následoval krok ošetření sílaném (silanizace). Pro tento účel byl připraven 2 až 3% roztok (3-glycidyloxypropyl)trimethoxysilanu v 95% vodném ethanolu (ethanol:voda 95:5, objemově). Ethanolový roztok silanu byl upraven na pH 4,9 až 5,2 pomocí koncentrované kyseliny octové. Po přidání a lOminutové hydrolýze byl povrch sklíček ošetřen připraveným roztokem silanu v ultrazvukové lázni 2 minuty.

Po opláchnutí 100% ethanolem v ultrazvukové lázni a oschnutí na vzduchu, byla silanizovaná sklíčka osušena 20 minut při 80°C. pak bylo možné imobilízovat amino-modifikované detekční jednotky (komponenty b) na povrch silanizovaného skla.

Detekční jednotky (komponenty b) takto imobilizované na čipu byly syntetizovány standardním způsobem (viz níže) . RNA kódující epitopy FLAG, MYC a STŘEP byla připravena podle publikace Roberts and Szostak (Proč. Nati. Acad. Sci USA_, 1997) následujícím postupem: templátová DNA sekvence (SEKVENCE ID. Č. 1) byla amplifikována se dvěma oligonukleotidovými primery (SEKVENCE ID. Č. 2/3) v reakci PCR s Taq polymerázou (Promega, katalog, č. M 166 F) :

' -GATTACAAGGACGACGACGACAAGGAACAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGATCTGGCAATGTGGAGCCACCCGCAGTTTGAGAAA-3' (SEKVENCE ID. Č. 1) ’ -TAATACGACTCACTA.TAGGGACAATTACTAITTACAATTACAATGGATTACAAGGACGACGACGACAAGG-3' (SEKVENCE ID. Č. 2)

5'-AGCGGATGCTTTCTCAAACTGCGGGTGGCTCCAC-3' (SEKVENCE ID. Č. 3)

Výsledný dvoj řetězcový DNA produkt byl transkribován do odpovídající RNA sekvence (SEKVENCE ID. Č. 4) v in vitro transkripci (Promega, katalog, č. P 1300):

* · · ·

• · · · · ·« • · · · · » · « · • · · « · • · · * ·» t · ·»< · ' -GGACAAUUACUAUUUACAAUUACAAUGGAUUACAAGGACGACGACGACAAGGAACAGAAGCUGAUCUCCGAAGAGGAUCUGGCAAUGUGGAGCCACCCGCAGUUUGAGAAAGCAUCCGCU-3' (SEKVENCE ID. Č. 4).

Dále byl linker (SEKVENCE ID. Č. 5), který nese fosfátovou skupinu na svém 5’-konci a puromycinový zbytek (Pu) na svém 3'-konci ligován 3'-koncově k RNA kódující epitop (SEKVENCE ID. Č. 4): ligace byla provedena za pomoci T4 DNA ligázy (MBI, katalog, č. EL 0333) a dvou pomocných molekul (SEKVENCE ID. Č. 6/7), které byly smíchány v reakci v poměru 80:20%.

5' -AAAAAAAAAAAAAAAAAANFAAAAAAAACCPu-3' (SEKVENCE ID. Č. 5)

5'-GCGCGCTTTTTTTTTTAGCGGATGC-3' (SEKVENCE ID. Č. 6)

5'-GCGCGCNTTTTTTTTTAGCGGATGC-3' (SEKVENCE ID. Č. 7)

Navíc byl derivát fluoresceinu (NF, Interactiva) inkorporován do linkeru pomocí standardní syntézy DNA na pevné fázi, a tento derivát umožnil v případě specifické komplementární komponentami (b) detekovat prostřednictvím výskytu fluorescence.

hybridizace s vznik vazby

Ligační produkt, který obsahuje RNA (SEKVENCE ID. Č. 4) a linker (SEKVENCE ID. Č. 5) byl pak purifíkován z neligované RNA prostřednictvím denaturujičího TBE gelu s 6% močovinou.

Fuzagen, který obsahuje RNA (SEKVENCE ID. Č. 4), epitopkódující peptid (SEKVENCE ID. Č. 4) a linker (SEKVENCE ID. Č. 5) byl syntetizován postupem podle publikace Roberts and Szostak (Proč. Nati. Acad. Sci USA, 1997) v in vitro translační reakci (Promega, katalog, č. L 4960) a pak inkubací v translační směsi s MgCl2 (150 mM) a KC1 (530 mM).

