JPWO2006095550A1 - Ｐｃｒプライマー、それを利用したｐｃｒ法及びｐｃｒ増幅産物、並びにｐｃｒ増幅産物を利用するデバイス及びｄｎａ−タンパク複合体 - Google Patents

Abstract

熱融解することなく二本鎖のＰＣＲ増幅産物をそのままアレイ上に固定することができるようにするＰＣＲプライマーを提供し、それを用いた簡便なＰＣＲ法とそれにより得られるＰＣＲ増幅産物若しくはアレイ上に固定されたＰＣＲ増幅産物へのタンパクの固定化技術を提供することを目的として、本発明に係るＰＣＲプライマーを、ＰＣＲ法における鋳型となり得る天然型ＤＮＡ鎖からなるプライマー本体部の５’末端側に、ＰＣＲ反応に関与しないタグ部を有するものとした。

Description

本発明は、ＰＣＲ法において用いられるプライマーと、当該プライマーを用いた遺伝子並びにタンパク関連技術に関するものである。

近年、遺伝子解析技術が急速に発展しており、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）を始めとする様々な解析ツールや解析手法が簡便に利用できるようになってきている。例えばＤＮＡマイクロアレイは、微細空間に他種類のオリゴヌクレオチドを配置したデバイスであり、これに標識が施された標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）（以下、「ターゲット」）をハイブリダイズさせ、ハイブリッド形成によるシグナル強度を検出装置で検出することによって、配列特異的に結合したターゲットを一度に解析するものとして重用されている。このようなＤＮＡ解析においては、固定化したプローブＤＮＡとターゲットとをマイクロアレイ上でハイブリダイゼーション（二本鎖形成）させることが必要であるが、そのためには一般に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法でターゲットを増幅した後、熱解離により一本鎖とすることで、この一本鎖のターゲットをアレイ上のプローブＤＮＡ（一本鎖）とハイブリダイズさせるのが通例である。

斯かる方法では、ＰＣＲ増幅産物であるターゲットＤＮＡを一本鎖にした後でないとマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行うことができないが、そのためには加熱処理が必要であってターゲットのＤＮＡに好ましくない影響を与えることがあり、また一本鎖ＤＮＡは球状化し易く検出感度に劣る等の観点から、ターゲットのＤＮＡをその一部分において二重鎖構造をとり他の部分において単鎖構造をとる「部分二重鎖ＤＮＡ」とその作製方法及び検出方法が考えられている（特許文献１参照）。同文献によると、この部分二重鎖ＤＮＡは、（１）作製しようとするＤＮＡの一部と同一な塩基配列を有する１種類のオリゴヌクレオチドを合成する、（２）作製しようとするＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドを合成する、（３）作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの一方をプライマーとして非対称ＰＣＲを行う、（４）作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの他方をプライマーとして非対称ＰＣＲを行う、（５）工程（３）の増幅産物と工程（４）の増幅産物を混合した後、加熱、冷却する、という工程を経ることで得ることができるものである。このようにして得られる部分二重鎖ＤＮＡは、ゲノムの増幅対象部分（二本鎖）に、当該対象部分に連続するＤＮＡ配列と同一配列を持つ一本鎖部分を連続させたものであるといえる。
特開平１１−３３２５６６公報

ところが、非対称ＰＣＲとは、片方のＤＮＡ鎖を増幅する手法であり、２つのプライマーの一方を大過剰に使用するものであるため、各プライマーの量の調節を始めとする条件設定が難しい非対称ＰＣＲを前記文献記載の方法では２回行う必要がある。さらに、このような非対称ＰＣＲを含む工程を最低５つ行わなければならず、非常に煩雑でもある。また、上記工程（３）と工程（４）の増幅産物には、同一の塩基配列部分が多く含まれているため、工程（５）においてこれらを混合、加熱、冷却しても、目的の部分二重鎖ＤＮＡ以外の産物も少なからず生成されるため、部分二重鎖ＤＮＡの生成効率はさほど高くなるとは言い難い。また、得られた部分二重鎖ＤＮＡの二重鎖部分はそのままにして熱解離などを施すことなく単鎖部分のみを測定用チップ上の相補鎖に結合させることができるとはいうものの、その前段階である工程（５）では非対称ＰＣＲの増幅産物を加熱することが必須であるため、この点においては上述した一般的な方法と同様の問題点がある。

また一般に、従来のＤＮＡマイクロアレイを用いたＤＮＡ検出においては、蛍光標識等されたＤＮＡがアレイ上に固定された相補鎖に結合したか否か、換言すれば目的のＤＮＡの存在の有無を確認しようとするものであるので、その限りにおいては問題はないが、アレイ上に目的のＤＮＡを確実に結合させることを目的としておらず、目的のＤＮＡが結合したアレイ上でさらに何らかの反応を行わせるというような応用は利かないといえる。

そこで本発明は、上述した従来の問題点を解消することを課題とし、極めて簡便な方法で得られるＰＣＲプライマーを創出・提供するとともに、当該プライマーを用いた応用性の広い技術をも提供することを目的としている。

すなわち本発明のＰＣＲプライマーは、試料中の対象天然型ＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅させる際に用いられるものであって、対象ＤＮＡ領域の二本鎖のうち一方の５’末端側と相補的配列を有するＤＮＡ鎖からなるプライマー本体部と、このプライマー本体部の５’末端に修飾され且つＰＣＲに関与しない物質からなるタグ部とを有してなることを特徴とする。

このようなＰＣＲプライマーであれば、プライマー本体部において従来通りのＰＣＲを行って所望の塩基配列を有する増幅産物を得ることが可能である。つまり、プライマー本体部には、従来のＰＣＲで用いるプライマーと同様に、目的とするゲノム等の試料ＤＮＡにおける対象領域に応じて適宜設計すればよい。特にタグ部は、プライマー本体部によるＰＣＲでは鋳型とならず増幅もされないため、斯かるＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる増幅産物は、目的である対象ＤＮＡ領域と同一配列の二本鎖ＤＮＡにタグ部を付加した形態をとる。したがって、本発明のＰＣＲプライマーは、後段で詳述する様々な応用技術に利用することが可能である。また本発明のＰＣＲプライマーを用いれば、１回のＰＣＲ工程を行うだけで目的の増幅産物を得られ、極めて迅速且つ簡便な処理が可能である。ここで、プライマー本体部とタグ部は、直接的に隣接していてもよいし、両者の間に他の物質を介在させていてもよい。また、タグ部として採用可能な物質には、別の物質との間での特異的結合性能を有するあらゆる物質が含まれる。例えば、タグ部と前記別の物質との関係には、ビオチンとアビジン、試料ゲノムに存在しない塩基配列からなるＤＮＡ鎖とその相補鎖を例示することができる。

特に、プライマー本体部とタグ部とを直接的に隣接させない本発明のＰＣＲプライマーの一態様としては、プライマー本体部とタグ部との間に、ＰＣＲにより増幅されない物質からなるスペーサ部を介在させたものを挙げることができる。この場合、スペーサ部の存在によって、プライマー本体部とその相補鎖とによる二本鎖ＤＮＡとタグ部との間での立体的混雑性を緩和することができる。

特にタグ部として採用するのに望ましい物質としては、非天然型（Ｌ型）ＤＮＡ鎖（以下、必要に応じて「Ｌ-ＤＮＡ」と称する）挙げることができる。ゲノムを始めとする二本鎖の天然型ＤＮＡはＤ型（以下、必要に応じて「Ｄ-ＤＮＡ」と称する）であるのに対して、非天然型ＤＮＡはＬ型であるため、天然型ＤＮＡを鋳型とする通常のＰＣＲにおいてはＬ-ＤＮＡからなるタグ部はＰＣＲにおけるプライマーとはなり得ない。したがって、このＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うと、天然型の二本鎖ＤＮＡの一方に一本鎖のＬ-ＤＮＡ鎖がタグ付けされた態様を有していることになる。なお、タグ部のＬ-ＤＮＡにおける塩基配列や塩基数は特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜決定すればよい。以下、本明細書において「プライマー本体部の５’末端に修飾され且つＰＣＲにより増幅されない物質」又は単に「タグ部」と記す場合は、Ｌ-ＤＮＡを含む概念を示す。

