JP2003500066A - 分子相互作用の研究用検出システムおよびその製造および使用 - Google Patents

分子相互作用の研究用検出システムおよびその製造および使用

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JP2003500066A JP2000620126A JP2000620126A JP2003500066A JP 2003500066 A JP2003500066 A JP 2003500066A JP 2000620126 A JP2000620126 A JP 2000620126A JP 2000620126 A JP2000620126 A JP 2000620126A JP 2003500066 A JP2003500066 A JP 2003500066A
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ベーケンカンプ，ディルク
ホッペ，ハンス−ウルリヒ
ブルクシュタラー，ペトラ
コンツ，ディルク
ヴェルク，ウーヴェ
ピグノート，マルク
ヴァーグナー，ペーター
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イクツィリオン・ゲーエムベーハー・ウント・コー・カーゲー
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Abstract

(57)【要約】 本発明は、（ａ）支持体（成分（ａ））および（ｂ）その支持体に結合した少なくとも一つの検出ユニット（成分（ｂ））、好ましくは、核酸であって、定常構造を有する領域（Ａ）および領域（Ａ）に隣接し且つ可変構造を有する領域（Ｂ）を含む該検出ユニット（成分（ｂ））を含む検出システム、試料中の個々の成分を分別する方法であって、少なくとも一つの試料成分を、適当な条件下において、支持体に結合した少なくとも一つの検出ユニット（成分（ｂ））に結合させる該方法、並びに試料の核酸および／またはタンパク質を発見するおよび／または識別するまたは特性決定するための、または細胞性または人工の結合パートナーを発見するおよび／または識別するための、本発明の検出システムおよび本発明の方法の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）（成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ａ））
、およびその支持体に結合していて且つ定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉ
ｏｎ）（Ａ）および隣接する可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）（Ｂ
）を含む検出ユニット成分（ｂ）、および領域（Ａ）および（Ｂ）に相補的な領
域および適宜、適当なリンカーによってそれに結合したエフェクターユニット（
ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｕｎｉｔ）を含む成分（ｃ）を含む検出システム（図１）に
関し、本発明は、更に、このような検出システムを製造する方法、およびそれら
検出システムを用いることによって分子相互作用を研究する方法に関する。
【０００２】 ヒト細胞において、概して、細胞の存在状態を特性決定する最大約３００００
までの遺伝子は活性である。細胞の状態は、例えば、癌細胞の場合は増加した細
胞分裂、または概して、疾患状態の場合は変更された代謝活性を示すことがあり
うる。遺伝子の活性は、ｍＲＮＡによって転写産物としてまたは該当するタンパ
ク質によって翻訳産物として決定することができる。したがって、細胞のｍＲＮ
Ａまたはタンパク質のプロフィールは、その存在状態を反映している。
【０００３】 ごく最近、健康なまたは不健全な（ｄｉｓｅａｓｅｄ）細胞のタンパク質プロ
フィールに基づく特性決定は、疾患を研究し且つ薬理学的活性化合物を発見する
のに極めて重要になってきている。細胞のタンパク質プロフィールを特性決定す
ることを可能にするいろいろな方法は、既に開発されている。
【０００４】 細胞中のタンパク質プロフィールを直接的に特性決定するためには、細胞タン
パク質を分別する必要がある。有効な方法は、例えば、二次元ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（２ＤＥ）である。この場合、タンパク質を、それらの等電点（
ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ：ＩＰ）によって一次元でおよびそれらの
分子量によって二次元で分別する。次に、それらタンパク質を、典型的な２Ｄゲ
ル中にスポットして染色される約１０００〜２０００種類のタンパク質を染色す
ることによって２Ｄゲル中で可視化する。その結果は、それぞれの細胞に有意で
あり且つ細胞の具体的な状態をタンパク質レベルで反映するタンパク質パターン
またはプロフィールである。細胞のタンパク質はそれぞれ、２Ｄゲル上にそのタ
ンパク質に特異的な位置を有するので、細胞に関して、結果的には、微生物全体
に関して“プロテオームマップ”を作成することは可能である。例えば、疾患経
過中の細胞の変更の分子的原因を決定するためには、健康なおよび不健全な細胞
のタンパク質プロフィールを、可能性のある相違を検出するために比較する。こ
の比較は、例えば、適当な計算機によって自動的に行うことができる（例えば、
Wilkins,M.R. et al.(eds) Proteome Research: New Frontiers in Functional
Genomics. Springer Verlag, Heidelberg (1997) または Humphrey-Smith,I. et
al.(1997) Electrophoresis 18,1216-1242 を参照されたい）。しかしながら、
この方法は、検出されるタンパク質の追加の分析のために、それらタンパク質を
タンパク質レベルで配列決定することが必要であるという実質的な欠点を有し、
しかもこの手順は、今なお時間がかかり且つ高価である。
【０００５】 細胞のタンパク質プロフィールにおいて可能性のある相違を決定するもう一つ
の方法は、“アレイ（ａｒｒａｙｓ）”、すなわち、マトリックスシステム（ｍ
ａｔｒｉｘ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる。アレイは、分析法および診断法におけ
る分析物の同時決定に重要な役割を果たす固定された検出種の配列である。例は
、核酸アレイ（例えば、Southern et al. Genomics (1992) 13,1008; 米国特許
第５，６３２，９５７号、ＷＯ９７／２７３１７号またはＥＰ−Ａ１−０５４３
５５０号を参照されたい）またはペプチドアレイ（Fodor et al., Nature 1993,
364,555）である。例えば、ＷＯ９６／０１８３６号は、異なった配列のＤＮＡ
分子のアレイを記載しているが、これは、遺伝子部分を検出するのに役立つので
、例えば、病原性細菌の診断をもたらす。特許公報Ｕ．Ｓ．５，６０５，６６２
号、ＷＯ９６／０１８３６号、Ｕ．Ｓ．５，６３２，９５７号およびＷＯ９７／
１２０３０号は、アレイの形の特定のアドレス可能な部位への、核酸またはタン
パク質のような生体化合物の特異的結合反応を電子制御可能な方法で行うのに用
いることができる半導体チップおよび方法を記載している。例えば、試料中の核
酸を、半導体チップ上の核酸アレイに電界（ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ）に
よってハイブリッド形成させた後、結合していないまたは特異的に結合していな
い核酸を、電界の極性を単純に逆にすることによって除去する。ここで、単一塩
基対の誤対合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を電界強さの正確な調整によって検出するこ
とが可能である。
【０００６】 本発明の目的は、対合システム−エフェクター融合分子（ｐａｉｒｉｎｇ ｓ
ｙｓｔｅｍ−ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の集団か
ら組み立てられていて且つその集団を識別し且つ特性決定するのを助けることが
できる検出システムを提供することであった。本発明のもう一つの目的は、エフ
ェクター結合パートナー相互作用を研究する方法である。
【０００７】 驚くべきことに、現在、それぞれの場合に、定常配列（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ）を有する領域（Ａ）および領域（Ａ）に隣接し且つ可変配列（
ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する領域（Ｂ）を含む検出ユニット
の適当な集合は、対合システム−エフェクター融合分子への特異的ハイブリダイ
ゼーションによって、エフェクタープロフィールを特性決定後、エフェクター結
合パートナー相互作用を識別するのに適しているということが判明している。
【０００８】 本発明は、検出システム（図１）であって、 （ｉ）支持体（成分（ａ））および （ii）その支持体に結合した少なくとも一つの検出ユニット（成分（ｂ））、
好ましくは、対合システムであって、定常配列を有する領域（Ａ）および領域（
Ａ）に隣接し且つ可変配列を有する領域（Ｂ）を含む検出ユニット、および （iii）それに結合し且つ検出ユニット（成分（ｂ））に相補的な配列を含む
対合システム−エフェクター融合分子（成分（ｃ）） を含む検出システムに関する。
【０００９】 好ましくは、複数の検出ユニット（成分（ｂ））は、支持体（成分（ａ））上
に、それぞれのアレイ位置が成分（ｂ）の規定の可変領域Ｂに割り当てられうる
アレイを形成する。そのアレイ表面上の異なった検出ユニットから開始して、特
定位置特異的検出システム（成分（ａ）〜（ｃ））を組み立てることができる。
【００１０】 検出ユニット（成分（ｂ））という用語は、本発明によれば、特に、ペントー
ス、好ましくは、ペントピラノースまたはペントフラノースを含有する核酸また
はそれらの類似体（ａｎａｌｏｇｓ）を意味する。概して、ペントースは、リボ
ース、アラビノース、リキソースまたはキシロースより選択される。適当な核酸
またはそれらの類似体の例は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡまたはｐ−ＲＮ
Ａ（ピラノシルＲＮＡ，例えば、ＷＯ９９／１５５３９号を参照されたい）、ア
ミノシクロヘキシル核酸（ＣＮＡ，例えば、ＷＯ９９／１５５０９号を参照され
たい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ，例えば、ＷＯ９２／２０７０２号 または Scie
nce (254),1999,1497-1500 を参照されたい）、または例えば、ＷＯ９８／２５
９４３号に記載のような非らせん超分子ナノシステムである。
【００１１】 これに関連して、検出ユニット（成分（ｂ））は、その領域ＡおよびＢに相補
的である成分（ｃ）の領域と特異的にハイブリッド形成する。成分（ｃ）の例は
、特に、核酸−タンパク質受容体誘導体、好ましくは、核酸−ピューロマイシン
誘導体、または核酸−タンパク質融合分子のようなフサジーン（ｆｕｓａｇｅｎ
ｅ）、特に、核酸−ピューロマイシン−タンパク質融合分子である。具体的には
、核酸ＲＮＡおよびＤＮＡから作られる、好ましくは、ピューロマイシン（ｐｕ
ｒｏｍｙｃｉｎ）およびタンパク質に融合した融合分子が好ましい。本発明によ
るタンパク質という用語は、例えば、グリコシル化、リン酸化、ハロゲン化、脂
質エステル化されたアミノ酸等のような翻訳後修飾または化学修飾されたアミノ
酸、更には、より短いペプチドアミノ酸配列から合成されるタンパク質またはタ
ンパク質構造を包含する。
【００１２】 “定常配列”（領域Ａ）という用語は、本発明によれば、全ての検出ユニット
（成分（ｂ））において一致する配列、好ましくは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡ基準の核酸配列、さもなければ、例えば、ｐ−ＲＮＡ、ＣＮＡまたはＰＮＡ
配列のような核酸類似体の配列を意味する。
【００１３】 “可変配列”（領域Ｂ）という用語は、本発明によれば、配列、好ましくは、
核酸配列を意味し、具体的な領域Ｂ中のその配列は、異なるが知られている。核
酸の可変配列は、例えば、個々のヌクレオチドのランダム変化（ｒａｎｄｏｍ
ｅｖｅｎｔｓ）または並べ換え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）によって形成される
その核酸配列である。
【００１４】 領域（Ａ）および／または領域（Ｂ）の長さは、好ましくは、互いに独立して
、領域（Ａ）については約５〜約８０ヌクレオチド、好ましくは、約５〜約３０
ヌクレオチド、そして特に、約１０〜約３０ヌクレオチド、そして領域（Ｂ）に
ついては、特に、７〜８ヌクレオチドであり、特に好ましい態様におけるヌクレ
オチドは、デオキシリボヌクレオチド（ｄ）、リボヌクレオチド（ｒ）または２
−ヒドロキシメチルリボヌクレオチド（ｈｍｒ）である。下の態様において、核
酸配列は、それらの具体的な主鎖を含むことなく述べられている。したがって、
述べられる核酸配列は、いずれの場合にも、（ｄ）、（ｒ）および（ｈｍｒ）の
態様を含む。更に、本発明によるＲＮＡは、リボヌクレオチドからのみならず、
２−ヒドロキシメチルリボヌクレオチドからも合成されてよい。
【００１５】 タンパク質集団、例えば、細胞のタンパク質集団のタンパク質プロフィールは
、例えば、適当な核酸−タンパク質融合によってタンパク質を選択することによ
り、うまく特性決定される。例えば、ＷＯ９８／３１７００号は、タンパク質受
容体、例えば、ピューロマイシンが、核酸、好ましくは、ｍＲＮＡに適当なリン
カーによって結合しているシステムを記載している。これは、該当するタンパク
質へのｍＲＮＡ翻訳が終了する直前に、合成されるタンパク質をそのエンコーデ
ィングｍＲＮＡに共有結合させ、したがって、それをより詳細に特性決定するこ
とを可能にする。配列が知られているリンカーは、本発明の核酸の領域（Ａ）へ
の結合領域として特に好都合に適している。例えば、ポリＴ15鎖を、例えば、配
列Ａ27ＣＣを有する核酸−タンパク質融合のリンカーへの結合のための領域（Ａ
）として用いることは可能である。核酸−タンパク質融合を生じさせるためには
、そのリンカーは、タンパク質受容体、例えば、特に適しているピューロマイシ
ンのようなｔＲＮＡアミノ酸類似体を含有してよい。本発明に用いることができ
る同じようなシステムの例は、ＤＥ１９６４６３７２Ｃ１号、ＷＯ９８／１６６
３６号、ＷＯ９１／０５０５８号、Ｕ．Ｓ．５，８４３，７０１号、ＷＯ９３／
０３１７２号またはＷＯ９４／１３６２３号に記載されている。
【００１６】 例えば、核酸融合、特に、核酸−ピューロマイシン−タンパク質融合（フサジ
ーン）のような対合システム−エフェクター融合分子の集団のいろいろな成分を
全て包含することができるためには、検出ユニット（成分（ｂ））の領域（Ｂ）
の可変配列は、可能な並べ換えを全て含有すべきである。可変領域（領域Ｂ）の
好ましく用いられる長さは、この場合、経験から分かるように、原核細胞で比較
的低く、真核細胞で比較的高い集団のコンプレキシティーに依る。ヒト細胞の場
合、例えば、約３００００の遺伝子が活性であるので、対合システム−エフェク
ター融合分子を全て含有するアレイの場合、並べ換えられた配列中の７〜８ヌク
レオチドの長さを有する領域Ｂ核酸配列は、ヒト細胞の活性遺伝子を全て包含す
るのに充分である。ｎマー（ｎ−ｍｅｒ）オリゴヌクレオチドに可能な並べ換え
の数は、知られているように４nであり、ここにおいて、ｎはオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチド数である。したがって、ヒト細胞の全ての活性遺伝子の識別に
関して、支持体に結合する核酸が好ましく、それは、次の式： ３’−（Ｘ）7-8−領域（Ａ）−５’ （式中、Ｘは、アデノシン、グアノシン、シトシン、チミジンまたはウラシルよ
り選択される任意のヌクレオチドである） を有する。
【００１７】 “支持体”という用語は、本発明によれば、材料、特に、固体、さもなければ
ゲル様状態で存在する半導体から成るチップ材料を意味する。適当な支持体材料
の例は、セラミック、金属、特に、半導体、貴金属、ガラス、プラスチック、結
晶性材料または支持体、特に、それら材料の薄層（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｍ
ａｔｅｒｉａｌｓ ｏｒ ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｐｐｏ
ｒｔ， ｉｎ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｏｆ ｓａｉｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）
、またはセルロースのような（生体）分子フィラメントおよび構造タンパク質で
ある。ＥＰ−Ａ１−０５４３５５０号またはＷＯ９９／１５８９３号、そして特
に、Ｕ．Ｓ．５，６０５，６６２号、ＷＯ９６／０１８３６号、Ｕ．Ｓ．５，６
３２，９５７号またはＷＯ９７／１２０３０号に記載の支持体システムが好まし
いが、それは、これらが、アレイの形の特定のアドレス可能な部位への、核酸の