MYC

MDYKDDDDKEQKLISEEDLAMWSHPQFEKASA (SEKVENCE ID. Č. 4)

FLAG

STŘEP ft · ·*· · »« ftftft* • * » » · ,· • » « · « * • » · « 9 · · ··· * ? « · ·· · ftft ·« homogenity

Pharmacia trep-Tactin

Syntetizovaný fuzagen byl pak purifikován do prostřednictvím oligo-d(T) celulózy (Amersham Biotech. Katalog, č. 27-5543-02) a pak užitím S Sepharose (IBA. Katalog, č. 2-1202-005).

Použité detekční jednotky (komponenty (b) ) obsahuji v každém případě konstantní úsek mající sekvenci 5'-T₁₅-3' (úsek A) a variabilní úsek (úsek B) složený z osmi nukleotidů. Pro komponenty (b) byly vybrány ID. Č. 8/9):

Komponenta (b)-l:

<-TTTTTTTTTTTTTTTAGCGGATG-3'

Komponenta (b)-2:

i-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGCGA-3' následující sekvence (SEKVENCE (SEKVENCE ID. Č. 8) (SEKVENCE ID. Č. 9)

Zde má komponenta (b)-1 uvnitř variabilního úseku B nukleotidovou sekvenci komplementární k molekule, která obsahuje RNA (SEKVENCE ID. Č. 4) a linker (SEKVENCE ID. Č. 5), zatímco komponenta (b)-2 nemá žádnou specifičnost pro cílovou sekvenci dané molekuly vzhledem k variabilnímu úseku B. komponenty (b) byly připraveny standardní syntézou DNA na pevné fázi. Pro imobilizaci prostřednictvím 3'-konce byl užit 3'-aminomodifkovaný C3 CPG nosič (Glen Research, katalog, č. 20-2950-10) a pro 5'-koncové navázání na povrch skla byl užit 5'-aminomodifikovaný C6 fosforamidit (Glen Research, katalog, č. 10-1906-90). Pro imobilizaci byl 50 μΜ roztok (v 0,1 M NaOH) komponent (b)-l/2 nanesen na povrch silanizovaného skla v pozici 1 a 2, v uvedeném pořadí. Po inkubaci alespoň 2 hodiny byl povrch sklíček oplachován 5 minut horkou vodou. Pak byl čip 10 minut promýván v pufru 5 x SSC.

Fuzagen, který byl fluorescenčně značen pomocí fluoresceinu v úseku polyA hybridizuje s komplementární cílovou sekvencí komponenty (b)-l (v poloze 1), když je fuzagen vnesen do pufru • » · · • · e «

		• « • *	• · » · · « · · • · · · · · *
21		• · • ·	• ···« ··» • «o ·· · · e···
5 x SCC a přenesen na čip, který	je	pak	překryt krycím
sklíčkem a inkubován 5 minut při 4°C.	Čip	pak	byl promyt 3 x

pufrem 5 x SSC při teplotě místnosti a byla měřena fluorescence fluoresceinu. Nakonec se opakovalo oplachování v pufru 0,5 x SSC a znovu byla odečtena intenzita fluorescence. Bylo ukázáno, že pouze v případě dokonalé hybridizace s komponentou (b)-1 bylo možné detekovat fluorescenční signál a že nedošlo k žádné interakci fuzagenu s nespecifickou sekvencí komponenty (b)-2.

Příklad 2

Příprava fúzního skleněného čipu FLAG, MYC, STŘEP pro detekci interakce protein-protein (detekci epitopu FLAG pomocí fluorescenčně značené protilátky anti-FLAG)

Povrch skleněného čipu byl silanizován nejdříve odmaštěním standardního podložního sklíčka v acetonu v ultrazvukové lázni 5 minut (za pomoci držáku pro barveni mikrobilogických preparátů). Po oschnutí na vzduchu byla sklíčka ošetřena roztokem 0,1 M NaOH v ultrazvukové lázni 5 minut.

Pak následovalo omytí v destilované vodě opět v ultrazvukové lázni po dalších 5 minut. Poslední zbytky NaOH byly odstraněny opakováním mytí v destilované vodě. Pak následoval krok ošetření silanem (silanizace). Pro tento účel byl připraven 2 až 3% roztok (3-glycidyloxypropyl)trimethoxysilanu v 95% vodném ethanolu (ethanol:voda 95:5, objemově). Ethanolový roztok sílánu byl upraven na pH 4,9 až 5,2 pomocí koncentrované kyseliny octové. Po přidání a lOminutové hydrolýze byl povrch sklíček ošetřen připraveným roztokem sílánu v ultrazvukové lázni 2 minuty.