この場合、前記プライマー本体部と前記タグ部との間に介在させるスペーサ部として好ましいものには、非天然型ＤＮＡ鎖を挙げることができる。このスペーサ部により、例えばＰＣＲ増幅産物のタグ部（Ｌ-ＤＮＡ）をその相補鎖に結合させた場合、二本鎖Ｄ-ＤＮＡと二本鎖Ｌ-ＤＮＡが近い位置に存在することによる立体的な混雑を解消することができる。なお、スペーサ部として採用するＬ-ＤＮＡ鎖における塩基配列や塩基数は特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜決定すればよい。Ｌ-ＤＮＡの他、スペーサ部に適用可能な物質としては、アルキル鎖、ペプチド、ペプチド核酸、糖鎖等を挙げることができる。

以上のようなＰＣＲプライマーを含む本発明のＰＣＲプライマーセットは、前述のＰＣＲプライマーをフォワードプライマーとして有し、対象ＤＮＡ領域の二本鎖のうち他方の３’末端側と相補的配列を有するＤＮＡ鎖からなるリバースプライマーとして有するものである。

また、本発明に係るＰＣＲ法は、上述のＰＣＲプライマーセットを用いて対象天然型ＤＮＡ領域に対応する二本鎖ＤＮＡ部と、この二本鎖ＤＮＡ部のうち一方において前記ＰＣＲプライマーに由来するタグ部とを有する増幅産物を得ることを特徴とするものであり、先述の如く対象天然型ＤＮＡ領域を含む領域を増幅することができる。このＰＣＲ法によれば、プライマー本体部の条件を近似させておくことで、複数種類の増幅産物を得るＰＣＲを同一チューブ内で同時に行うことも可能となり、ＰＣＲ処理に要する器具、手間、時間を大幅に削減することができる。

さらに、このＰＣＲ法で反応生成物たる増幅産物は、上述の通り、対象天然型ＤＮＡ領域に対応する二本鎖ＤＮＡ部と、当該二本鎖ＤＮＡ部のうち一方において前述のＰＣＲプライマーにおけるタグ部とを有していることを特徴とするものである。このようなＰＣＲ増幅産物は、プライマー本体部に基づいて増幅された天然型の二本鎖ＤＮＡ部分を有しているため極めて安定性がよく、後述するように様々な技術に利用可能である。

また、本発明に係るＤＮＡ担持用デバイスは、前述のＰＣＲプライマーにおけるタグ部と特異的に結合する物質と、当該物質を固定化して担持する担体とを具備してなることを特徴とするものである。ここで、ＰＣＲプライマーのタグ部にＬ-ＤＮＡを採用した場合には、当該タグ部と特異的に結合する物質としては、タグ部のＬ-ＤＮＡの相補鎖（もちろ非天然型である）からなるＬ型プローブを担体に固定化することが適切である。その他、例えばタグ部にビオチンを採用した場合には、当該タグ部と特異的に結合する物質としてはアビジンを担体に固定化することが適切である。また、担体には、一般的なＤＮＡチップに用いられる基板やビーズ等を適用することができる。なお、担体に固定化される物質は、一種類でもよいし複数種類でもよい。そして、このようなＤＮＡ担持用デバイスを用いると、次のような二本鎖ＤＮＡ修飾デバイスを容易に得ることができる。

すなわち本発明に係る二本鎖ＤＮＡ修飾デバイスは、上述したＰＣＲ増幅産物及びＤＮＡ担持用デバイスを利用するものであって、ＤＮＡ担持用デバイスにおけるタグ部と特異的に結合する物質に、ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を結合させてなることを特徴とするものである。このような二本鎖ＤＮＡ修飾デバイスを用いれば、タグ部とそれに特異的な結合をする物質とを介し二本鎖ＤＮＡを、担体上の位置を指定して、特に担体がアレイであればそのアドレスを指定して、固定化することができる。したがってこのデバイスは、次に説明するようなＤＮＡ検出方法において検出処理の結果得られる生成物とみることもでき、また後述するようなデバイス上での酵素反応にも利用することができる。

前述した本発明に係るＤＮＡ検出方法は、上述のＰＣＲ増幅産物とＤＮＡ担持用デバイスを用いる方法であって、ＤＮＡ担持用デバイスにおけるタグ部と特異的に結合する物質に対して、ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を当該ＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部を二本の単鎖ＤＮＡに解離させることなく結合させる工程を含むことを特徴とする。このような検出方法によれば、ＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡ部を改めて熱解離させる必要がないので、検出対象であるＰＣＲ増幅産物を劣化させることがなく、またＰＣＲ増幅産物のタグ部のみが確実に担体上に固定化された物質と特異的な結合をするので、担体上における前記物質のほぼ全てに対して確実にＰＣＲ増幅産物を結合させることができる。なお、担体上には、ＰＣＲ増幅産物のタグ部と結合する物質を一種類のみならず複数種類固定化しておくこともできる。それにより、対応するタグ部を有する複数種類のＰＣＲ増幅産物を同時に検出することが可能である。

また、上述したＰＣＲ増幅産物を利用することで、次のものを創出することができる。すなわち本発明に係るＤＮＡ-タンパク複合体（タンパクを結合させた二本鎖ＤＮＡ）は、当該ＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部に、その二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させてなるものである。ここでタンパクは、二本鎖ＤＮＡ中における特定配列を認識して結合するものならば特に限定されるものではなく、一例として制限酵素を挙げることができる。斯かるＤＮＡ-タンパク複合体は、次に説明するようなタンパク担持用デバイスと共に用いることで、ＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイスとしての利用が可能である。

すなわち本発明に係るタンパク担持用デバイスは、前述のＰＣＲ増幅産物又はＤＮＡ-タンパク複合体の何れか一方又は両方におけるタグ部と特異的に結合する物質と、この物質を固定化して担持する担体とを具備してなるものである。なお、ＰＣＲ増幅産物を利用する場合には、その二本鎖ＤＮＡ部に、当該二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させ得るように構成する。このようなデバイスは、前記のＰＣＲ増幅産物やＤＮＡ-タンパク複合体の何れかのタグ部と結合する物質を備えているため、ＰＣＲ増幅産物やＤＮＡ-タンパク複合体の検出デバイスとして利用できるほかにも、次に説明するようなＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイスの基板部分として利用することもできる。その結果、デバイス上の定まった位置にタンパクを固定化することが可能となる。また、担体上には、ＰＣＲ増幅産物やＤＮＡ-タンパク複合体のタグ部と結合する物質を一種類のみならず複数種類固定化しておくこともできる。それにより、対応するタグ部を有する複数種類のＰＣＲ増幅産物やＤＮＡ-タンパク複合体を同時に検出することが可能である。さらに担体には、一般的なＤＮＡチップ等に用いられる基板やビーズ等を適用することができる。

そしてＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイスとは、本発明においては、前記のＤＮＡ-タンパク複合体とタンパク担持用デバイスを利用するものであって、タンパク担持用デバイスにおけるタグ部と特異的に結合する物質に、ＤＮＡ-タンパク複合体におけるタグ部を結合させてなることを特徴とするもの、或いは、前記のＰＣＲ増幅産物及びタンパク担持用デバイスを利用するものであって、タンパク担持用デバイスにおけるタグ部と特異的に結合する物質に、ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を結合させ、さらに当該ＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部に、その二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させてなることを特徴とするものである。これら両ＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイスは、最終形態は同様であるが、タンパクを予め二本鎖ＤＮＡに結合させてからタンパク担持用デバイスに固定してもよいし、ＰＣＲ増幅産物をタンパク担持用デバイスに固定した後で当該ＰＣＲ増幅産物に結合させてもよい。いずれにしても、担体上の決まった位置に二本鎖ＤＮＡを介してタンパクを固定化した態様のデバイス（プロテインチップと呼ぶこともできる）が得られる。特に前者の態様のＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイスにおいて担体がアレイであれば、タンパクと二本鎖ＤＮＡの複合体をアレイ上のアドレスを指定して固定することができ、後者の態様のＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイスにおいて担体がアレイであれば、アレイ上の指定位置に固定した二本鎖ＤＮＡにタンパクを固定化することができる。このようにタンパクを固定化することで、専用の器具を用いなくても直接ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ法によるタンパクの同定を行うことも可能である。さらに、タンパクの転写因子を二本鎖ＤＮＡに固定化しておけば、それを阻害するタンパクの探索も可能であり、新薬開発にも有用なものとなる。その他、このようなＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイスを用いることで、このデバイス上で固定されたタンパクを利用した酵素反応や、当該酵素と反応する物質の探索を行うことが可能となる。