特異的結合反応を電子制御可能な方法で行う場合に用いることができる半導体チ
ップを製造するのに用いることができるためである。これは、特異的に分別され
るべき試料の核酸集団を、特に好都合な方法で、半導体チップ上の本発明の核酸
を含む核酸アレイに電界によってハイブリッド形成させた後、結合していないま
たは特異的に結合していない核酸を、電界の極性を単純に逆にすることによって
除去することを可能にする。したがって、本発明の検出システムの特に好ましい
態様は、電子チップである。
【００１８】 その支持体は、概して、共有結合によって、多かれ少なかれ、共有結合によっ
て、超分子によってまたは物理的に、更には、磁気によって（A.R.Shepard et a
l. (1997) Nucleic Acids Res., 25,3183-3185,No.15）、電界中でまたはモレキ
ュラーシーブによって、好ましくは、Ｕ．Ｓ．５，６０５，６６２号、ＷＯ９６
／０１８３６号、Ｕ．Ｓ．５，６３２，９５７号、ＷＯ９７／１２０３０号また
はＷＯ９９／１５８９３号に記載の方法によって装填されている。
【００１９】 本発明は、更に、対合システム−エフェクター融合分子アレイ、例えば、フサ
ジーンアレイを製造する方法であって、次の処理工程 （ｉ）定常配列を有する領域（Ａ）および領域（Ａ）に隣接し且つ可変配列を
有する領域（Ｂ）を含む検出ユニット（成分（ｂ））を支持体（成分（ａ））に
結合することによるアレイの製造であって、ここにおいて、それぞれのアレイ位
置は、特定の領域Ｂを有する検出ユニットに割り当てることができる、および （ii）その検出ユニット（成分（ｂ））と、その検出ユニット（成分（ｂ））
に相補的な配列を含む対合システム−エフェクター融合分子（成分（ｃ））との
ハイブリダイゼーション を含む方法に関する。
【００２０】 例えば、フサジーンライブラリー（成分（ｃ））の作成のような、成分（ｃ）
の製造は、ＷＯ９８／３１７００号または Roberts and Szostak（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 1997）にしたがって行うことができる。
【００２１】 本発明の方法において、アレイは、例えば、別々の細胞中において、空間的に
隔てられた成分（ｂ）および成分（ｃ）を含む二つ以上の検出システムを支持体
（成分（ａ））に結合することによって製造される。これに関連して、検出ユニ
ット（成分（ｂ））は、支持体表面に直接的に、例えば、吸着によってまたは当
業者に知られているスペーサーによって適用することができる。具体的な製造方
法は、例えば、ＥＰ−Ａ１−０５４３５５０号またはＷＯ９９／１５８９３号、
そして特に、Ｕ．Ｓ．５，６０５，６６２号、ＷＯ９６／０１８３６号、Ｕ．Ｓ
．５，６３２，９５７号またはＥＰ−Ｂ１−０３７３２０３号、ＷＯ９７／１２
０３０号またはＷＯ９８／３１７００号に、より詳細に記載されている。
【００２２】 検出ユニット（成分（ｂ））の領域Ｂ中の可能な並べ換えを全て含むアレイが
好ましい。 本発明の方法の好ましい態様は、既に本明細書中の前により詳細に記載された
検出システムを含む。本発明の特に好ましい方法において、検出システムは、電
子チップ上に組み立てられていて、試料成分、例えば、核酸融合は、支持体に結
合した検出ユニット（成分（ｂ））、例えば、相補的配列を含む成分（ｃ）の核
酸領域に、電界によって好都合に結合している。この種類の電子チップおよびそ
の適用についての詳細な説明は、例えば、ＥＰ−Ａ１−０５４３５５０号または
ＷＯ９９／１５８９３号、そして特に、Ｕ．Ｓ．５，６０５，６６２号、ＷＯ９
６／０１８３６号、Ｕ．Ｓ．５，６３２，９５７号またはＷＯ９７／１２０３０
号に記載されている。
【００２３】 好ましい態様において、例えば、適当な核酸リンカー、例えば、Ａ27ＣＣを、
第一工程で、試料のｍＲＮＡ集団に、好ましくは、化学的にまたは適当なリガー
ゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって融合させ、そのｍＲＮＡ−リンカー
融合を、第二工程で、典型的な式３’−（Ｘ）7-8−（Ｔ15）−５’を有する検
出ユニット（成分（ｂ））の核酸に、好ましくは、電界によって結合する。ここ
において、Ｘは、アデノシン、チミジン、ウラシル、グアノシンまたはシトシン
より選択される任意のヌクレオチドである。適宜、追加の工程において、結合し
ていないまたは特異的に結合していない核酸を、好ましくは、逆の極性を有し且
つ第一工程の場合より低い電界強さを有する電界によって除去する。
【００２４】 本発明は、更に、対合システム−エフェクター融合分子を、好ましくは、複合
体混合物（図２）から分別し且つ識別する方法であって、次の処理工程、 （ｉ）対合システム−エフェクター融合分子ライブラリー（成分（ｃ）ライブ
ラリー）、好ましくは、フサジーンライブラリーの作成、 （ii）（成分（ａ））および領域（Ｂ）が可能な並べ換えを全て含む成分（ｂ
）を含むアレイ上の対合システム−エフェクター融合分子（成分（ｃ））のハイ
ブリダイゼーションであって、それぞれの並べ換えは一つのアレイ位置に具体的
に割り当てられているハイブリダイゼーション、 （iii）成分（ｂ）および成分（ｃ）の複合体が形成されているアレイ位置の
識別、 （iv）（iii）で識別される成分（ｂ）および成分（ｃ）の複合体の特性決定
を含む方法に関する。
【００２５】 例えば、フサジーンライブラリー（成分（ｃ））の作成のような成分（ｃ）の
製造は、ＷＯ９８／３１７００号または Roberts and Szostak（Proc.Natl.Acad
.Sci.USA, 1997）にしたがって行うことができる。
【００２６】 この方法の具体的な利点は、検出ユニット（成分（ｂ））の具体的な構築が、
成分（ｃ）に相補的な領域が知られていない対合システム−エフェクター融合分
子、特に、フサジーンを識別することも可能にするということである。これは、
一方では、ストリンジェントハイブリダイゼーションを可能にする対合システム
の長さによって、そしてもう一方では、ハイブリダイゼーション特異性（成分（
ｃ）の分別と等価である）を調整することができる領域Ｂの長さによって行われ
る。
【００２７】 検出ユニット（成分（ｂ））および具体的な成分（ｃ）のハイブリダイゼーシ
ョン中に形成される複合体は、成分（ｃ）の標識付によって検出することができ
る。更に、例えば、電子チップ（成分（ａ））を用いる場合、それら複合体は、
電極またはその付近での酸化還元過程によってまたはインピーダンスおよび直流
の測定値のような物理的パラメーターによって、または金チップの場合、例えば
、表面プラスモン共鳴測定値（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａ
ｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）によって識別することができる。
【００２８】 概して、対合システム−エフェクター融合分子（成分（ｃ））は、個々の識別
される複合体から、例えば、温度を上昇させること、局所塩濃度を変化させるこ
と、または好ましくは、電子結合パラメーターを調節することによる成分（ｂ）
へのハイブリダイゼーションの中断を用いて、逐次的に溶離される。次に、これ
らフサジーンを、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよび引き続きのＤＮＡ配列決定のよう
な当業者に知られている分子生物学的方法によって特性決定する。
【００２９】 その方法は、フサジーンライブラリーを分析するのに好ましく用いられる。例
えば、この方法で決定される核酸および／またはタンパク質プロフィールによっ
て、いろいろな細胞または組織試料の状態を分析しおよび／または比較すること
が可能である。更に、特定の核酸または特定のタンパク質が集団中に存在するか
どうか検出することが可能である。いろいろな細胞の可能な発現状態を識別する
こともできる。
【００３０】 本発明は、更に、成分（ｃ）の特定のエフェクターユニット（図３）に親和性
を有する一つまたはそれ以上の結合パートナー（成分（ｄ））の相互作用を識別
する方法に関する。
【００３１】 本発明による“親和性”とは、試料成分が、成分（ｃ）のエフェクターユニッ
トと特異的に相互作用することを意味する。このような相互作用は、具体的には
、特異的タンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−核酸結合、そして
更には、化学的活性物質とタンパク質エフェクターとの特異的結合であってよい
。
【００３２】 その方法は、次の処理工程、 （ｉ）対合システム−エフェクター融合分子アレイと、少なくとも一つの成分
（ｄ）を含む分析される物質混合物とのインキュベーション、 （ii）成分（ｂ）、成分（ｃ）および成分（ｄ）の複合体が形成されているア