Po opláchnutí 100% ethanolem v ultrazvukové lázni a oschnutí na vzduchu, byla silanizovaná sklíčka osušena 20 minut při 80°C. pak bylo možné imobilizovat amino-modifikované detekční jednotky (komponenty b) na povrch silanizovaného skla.

Komponenty b) takto imobilizované na čipu byly syntetizovány standardním způsobem (viz níže). RNA kódující epitopy FLAG, MYC a STŘEP byla připravena podle publikace Roberts and Szostak (Proč. Nati. Acad. Sci USA, 1997) následujícím postupem: templátová DNA sekvence (SEKVENCE ID. Č. 1) byla amplifikována se dvěma oligonukleotidovými primery (SEKVENCE ID. Č. 2/3) v reakci PCR s Taq polymerázou (Promega, katalog, č. M 166 F).

Dále byl linker (SEKVENCE ID. Č. 10), který nese fosfátovou skupinu na svém 5'-konci a puromycinový zbytek (Pu) na svém 3'-konci ligovén 3'-koncově k RNA kódující epitop (SEKVENCE ID. Č. 4): ligace byla provedena za pomoci T4 DNA ligázy (MBI, katalog, č. EL 0333) a dvou pomocných molekul (SEKVENCE ID. Č. 6/7), které byly smíchány v reakci v poměru 80:20%.

5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCPu-3' (SEKVENCE ID. Č. 10)

Ligační produkt, který obsahoval RNA (SEKVENCE ID. Č. 4) a linker (SEKVENCE ID. Č. 5) byl pak purifikován z neligované RNA prostřednictvím denaturujíčího TBE gelu s 6% močovinou.

Fuzagen obsahující RNA (SEKVENCE ID. Č. 4), epitop-kódující peptid (SEKVENCE ID. Č. 4) a linker (SEKVENCE ID. Č. 10) byl syntetizován postupem podle publikace Roberts and Szostak (Proč. Nati. Acad. Sci USA, 1997) v in vitro translační reakci (Promega, katalog, č. L 4960) a pak inkubací v translační směsi s MgCl₂ (150 mM) a KC1 (530 mM) .

• · · ·

Takto syntetizovaný fuzagen byl pak purifikován do homogenity prostřednictvím oligo-d(T) celulózy (Amersham Pharmacia Biotech. Katalog, č. 27-5543-02) a pak užitím Strep-Tactin Sepharose (IBA. Katalog, č. 2-1202-005).

Použité detekční jednotky (komponenty (b) ) obsahují v každém případě konstantní úsek mající sekvenci 5'-Ti5~3' (úsek A) a variabilní úsek (úsek B) složený z osmi nukleotidů. Pro komponenty (b) byly vybrány následující sekvence (SEKVENCE ID. Č. 8/9):

Komponenta (to)—1:

5-__TTTTTTTTTTTTTTTAGCGGATG-3’ (SEKVENCE ID. Č. 8)

Komponenta (to)—2:

5'-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGCGA-3' (SEKVENCE ID. Č. 9)

Zde má komponenta (b)-l uvnitř variabilního úseku B nukleotidovou sekvenci komplementární k molekule obsahující RNA (SEKVENCE ID. Č. 4) a linker (SEKVENCE ID. Č. 10), zatímco komponenta (b)-2 nemá žádnou specifičnost pro cílovou sekvenci dané molekuly vzhledem k variabilnímu úseku B. komponenty (b) byly připraveny standardní syntézou DNA na pevné fázi. Pro imobilizaci prostřednictvím 3'-konce byl užit 3'-aminomodifikovaný nosič C3 CPG (Glen Research, katalog, č. 20-2950-10) a pro 5'-koncové navázání na povrch skla byl užit 5'-aminomodifikátor C6 fosforamidit (Glen Research, katalog, č. 10-1906-90). Pro imobilizaci byl 50 μΜ roztok (v 0,1 M NaOH) komponent (b)-l/2 nanesen na povrch silanizovaného skla v pozicí 1 a 2, v uvedeném pořadí. Po inkubaci alespoň 2 hodiny byl povrch sklíček oplachován 5 minut horkou vodou. Pak byl čip 10 minut promýván v pufru 5 x SSC.