本発明のＰＣＲプライマーを利用することで、ＰＣＲには関与しないタグ部を備えたＰＣＲ増幅産物を極めて簡易なＰＣＲ法で得ることができ、この増幅産物を用いれば、二本鎖ＤＮＡを担体に固定化したデバイスや、そのデバイス上の二本鎖ＤＮＡにタンパクを固定化したデバイス、さらにタンパクと二本鎖ＤＮＡの複合体を固定化したデバイスを高率で得ることが可能である。また、特にタグ部としてＬ-ＤＮＡを適用した場合には、ＰＣＲの鋳型とはなり得ないタグ部の塩基配列を自由に設計できるため、二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ-タンパク複合体の担体への固定化の際に、正確に位置指定を行うことができ、複数種類の二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ-タンパク複合体の固定化が容易に可能となる。さらに、斯かるデバイスを利用することで、極めて効率のよいＤＮＡ、タンパク、ＤＮＡ-タンパク複合体の検出、デバイス上での酵素反応など、広範囲にわたる応用が可能である。

本発明の一実施形態におけるＰＣＲ工程とＰＣＲ増幅産物のＤＮＡチップへの固定化工程を示す概念図である。 同実施形態におけるＰＣＲ増幅産物とタンパクの複合体生成工程と同複合体のアレイへの固定工程、アレイに固定したＰＣＲ増幅産物とタンパクの複合体生成工程を示す概念図である。 実施例１で用いるプライマーセットを示す図である。 実施例２のDenaturing PAGE結果を示す図である。 実施例３で作成したＬ-ＤＮＡマイクロアレイの部分拡大概念図である。 実施例４のSPR差イメージング画像を示す図である。 実施例５のＰＣＲ増幅産物固定化確認試験の工程を示す概念図、及びSPR差イメージング結果を示すグラフである。 実施例６のＬ-ＤＮＡマイクロアレイ上のＬ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡ部へのタンパクの固定化試験を示す図である。

以下、本発明の実施形態を、図面を参照して説明する。
図１は、本発明の一実施形態として、ＰＣＲプライマー１を用いたＰＣＲの工程と、当該ＰＣＲによる増幅産物３をＤＮＡ担持用デバイスの一種であるＤＮＡマイクロアレイ４へ固定して二本鎖ＤＮＡ修飾デバイス５を得る工程を示す概念図である。同図において左側のフロー（ａ）に、本実施形態に係るＰＣＲプライマー１を利用した工程を示し、この工程と比較のために、右側のフロー（ｂ）に、通常のＰＣＲプライマー１’を利用した工程を示す。

フロー（ａ）の本実施形態では、ＰＣＲプライマー１として、ＰＣＲによる増幅目的である対象天然型ＤＮＡ領域０（以下、「対象領域０」と称する）の二本鎖のうち一方の５’末端側と相補的塩基配列を有する天然型（Ｄ型）オリゴヌクレオチドからなるプライマー本体部１１と、このプライマー本体部１１の５’末端に繋げたタグ部１２とを有するものである。本実施形態においてタグ部１２には、ＰＣＲでは増幅されない物質の一例として、非天然型（Ｌ型）オリゴヌクレオチドを採用している。そして、このようなＰＣＲプライマー１をフォワードプライマーとして用い、リバースプライマー２として、対象天然型ＤＮＡ領域０の二本鎖のうち他方の３’末端側と相補的塩基配列を有するＤ型オリゴヌクレオチドを採用し、これらフォワードプライマー（ＰＣＲプライマー１）とリバースプライマー２をプライマーセット１０としてＰＣＲ法を行うこととする。一方、本実施形態と比較されるフロー（ｂ）におけるＰＣＲ法で用いるプライマーセット１０’では、フォワードプライマー１’として、前記ＰＣＲプライマー１のプライマー本体部１１と同一のプライマー本体部１１’の５’末端にＤ型オリゴヌクレオチドからなるタグ部１２’を繋いだものを採用し、リバースプライマー２’として前記リバースプライマー２と同一のオリゴヌクレオチドを用いることとする。なお、タグ部１２，１２’の塩基配列は、対象領域０の５’に隣接する上流側の配列と相補的にならない配列を選択する。以下では説明の便宜上、フロー（ａ）におけるＰＣＲプライマー１を、「Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマー１」と称し、フロー（ｂ）におけるＰＣＲプライマー１’を、「Ｄ-ＤＮＡタグ付プライマー１’」と称することとする。なお、フロー（ａ）（ｂ）では、プライマーセット１０，１０’以外のＰＣＲ反応条件を同一にしておく。

ＤＮＡマイクロアレイ４，４’には、一般的に用いられるマイクロアレイ用基板を担体４１、４１’とすることができ、この担体４１、４１’に固定されてタグ部１２，１２’と特異的に結合する物質として当該タグ部１２、１２’の相補鎖からなるＤＮＡプローブを適用する。すなわち、フロー（ａ）で用いるＤＮＡプローブ４２には、タグ部１２の相補鎖であるＬ-ＤＮＡプローブを適用し、フロー（ｂ）で用いるＤＮＡプローブ４２’には、タグ部１２’の相補鎖であるＤ-ＤＮＡプローブを適用する。なお、説明の簡易化のため、各担体４１、４１’には、それぞれ一種類のＤＮＡプローブ４２，４２’を固定した場合を示す。

まず、通常のＰＣＲであるフロー（ｂ）について説明する。対象領域０を含む試料ゲノムを鋳型とする１回目のＰＣＲサイクルでは、フォワードプライマーであるＤ-ＤＮＡタグ付プライマー１’から伸長した生成物は、対象領域０のみ二本鎖部分をなしさらに当該プライマー１’に由来するタグ部１２’が付加されたものであり、リバースプライマー２’から伸長した生成物は、対象領域０のみ二本鎖をなしたものである。これら生成物のうち対象領域０以外の部分を含む一本鎖を除く一本鎖を鋳型とする２回目以降のＰＣＲサイクルでは（なお、試料ゲノム、及び対象領域０以外の部分を含む一本鎖を鋳型として進行する２回目以降のＰＣＲサイクルについては省略する）、Ｄ-ＤＮＡタグ付プライマー１’から伸長した生成物は、対象領域０のみ二本鎖部分をなしその一方の５’末端にタグ部１２’が付加されたものであり、リバースプライマー２’から伸長した生成物は、対象領域０及びタグ部１２’共に二本鎖をなしたものである。そして、最終的に得られる主たるＰＣＲ増幅産物３’は、対象領域０よりもタグ部１２’に相当する分だけ長い通常の二本鎖ＤＮＡである。このようなＰＣＲ増幅産物３’をＤＮＡマイクロアレイ４’に固定化する場合、まず、ＰＣＲ増幅産物３’を熱融解により２本の一本鎖ＤＮＡにした後、これをＤＮＡマイクロアレイ４’に接触させることで、タグ部１２’を有する側の一本鎖ＤＮＡが当該タグ部１２’とＤ-ＤＮＡプローブ４２’とのアニーリングにより固定化される。この結果、タグ部１２’のみがＤＮＡプローブ４２’と二本鎖を形成しその他の部分では一本鎖のＤＮＡがＤＮＡマイクロアレイ４’に固定化された一本鎖ＤＮＡ修飾デバイス５’が得られる。

次に本実施形態のＰＣＲであるフロー（ａ）について説明する。対象領域０を含む試料ゲノムを鋳型とする１回目のＰＣＲサイクルでは、フォワードプライマーであるＬ-ＤＮＡタグ付プライマー１から伸長した生成物は、対象領域０のみ二本鎖部分をなしさらに当該プライマー１に由来するタグ部１２が付加されたものであり、リバースプライマー２’から伸長した生成物は、フロー（ｂ）と同じく対象領域０のみ二本鎖をなしたものである。これら生成物のうち対象領域０以外の部分を含む一本鎖を除く一本鎖を鋳型とする２回目以降のＰＣＲサイクルでは（なお、上の説明と同じく、試料ゲノム、及び対象領域０以外の部分を含む一本鎖を鋳型として進行するＰＣＲサイクルについては省略する）、タグ部１２は鋳型としてもプライマーとしても機能しないので、このＬ-ＤＮＡタグ付プライマー１から伸長した生成物とリバースプライマー２から伸長した生成物は共に、対象領域０のみ二本鎖をなしその一方の５’末端にタグ部１２が付加されたものである。つまりこの生成物が、主たる最終生成物であるＰＣＲ増幅産物３となり、このＰＣＲ増幅産物３は、対象領域０と同一の二本鎖ＤＮＡ部３１と、この二本鎖ＤＮＡ部３１の二本鎖のうち一方の５’末端に接続された一本鎖のＬ-ＤＮＡからなるタグ部１２とから構成されるものである。このＰＣＲ増幅産物３をＤＮＡマイクロアレイ４に固定化する場合、このＰＣＲ増幅産物３を熱融解することなく、ＤＮＡマイクロアレイ４に接触させることで、タグ部１２がＬ-ＤＮＡプローブ４２とアニーリングすることにより、二本鎖部分はそのままで固定化される。この結果、タグ部１２から二本鎖ＤＮＡ部３１を含めて全体が二本鎖のＤＮＡがＤＮＡマイクロアレイ４に固定化された二本鎖ＤＮＡ修飾デバイス５が得られる。

