JP4185185B2 - 部分二重鎖ｄｎａを利用したｄｎａの検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、部分二重鎖ＤＮＡを利用したＤＮＡの検出方法、並びにその部分二重鎖ＤＮＡ自体及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
あるＤＮＡをそのＤＮＡと相補的なＤＮＡ（以下、「相補鎖ＤＮＡ」という）を用いて検出する方法は、従来から数多く知られている。例えば、特定のＤＮＡを検出するサザンブロッテイング法はその代表的な例の一つである。また、ＤＮＡのクローニングの際に用いるプラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションもこのような検出方法の一種とみなすことができる。これらの方法は、いずれも検出しようとするＤＮＡがその相補鎖ＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることを利用するものなので、検出しようとするＤＮＡを予め単鎖状態にしておかなくてはならない。しかし、サザンブロッテイング法のように膜に固定している場合を除き、単鎖状態のＤＮＡは球状構造をとることが多く、そのような球状のＤＮＡはもはや相補鎖ＤＮＡとハイブリダイズすることはできない。また、二重鎖ＤＮＡを単鎖ＤＮＡにするためには、加熱などの処理が必要であるが、このような処理は一般に検出しようとするＤＮＡに好ましくない影響を与えることが多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このように相補鎖ＤＮＡを利用したＤＮＡ検出方法には未だに数多くの問題がある。本発明の目的は、このような問題を解決し、相補鎖ＤＮＡを利用した新たなＤＮＡ検出方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、検出しようとするＤＮＡを部分二重鎖ＤＮＡに変換した後に、相補鎖ＤＮＡを用いて検出することにより、検出感度が著しく向上することを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、検出しようとするＤＮＡをそのＤＮＡと相補的なＤＮＡを用いて検出する方法において、検出しようとするＤＮＡを、その一部分において二重鎖構造をとり、他の部分において単鎖構造をとる部分二重鎖ＤＮＡに変換した後に、相補的なＤＮＡを用いて検出することを特徴とするＤＮＡの検出方法である。
【０００５】
また、本発明は、下記の工程を含むことを特徴とする部分二重鎖ＤＮＡの作製方法である。
（１）作製しようとするＤＮＡの一部と同一な塩基配列を有する１種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（２）作製しようとするＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（３）作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの一方をプライマーとして非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う
【０００６】
（４）作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの他方をプライマーとして非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う
（５）工程（３）の増幅産物と工程（４）の増幅産物を混合した後、加熱、冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを得る
さらに、本発明は、一部分において二重鎖構造をとり、他の部分において単鎖構造をとる部分二重鎖ＤＮＡであって、単鎖構造をとる部分が６塩基以上である部分二重鎖ＤＮＡである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡの検出方法は、検出しようとするＤＮＡを部分二重鎖ＤＮＡに変換した後に、相補鎖ＤＮＡを用いて検出することを特徴とする。
ここで「部分二重鎖ＤＮＡ」とは、その一部分において二重鎖構造をとり、他の部分において単鎖構造をとるＤＮＡのことをいう。但し、この「部分二重鎖ＤＮＡ」を本発明の検出方法に利用するためには、単鎖部分は相補鎖ＤＮＡとハイブリダイズするのに十分な長さを持たなければならない。従って、通常、本発明において「部分二重鎖ＤＮＡ」といった場合、前記定義のＤＮＡのうち、単鎖部分の長さが６塩基以上であるものを意味する。また、「部分二重鎖ＤＮＡに変換する」とは、検出しようとするＤＮＡを単純に加工して部分二重鎖ＤＮＡにする場合だけでなく、検出しようとするＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させて部分二重鎖ＤＮＡにする場合をも含む意である。
【０００８】