Fuzagen, který byl fluorescenčně značen pomocí fluoresceinu v úseku polyA hybridizoval s komplementární cílovou sekvencí komponenty (to)—1 (v poloze 1), když byl fuzagen vnesen do • · · · • · * » *

pak překryt krycím pak byl promyt 3 x přidal se roztok pufru 5 x SCC a přenesen na čip, který byl sklíčkem a inkubován 5 minut při 4°C. Čip pufrem 5 x SSC při teplotě místnosti, protilátky anti-FLAG (Sigma Immunochemicals, katalog, č. F 3040), která byla fluorescenčně označena (Cy5 Ab Labelling Kit, Amersham Pharmacia Biotech., katalog, č. PA 35000) a byla změřena fluorescence. Nakonec se opakovalo oplachování v pufru 0,5 x SSC a znovu byla změřena intenzita fluorescence. Bylo ukázáno, že pouze v případě dokonalé hybridizace s komponentou (fc>)—1 byl detekován fluorescenční signál a že nedošlo k žádné interakci fuzagenu s nespecifickou sekvencí komponenty (b)-2.

Příklad 3

Příprava matrice fuzagenů obsahující dva různé fuzageny elektronicky adresovatelném čipu

Byly připraveny dva fuzageny (komponenty (c)) které mohou být navzájem zcela jednoznačně odlišeny a charakterizovány při hybridizaci na adresovatelném elektronickém čipu. Pro tento účel byl kromě fuzagenu (komponenta (c)-l) z příkladu 2, připraven jiný, odlišný fuzagen (komponenta (c)-2), který obsahuje RNA (SEKVENCE ID. Č. 15), epitop-kódujicí peptid a sice

ID. C. io;

Č. 11) pomocí dvou ID. Č. 12/13) a (SEKVENCE ID. C. 15) a linker (SEKVENCE syntézou z templátové DNA (SEKVENCE ID oligonukleotidových primerů (SEKVENCE podpůrné sekvence (SEKVENCE ID. Č. 14):

5'-GGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGAACAGAAGCTGATCTCCGA AGAGGATCTGGCAATGTACAAGGACGACGACGACAAG-3' (SEKVENCE ID. Č. 11) ’ -TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATGGGTGCGCCGGTGCC GTAT-3' (SEKVENCE ID. Č. 12) * · • · · « • · · · • · · r · · · · · · · · · · Λ ·**···

5'-CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACATTGCCAGATCCT-3 ' (SEKVENCE ID. Č.

13)

5’-TTTTTTTTTTCTTGTCGTC-3' (SEKVENCE ID. Č. 14)

5'-GGACAAUUACUAUUUACAAUUACAAUGGGUGCGCCGGUGCCGUAUCCGGAUCCGCUGGA ACCGCGUGAACAGAAGCUGAUCUCCGAAGAGGAUCUGGCAAUGUACAAGGACGACGACGACA AG-3' (SEKVENCE ID. Č. 15)

MYC

MGAPVPYPDPLEPREQKLISEEDLAMYKKDDDDKASA (SEKVENCE ID. Č. 15)

E-TAG FLAG

Komponenty (b) imobilizované na elektronickém čipu biotinem značené komponenty (b) (SEKVENCE ID. Č. 16 až které byly připraveny standardním postupem syntézy DNA.

byly 28) ,

Imobilizace na čipu může být provedena v každém případě buďto 3'-koncově nebo 5'-koncově. V uvedeném příkladu byly komponenty (b) navázány na povrch čipu prostřednictvím biotinové modifikace na 3'-konci. Pro tento účel byl užit při chemické syntéze DNA nosič biotinTEG CPG (Glen Research, katalog. č. 20-2955-10) a byly syntetizovány následující komponenty (b) mající příslušnou biotinylovou modifikaci, a navíc, obsahující 15 nukleotidů dlouhý thymidinový úsek (úsek A) a variabilní úsek z 8 nukleotidů (úsek B):

Komponenta (b)-3:

5.-TTTTTTTTTTTTTTTGGATGCTTBio-3'

Komponenta (b)-4:

i-TTTTTTTTTTTTTTTCTTGTCGTBio-3' 'SEKVENCE ID. C. 16) (SEKVENCE ID. C. 17)

Komponenta (b)-5:

₅.__{TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGCGABio}_3. (SEKVENCE ID. Č. 18

Komponenta (h)—3 a komponenta (b)-4 jsou komplementární k relevantní komponentě (c)-l a případně komponentě (c)-2, s ohledem na jejich konkrétní variabilní úsek B. Komponenta (b)-5 nemá vůbec žádnou specificitu ke komplementární cílové sekvenci komponenty (c)-l, a případně komponenty (c)-2, s ohledem na úsek B.