すなわち、フロー（ａ）をフロー（ｂ）と比較すれば明らかなように、Ｄ-ＤＮＡタグ付プライマー１’を用いたＰＣＲ法を行うと全体が二本鎖のＰＣＲ増幅産物３’が生成されるため、ＤＮＡマイクロアレイ４’への固定化に際してＰＣＲ増幅産物３’を一本鎖ＤＮＡに熱融解する工程が必須であり、固定化されたＤＮＡもタグ部１２’を除いて一本鎖であるのに対して、Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマー１を用いたＰＣＲ法を行うと、当該プライマー１のうちＬ-ＤＮＡであるタグ部１２が一本鎖のまま残り他はＤ-ＤＮＡ二本鎖構造をとるＰＣＲ増幅産物３が生成されるため、ＤＮＡマイクロアレイ４への固定化に際してＰＣＲ増幅産物３を熱融解する工程が不要となり、固定化されたＤＮＡもタグ部１２を含んで全体が二本鎖である。したがって、このようなＤＮＡマイクロアレイ４へのＰＣＲ増幅産物３の固定化手法は、例えばＰＣＲ増幅産物３に蛍光標識などを施しておくことで、斯かるＰＣＲ増幅産物３たるＤＮＡの検出方法としても応用することが可能である。

また、フロー（ａ）のＰＣＲ法で得られたＰＣＲ増幅産物３の二本鎖ＤＮＡ部３１に、ＤＮＡの特定塩基配列を認識する特定タンパク６を結合させると、図２（ａ）に示すようなＤＮＡ-タンパク複合体７を生成することが可能である。ここで、ＤＮＡの特定塩基配列及び当該配列を認識するタンパクは、両者の関係が維持された組み合わせである限り特に限定されない。このＤＮＡ-タンパク複合体７は、ＰＣＲ増幅産物３のうちＬ-ＤＮＡからなるタグ部１２をそのまま有している。したがって、同図（ａ）に示すように、上述したＤＮＡマイクロアレイ４と同様、基板８１にタグ部１２と特異的に結合する物質（ここではＬ-ＤＮＡプローブ８２）を備えたデバイス（ここでは、タンパク担持用デバイス８と称する）上において、タグ部１２とプローブ８２とのハイブリダイゼーションによってＤＮＡ-タンパク複合体７を固定化することができる。この固定化手法は、ＤＮＡ-タンパク複合体７の検出方法としても利用することができ、ＤＮＡ-タンパク複合体７を固定化させたタンパク担持用デバイス８は、アレイ上の所定位置にタンパクを固定したＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイス９（いわゆる、プロテインチップ）として利用することが可能である。勿論、このようなＤＮＡ-タンパク複合体７やＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイス９は、フロー（ｂ）においてＤＮＡマイクロアレイ４’に固定された一本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物３’を熱融解したもの）では得ることができない。

さらに、このようなＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイス９は、図２（ｂ）に示すように、予め前述の二本鎖ＤＮＡ修飾デバイス５を作製しておき、その二本鎖ＤＮＡ部３１の特定塩基配列に対して特定タンパク６を結合させることによっても作製することができる。このようなＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイス９の作製方法であれば、特定タンパク６のスクリーニングに利用することも可能である。また、前者後者いずれの方法で作製しても、ＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイス９の用途例としては、アレイ上での特定タンパク６による酵素反応、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ法による当該特定タンパク６の同定、特定タンパク６と相互反応するタンパクの探索、等を挙げることができる。

なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲であれば、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲ増幅産物、各種デバイスに関する具体的構成を適宜変更することができるし、ＰＣＲ法やＤＮＡ検出法等については必要に応じて適宜条件設定を行えばよい。

＜１．Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーの合成＞ 本発明の一実施例として、Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーを２種合成した。この合成は、アプライドバイオシステムズ社製392DNA/RNA自動合成機を用い、1.0mmolスケールにて標準合成プロトコルに従って行ったものである。図３にプライマーセットＡ，Ｂとして、フォワードプライマーたる両Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーと、それらに対応するリバースプライマーを示す。なお、これらのＰＣＲセットを用いて行うＰＣＲ法は、本実施例ではプラスミドpUC18を鋳型とするものであるので、各Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーにおけるプライマー本体部１１及びリバースプライマーは、pUC18が有する塩基配列に対応させてある。各Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーは、斯かる天然型（Ｄ型）ＤＮＡ鎖からなるプライマー本体部１１を３’末端側に有し、プライマー本体部１１の５’末端側に非天然型（Ｌ型）ＤＮＡ鎖からなるタグ部１２を有しており、さらにプライマー本体部１１とタグ部１２との間に、Ｌ型ＤＮＡ鎖からなるスペーサ部１３を設けている。斯かるスペーサ部１３は、タグ部１２に基づくＬ型二本鎖ＤＮＡとプライマー本体部１１に基づくＤ型二本鎖ＤＮＡの立体的な混雑解消のために加えたものであり、タグ部１２と同じくＬ型であるためにプライマー本体部１２に基づくＰＣＲの鋳型とはならない。

すなわち各Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーは、５’末端側から、タグ部１２、スペーサ部１３、プライマー本体部１１をこの順で繋げたものであるといえる。ここで、タグ部１２は、Ｌ型ＤＮＡを任意の塩基配列を任意の塩基数で構成することができるが、塩基数としては１５〜２５とするのが好ましく、本実施例では20 merとしている。また、スペーサ部１３も、タグ部１２と同じくＬ型ＤＮＡを任意の塩基配列を任意の塩基数で構成することができるが、上述のようにＬ型二本鎖ＤＮＡとＤ型二本鎖ＤＮＡの立体的混雑性の解消という目的からは塩基数を数merとすれば十分であり、本実施例ではチミン（Ｔ）を３つ並べたものを採用している。なお、後述するＰＣＲ増幅産物のＤＮＡチップへの固定確認試験のため、プライマーセットＢにおけるリバースプライマーには、通常のプライマーの他に、５’末端をビオチン（biotin）標識したプライマーも作製した。

＜２．Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーを含むプライマーセットを用いたＰＣＲ反応＞ 本発明の一実施例として、上記実施例１で作製したプライマーセットＡ，Ｂを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、プライマー濃度：500 nM， Taq polymerase Master Mix（QIAGEN）：100 pg/ml，ＰＣＲサイクル：３５サイクル（94℃ Ｘ 30秒, 55℃ Ｘ
30秒, 72℃ Ｘ 1分）である。なお、プライマーセットＡ，Ｂを用いたＰＣＲ反応は１つのチューブ内で同時に行うことが可能であるが、本実施例では別々に行っている。このようなＰＣＲ反応により得られた増幅産物において、各両Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーのタグ部１２及びスペーサ部１３がＰＣＲ伸長反応の鋳型となっていないことを確認するため、両ＰＣＲ増幅産物について、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にして行う熱融解ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Denaturing PAGE）を、8% Polyacrylamide，7M ureaの条件にて実施した。その結果を図４に示す。

同図（ａ）は、プライマーセットＡを用いたＰＣＲの増幅産物を対象としたDenaturing
PAGEの写真である。この結果から、このＰＣＲでは、96 merの一本鎖と119 mer の一本鎖がハイブリダイズしたものが増幅産物として得られていることが分かる。96 merの一本鎖はリバースプライマーから伸長したものであり、119 mer の一本鎖はフォワードプライマー（Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマー）から伸長したものである。両者の塩基数の差である20 merは、タグ部１２の20 mer とスペーサ部１３の3 merの合計に相当する。同図（ｂ）は、プライマーセットＢを用いたＰＣＲの増幅産物を対象としたDenaturing PAGEの写真である。この結果から、このＰＣＲでは、123 merの一本鎖と146 mer の一本鎖がハイブリダイズしたものが増幅産物として得られていることが分かる。123 merの一本鎖はリバースプライマーから伸長したものであり、146mer の一本鎖はフォワードプライマー（Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマー）から伸長したものである。両者の塩基数の差である20 merは、タグ部１２の20 mer とスペーサ部１３の3 merの合計に相当する。以上の結果から、Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーを含むプライマーセットを用いると、Ｌ-ＤＮＡ鎖からなるタグ部１２とスペーサ部１３はポリメラーゼ伸長反応の鋳型とはならないことが示された。