レイ位置の識別、 （iii）（ii）で識別される成分（ｂ）、成分（ｃ）および成分（ｄ）の複合
体の特性決定 を含む。
【００３３】 概して、形成される複合体は、標識［空隙（ｌａｃｕｎａ）］成分（ｄ）によ
って検出される。更に、例えば、電子チップ（成分（ａ））を用いる場合、それ
ら複合体は、電極またはその付近での酸化還元過程によってまたはインピーダン
スおよび直流の測定値のような物理的パラメーターによって、または金チップ（
ｇｏｌｄ ｃｈｉｐ）の場合、例えば、表面プラスモン共鳴測定値によって識別
することができる。
【００３４】 概して、成分（ｃ）および成分（ｄ）の部分複合体（ｓｕｂｃｏｍｐｌｅｘｅ
ｓ）は、個々の識別される複合体から、例えば、温度を上昇させること、局所塩
濃度を変化させること、または好ましくは、電子結合パラメーターを調節するこ
とによる成分（ｂ）へのハイブリダイゼーションの中断を用いて、逐次的に溶離
される。次に、成分（ｄ）を、当業者に知られている分析法によって特性決定す
る。
【００３５】 核酸、タンパク質および／または化学的活性物質を標識する方法の例は、化学
的および／または物理化学的、酵素、タンパク質、放射性同位体、非放射性同位
体、毒素（ｔｏｘｉｎ）、化学発光および／または蛍光の標識である。
【００３６】 本発明による化学的標識に適する、当業者に知られている化学物質の例は、ビ
オチン、フルオレセインイソチオソアネート（ＦＩＴＣ）またはストレプトアビ
ジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）である。
【００３７】 当業者に知られている本発明の化学修飾の例は、メチル基、アセチル基、リン
酸基および／または単糖基の転移である。 本発明による、例えば、ＥＬＩＳＡの形の酵素標識に適する、当業者に知られ
ている酵素の例は、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ−５
−ステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリ
ン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコアミラーゼ、ルシフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ
である。
【００３８】 本発明のタンパク質標識に適する、当業者に知られているタンパク質またはタ
ンパク質フラグメントの例は、Ｎ−またはＣ末端（ＨＩＳ）6、ｍｙｃ、ＦＬＡ
Ｇ、Ｅタグ（Ｅｔａｇ）、Ｓｔｒｅｐタグ（Ｓｔｒｅｐ ｔａｇ）、ヘマグルチ
ニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）、キチン含有インテイン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、または抗
体または抗体の抗原結合部、例えば、Ｆｖフラグメントである。
【００３９】 本発明の放射性同位体標識に適する、当業者に知られている同位体の例は、3
Ｈ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ
、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃｕ、217Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃまたは 109 Ｐｂである。
【００４０】 本発明の非放射性同位体標識に適する、当業者に知られている同位体の例は、 2 Ｈまたは13Ｃである。 本発明の毒素標識に適する、当業者に知られている毒素（ｔｏｘｉｎ）の例は
、ジフテリア毒素、リシン（ｒｉｃｉｎ）またはコレラ毒素である。
【００４１】 本発明の化学発光標識に適する、当業者に知られている化学発光物質の例は、
ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、シ
ュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、アクリジニウム塩標識、イミダソール
標識またはエクオリン標識である。
【００４２】 本発明の蛍光標識に適する、当業者に知られている蛍光物質の例は、152ＥＵ
、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィ
コシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、グ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変異体（ＹＦＰ，ＲＦＰ）またはフ
ルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）である。
【００４３】 結合した核酸は、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ
：発現される配列標識）データベース、本発明の検出システムでのノーザンブロ
ットによって、または検出時または特異的放出後、好ましくは、ＰＣＲ、ＲＴ−
ＰＣＲまたはクローニングによる先行増幅後に配列決定することによって識別す
ることもまたは更に特性決定することもできる。
【００４４】 当業者は、本発明によって標識するのに用いることができる、例えば、質量分
析法、ＮＭＲ分光法、熱量測定法または電位差測定法のような本明細書中に挙げ
られていない追加の標識法または分析法に精通している。
【００４５】 本発明により、特に好都合な方法で、細胞の生理学的状態および細胞の生物学
的過程を識別し、特性決定し、そして監視することが可能である。 したがって、本発明は、更に、少なくとも一つの試料成分（成分（ｄ））、特
に、試料の核酸および／またはタンパク質を発見するおよび／または識別するお
よび／または特性決定するための、または細胞性または人工の結合パートナー、
好ましくは、タンパク質、ペプチド、核酸、化学的活性物質、好ましくは、有機
化合物、薬理学的活性化合物、生産物保護物質（ｃｒｏｐ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏ
ｎ ａｇｅｎｔｓ）、毒素、特に、毒物（ｐｏｉｓｏｎｓ）、発癌性および／ま
たは催奇形性物質、除草剤、抗真菌剤または殺虫剤を発見するおよび／または識
別するための、定常構造を有する領域（Ａ）および領域（Ａ）に隣接し且つ可変
構造を有する領域（Ｂ）を含む、本発明の検出システム、本発明の方法または本
発明の検出ユニットの使用に関する。
【００４６】 これに関連して、転写因子、リプレッサーまたはエンハンサーの相互作用を研
究すること、または例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、ＧＴＰアーゼ、エステ
ラーゼ、グリコシラーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、ヒドロラー
ゼ、イソメラーゼまたはリガーゼのような酵素と、それらの基質または調節物質
、例えば、誘導物質、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのような二次メッセンジャーとの
相互作用を研究することは、極めて興味深い。更に別の研究対象は、受容体およ
びそれらの結合パートナー、例えば、ホルモンおよびサイトカインなどである。
【００４７】 例えば、一つの細胞種類で発現される遺伝子の全集団が、本発明の検出システ
ムアレイ上に、それらのフサジーンによって（成分（ｃ）として）示される場合
、個々のタンパク質の結合パートナー（成分（ｄ））は、直接標識、例えば、35 Ｓ同位体標識によって、アレイ上のスポットとして識別することができる。
【００４８】 更に、成分（ｄ）の結合パートナー、好ましくは、タンパク質を、サンドイッ
チ検定の形の標識成分（ｄ）抗体によって識別することが可能である。この方法
に具体的な利点は、それによって、相互作用性物質のプールからの、例えば、細
胞抽出物中の成分（ｄ）の特異的相互作用を特異的に識別することが可能である
ということである。
【００４９】 更に、エフェクターおよび成分（ｄ）の相互作用への補因子、活性化物質およ
び阻害物質の作用を、個々の因子の継続的な添加によって研究することも可能で
ある。
【００５０】 検出システムアレイの適用のもう一つ重要な分野は、酵素活性パターンの分析
である。したがって、例えば、ＡＴ32Ｐをリン酸ドナーとして利用するキナーゼ
の基質を、アレイによって簡単な方法で識別することが可能である。
【００５１】 アレイが、例えば、グリコーゲンシンターゼおよび／またはホスホリラーゼキ
ナーゼをエフェクターとして含むフサジーンを含有する場合、アレイ上の in vi
tro 検定で、例えば、グリコーゲン代謝において重要な役割を生じるプロテイン