Komponenty (b)—3 až (b)-5 byly imobilizovány tak, že se připravil 1 μΜ roztok konkrétní komponenty (b) v 50 mM histidinovém pufru a naneslo se vždy 50 μΐ příslušné komponenty (b) na čip vyrobený z polovodičového materiálu, který obsahoval matrici 3x3 pozic. Imobilizace byla provedena při teplotě místnosti. Pozice na čipu (řádka, sloupec) byly obsazeny následujícím způsobem:

1,1: Komponenta (b)-3; 1,2: komponenta (b)-4; 2,1: komponenta (b)-3; 2,2: komponenta (b)-4; 3,1: komponenta (b)-5; 3,2: komponenta (b)—5; 1,3: komponenta (b)-3; 2,3: komponenta (b)4; 3,3: komponenta (b)-5.

Ligované nukleové kyseliny obsahující SEKVENCE ID. Č. 4+10 (komponenta (c)-3) a SEKVENCE ID. Č. 15 + 10 (komponenta (c)4) nebo fuzageny (komponenta (c)-l a komponenta (c)-2) byly hybridizovány po vnesení do 50 mM histidinového pufru a provedením konkrétního hybridizačního experimentu na příslušné pozici čipové matrice (řádka, sloupec) při teplotě místnosti:

1,1: Komponenta (c)-l; 1,2: komponenta (c)-2; 2,1: komponenta (c)-l; 2,2: komponenta (c)-2; 3,1: komponenta (c)-l; 3,2: komponenta (c)-2; 1,3: komponenta (c)-3; 2,3: komponenta (c)4; 3,3: žádná komponenta (c).

Hybridizační události, ke kterým došlo na čipu, pak byly charakterizovány aplikací protilátky anti-FLAG (Sigma Immunochemicals, katalog. č. F 3040), která specificky rozpoznává FLAG epitop a která byla předtím fluorescenčně značena (Cy5 Ab Labelling Kit, Amersham Pharmacia Biotech, • » · · • · · · « » · · · ·

Protilátka E27 9412-01), byla předtím katalog, č. PA 35000) na pozice čipu 1,1 a 1,2 Tag (Amersham Pharmacia Biotech, katalog, č která rozpoznává E-Tag epitop a která fluorescenčně značena (CySAb Labelling Kit, Amersham Pharmacia Biotech., katalog, č. PA 35000), byla nanesena na pozice čipu 2,1 a 2,2. Fluorescenční protilátka anti-FLAG nebo protilátka anti-E-tag byly naneseny na pozice čipu 3,1; 3,2; 1,3; 2,3 a 3,3, aby byly detekovány možné nespecifické vazebné události mezi protilátkami.

Ve všech případech byla odečtena intenzita fluorescence: bylo ukázáno pomoci fluorescenčně značené protilátky anti-FLAG použité jako fluorescenční sondy, že v případě dokonalé hybridizace komponent (b) s komplementárními komponentami (c)1/2 došlo ke specifické pozitivní vazebné události na čipu v pozici 1,1 a 1,2. V případě interakce protilátky anti-E-tag (v pozici 2,1 a 2,2), byla zvýšená intenzita fluorescence detekovatelná jen v pozici 2,2, která nese komponentu (c)-2, nesoucí epitop E-tag. Tyto experimenty jasně ukázaly, že nejdříve byly komponenty (c)-l a (c)-2 specificky rozpoznány relevantními protilátkami. Kontrolní dva fúzní komponentou experiment geny byly nejprve schopné zkoumal možnost, zda by nespecificky interagovat s (b), která nemá ve variabilním úseku (úsek B) vůbec žádnou komplementární část ke komponentám (c) (pozice 3,1 a 3,2). Po přidání protilátky anti-FLAG nebyla detekovatelná žádná fluorescence, takže lze předpokládat, že se žádná nespecifická hybridizace komponent (c) neuskutečnila. Navíc další kontrolní experiment vyloučil možnost, že protilátka anti-FLAG interaguje s dvoj řetězcovou nukleovou kyselinou. K ověřeni toho byly aplikovány relevantní komponenty (c)-3/4 bez peptidového epitopu na pozice 1,3 a 2,3, a přidání protilátky anti-FLAG nebo anti-E-Tag ukázalo, že nedošlo k žádné změně fluorescence. Nakonec bylo možné také ukázat, že fluorescenční protilátky anti-FLAG nebo anti-E-Tag » · * • · ·

4 * nemají žádnou afinitu k jednořetězcové komponentě (b) (experiment v pozici 3,3). Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:

Pozice Komponenta (c)/ Protilátka Fluorescenční na čipu komponenta (b) signál

1,1	1/3	FLAG	+
1/2	2/4	FLAG	+
2,1	1/3	E-Tag	-
2,2	2/4	E-Tag	+
3,1	1/5	FLAG	-
3,2	2/5	FLAG	-
1,3	3/3	FLAG	-
2,3	4/4	E-Tag	-
3,3	-/5	E-Tag	-