＜３．Ｌ-ＤＮＡマイクロアレイの作成＞ 上記実施例２で得られたＰＣＲ増幅産物をハイブリダイズさせるためのＤＮＡ担持用デバイスとして、ＤＮＡマイクロアレイを作成した。作成に際しては、東洋紡社製アミノ修飾SPRイメージングチップを、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド-ポリエチレングリコール（10 mg/ml，MW 3400，NHS-PEG₁₂-MAL，Quanta Biodesign）を反応させ、マレイイミドを固定化した。続いて、10 mM 3’-チオール標識Ｌ-ＤＮＡを東洋紡社製自動スポッターでスポットし、一晩反応させた。さらに、未反応マレイイミドをキャッピングするために、チップを300mLの10mg/mL
ＰＥＧ−ｔｈｉｏｌに浸し、１時間反応させた後、チップをリン酸バッファー（10 mM phosphate : pH 7.2 and 150 mM NaCl）でよく洗浄し、実験に用いた。

そして、プライマーセットＡ，Ｂにおける各Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーのタグ部１２に相補的なＬ-ＤＮＡ鎖を、表面プラズモン共鳴差イメージング測定用のアレイ（東洋紡社製）に固定化した。この固定化には、３’末端をチオール化したＬ-ＤＮＡ鎖を合成して用い、上述のマレイイミド固定化アレイと反応させた。アレイ上に固定化した各プローブ（Ｌ-ＤＮＡプローブ）のアドレスの部分拡大概念図を図５に示す。すなわち、プライマーセットＡのタグ部１２に相補的なプローブ、プライマーセットＢのタグ部１２に相補的なプローブ、対照としてalkyl-Sを、アレイ上に交互に固定している。以下、このマイクロアレイを、「Ｌ-ＤＮＡマイクロアレイ」と称する。

＜４．Ｌ-ＤＮＡマイクロアレイ上へのＰＣＲ増幅産物のハイブリダイゼーション＞
実施例２で得た２つのＰＣＲ増幅産物を、実施例３で作成したマイクロアレイ上に加え、表面プラズモン共鳴差イメージングの変化を観測した。具体的には、Ｌ-ＤＮＡマイクロアレイを東洋紡社製SPRイメージング装置（MultiSPRinter）にセットし、リン酸バッファー（10 mM phosphate : pH 7.2 and 150mM NaCl）を表面に流速100 ml/minで流し、30℃で安定化させた。そして、ＰＣＲ増幅産物をリン酸バッファーに溶解してチップ上に流し、SPRイメージングを測定した。その後、ＰＣＲ増幅産物からリン酸バッファーに代えて、固定化後の状態を安定化させた。ＰＣＲ増幅産物を流す前後のSPRイメージングの差を取ることにより、SPR差イメージを得た。図６（ａ）に、プライマーセットＡによりＰＣＲ増幅産物をハイブリダイズさせた際のSPRイメージング画像、同図（ｂ）にプライマーセットＢによりＰＣＲ増幅産物をハイブリダイズさせた際のSPRイメージング画像を示す。それぞれ、Ｌ-ＤＮＡタグ付プライマーのタグ部１２がＬ-ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたアレイ上で、SPRシグナルの変化（濃色部分）が観測されている。すなわち、ＰＣＲに用いたＬ-ＤＮＡタグ付プライマーに対応したＬ-ＤＮＡプローブにＰＣＲ増幅産物が選択的に固定化された。

＜５．ＰＣＲ増幅産物のＬ-ＤＮＡマイクロアレイ上への固定化の確認＞ 二本鎖ＤＮＡ部がそのままの状態でＰＣＲ増幅産物がアレイ上に固定化されていることを確認するため、プライマーセットＢのリバースプライマーをビオチンで標識し（実施例２、図３参照）、それを用いたＰＣＲの増幅産物３を、実施例４の通り二本鎖ＤＮＡ部３１を熱融解することなく、タグ部１２とＬ-ＤＮＡプローブ４２との結合によりＬ-ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化した後、ビオチンをアビジン（Streptavidine(SA)）と結合させ、そのアビジンと抗アビジン抗体（Antibodt to SA）との結合を観測した。この試験の工程を概念図として図７（ａ）に示す。また同図（ｂ）に、ＰＣＲ増幅産物３の固定化前後のSPRイメージング測定結果をグラフで示す。同図から明らかなように、ＰＣＲ増幅産物３の固定化後、アビジンを流すとSPRシグナル強度が上昇し、アビジンがＰＣＲ増幅産物３に標識されたビオチンに結合したことが示された。続いて、抗アビジン抗体を添加すると大きなシグナル上昇が観測された。ブランクでは、アビジン、抗アビジン抗体によるシグナル強度上昇は観測されなかったので、プライマーセットＢのリバースプライマーがアレイ上に固定化されていること、すなわちＰＣＲ増幅産物である二本鎖ＤＮＡが固定化されていることが確認された。

＜６．Ｌ-ＤＮＡマイクロアレイ上のＬ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡ部へのタンパクの固定化＞ Ｌ-ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化させたＬ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡに対し、ＤＮＡ認識タンパク（制限酵素EcoRI）を結合させる試験を行った。但し、EcoRIによりＤＮＡが切断されないように、メディアからマグネシウムイオン（MG²⁺）を除いている。この試験では、実施例３と同様に作成した３’末端をチオール化したＬ-ＤＮＡマイクロアレイに、EcoRI認識配列を有する二本鎖Ｄ-ＤＮＡ鎖の一方に実施例１と同様のＬ-ＤＮＡ鎖からなる一本鎖のタグ部及びスペーサ部を有するＬ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡを結合させることとした。図８（ａ）に、Ｌ-ＤＮＡマイクロアレイに固定化させたプローブと、Ｌ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡを示す。また、同図（ｂ）に、Ｌ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡのＬ-ＤＮＡマイクロアレイ上への固定化前からＬ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡへのEcoRIの結合後までに亘るSPRイメージング測定結果をグラフで示す。同図から明らかなように、１）プローブにＬ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡのタグ部が固定化されたアドレスでは、当該固定化によりSPRシグナルの増大が観測されたが、ブランクではシグナルの増大は観測されない。続いて、２）EcoRIの固定化段階では、指定アドレス、ブランク共にシグナルが増大しているが、これはバッファーが交換されることに起因する。そして、３）表面の洗浄により、指定アドレスでのSPRシグナルがEcoRIの固定化前よりも増大していることが観測されたが、ブランクではシグナルの増大していない。以上により、Ｌ-ＤＮＡマイクロアレイ上のＬ-ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡ部へタンパク（EcoRI）が固定化されたことが確認された。

ＰＣＲには直接は関与しないタグ部を備えたＰＣＲ増幅産物を通常のＰＣＲ法で得ることができ、この増幅産物を利用することで、二本鎖ＤＮＡを担体に固定化したデバイスや、そのデバイス上の二本鎖ＤＮＡにタンパクを固定化したデバイス、さらにタンパクと二本鎖ＤＮＡの複合体を固定化したデバイスが得られる。このような本発明は、極めて効率のよいＤＮＡ、タンパク、ＤＮＡ-タンパク複合体の検出、デバイス上での酵素反応などといった分野での利用が可能である。