検出しようとするＤＮＡは、相補鎖ＤＮＡを調製できるものであればどのようなものでもよい。具体的には、病原性大腸菌のベロ毒素をコードするＤＮＡ、ＨＩＶの外殻タンパク質gp120 をコードするＤＮＡ、各種微生物の 16SｒＲＮＡの特異的塩基配列部分（ｃＤＮＡ）、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の抗生物質結合タンパク質をコードするＤＮＡなどの微生物由来のＤＮＡのほか、ヒトの遺伝病に関係するＤＮＡなども例示することができる。また、検出しようとするＤＮＡは、夾雑物を含んだ状態にあってもよく、例えば、ベロ毒素をコードするＤＮＡを検出する場合、病原性大腸菌の加熱処理物をそのまま検出試料とすることも可能である。
【０００９】
部分二重鎖ＤＮＡに変換する方法としては、下記の工程を含む方法を例示できるが、これに限定されるわけではない。
（１）検出しようとするＤＮＡの一部と同一な塩基配列を有する１種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（２）検出しようとするＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドを合成する
【００１０】
（３）検出しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの一方をプライマーとして非対称ＰＣＲを行う
（４）検出しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの他方をプライマーとして非対称ＰＣＲを行う
（５）工程（３）の増幅産物と工程（４）の増幅産物を混合した後、加熱、冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを得る
【００１１】
工程（１）及び工程（２）で合成するオリゴヌクレオチドと検出しようとするＤＮＡとの位置関係は図１に示す通りである。即ち、工程（１）のオリゴヌクレオチドは、工程（２）の２種類のオリゴヌクレオチドよりも、ａ又はａ＋ｂだけ5'末端側に位置する。このａ及びｂは、図１（Ａ）に示すように、そのまま得られる部分二重鎖ＤＮＡの二重鎖部分の長さ及び単鎖部分の長さとなる。ａ及びｂの長さは、検出に用いる相補的なＤＮＡに応じて任意に決めることができるが、84塩基以下の場合はＰＣＲによる副生成物が多いなどの問題点もあり、ａの長さは、100 〜2000塩基とするのが好ましく、ｂの長さは、85〜1985塩基とするのが好ましい。
【００１２】
工程（３）及び工程（４）では、工程（１）及び工程（２）で合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして非対称ＰＣＲを行う。非対称ＰＣＲとは、ＰＣＲの際に使用する２種類のプライマーのうち、一方を他方に対して過剰量添加して行うＰＣＲをいう（Gyllensten,U.B. らProc.Natl.Acad.Sci.USA,85,7652-7656(1988) ）。いずれのプライマーを過剰に添加するかは、図１（Ｂ）に示すように、長い増幅断片を得る場合は、工程（１）で作製したプライマーを過剰に添加し、短い増幅断片を得る場合は、工程（２）で作製したプライマーを過剰に添加する（図中の実線の矢印が過剰に添加するプライマーで破線の矢印が少量添加するプライマーである。）。プライマーの添加比は、過剰に添加するプライマーが、他方のプライマーの10〜100 倍とするのが好ましく、20倍とするのが更に好ましい。ＰＣＲにおける温度、時間、サイクル等は、増幅しようとするＤＮＡ断片に応じて決めればよく、特別な条件に限定されるものではない。以上のような条件で２種類のＰＣＲを行うと、図１（Ｂ）に示すような増幅断片が得られる（図中の実線が多量に得られた増幅断片、破線が少量得られた増幅断片である）。
【００１３】
工程（５）では、工程（３）及び工程（４）で得られた増幅産物を混合した後、加熱、冷却を行い、部分二重鎖ＤＮＡを得る。加熱処理は、90〜95℃で５〜10分行うのが好ましく、冷却処理は20〜30分かけて18〜30℃まで冷却するのが好ましい。この混合、加熱、冷却の一連の処理により、図１（Ｃ）に示すような（イ）、（ロ）、（ハ）、（ニ）の４種類のＤＮＡ断片が得られる。但し、得られるＤＮＡ断片の量は（イ）だけが多く、他の３種類のＤＮＡ断片はいずれも少量しか得られない。
【００１４】
相補的なＤＮＡを用いて検出する方法としては、標識した相補鎖ＤＮＡを用いる一般的なハイブリダイゼーション法を例示できるが、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いる方法が好ましい。
以下、本発明のＤＮＡ検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサー及びそれに用いる測定チップについて説明する。
本発明に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの一例を図２に示す。この表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器９とを有し、カートリッジブロック７の上に相補鎖ＤＮＡを固定した測定チップ10を設置して使用する。カートリッジブロック７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出される。