• · « · ···· ·* «··· « · · · · « » • · · · · · ··· fc «· ·· »»···

Pv Zoo/SEZNAM SEKVENCÍ <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 83 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Templát <400> 1 gattacaagg acgacgacga caaggaacag aagctgatct ccgaagagat ctggcaatgt 60 ggagccaccc gcagtttgag aaa 83 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer <400> 2 taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caatggatta caaggacgac 60 gacgacaagg ⁷⁰ <210> 3 <211> 34

<212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer <400> 3 agcggatgct ttctcaaact gcgggtggct ccac <210> 4 <211> 120 <212> RNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Transkript/protein <400> 4 ggacaauuac uauuuacaau uacaauggau uacaaggacg acgacgacaa ggaacagaag 60 cugaucuccg aagaggaucu ggcaaugugg agccacccgc aguuugagaa agcauccgcu 120 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Puromycin-linker <400> 5 aaaaaaaaaa aaaaaaaana aaaaaaacc <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Pomocná sekvence (splint) <400> 6 gcgcgctttt ttttttagcg gatgc .

• * · ···· *·· • » t ·· » ♦ 4 · · · « <210> 7 <2il> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Pomocná sekvence (splint) <400> 7 gcgcgcnttt ttttttagcg gatgc 25 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Komponenta (b)-l <400> 8 tttttttttt tttttagcgg atg

<210>	9
<211>	23
<212>	DNA
<213>	Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	umělé sekvence: Komponenta (b)-2

<400> 9 tttttttttt tttttgtagg ega
<210>	10
<211>	29
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: Puromycin-linker

··· · · · * · * · • · » « · «· ··«·· <400> 10 ? <3

3333333333 3333333CC <210> 11 <211> 96 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Templát <400> 11 ggtgcgccgg tgccgtatcc ggatccgctg gaaccgcgtg aacagaagct gatctccgaa 60 gaggatctgg caatgtacaa ggacgacgac gacaag 96 <210> 12 <211> 63 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer <400> 12 taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caatgggtgc gccggtgccg 60 tat 63 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Primer <400> 13 cctgtcgtcg tcgtccttgt acattgccag atcct <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Pomocná sekvence (splint) • · · ·

		33	« · • ·	• · · · · • « » · ·
<400>	14
tttttttttt cttgtcgtc			15
<210>	15
<211>	123
<212>	RNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis umělé sekvence:
	Transkript/Protein
<400>	15
ggacaauuac uauuuacaau uacaaugggu	gcgccggugc	cguauccgga	uccgcuggaa 60
ccgcgugaac agaagcugau cuccgaagag	gaucuggcaa	uguacaagga	cgacgacgac 120
aag				123
<210>	16
<211>	23
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: Komponenta (to)—3
<400>	16

tttttttttt tttttggatg ctt <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Komponenta (to; —4 <400> 17 tttttttttt tttttcttgt cgt 23 <210> 13 • · · · · · · · * · • 9 * · · ♦· ······ <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Komponenta (b)-5 <400> 18 tttttttttt tttttgtagg ega ²³ <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: epitop FLAG-MYC-STŘEP <400> 19

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu 15 10 15

Glu Asp Leu Ala Met Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Ala Ser Ala 20 25 30 <210> 20 <211> 36 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: epitop E-TAG-MYC-FLAG <400> 20

Met Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Glu Gin 15 10 15

Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Met Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 20 · 25 30 p/ Zoo 3

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY (staré)

1. Detekční systém vyznačující se tím, že obsahuj e

i) nosič (komponenta (a)) a ii) alespoň jednu detekční jednotku (komponenta (b)) navázanou na nosič, přičemž detekční jednotka obsahuje párující systém s úsekem (A) majícím konstantní sekvenci alespoň 5 nukleotidů a úsekem (B) sousedícím s úsekem (A) a majícím variabilní sekvenci, a iii) párující fúzní molekulu systém-efektor (komponenta (c) ) na ni navázanou, která obsahuje sekvenci komplementární k detekční jednotce (komponenta (b)).

2. Detekční systém podle nároku 1, v y z n a č u j ící s e tím, že úsek (A) obsahuje 5 až 80 nukleotidů nebo nukleotidových analogů, výhodně 5 až 30 nukleotidů nebo nukleotidových analogů a zejména 10 až 30 nukleotidů nebo nukleotidových analogů 3. Detekční systém podle nároku 1 nebo 2, vyznačující s e t í m, že úsek ( 'B) obsahuje 5 až 30, zejména5 až 10 a výhodně 7 až 8 nukleotidů nebo nukleotidových analogů. 4. Detekční systém podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačuj ící se tím, že nukleotidy j sou deoxyribonukleotidy (d) , ribonukleotidy (r) nebo 2-hydroxy-

methylribonukleotidy (hmr).