【０００３】
いといえる。
［０００６］
そこで本発明は、上述した従来の問題点を解消することを課題とし、極めて簡便な方法で得られるＰＣＲプライマーを創出・提供するとともに、当該プライマーを用いた応用性の広い技術をも提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
［０００７］
すなわち本発明のＰＣＲプライマーは、試料中の対象天然型ＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅させる際に用いられるものであって、対象ＤＮＡ領域の二本鎖のうち一方の５’末端側と相補的配列を有するＤＮＡ鎖からなるプライマー本体部と、このプライマー本体部の５’末端に修飾され且つＰＣＲに関与しないＬ型ＤＮＡ鎖からなるタグ部とを有してなることを特徴とする。
［０００８］
このようなＰＣＲプライマーであれば、プライマー本体部において従来通りのＰＣＲを行って所望の塩基配列を有する増幅産物を得ることが可能である。つまり、プライマー本体部には、従来のＰＣＲで用いるプライマーと同様に、目的とするゲノム等の試料ＤＮＡにおける対象領域に応じて適宜設計すればよい。特にタグ部は、プライマー本体部によるＰＣＲでは鋳型とならず増幅もされないため、斯かるＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる増幅産物は、目的である対象ＤＮＡ領域と同一配列の二本鎖ＤＮＡにタグ部を付加した形態をとる。したがって、本発明のＰＣＲプライマーは、後段で詳述する様々な応用技術に利用することが可能である。また本発明のＰＣＲプライマーを用いれば、１回のＰＣＲ工程を行うだけで目的の増幅産物を得られ、極めて迅速且つ簡便な処理が可能である。ここで、プライマー本体部とタグ部は、直接的に隣接していてもよいし、両者の間に他の物質を介在させていてもよい。
［０００９］
特に、プライマー本体部とタグ部とを直接的に隣接させない本発明のＰＣＲプライマーの一態様としては、プライマー本体部とタグ部との間に、ＰＣＲにより増幅されない物質からなるスペーサ部を介在させたものを挙げることができる。この場合、スペーサ部の存在によって、プライマー本体部とその相補鎖とによる二本鎖ＤＮＡとタグ部との

【０００４】
間での立体的混雑性を緩和することができる。
［００１０］
本発明では、タグ部として非天然型であるＬ型ＤＮＡ鎖（以下、必要に応じて「Ｌ−ＤＮＡ」と称する）を採用している。ゲノムを始めとする二本鎖の天然型ＤＮＡはＤ型（以下、必要に応じて「Ｄ−ＤＮＡ」と称する）であるのに対して、Ｌ−ＤＮＡは非天然型であるため、Ｄ−ＤＮＡを鋳型とする通常のＰＣＲにおいてはＬ−ＤＮＡからなるタグ部はＰＣＲにおけるプライマーとはなり得ない。したがって、このＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うと、天然型の二本鎖ＤＮＡの一方に一本鎖のＬ−ＤＮＡ鎖がタグ付けされた態様を有していることになる。なお、タグ部のＬ−ＤＮＡにおける塩基配列や塩基数は特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜決定すればよい。
［００１１］
前記プライマー本体部と前記タグ部との間に介在させるスペーサ部として好ましいものには、非天然型であるＬ型ＤＮＡ鎖を挙げることができる。このスペーサ部により、例えばＰＣＲ増幅産物のタグ部（Ｌ−ＤＮＡ）をその相補鎖に結合させた場合、二本鎖Ｄ−ＤＮＡと二本鎖Ｌ−ＤＮＡが近い位置に存在することによる立体的な混雑を解消することができる。なお、スペーサ部として採用するＬ−ＤＮＡ鎖における塩基配列や塩基数は特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜決定すればよい。Ｌ−ＤＮＡの他、スペーサ部に適用可能な物質としては、アルキル鎖、ペプチド、ペプチド核酸、糖鎖等を挙げることができる。
［００１２］
以上のようなＰＣＲプライマーを含む本発明のＰＣＲプライマーセットは、前述のＰＣＲプライマーをフォワードプライマーとして有し、対象ＤＮＡ領域の二本鎖のうち他方の３’末端側と相補的配列を有するＤＮＡ鎖からなるリバースプライマーとして有するものである。
［００１３］
また、本発明に係るＰＣＲ法は、上述のＰＣＲプライマーセットを用いて対象天然型ＤＮＡ領域に対応する二本鎖ＤＮＡ部と、この二本鎖ＤＮＡ部のうち一方において前記ＰＣＲプライマーに由来するタグ部とを有する増幅産物を得ることを特徴とするものであり、先述の如く対象天然型ＤＮＡ領域を含む領域を増幅することができる。このＰＣ

【０００５】
Ｒ法によれば、プライマー本体部の条件を近似させておくことで、複数種類の増幅産物を得るＰＣＲを同一チューブ内で同時に行うことも可能となり、ＰＣＲ処理に要する器具、手間、時間を大幅に削減することができる。
［００１４］
さらに、このＰＣＲ法で反応生成物たる増幅産物は、上述の通り、対象天然型ＤＮＡ領域に対応する二本鎖ＤＮＡ部と、当該二本鎖ＤＮＡ部のうち一方において前述のＰＣＲプライマーにおけるタグ部とを有していることを特徴とするものである。このようなＰＣＲ増幅産物は、プライマー本体部に基づいて増幅された天然型の二本鎖ＤＮＡ部分を有しているため極めて安定性がよく、後述するように様々な技術に利用可能である。
［００１５］
また、本発明に係るＤＮＡ担持用デバイスは、前述のＰＣＲプライマーにおけるタグ部を構成するＬ−ＤＮＡ鎖の相補鎖からなるＬ型ＤＮＡプローブと、該Ｌ型ＤＮＡプローブを固定化して担持する担体とを具備してなることを特徴とするものである。ここで、前記担体に固定化されるＬ型ＤＮＡプローブは、ＰＣＲプライマーにおけるタグ部のＬ−ＤＮＡの相補鎖（もちろん非天然型である）であるので、タグ部と特異的に結合する。また、担体には、一般的なＤＮＡチップに用いられる基板やビーズ等を適用することができる。なお、担体に固定化されるＬ型ＤＮＡプローブは、一種類でもよいし複数種類でもよい。そして、このようなＤＮＡ担持用デバイスを用いると、次のような二本鎖ＤＮＡ修飾デバイスを容易に得ることができる。
［００１６］
すなわち本発明に係る二本鎖ＤＮＡ修飾デバイスは、上述したＰＣＲ増幅産物及びＤＮＡ担持用デバイスを利用するものであって、ＤＮＡ担持用デバイスにおけるＬ型ＤＮＡプローブに、ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を結合させてなることを持徴とするものである。このような二本鎖ＤＮＡ修飾デバイスを用いれば、タグ部とそれに特異的な結合をするＬ型ＤＮＡプローブとを介し二本鎖ＤＮＡを、担体上の位置を指定して、特に担体がアレイであればそのアドレスを指定して、固定化することができる。したがってこのデバイスは、次に説明するようなＤＮＡ検出方法において検出処理の結果得られる生成物とみることもでき、また後述するようなデバイス上での酵素反応にも利用

【０００６】
することができる。
［００１７］
前述した本発明に係るＤＮＡ検出方法は、上述のＰＣＲ増幅産物とＤＮＡ担持用デバイスを用いる方法であって、ＤＮＡ担持用デバイスにおけるＬ型ＤＮＡプローブに対して、ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を当該ＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部を二本の単鎖ＤＮＡに解離させることなく結合させる工程を含むことを特徴とする。このような検出方法によれば、ＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡ部を改めて熱解離させる必要がないので、検出対象であるＰＣＲ増幅産物を劣化させることがなく、またＰＣＲ増幅産物のタグ部のみが確実に担体上に固定化されたＬ型ＤＮＡプローブと特異的な結合をするので、担体上における前記Ｌ型ＤＮＡプローブのほぼ全てに対して確実にＰＣＲ増幅産物を結合させることができる。なお、担体上には、ＰＣＲ増幅産物のタグ部と結合するＬ型ＤＮＡプローブを一種類のみならず複数種類固定化しておくこともできる。それにより、対応するタグ部を有する複数種類のＰＣＲ増幅産物を同時に検出することが可能である。
［００１８］
また、上述したＰＣＲ増幅産物を利用することで、次のものを創出することができる。すなわち本発明に係るＤＮＡ−タンパク複合体（タンパクを結合させた二本鎖ＤＮＡ）は、当該ＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部に、その二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させてなるものである。ここでタンパクは、二本鎖ＤＮＡ中における特定配列を認識して結合するものならば特に限定されるものではなく、一例として制限酵素を挙げることができる。斯かるＤＮＡ−タンパク複合体は、次に説明するようなタンパク担持用デバイスと共に用いることで、ＤＮＡ−タンパク複合体修飾デバイスとしての利用が可能である。
［００１９］
すなわち本発明に係るタンパク担持用デバイスは、前述のＰＣＲ増幅産物又はＤＮＡ−タンパク複合体の何れか一方又は両方におけるタグ部と特異的に結合するＬ型ＤＮＡプローブと、このＬ型ＤＮＡプローブを固定化して担持する担体とを具備してなるものである。なお、ＰＣＲ増幅産物を利用する場合には、その二本鎖ＤＮＡ部に、当該二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させ得るように構成する。このようなデバイスは、前記のＰＣＲ増幅産物やＤＮＡ−タンパク複合体の何れかのタグ部と結合するＬ型ＤＮＡプローブを備えているため、ＰＣＲ増幅産物やＤＮＡ−タンパク複合体の検出デバイスとして利用できるほかにも、次に説明するようなＤＮＡ−タンパク複合体修飾デバイスの基板