キナーゼに関して、基質としてのエフェクターの作用を研究することは可能であ
る。このような in vitro 検定によって、例えば、プロテインキナーゼが、二つ
のエフェクターのリン酸化に関して、ｃＡＭＰの添加によって活性化されること
を示すことは可能である。更に、例えば、プロテインホスファターゼ１を加える
ことによる、個々のエフェクター上の該当するリン酸基の除去を研究することが
可能である。
【００５２】 本発明は、更に、成分（ａ）〜（ｃ）を含む検出システム、少なくとも一つの
成分（ｄ）、および適宜、成分（ｄ）と相互作用する物質のような追加の物質、
好ましくは、成分（ｄ）抗体を含む結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。
【００５３】 フサジーンを成分（ｃ）として含有する結合体が好ましい。 成分（ｄ）として含有される結合体は、好ましくは、タンパク質、ペプチド、
特に、転写因子、受容体、酵素および／または化学的活性物質、好ましくは、有
機化合物、薬理学的活性化合物、ホルモン、生産物保護物質、毒素、特に、毒物
、発癌性および／または催奇形性物質、除草剤、抗真菌剤および／または殺虫剤
である。
【００５４】 次の実施例は、本発明を制限することなく、より詳細に記載するものである。 実施例１：典型的なＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＳＴＲＥＰ融合ガラスチップの生成 ガラスチップ表面を、最初に、超音波浴中のアセトン中で標準的なスライドガ
ラスを５分間脱脂することによってシラン化する（補足：微生物学用の染色槽）
。自然乾燥後、それらスライドを、超音波浴中で０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用い
て５分間処理する。
【００５５】 この後、超音波浴中で蒸留水を用いて更に５分間洗浄する。最後に残るＮａＯ
Ｈ残留物を、蒸留水を用いた洗浄操作を繰り返すことによって除去する。この後
、シラン化工程を行う。この目的には、９５％濃度水性エタノール（エタノール
：水；９５．５ｖ：ｖ）中の２〜３％濃度（３−グリシジルオキシプロピル）ト
リメトキシシラン溶液を調製する。そのエタノール性シラン溶液を、濃酢酸を用
いてｐＨ４．９〜５．２に調整する。添加および１０分間の加水分解後、その調
製されたシラン化溶液を超音波浴中で用いて、ガラス表面を２分間処理する。
【００５６】 超音波浴中で１００％エタノール溶液を用いた洗浄および自然乾燥の後、シラ
ン化されたスライドガラスを、８０℃で２０分間乾燥させる。次に、そのシラン
化ガラス表面上に、アミノ修飾された検出ユニット（成分ｂ）を固定することが
できる。
【００５７】 このようにしてチップ上に固定される検出ユニット（成分ｂ）を、標準法によ
って合成する（下を参照されたい）。ＦＬＡＧ、ＭＹＣおよびＳＴＲＥＰエピト
ープをコードするＲＮＡを、次のように、Roberts and Szostak（Proc.Natl.Aca
d.Sci USA, 1997）にしたがって製造する。ＤＮＡ鋳型配列（配列番号：１）を
、Ｔａｑポリメラーゼ（Promega, Cat.No.: Ｍ１６６Ｆ）を用いたＰＣＲ反応に
おいて二つのプライマー（配列番号：２／３）を用いて増幅させる。
【００５８】
【化１】
【００５９】 得られた二本鎖ＤＮＡ産物を、in vitro 転写（Promega, Cat.No.: Ｐ１３０
０）によって該当するＲＮＡ配列（配列番号：４）に転写する。
【００６０】
【化２】
【００６１】 更に、５’末端にリン酸基および３’末端にピューロマイシン残基（Ｐｕ）を
有するリンカー（配列番号：５）を、エピトープをコードしているＲＮＡ（配列
番号：４）の３’末端に連結するが、その連結反応は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｍ
ＢＩ， Cat.No.: ＥＬ０３３３）を用い且つ８０：２０％の比率で反応中に混合
される二つのスプリント（splint）分子（配列番号：６／７）を用いて行われる
。
【００６２】
【化３】
【００６３】 更に、フルオレセイン誘導体（ＮＦ，Interactiva）を、標準的なＤＮＡ固相
合成によってリンカー中に包含させるが、その誘導体は、相補性成分（ｂ）との
特異的ハイブリダイゼーションの場合、生じる蛍光によって結合結果を読み取る
ことを可能にする。
【００６４】 次に、ＲＮＡ（配列番号：４）およびリンカー（配列番号：５）を含む連結反
応生成物を、変性６％濃度ＴＢＥ尿素ゲルによって、非連結ＲＮＡから精製する
。
【００６５】 ＲＮＡ（配列番号：４）、エピトープエンコーディングペプチド（配列番号：
４）およびリンカー（配列番号：５）を含むフサジーンを、Roberts and Szosta
k（Proc.Natl.Acad.Sci USA, 1997）にしたがって、in vitro 翻訳（Promega, C
at.No.: Ｌ４９６０）後、ＭｇＣｌ2（１５０ｍＭ）およびＫＣｌ（５３０ｍＭ
）を含む翻訳混合物（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）のインキュベ
ーションを行って合成する。
【００６６】
【化４】
【００６７】 次に、このように合成されるフサジーンを、オリゴ−ｄ（Ｔ）セルロース（Am
ersham Pharmacia Biotech. Cat.No: ２７−５５４３−０２）によって、続いて
Strep-Tactin Sepharose（ＩＢＡ，CAt.No: ２−１２０２−００５）によって
、均一になるまで精製する。
【００６８】 用いられる検出ユニット（成分（ｂ））は、それぞれに、配列５’−Ｔ15−３
’を有する定常領域（領域Ａ）および８個のヌクレオチドから成る可変領域（領
域Ｂ）を含む。成分（ｂ）には、次の配列（配列番号：８／９）を選択した。
【００６９】
【化５】
【００７０】 ここで、成分（ｂ）−１は、その可変領域Ｂ内に、ＲＮＡ（配列番号：４）お
よびリンカー（配列番号：５）を含む分子に相補的なヌクレオチド配列を有する
が、成分（ｂ）−２には、可変領域Ｂに関して、その分子の標的配列への特異性
がない。成分（ｂ）は、標準的な固相ＤＮＡ合成によって製造された。３’末端
による固定化には、３’−アミノ修飾Ｃ３ＣＰＧ支持体（Glen Research, Cat.N
o.:２０−２９５０−１０）を用い、そしてガラス 表面への５’末端結合には、
５’−アミノ修飾因子Ｃ６ホスホルアミダイト（Glen Research, Cat.No.: １０
−１９０６−９０）を用いた。固定化には、成分（ｂ）−１／２の５０μＭ（０
．１Ｍ ＮａＯＨ中）溶液として、シラン化ガラス表面の位置１および２にそれ
ぞれ適用する。少なくとも２時間インキュベーション後、ガラス表面を、温水を
用いて約５分間洗浄する。この後、５ｘＳＳＣ緩衝液を用いてチップを１０分間
洗浄する。
【００７１】 ポリＡ領域中のフルオレセインを用いて蛍光標識されたフサジーンは、５ｘＳ
ＳＣ緩衝液中のフサジーンを取り、それをチップに移し、カバーガラスでそれを
覆い、４℃で５分間インキュベートすることによって、成分（ｂ）−１の相補性
標的配列とハイブリッド形成する（位置１で）。次に、そのチップを、５ｘＳＳ
Ｃ緩衝液を用いて室温で３回洗浄し、フルオレセイン蛍光を読み取る。最後に、
０．５ｘＳＳＣ緩衝液を用いた洗浄を繰り返し、蛍光強度を再度読み取る。成分
（ｂ）−１との完全なハイブリダイゼーションの場合のみ、蛍光シグナルを検出
することが可能であったということおよび成分（ｂ）−２の非特異的配列を含む
フサジーンの相互作用はいずれにせよ起こらなかったということが示された。
【００７２】 実施例２：タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための典型的なＦＬＡ
Ｇ、ＭＹＣ、ＳＴＲＥＰ融合ガラスチップの生成（蛍光標識された特異的抗ＦＬ
ＡＧ抗体を用いたＦＬＡＧエピトープの検出） ガラスチップ表面を、最初に、超音波浴中のアセトン中で標準的なスライドガ
ラスを５分間脱脂することによってシラン化する（補足：微生物学用の染色槽）
。自然乾燥後、それらスライドを、超音波浴中で０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液を用い
て５分間処理する。
【００７３】 この後、超音波浴中で蒸留水を用いて更に５分間洗浄する。最後に残るＮａＯ
Ｈ残留物を、蒸留水を用いた洗浄操作を繰り返すことによって除去する。この後
、シラン化工程を行う。この目的には、９５％濃度水性エタノール（エタノール
：水；９５．５ｖ：ｖ）中の２〜３％濃度（グリシジルオキシプロピルトリメト
キシシラン溶液を調製する。そのエタノール性シラン溶液を、濃酢酸を用いてｐ
Ｈ４．９〜５．２に調整する。添加および１０分間の加水分解後、その調製され