• · · ♦ > · •· ♦♦ ♦· ····

5. Detekční systém podle nároku 2, kde nukleotidové analogy jsou p-RNA, CNA nebo PNA monomery.

v/
6. Detekční systém podle kteréhokoliv z nároků 1 4, vyznačující se tím, že úsek (A) obsahuje řetězec polyT, výhodně řetězec T₇ až T₁₅.
7. Detekční systém podle kteréhokoliv z nároků 1 6, vyznačující se tím, že komponenta (c) je vybrána z fúzních molekul nukleová kyselina-proteinový akceptor a/nebo fúzních molekul nukleová kyselina-protein, zejména z derivátů nukleová kyselina-puromycin a/nebo fúzních molekul nukleová kyselina-puromycin-protein.

az
8. Detekční systém podle kteréhokoliv z nároků 1 Jzď 7, vyznačující se tím, kde nosič obsahuje keramiku, kov, zejména polovodiče, ušlechtilé kovy, skla, plasty, a to jako krystalické materiály nebo tenké vrstvy nosiče, zejména těchto materiálů, nebo (bio)molekulární vlákna jako je celulóza, strukturní proteiny, nebo kombinaci těchto materiálů.
9. Detekční systém podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že detekční systém je sestaven na elektronickém čipu.
10. Způsob výroby detekčního systému podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

i) připraví se matrice tak, že se na nosič uchytí detekční jednotky (komponenty (b)), které obsahují úsek (A) mající konstantní sekvenci alespoň 5 nukleotidů a úsek (B) sousedící s úsekem (A) mající variabilní sekvenci (komponenta (a)), přičemž každá pozice matrice může být přiřazena detekční jednotce mající určitý úsek B, a ii) hybridizují se detekční jednotky (komponenty (b) ) s párujícími fúzními molekulami systém-efektor (komponenty (c) ) , které obsahují sekvenci komplementární k detekční jednotce (komponenta (b)).
11. Způsob frakcionace a identifikace jednotlivých komponent v roztoku obsahujícím párující fúzni molekuly systém-efektor, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

i) připraví se knihovna párujících fúzních molekul systémefektor (knihovna komponent (c)), výhodně fuzagenová knihovna, ii) knihovna párujících fúzních molekul systém-efektor (knihovna komponent (c) ) se hybridizuje na matrici, které obsahuje komponenty (a) a komponenty (b) jejichž úseky (B) zahrnují všechny možné permutace, přičemž každou jednotlivou komponentu (b) je možné specificky přiřadit jedné pozici matrice, iii) identifikuje se pozice matrice, ve které se vytvořil komplex komponenty (b) a komponenty (c), iv) charakterizují se komplexy komponenty (b) a komponenty (c) identifikované podle kroku iii).
12. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačuj ící se tím, že se užijí komponenty (b) mající úsek (A) obsahující • » · · • ·

5 až 80 nukleotidů nebo nukleotidových analogů, výhodně 5 až 3 a zejména 10 až 30 nukleotidů nebo nukleotidových analogů.

13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, v y z n a č u jící se tím, že se užijí komponenty (b) mající úsek ( B) obsahující 5 až 30 nukleotidů, výhodně 7 nebo 8 nukleotidů.

14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13, vyznačuj ící se tím, že se užije úsek (A) obsahující řetězec polyT, výhodně řetězec T₇ až Tis, nebo řetězec komplementární k ribozomélnímu vazebnému místu • 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 14,

vyznačující se tím, že nosič obsahuje keramiku, kov, zejména polovodiče, ušlechtilé kovy, skla, plasty, a to jako krystalické materiály nebo tenké vrstvy nosiče, zejména těchto materiálů, nebo (bio)molekulární vlákna jako je celulóza, strukturní proteiny, nebo kombinaci těchto materiálů.

16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 15, v y z n a č u jící se tím, že se provádí na elektronickém čipu. 17. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 16, v y z n a č u jící se tím, komponenta vzorku se naváže

jako komponenta (b) nebo komponenta (c) pomocí elektrického pole k detekční jednotce navázané na nosič.

z nároků 10 až 17, že jako komponenta (c) se systém-eřektor sestavená analogů, výhodně DNA, RNA, a proteinu.