【０００７】
部分として利用することもできる。その結果、デバイス上の定まった位置にタンパクを固定化することが可能となる。また、担体上には、ＰＣＲ増幅産物やＤＮＡ−タンパク複合体のタグ部と結合するＬ型ＤＮＡプローブを一種類のみならず複数種類固定化しておくこともできる。それにより、対応するタグ部を有する複数種類のＰＣＲ増幅産物やＤＮＡ−タンパク複合体を同時に検出することが可能である。さらに担体には、一般的なＤＮＡチップ等に用いられる基板やビーズ等を適用することができる。
［００２０］
ＤＮＡ−タンパク複合体修飾デバイスは、前記ＤＮＡ−タンパク複合体とタンパク担持用デバイスを利用するものであって、タンパク担持用デバイスにおけるタグ部と特異的に結合するＬ型ＤＮＡプローブに、ＤＮＡ−タンパク複合体におけるタグ部を結合させてなることを特徴とするもの、或いは、前記のＰＣＲ増幅産物及びタンパク担持用デバイスを利用するものであって、タンパク担持用デバイスにおけるタグ部と特異的に結合するＬ型ＤＮＡプローブに、ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を結合させ、さらに当該ＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部に、その二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させてなることを特徴とするものである。これら両ＤＮＡ−タンパク複合体修飾デバイスは、最終形態は同様であるが、タンパクを予め二本鎖ＤＮＡに結合させてからタンパク担持用デバイスに固定してもよいし、ＰＣＲ増幅産物をタンパク担持用デバイスに固定した後で当該ＰＣＲ増幅産物に結合させてもよい。いずれにしても、担体上の決まった位置に二本鎖ＤＮＡを介してタンパクを固定化した態様のデバイス（プロテインチップと呼ぶこともできる）が得られる。特に前者の態様のＤＮＡ−タンパク複合体修飾デバイスにおいて担体がアレイであれば、タンパクと二本鎖ＤＮＡの複合体をアレイ上のアドレスを指定して固定することができ、後者の態様のＤＮＡ−タンパク複合体修飾デバイスにおいて担体がアレイであれば、アレイ上の指定位置に固定した二本鎖ＤＮＡにタンパクを固定化することができる。このようにタンパクを固定化することで、専用の器具を用いなくても直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法によるタンパクの同定を行うことも可能である。さらに、タンパクの転写因子を二本鎖ＤＮＡに固定化しておけば、それを阻害するタンパクの探索も可能であり、新薬開発にも有用なものとなる。その他、このようなＤＮＡ−タンパク複合体修飾デバイスを用いることで、このデバイス上で固定されたタンパクを利用した酵素反応や、当該酵素と反応

【０００８】
する物質の探索を行うことが可能となる。
【発明の効果】
［００２１］
本発明のＰＣＲプライマーを利用することで、ＰＣＲには関与しないタグ部を備えたＰＣＲ増幅産物を極めて簡易なＰＣＲ法で得ることができ、この増幅産物を用いれば、二本鎖ＤＮＡを担体に固定化したデバイスや、そのデバイス上の二本鎖ＤＮＡにタンパクを固定化したデバイス、さらにタンパクと二本鎖ＤＮＡの複合体を固定化したデバイスを高率で得ることが可能である。また、特にタグ部としてＰＣＲの鋳型とはなり得ないＬ−ＤＮＡ鎖を適用したため、タグ部の塩基配列を自由に設計でき、二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ−タンパク複合体の担体への固定化の際に、正確に位置指定を行うことができ、複数種類の二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ−タンパク複合体の固定化が容易に可能となる。さらに、斯かるデバイスを利用することで、極めて効率のよいＤＮＡ、タンパク、ＤＮＡ−タンパク複合体の検出、デバイス上での酵素反応など、広範囲にわたる応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
［００２２］
［図１］本発明の一実施形態におけるＰＣＲ工程とＰＣＲ増幅産物のＤＮＡチップへの固定化工程を示す概念図である。
［図２］同実施形態におけるＰＣＲ増幅産物とタンパクの複合体生成工程と同複合体のアレイへの固定工程、アレイに固定したＰＣＲ増幅産物とタンパクの複合体生成工程を示す概念図である。
［図３］実施例１で用いるプライマーセットを示す図である。
［図４］実施例２のＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＰＡＧＥ結果を示す図である。
［図５］実施例３で作成したＬ−ＤＮＡマイクロアレイの部分拡大概念図である。
［図６］実施例４のＳＰＲ差イメージング画像を示す図である。
［図７］実施例５のＰＣＲ増幅産物固定化確認試験の工程を示す概念図、及びＳＰＲ差イメージング結果を示すグラフである。
［図８］実施例６のＬ−ＤＮＡマイクロアレイ上のＬ−ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡ部へのタンパクの固定化試験を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】

【０００９】
［００２３］
以下、本発明の実施形態を、図面を参照して説明する。
図１は、本発明の一実施形態として、ＰＣＲプライマー１を用いたＰＣＲの工程と、当該ＰＣＲによる増幅産物３をＤＮＡ担持用デバイスの一種であるＤＮＡマイクロアレイ４へ固定して二本鎖ＤＮＡ修飾デバイス５を得る工程を示す概念図である。同図において左側のフロー（ａ）に、本実施形態に係るＰＣＲプライマー１を利用した工程を示し、この工程と比較のために、右側のフロー（ｂ）に、通常のＰＣＲプライマー１’を利用した工程を示す。
［００２４］
フロー（ａ）の本実施形態では、ＰＣＲプライマー１として、ＰＣＲによる増幅目的である対象天然型ＤＮＡ領域０（以下、「対象領域０」と称する）の二本鎖のうち一方の５’末端惻と相補的塩基配列を有する天然型（Ｄ型）オリゴヌクレオチドからなるプライマー本体部１１と、このプライマー本体部１１の５’末端に繋げたタグ部１２とを有するものである。本実施形態においてタグ部１２には、ＰＣＲでは増幅されない非天然型であるＬ型オリゴヌクレオチドを採用している。そして、このようなＰＣＲプライマー１をフォワードプライマーとして用い、リバースプライマー２として、対象天然型ＤＮＡ領域０の二本鎖のうち他方の３’末端側と相補的塩基配列を有するＤ型オリゴヌクレオチドを採用し、これらフォワードプライマー（ＰＣＲプライマー１）とリバースプライマー２をプライマーセット１０としてＰＣＲ法を行うこととする。一方、本実施形態と比較されるフロー（ｂ）におけるＰＣＲ法で用いるプライマーセット１０’では、フォワードプライマー１’として、前記ＰＣＲプライマー１のプライマー本体部１１と同一のプライマー本体部１１’の５’末端にＤ型オリゴヌクレオチドからなるタグ部１２’を繋いだものを採用し、リバースプライマー２’として前記リバースプライマー２と同一のオリゴヌクレオチドを用いることとする。なお、タグ部１２，１２’の塩基配列は、対象領域０の５’に隣接する上流側の配列と相補的にならない配列を選択する。以下では説明の便宜上、フロー（ａ）におけるＰＣＲプライマー１を、「Ｌ−ＤＮＡタグ付プライマー１」と称し、フロー（ｂ）におけるＰＣＲプライマー１’を、「Ｄ−ＤＮＡタグ付プライマー１’」と称することとする。なお、フロー（ａ）（ｂ）では、プライマーセット１０，１０’以外のＰＣＲ反応条件を同一にしておく。
［００２５］
ＤＮＡマイクロアレイ４，４’には、一般的に用いられるマイクロアレイ用基板を担体４１、４１’とすることができ、この担体４１、４１’に固定されてタグ部１２，１２’と特異的に