たシラン化溶液を超音波浴中で用いて、ガラス表面を２分間処理する。
【００７４】 超音波浴中で１００％エタノール溶液を用いた洗浄および自然乾燥の後、シラ
ン化されたスライドガラスを、８０℃で２０分間乾燥させる。次に、そのシラン
化ガラス表面上に、アミノ修飾された検出ユニット（成分ｂ）を固定することが
できる。
【００７５】 チップ上に固定された成分（ｂ）は、標準法によって合成した（下を参照され
たい）。ＦＬＡＧ、ＭＹＣおよびＳＴＲＥＰエピトープをコードするＲＮＡを、
次のように、Roberts and Szostak（Proc.Natl.Acad.Sci USA, 1997）にしたが
って製造する。ＤＮＡ鋳型配列（配列番号：１）を、Ｔａｑポリメラーゼ（Prom
ega, Cat.No.: Ｍ１６６Ｆ）を用いたＰＣＲ反応において二つのプライマー（配
列番号：２／３）を用いて増幅させる。
【００７６】 得られた二本鎖ＤＮＡ産物を、in vitro 転写（Promega, Cat.No.: Ｐ１３０
０）によって該当するＲＮＡ配列（配列番号：４）に転写する。 更に、５’末端にリン酸基および３’末端にピューロマイシン残基（Ｐｕ）を
有するリンカー（配列番号：１０）を、エピトープをコードしているＲＮＡ（配
列番号：４）の３’末端に連結するが、その連結反応は、好ましくは、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ＭＢＩ， Cat.No.: ＥＬ０３３３）を用い且つ８０：２０％の比率
で反応中に混合される二つのスプリント分子（配列番号：６／７）を用いて行わ
れる。
【００７７】
【化６】
【００７８】 次に、ＲＮＡ（配列番号：４）およびリンカー（配列番号：５）を含む連結反
応生成物を、変性６％濃度ＴＢＥ尿素ゲルによって、非連結ＲＮＡから精製する
。
【００７９】 ＲＮＡ（配列番号：４）、エピトープエンコーディングペプチド（配列番号：
４）およびリンカー（配列番号：１０）を含むフサジーンを、Roberts and Szos
tak（Proc.Natl.Acad.Sci USA, 1997）にしたがって、in vitro 翻訳（Promega,
Cat.No.: Ｌ４９６０）後、ＭｇＣｌ2（１５０ｍＭ）およびＫＣｌ（５３０ｍ
Ｍ）を含む翻訳混合物のインキュベーションを行って合成する。
【００８０】 次に、このように合成されるフサジーンを、オリゴ−ｄ（Ｔ）セルロース（Am
ersham Pharmacia Biotech. Cat.No: ２７−５５４３−０２）によって、続いて
Strep-Tactin Sepharose（ＩＢＡ，CAt.No: ２−１２０２−００５）によって
、均一になるまで精製する。
【００８１】 用いられる検出ユニット（成分（ｂ））は、それぞれに、配列５’−Ｔ15−３
’を有する定常領域（領域Ａ）および８個のヌクレオチドから成る可変領域（領
域Ｂ）を含む。成分（ｂ）には、次の配列（配列番号：８／９）を選択した。
【００８２】
【化７】
【００８３】 ここで、成分（ｂ）−１は、その可変領域Ｂ内に、ＲＮＡ（配列番号：４）お
よびリンカー（配列番号：１０）を含む分子に相補的なヌクレオチド配列を有す
るが、成分（ｂ）−２には、可変領域Ｂに関して、その分子の標的配列への特異
性がない。成分（ｂ）は、標準的な固相ＤＮＡ合成によって製造された。３’末
端による固定化の場合、３’−アミノ修飾Ｃ３ＣＰＧ支持体（Glen Research, C
at.No.:２０−２９５０−１０）を用いたが、ガラス 表面への５’末端結合には
、５’−アミノ修飾因子Ｃ６ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉ
ｔｅ）（Glen Research, Cat.No.: １０−１９０６−９０）を用いた。固定化に
は、成分（ｂ）−１／２の５０μＭ（０．１Ｍ ＮａＯＨ中）溶液として、シラ
ン化ガラス表面の位置１および２にそれぞれ適用する。少なくとも２時間インキ
ュベーション後、ガラス表面を、温水を用いて約５分間洗浄する。この後、５ｘ
ＳＳＣ緩衝液を用いてチップを１０分間洗浄する。
【００８４】 フサジーンは、５ｘＳＳＣ緩衝液中の融合タンパク質を取り、それを個々のチ
ップに移し、カバーガラスを用いてそれを覆い、４℃で５分間インキュベートす
ることによって、相補性成分（ｂ）−１とハイブリッド形成する（位置１）。次
に、そのチップを、５ｘＳＳＣ緩衝液を用いて室温で３回洗浄し、そして予め蛍
光標識された（Ｃｙ５Ａｂ Labelling Kit, Amersham Pharmacia Biotech. Cat.
No: ＰＡ３５０００）抗ＦＬＡＧ抗体（Sigma Immunochemicals, Cat.No.: Ｆ３
０４０）の溶液を適用し、その蛍光を読み取る。最後に、０．５ｘＳＳＣ緩衝液
を用いた洗浄を繰り返し、蛍光強度を再度読み取る。成分（ｂ）−１との完全な
ハイブリダイゼーションの場合のみ、蛍光シグナルを検出することが可能であっ
たということおよび成分（ｂ）−２の非特異的配列を含むフサジーンまたは蛍光
標識された抗体の相互作用はいずれにせよ起こらなかったということが示された
。
【００８５】 実施例３：電子的にアドレス可能なチップ（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃａｌｌｙ
ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｃｈｉｐ）上に二つの異なったフサジーンを含む典型
的なフサジーンアレイの生成 互いに明瞭に区別され且つアドレス可能な電子チップ上のハイブリダイゼーシ
ョン実験において特性決定されうる二つのフサジーン（成分（ｃ））を合成した
。この目的には、実施例２からのフサジーン（成分（ｃ）−１）の他に、別の、
ＲＮＡ（配列番号：１５）、エピトープエンコーディングペプチド（配列番号：
１５）およびリンカー（配列番号：１０）を含む異なったフサジーン（成分（ｃ
）−２）を、鋳型ＤＮＡ（配列番号：１１）、二つのプライマー（配列番号：１
２／１３）およびスプリント（配列番号：１４）を用いて合成する。
【００８６】
【化８】
【００８７】 電子チップ上に固定された成分（ｂ）は、標準的なＤＮＡ合成によって得られ
たビオチン標識成分（ｂ）（配列番号：１６〜２８）である。これに関連して、
固定化は、３’末端へかまたは５’末端へのそれぞれの場合において行うことが
できる。挙げられる例では、成分（ｂ）を、３’末端上のビオチン修飾によって
チップ表面に結合させる。このためには、ビオチンＴＥＧ ＣＰＧ支持体（Glen
Research, Cat.No.:２０−２９５５−１０）を、化学的ＤＮＡ合成において用
い、そして適当なビオチン修飾を有し且つ更に、１５ヌクレオチド長さチミジン
領域（領域Ａ）および８ヌクレオチドの可変領域（領域Ｂ）を含む次の成分（ｂ
）を合成する。
【００８８】
【化９】
【００８９】 成分（ｂ）−３および成分（ｂ）−４は、それらの具体的な可変領域Ｂに関し
て、適切な成分（ｃ）−１および成分（ｃ）−２それぞれに相補的である。成分
（ｃ）−５には、いずれにせよ、可変領域Ｂに関して、成分（ｃ）−１および成
分（ｃ）−２それぞれの相補性標的配列に特異性がない。
【００９０】 成分（ｂ）−３〜５は、５０ｍＭヒスチジン緩衝液中の具体的な成分（ｂ）の
１μＭ溶液を調製し、それぞれの場合に５０μｌの適当な成分（ｂ）を、３ｘ３
の位置を有する半導体材料から成るチップに適用することによって固定される。
固定化は、室温で行われた。チップ上の位置（列、行）を次のように占有するこ
とが選択された。
【００９１】 １，１：成分（ｂ）−３；１，２：成分（ｂ）−４；２，１：成分（ｂ）−３
；２，２：成分（ｂ）−４；３，１：成分（ｂ）−５；３，２：成分（ｂ）−５
；１，３：成分（ｂ）−３；２，３：成分（ｂ）−４；３，３：成分（ｂ）−５
。
【００９２】 配列番号：４＋１０（成分（ｃ）−３）および配列番号：１５＋１０（成分（
ｃ）−４）を含む連結された核酸またはフサジーン（成分（ｃ）−１および成分
（ｃ）−２）を、５０ｍＭヒスチジン緩衝液中にそれらを取り、適当なチップ位
置（列、行）において室温で具体的なハイブリダイゼーション実験を行うことに
よってハイブリッド形成させる。
【００９３】 １，１：成分（ｃ）−１；１，２：成分（ｃ）−２；２，１：成分（ｃ）−１
；２，２：成分（ｃ）−２；３，１：成分（ｃ）−１；３，２：成分（ｃ）−２
；１，３：成分（ｃ）−３；２，３：成分（ｃ）−４；３，３：成分（ｃ）なし
。
【００９４】 次に、チップ上で生じたハイブリダイゼーション結果を、ＦＬＡＧエピトープ
を特異的に認識し、しかも予め蛍光標識されている（Ｃｙ５Ａｂ Labelling Kit
, Amersham Pharmacia Biotech. Cat.No: ＰＡ３５０００）抗ＦＬＡＧ抗体（Si