»»· ♦

18. Způsob podle kteréhokoliv vyznačující se tím, užije pérující fúzní molekula z nukleových kyselin a/nebo jejich zejména mRNA, derivátu RNA-puromycin

19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 18, vyznačující se tím, že se jedna fúzní molekula vzorku RNA-protein naváže na alespoň jednu nukleovou kyselinu navázanou na nosič a mající vzorec 3 '- (X) ₇_₈- (T₇_i₅)-5 ', kde X je jakýkoliv nukleotid vybraný z adenosinu, thymidinu, uracilu, guanosinu nebo cytosinu, výhodně pomocí elektrického pole, a pokud je to vhodné, v dalším kroku se odstraní nukleové kyseliny, které nejsou navázány nebo se váží nespecificky, výhodně pomocí elektrického pole, která má opačnou polaritu a nižší intenzitu než v předchozím kroku.

20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 19, vyznačující se tím, že v prvním kroku se vhodný linker nukleové kyseliny, výhodně linker dA₂7dCdC, fúzuje chemicky nebo pomocí vhodné ligázy, výhodně T4 DNA ligázy, s populací RNA vzorku, pak translatuje, a následně se indukuje tvorba fúze RNA-linker-protein, ve druhém kroku se fúzní molekula RNA-linker-protein naváže na nukleovou kyselinu detekčního systému podle vynálezu, která má výhodně vzorec 3'(X) 7_₈-(T27GG)-5', kde X je jakýkoliv nukleotid vybraný z adenosinu, thymidinu, uracilu, guanosinu nebo cytosinu, a v dalším kroku se odstraní nukleové kyseliny, které nejsou navázány nebo se váží nespecificky, a o pomocí elektrického pole s opačnou polaritou a nižší intenzitou než v prvním kroku.

21. Způsob identifikace interakce jednoho nebo partnerů (komponenty (d)) majících afinitu efektorovým jednotkám komponent (c), v y z se tím, že obsahuje kroky:

více vazebných ke specifickým načuj ící

i) inkubuje se matrice párujících fúzních molekul systémefektor s analyzovanou směsí látek, která obsahuje alespoň jednu komponentu (d), ii) identifikuje se pozice matrice, ve které se vytvořil komplex komponenty (b) mající konstantní úsek (A) s alespoň 5 nukleotidy a variabilní úsek (b) , komponenty (c) a komponenty (d), iii) charakterizují se komplexy tvořené komponentou (b), komponentou (c) a komponentou (d), které byly identifikovány v kroku ii).

22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že je určen pro vyhledávání a/nebo identifikaci a/nebo charakterizaci alespoň jedné komponenty vzorku, zejména nukleových kyselin vyhledávání a/nebo partnerů, chemicky vazebných kyselin, sloučenin, organických činidel na a/nebo proteinů vzorku, nebo pro identifikaci buněčných nebo umělých výhodně proteinů, peptidů, nukleových aktivních látek, výhodně farmakologicky účinných sloučenin, ochranu rostlin, toxinů, zejména jedů, karcinogenních a/nebo teratogenních látek, herbicidů, fungicidů nebo pesticidů.

23. Způsob podle nároků 21 a 22, vyznačuj ící tím, že alespoň jedna komponenta (d) je značena přímo.

• · · · fc· fcfc · · fcfc fcfcfcfc

24. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23, vyznačující se tím, alespoň jedna komponenta (d) vázaná na efektor se detekuje užitím značeného specifického vazebného partnera jako je např. protilátka.

25. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 21 až 24, vyznačující se tím, že interakce mezi efektorem a komponentou (d) podle kroku ii) se modifikuje přidáním další látky ovlivňující interakci, jako jsou např. kofaktory, koenzymy, aktivátory nebo inhibitory.

26. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 21 až 25, vyznačující se tím, že se určí profil enzymatické aktivity.

27. Konjugát obsahující detekční systém (komponenty (a) až (c)) a komponentu (d).

28. Konjugát podle nároku 27, kde komponenta (d) je fuzagen.

29. Konjugát podle nároku 27 nebo 28, kde komponenta (d) je protein, peptid, zejména transkripční faktor, receptor nebo enzym jako jsou např. kinázy, fosfatázy, GTPázy, esterázy, glykosylázy, lipázy, oxidázy, reduktázy, hydrolázy, isomerázy, isomerázy nebo ligázy společně s jejich substráty nebo regulátory jako jsou např. induktory, druzí poslové jako jsou cAMP nebo cGMP, a/nebo chemicky aktivní látky, výhodně organické sloučeniny, farmakologicky účinné sloučeniny, činidla na ochranu rostlin, toxiny, zejména jedy, karcinogenní a/nebo teratogenní látky, herbicidy, fungicidy nebo pesticidy.