【００１５】
光源８からは、測定チップ10の透明基板に向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を検出することができる。
上記のような構造によって、ある入射角θに対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ10の透明基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つの表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用され、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモンの波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響を受けるため、検出しようとするＤＮＡと相補鎖ＤＮＡとの相互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強度曲線の谷のずれによって、検出しようとするＤＮＡの濃度の変化を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を１RUとして表す。
【００１６】
測定チップ10は、表面プラズモン共鳴に必要な透明基板及び金属膜を有し、相補鎖ＤＮＡを金属膜上に固定できるものであればどのようなものでもよく、市販の測定チップ（例えば、ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcore2000 用測定チップ ）を使用することもできるが、図３に示すような構造を有する測定チップを使用することが好ましい。この測定チップは、透明基板１上に金属膜２、有機物質層３が形成されおり、その上にアビジン４が固定されており、このアビジンにビオチン５で標識された相補鎖ＤＮＡ６が固定される。
【００１７】
透明基板１としては、通常表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるものであればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金属膜に使用することのできる金属の種類としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独で又は組み合わせて使用することができる。また、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１８】
金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるのが好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。3000Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが好ましい。
金属膜２の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いるのが好ましい。
【００１９】
有機物質層３は、金属原子とアビジン分子の両者と結合することができる物質からなる層である。有機物質層３の厚さは、10〜200 Åであるのが好ましく、特に10〜50Åであるのが好ましい。また、アビジン−ビオチン結合を用いる以外にもエステル結合やアミド結合等の共有結合を利用してＤＮＡを有機物質層３に固定化することも可能である。
有機物質層は、シランカップリング剤、メルカプト基と他の有機官能基を有する化合物（以下、単に「チオール化合物」という）用いて形成させることができ、また、ＬＢ（ラングミュア・ブロジェット）法によっても形成させることができる。ＬＢ法によって成膜した場合、シランカップリング剤やチオール化合物によって成膜した場合に比べ、金属膜との結合能が弱いという短所があるが、広範な物質に適用でき、また、凝集膜を形成できるので単位面積当たりに結合させる生理活性物質の数を増加させることができるという長所もある。
【００２０】
有機物質層形成に使用できるシランカップリング剤としては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。また、チオール化合物としては、メルカプトアミノメタン、２−メルカプト−１−アミノエタン、３−メルカプト−１−アミノプロパン、４−メルカプト−１−アミノブタン、１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト酪酸、４−メルカプト吉草酸、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパンなどが挙げられ、これらの中でも多官能物質であり、アビジンとの結合部位が多い１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパンなどを用いるのが好ましい。ＬＢ法に適用できる物質としては、２１−アミノドコサン酸、ステアリルアミン、ポリリジンなどを例示することができる。