gma Immunochemicals, Cat.No.: Ｆ３０４０）を、位置１，１および１，２に適
用することによって特性決定する。Ｅ−Ｔａｇエピトープを認識し、しかも予め
蛍光標識されている（Ｃｙ５Ａｂ 標識キット（Labelling Kit）, Amersham Pha
rmacia Biotech. Cat.No: ＰＡ３５０００）Ｅ−Ｔａｇ抗体（Amersham Pharmac
ia Biotech. Cat.No: ２７９４１２−０１）を、位置２，１および２，２に適用
する。蛍光抗ＦＬＡＧ抗体または抗Ｅ−Ｔａｇ抗体を、抗体の可能な非特異的結
合結果を検出するために、チップ位置３，１；３，２；１，３；２，３および３
，３に適用する。
【００９５】 いずれの場合も、蛍光強度を読み取ったが、蛍光標識された抗ＦＬＡＧ抗体を
蛍光プローブとして用いて、相補性成分（ｃ）−１／２と成分（ｂ）の完全なハ
イブリダイゼーションの場合、特異的に正の結合結果が、チップ位置１，１およ
び１，２で生じたということが示された。抗Ｅ−ｔａｇ抗体（位置２，１および
２，２上）の相互作用の場合、蛍光強度の増加は、Ｅ−ｔａｇエピトープを装填
される成分（ｃ）−２を有する位置２，２でのみ検出可能であった。これら実験
は、最初に、成分（ｃ）−１および−２が、適切な抗体によって特異的に認識さ
れたことを明示している。対照実験は、最初に、二つの融合する遺伝子が、いず
れにせよ、可変領域（領域Ｂ）内に成分（ｃ）（位置３，１および３，２）への
相補性のない成分（ｂ）と非特異的に相互作用することができたかどうかの可能
性を研究した。抗ＦＬＡＧ抗体を加えた後、検出しうる蛍光はなかったので、成
分（ｃ）の非特異的ハイブリダイゼーションは生じなかったということが考えら
れうる。更に、もう一つの対照実験は、抗ＦＬＡＧ抗体が、二本鎖核酸と相互作
用する可能性を排除した。この目的には、ペプチドエピトープを含まない適切な
成分（ｃ）−３／４を、位置１，３および２，３に適用したが、抗ＦＬＡＧまた
は抗Ｅ−Ｔａｇ抗体の添加は、蛍光変化が生じなかったことを示した。最後に、
蛍光抗ＦＬＡＧまたは抗Ｅ−Ｔａｇ抗体には、いずれにせよ、一本鎖成分（ｂ）
（位置３，３での実験）への親和性がないということを示すことも可能であった
。要約として、それら結果を次の表に示す。
【００９６】
【表１】
【００９７】 次の図面は、本発明を制限することなく、より詳細に記載するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、支持体（（１）成分（ａ））、およびその支持体に結合した検出ユニ
ット成分であって、支持体表面にスペーサー（３）によって結合することができ
、そして更に、定常領域（Ａ）（４）および隣接する可変領域（Ｂ）（５）を含
有する検出ユニット成分（ｂ）（２）、および領域（Ａ）（４）および（Ｂ）（
５）に相補的であり且つ適当なリンカー、例えば、ピューロマイシン（７）含有
核酸リンカー（８）の一部分と、リンカーに結合した核酸、ここではＲＮＡ（９
）の一部分とから形成されている領域を含む成分（ｃ）（６）を含む本発明の検
出システムを図式的に記載する。エフェクターユニット（１０）は、核酸−ピュ
ーロマイシンリンカー（７，８）に結合している。
【図２】 図２は、成分（ａ）〜（ｃ）を含む複合体の、成分（ｃ）中に含有される標識
（１１）による識別を図式的に記載する。
【図３】 図３は、成分（ａ）〜（ｄ）を含む複合体の、ここではエフェクター抗体の例
によって示される、例えば、成分（ｄ）中に含有される標識（１２）による識別
を図式的に記載する。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月１６日（２００１．７．１６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 ブルクシュタラー，ペトラ ドイツ連邦共和国デー−12205 ベルリン， バーゼラー・シュトラーセ 142 (72)発明者 コンツ，ディルク ドイツ連邦共和国デー−65719 ホフハイ ム，ジントリンガー・シュトラーセ 46 (72)発明者 ヴェルク，ウーヴェ ドイツ連邦共和国デー−35039 マールブ ルク，カペッラーシュトラーセ 51 (72)発明者 ピグノート，マルク ドイツ連邦共和国デー−65812 バート・ ゾーデン，フライヘル−フォン−シュタイ ン・シュトラーセ ４ (72)発明者 ヴァーグナー，ペーター ドイツ連邦共和国デー−65510 イドシュ タイン，イム・アルテンホフ ４ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB14 BB50 BB51 DA13 FB01 FB02 FB07 FB12 4B024 AA11 AA19 AA20 CA09 CA20 HA14 HA20 4B029 AA07 AA23 AA27 BB15 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 FA15 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ42 QQ52 QQ79 QR32 QR35 QR38 QR55 QR84 QS34 QS36 QS39 QX02 QX04

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 検出システムであって、 （ｉ）支持体（成分（ａ））および （ii）該支持体に結合した少なくとも一つの検出ユニット（成分（ｂ））であ
    って、定常配列を有する領域（Ａ）および領域（Ａ）に隣接し且つ可変配列を有
    する領域（Ｂ）を含む対合システムを包括的に含む上記検出ユニット、および （iii）それに結合し且つ該検出ユニット（成分（ｂ））に相補的な配列を含
    む対合システム−エフェクター融合分子（成分（ｃ）） を含む検出システム。
  2. 【請求項２】 領域（Ａ）が、長さ５〜約８０ヌクレオチドまたはヌクレオ
    チド類似体、好ましくは、５〜約３０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、
    そして特に、１０〜約３０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である請求項
    １に記載の検出システム。
  3. 【請求項３】 領域（Ｂ）が、長さ５〜３０、特に、５〜１０、好ましくは
    、７〜８ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である請求項１および２のどち
    らかに記載の検出システム。
  4. 【請求項４】 ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド（ｄ）、リボヌ
    クレオチド（ｒ）または２−ヒドロキシメチルリボヌクレオチド（ｈｍｒ）であ
    る請求項１〜３に記載の検出システム。
  5. 【請求項５】 ヌクレオチド類似体が、ｐ−ＲＮＡ、ＣＮＡまたはＰＮＡモ
    ノマーである請求項２に記載の検出システム。
  6. 【請求項６】 領域（Ａ）が、ポリＴ鎖、好ましくは、Ｔ7-15鎖を含む請求
    項１〜４のいずれかに記載の検出システム。
  7. 【請求項７】 成分（ｃ）が、核酸−タンパク質受容体融合分子および／ま
    たは核酸−タンパク質融合分子、特に、核酸−ピューロマイシン誘導体および／
    または核酸−ピューロマイシン−タンパク質融合分子より選択される請求項１〜
    ６のいずれかに記載の検出システム。
  8. 【請求項８】 支持体が、セラミック、金属、特に、半導体、貴金属、ガラ
    ス、プラスチック、結晶性材料、または支持体、特に、該材料の薄層、若しくは
    セルロースのような（生体）分子フィラメント、構造タンパク質、または上記材
    料の組合せから構成されている請求項１〜７のいずれかに記載の検出システム。
  9. 【請求項９】 検出システムが、電子チップ上に組み立てられている請求項
    １〜８のいずれかに記載の検出システム。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれかに記載の検出システムを製造する
    方法であって、 （ｉ）定常配列を有する領域（Ａ）および領域（Ａ）に隣接し且つ可変配列を
    有する領域（Ｂ）を含む検出ユニット（成分（ｂ））を支持体（成分（ａ））に
    結合することによるアレイの製造であって、ここにおいて、それぞれのアレイ位
    置は、特定の領域Ｂを有する検出ユニットに割り当てることができる、および （ii）該検出ユニット（成分（ｂ））と、該検出ユニット（成分（ｂ））に相
    補的な配列を含む対合システム−エフェクター融合分子（成分（ｃ））とのハイ
    ブリダイゼーション を含む上記方法。