【００１３】
［００３２］
＜１．Ｌ−ＤＮＡタグ付プライマーの合成＞ 本発明の一実施例として、Ｌ−ＤＮＡタグ付プライマーを２種合成した。この合成は、アプライドバイオシステムズ社製３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用い、１．０ｍｍｏｌスケールにて標準合成プロトコルに従って行ったものである。図３にプライマーセットＡ，Ｂとして、フォワードプライマーたる両Ｌ−ＤＮＡタグ付プライマーと、それらに対応するリバースプライマーを示す。なお、これらのＰＣＲセットを用いて行うＰＣＲ法は、本実施例ではプラスミドｐＵＣ１８を鋳型とするものであるので、各Ｌ−ＤＮＡタグ付プライマーにおけるプライマー本体部１１及びリバースプライマーは、ｐＵＣ１８が有する塩基配列に対応させてある。各Ｌ−ＤＮＡタグ付プライマーは、斯かる天然型（Ｄ型）ＤＮＡ鎖からなるプライマー本体部１１を３’末端側に有し、プライマー本体部１１の５’末端側に非天然型であるＬ型ＤＮＡ鎖からなるタグ部１２を有しており、さらにプライマー本体部１１とタグ部１２との間に、Ｌ型ＤＮＡ鎖からなるスペーサ部１３を設けている。斯かるスペーサ部１３は、タグ部１２に基づくＬ型二本鎖ＤＮＡとプライマー本体部１１に基づくＤ型二本鎖ＤＮＡの立体的な混雑解消のために加えたものであり、タグ部１２と同じくＬ型であるためにプライマー本体部１２に基づくＰＣＲの鋳型とはならない。
［００３３］
すなわち各Ｌ−ＤＮＡタグ付プライマーは、５’末端側から、タグ部１２、スペーサ部１３、プライマー本体部１１をこの順で繋げたものであるといえる。ここで、タグ部１２は、Ｌ型ＤＮＡを任意の塩基配列を任意の塩基数で構成することができるが、塩基数としては１５〜２５とするのが好ましく、本実施例では２０ｍｅｒとしている。また、スペーサ部１３も、タグ部１２と同じくＬ型ＤＮＡを任意の塩基配列を任意の塩基数で構成することができるが、上述のようにＬ型二本鎖ＤＮＡとＤ型二本鎖ＤＮＡの立体的混雑性の解消という目的からは塩基数を数ｍｅｒとすれば十分であり、本実施例ではチミン（Ｔ）を３つ並べたものを採用している。なお、後述するＰＣＲ増幅産物のＤＮＡチップへの固定確認試験のため、プライマーセットＢにおけるリバースプライマーには、通常のプライマーの他に、５’末端をビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）標識したプライマーも作製した。
［００３４］
＜２．Ｌ−ＤＮＡタグ付プライマーを含むプライマーセットを用いたＰＣＲ反応＞ 本発明の一実施例として、上記実施例１で作製したプライマーセットＡ，Ｂを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、プライマー濃度：５００ｎＭ，Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑ

【００１７】
ブランク共にシグナルが増大しているが、これはバッファーが交換されることに起因する。そして、３）表面の洗浄により、指定アドレスでのＳＰＲシグナルがＥｃｏＲＩの固定化前よりも増大していることが観測されたが、ブランクではシグナルの増大していない。以上により、Ｌ−ＤＮＡマイクロアレイ上のＬ−ＤＮＡタグ付二本鎖ＤＮＡ部へタンパク（ＥｃｏＲＩ）が固定化されたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
［００４１］
ＰＣＲには直接は関与しないＬ型ＤＮＡ鎖からなるタグ部を備えたＰＣＲ増幅産物を通常のＰＣＲ法で得ることができ、この増幅産物を利用することで、二本鎖ＤＮＡを担体に固定化したデバイスや、そのデバイス上の二本鎖ＤＮＡにタンパクを固定化したデバイス、さらにタンパクと二本鎖ＤＮＡの複合体を固定化したデバイスが得られる。このような本発明は、極めて効率のよいＤＮＡ、タンパク、ＤＮＡ−タンパク複合体の検出、デバイス上での酵素反応などといった分野での利用が可能である。

Claims (14)

1. 試料中の対象天然型ＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅させる際に用いられるＰＣＲプライマーであって、前記対象ＤＮＡ領域の二本鎖のうち一方の５’末端側と相補的配列を有するＤＮＡ鎖からなるプライマー本体部と、当該プライマー本体部の５’末端に修飾され且つＰＣＲに関与しない物質からなるタグ部とを有してなることを特徴とするＰＣＲプライマー。
2. 前記プライマー本体部と前記タグ部との間に、ＰＣＲにより増幅されない物質からなるスペーサ部を介在させている請求項１に記載のＰＣＲプライマー。
3. 試料中の対象天然型ＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅させる際に用いられるＰＣＲプライマーであって、前記対象ＤＮＡ領域の二本鎖のうち一方の５’末端側と相補的配列を有するＤＮＡ鎖からなるプライマー本体部と、該プライマー本体部の５’末端に修飾された非天然型ＤＮＡ鎖からなるタグ部とを有してなることを特徴とするＰＣＲプライマー。
4. 前記プライマー本体部と前記タグ部との間に、非天然型ＤＮＡ鎖からなるスペーサ部を介在させている請求項３に記載のＰＣＲプライマー。
5. 請求項１乃至４の何れかに記載のＰＣＲプライマーをフォワードプライマーとして有し、前記対象ＤＮＡ領域の二本鎖のうち他方の３’末端側と相補的配列を有するＤＮＡ鎖からなるリバースプライマーとして有することを特徴とするＰＣＲプライマーセット。
6. 試料中の対象天然型ＤＮＡ領域を含む領域を増幅する方法であって、請求項５に記載のＰＣＲプライマーセットを用い、前記対象天然型ＤＮＡ領域に対応する二本鎖ＤＮＡ部と、該二本鎖ＤＮＡ部のうち一方において前記ＰＣＲプライマーにおけるタグ部とを有する増幅産物を得ることを特徴とするＰＣＲ法。
7. 請求項６に記載のＰＣＲ法により得られる反応生成物であって、前記対象天然型ＤＮＡ領域に対応する二本鎖ＤＮＡ部と、該二本鎖ＤＮＡ部のうち一方において前記ＰＣＲプライマーにおけるタグ部とを有していることを特徴とするＰＣＲ増幅産物。
8. 請求項１乃至４の何れかに記載のＰＣＲプライマーにおけるタグ部と特異的に結合する物質と、該物質を固定化して担持する担体とを具備してなることを特徴とするＤＮＡ担持用デバイス。
9. 請求項７に記載のＰＣＲ増幅産物、及び請求項８に記載のＤＮＡ担持用デバイスを利用するものであって、前記ＤＮＡ担持用デバイスにおける前記タグ部と特異的に結合する物質に、前記ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を結合させてなることを特徴とする二本鎖ＤＮＡ修飾デバイス。
10. 請求項７に記載のＰＣＲ増幅産物、及び請求項８に記載のＤＮＡ担持用デバイスを用いる方法であって、前記ＤＮＡ担持用デバイスにおける前記タグ部と特異的に結合する物質に対して、前記ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を当該ＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部を二本の単鎖ＤＮＡに解離させることなく結合させる工程を含むことを特徴とするＤＮＡ検出方法。
11. 請求項７に記載のＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部に、該二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させてなることを特徴とするＤＮＡ-タンパク複合体。
12. 請求項７に記載のＰＣＲ増幅産物又は請求項１１に記載のＤＮＡ-タンパク複合体の何れか一方又は両方におけるタグ部と特異的に結合する物質と、該物質を固定化して担持する担体とを具備してなり、前記ＰＣＲ増幅産物にはその二本鎖ＤＮＡ部に、該二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させ得るように構成していることを特徴とするタンパク担持用デバイス。
13. 請求項１１に記載のＤＮＡ-タンパク複合体、及び請求項１２に記載のタンパク担持用デバイスを利用するものであって、前記タンパク担持用デバイスにおける前記タグ部と特異的に結合する物質に、前記ＤＮＡ-タンパク複合体におけるタグ部を結合させてなることを特徴とするＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイス。
14. 請求項７に記載のＰＣＲ増幅産物、及び請求項１２に記載のタンパク担持用デバイスを利用するものであって、前記タンパク担持用デバイスにおける前記タグ部と特異的に結合する物質に、前記ＰＣＲ増幅産物におけるタグ部を結合させ、さらに該ＰＣＲ増幅産物における二本鎖ＤＮＡ部に、該二本鎖ＤＮＡ部中の所定配列を認識して結合するタンパクを結合させてなることを特徴とするＤＮＡ-タンパク複合体修飾デバイス。
    

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