【００２１】
シランカップリング剤を用いて有機物質層を形成する方法としては、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属膜を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカップリング剤を含む溶液中に金属膜を一定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラビア法）などを用いることができ、チオール化合物を用いて有機物質層３を形成する方法としては、飽和蒸気法、浸漬法、スピンコーティング法、グラビア法などを用いることができる。
【００２２】
有機物質層３にアビジン４を固定することは、所定量のアビジン４を有機物質層３に所定時間接触させることにより形成させることができる。具体的な方法としては、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに有機物質層３を形成させた透明基板１を設置して一定流量のアビジン４を所定時間（所定量）流す方法を例示できる。
【００２３】
アビジン４に、ビオチンで標識した相補鎖ＤＮＡ５に固定化する方法としては、インクジエット法、マクロディスペンサー法などを例示することができる。インクジェット法は、極めて狭い領域に精度よく相補鎖ＤＮＡ５を含む液滴を発射できるので、固定化する相補鎖ＤＮＡ５を有効利用できるという点で有利である。また、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに測定チップを設置して一定流量の相補鎖ＤＮＡ５を所定時間（所定量）流すことによっても固定化できる。この固定化方法によれば、アビジン４及び相補鎖ＤＮＡ５の固定を一連の操作で行うことができるという点で有利である。相補鎖ＤＮＡをビオチンで標識する方法としては、ビオチンを結合させたプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を例示することができる。
【００２４】
検出するＤＮＡは１種類だけでなく、２種類以上であってもよい。２種類以上のＤＮＡを検出するには、一つのチップに複数のＤＮＡを固定するか、センサーに複数のチップを固定することにより行い得る。このように２種類以上のＤＮＡを検出することにより、検出の精度を向上させることができる。例えば、ある微生物の持つ特異的なＤＮＡと相補的なＤＮＡを二つ以上チップに固定することにより、その微生物に由来するＤＮＡが試料中に含まれているかどうかをより高い精度で判別することができる。また、固定化するＤＮＡの中に目的のＤＮＡとは結合しないＤＮＡ（陰性プローブ）を含ませておくことによっても精度を向上させることができる。さらに、固定化するＤＮＡの選択を適切に行えば、例えば、試料中にベロ毒素が含まれるかどうかということだけでなく、そのベロ毒素がＩ型なのかII型なのかというようなことまで判別できる。
【００２５】
２種類以上のＤＮＡを固定する場合、使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、測定チップを水平方向に自由に移動可能なタイプのものが好ましい。このようなセンサーを使用すれば、光学系を固定したままチップ上の複数の試料のシグナルを測定できる。
【００２６】
【実施例】
〔実施例１〕
市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcore2000 ）の測定セルに0.1 ％アビジン溶液を流速５μl/分で10分間流し込み、測定チップにアビジンを固定した。一方、図４に示す２型ベロ毒素をコードするＤＮＡの塩基配列の401 〜421 の塩基に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、その5'末端にビオチンを結合させた（以下、このオリゴヌクレオチドを「antiprobe VT2-2B」という）。antiprobe VT2-2Bを含む溶液を前記バイオセンサーの測定セルに流速１μl/分で50分間流し込み、測定チップ上にアビジンを介して固定した。
【００２７】
次に、図４に示す塩基配列に基づき、下記のプライマーを合成した。
P-VT2Cは図４に示す塩基配列の301 〜321 塩基に対応し、asp-VT2-2aは381 〜401 塩基に対応し、asp-VT2-2bは433 〜433 に対応する。
【００２８】
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2bをプライマーとして非対称ＰＣＲを行った。P-VT2Cは、asp-VT2-2bの20倍量加えた。ＰＣＲは、初期変性（94℃３分）を行った後、変性（94℃１分）、アニーリング（59℃0.5 分）、伸長（72℃１分）のサイクルを10〜40に変化させて行った。
また、P-VT2Cとasp-VT2-2aをプライマーとして上記と同様に非対称ＰＣＲを行った。asp-VT2-2bは、P-VT2Cの20倍量加えた。
【００２９】