  11. 【請求項１１】 対合システム−エフェクター融合分子を含む溶液中の個々
    の成分を分別し且つ識別する方法であって、 （ｉ）対合システム−エフェクター融合分子ライブラリー（成分（ｃ）ライブ
    ラリー）、好ましくは、フサジーン（fusagene）ライブラリーの作成、 （ii）成分（ａ）および領域（Ｂ）が可能な並べ換えを全て含む成分（ｂ）を
    含むアレイ上の対合システム−エフェクター融合分子（成分（ｃ））のハイブリ
    ダイゼーションであって、個々の成分（ｂ）それぞれを一つのアレイ位置に具体
    的に割り当てることを可能にするハイブリダイゼーション、 （iii）成分（ｂ）および成分（ｃ）の複合体が形成されているアレイ位置の
    識別、 （iv）（iii）で識別される成分（ｂ）および成分（ｃ）の複合体の特性決定
    を含む上記方法。
  12. 【請求項１２】 長さ５〜８０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、好
    ましくは、５〜３０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、そして特に、１０
    〜３０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の領域（Ａ）を有する成分（ｂ）
    を用いる請求項１０および１１のどちらかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 長さ５〜３０、好ましくは、７〜８ヌクレオチドの領域（
    Ｂ）を有する成分（ｂ）を用いる請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ポリＴ鎖、好ましくは、Ｔ7-15鎖、またはリボソーム結合
    部位に相補的な鎖から構成される領域（Ａ）を用いる請求項１０〜１３のいずれ
    かに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 支持体が、セラミック、金属、特に、半導体、貴金属、ガ
    ラス、プラスチック、結晶性材料、または支持体、特に、該材料の薄層、若しく
    はセルロースのような（生体）分子フィラメント、構造タンパク質、または上記
    材料の組合せから構成されている請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記方法を電子チップ上で行う請求項１０〜１５のいずれ
    かに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 試料成分を、支持体に結合した検出ユニットに、電界によ
    って成分（ｂ）としてまたは成分（ｃ）として結合する請求項１０〜１６のいず
    れかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 用いられる成分（ｃ）が、核酸および／またはその類似体
    、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ−ピューロマイシン誘
    導体およびタンパク質から構成される対合システム−エフェクター融合分子であ
    る請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ［空隙（ｌａｃｕｎａ）］中において、試料の少なくとも
    一つのＲＮＡ−タンパク質融合分子を、支持体に結合し且つ式３’−（Ｘ）7-8
    −（Ｔ7-15）−５’（式中、Ｘは、アデノシン、チミジン、ウラシル、グアノシ
    ンまたはシトシンより選択される任意のヌクレオチドである）を有する少なくと
    も一つの核酸に、好ましくは、電界によって結合し、そして適宜、追加の工程に
    おいて、結合していないまたは特異的に結合していない核酸を、好ましくは、逆
    の極性を有し且つ第一工程の場合より低い電界強さを有する電界によって除去す
    る請求項１０〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】 第一工程において、適当な核酸リンカー、好ましくは、ｄ
    Ａ27ｄＣｄＣリンカーを、試料のＲＮＡ集団に、化学的にまたは適当なリガーゼ
    、好ましくは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって融合した後、翻訳し、続いてＲＮ
    Ａ−リンカー−タンパク質融合の形成を引き起こし、第二工程において、ＲＮＡ
    −リンカー−タンパク質融合分子を、好ましくは、式３’−（Ｘ）7-8−（Ｔ27
    ＧＧ）−５’（式中、Ｘは、アデノシン、チミジン、ウラシル、グアノシンまた
    はシトシンより選択される任意のヌクレオチドである）を有する本発明の検出シ
    ステムの核酸に、好ましくは、電界によって結合し、そして適宜、追加の工程に
    おいて、結合していないまたは特異的に結合していない核酸を、好ましくは、逆
    の極性を有し且つ第二工程の場合より低い電界強さを有する電界によって除去す
    る請求項１０〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 成分（ｃ）の特定のエフェクターユニットに親和性を有す
    る一つまたはそれ以上の結合パートナー（成分（ｄ））の相互作用を識別する方
    法であって、 （ｉ）対合システム−エフェクター融合分子アレイと、少なくとも一つの成分
    （ｄ）を含む分析されるべき物質混合物とのインキュベーション、 （ii）成分（ｂ）、成分（ｃ）および成分（ｄ）の複合体が形成されているア
    レイ位置の識別、 （iii）（ii）で識別される成分（ｂ）、成分（ｃ）および成分（ｄ）の複合
    体の特性決定 を含む上記方法。
  22. 【請求項２２】 少なくとも一つの試料成分、特に、試料の核酸および／ま
    たはタンパク質を発見するおよび／または識別するおよび／または特性決定する
    ための、または細胞性または人工の結合パートナー、好ましくは、タンパク質、
    ペプチド、核酸、化学的活性物質、好ましくは、有機化合物、薬理学的活性化合
    物、生産物保護物質、毒素、特に、毒物、発癌性および／または催奇形性物質、
    除草剤、抗真菌剤または殺虫剤を発見するおよび／または識別するための請求項
    ２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 少なくとも一つの成分（ｄ）を直接的に標識する請求項２
    １および２２のどちらかに記載の方法。
  24. 【請求項２４】 少なくとも一つのエフェクター結合成分（ｄ）を、例えば
    、抗体のような標識された特異的結合パートナーを用いて検出する請求項２１〜
    ２３のいずれかに記載の方法。
  25. 【請求項２５】 工程（ii）によるエフェクターと成分（ｄ）との間の相互
    作用を、例えば、補因子、補酵素、活性化物質または阻害物質のような、相互作
    用に影響を与える追加の物質を加えることによって変更する請求項２１〜２４の
    いずれかに記載の方法。
  26. 【請求項２６】 酵素活性パターンを決定する請求項２１〜２５のいずれか
    に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 検出システム（成分（ａ）〜（ｃ））および成分（ｄ）を
    含む結合体。
  28. 【請求項２８】 成分（ｄ）がフサジーンである請求項２７に記載の結合体
    。
  29. 【請求項２９】 成分（ｄ）が、タンパク質、ペプチド、特に、転写因子、
    受容体、または例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、ＧＴＰアーゼ、エステラー
    ゼ、グリコシラーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、ヒドロラーゼ、
    イソメラーゼまたはリガーゼのような酵素であって、それらの基質または調節物
    質と一緒のものである請求項２７および２８のどちらかに記載の結合体。例えば
    、誘導物質、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのような二次メッセンジャー、および／ま
    たは化学的活性物質、好ましくは、有機化合物、薬理学的活性化合物、ホルモン
    、生産物保護物質、毒素、特に、毒物、発癌性および／または催奇形性物質、除
    草剤、抗真菌剤および／または殺虫剤など。
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