上記で得られる２種類のＰＣＲ増幅産物を混合し、全量100 μl とした。95℃で10分加熱した後、30分かけて25℃まで冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを作製した。この部分二重鎖ＤＮＡを含む混合増幅産物を、上記バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量が10μｌ、20μｌ、30μｌ、及び40μｌにおける共鳴シグナルを測定した。この結果を図５に示す。また、対照としてP-VT2Cとasp-VT2-2bをプライマーとしてＰＣＲ（対称ＰＣＲ）を行い、その増幅産物を測定セルに流し込み、共鳴シグナルを測定した。この結果を図６に示す。図中の○が10サイクル、●が20サイクル、△が25サイクル、▲が30サイクル、□が40サイクルを示す。
図５及び図６に示すように、いずれの場合も30サイクル以上でハイブリダイゼーションによるシグナルを検出することができた。また、非対称ＰＣＲ産物を部分二重鎖ＤＮＡにすることにより、検出感度が約２倍向上した。
【００３０】
〔実施例２〕
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2bをプライマーとして非対称ＰＣＲを行った（この増幅産物を「増幅産物Ａ」という）。P-VT2Cはasp-VT2-2bの20倍量加えた。ＰＣＲは、初期変性（95℃３分）を行った後、変性（94℃１分）、アニーリング（61℃１分）、伸長（72℃１分）を40サイクル繰り返した。
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2aをプライマーとして非対称ＰＣＲを行った（この増幅産物を「増幅産物Ｂ」という）。asp-VT2-2aはP-VT2Cの20倍量加えた。ＰＣＲの反応条件は、上記と同様にして行った。
【００３１】
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2bをプライマーとして対称ＰＣＲを行った（この増幅産物を「増幅産物Ｃ」という）。ＰＣＲの反応条件は、上記と同様にして行った。
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2aをプライマーとして対称ＰＣＲを行った（この増幅産物を「増幅産物Ｄ」という）。ＰＣＲの反応条件は、上記と同様にして行った。
【００３２】
増幅産物Ａ〜Ｄを、▲１▼増幅産物Ｃ＋増幅産物Ｄ、▲２▼増幅産物Ａ＋増幅産物Ｂ、▲３▼増幅産物Ａ＋増幅産物Ｄ、▲４▼増幅産物Ｂ＋増幅産物Ｃの４通りの組み合わせで混合し、その混合増幅産物を95℃で10分加熱した後、30分かけて25℃まで冷却した。この４種類の混合増幅産物を、上記バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量が10μｌ、20μｌ、30μｌ、及び40μｌにおける共鳴シグナルを測定した。この結果を図７に示す。図中の○が混合増幅産物▲１▼、●が混合増幅産物▲２▼、△が混合増幅産物▲３▼、▲が混合増幅産物▲４▼を示す。
図７に示すように、非対称ＰＣＲ増幅産物同士を混合した場合（混合増幅産物▲２▼）が最も検出感度が良好であった。
【００３３】
〔実施例３〕
実施例２で調製した増幅産物Ａと増幅産物Ｂとの混合増幅産物を95℃で10秒加熱した後、30分かけて25℃まで冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを作製した。この部分二重鎖ＤＮＡを含む混合増幅産物を、上記バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量が10μｌ、20μｌ、30μｌ、及び40μｌにおける共鳴シグナルを測定した。また、対照１として増幅産物Ａのみを加熱、冷却して調製したサンプル、対照２として増幅産物Ａと増幅産物Ｂとの混合増幅産物を加熱、冷却せずに調製したサンプル、対照３として増幅産物Ａのみを加熱、冷却せずに調製したサンプル、についても上記と同様に共鳴シグナルを測定した。この結果を図８に示す。図中の○が部分二重鎖ＤＮＡを含むサンプル、●が対照１のサンプル、△が対照２のサンプル、▲が対照３のサンプルを示す。
図８に示すように、増幅産物Ａのみからなるサンプルでは十分なシグナルを検出できなかった。また、混合増幅産物からなるサンプルではいずれも一定のシグナルを検出することはできたが、加熱、冷却処理を施さない場合は明らかに感度が劣った。
【００３４】
〔実施例４〕
13mm X 18mm 、厚さ0.3mm の青板ガラス（松浪硝子工業社製）上にスパッタリングによりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成し、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップを作製した。スパッタリングは、クロムについては100W、30秒間、金については100W、150 秒間行った。得られたクロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åであった。この測定チップを11- メルカプトウンデカン酸の１mMエタノ−ル溶液に24時間浸漬し、金属層上に有機薄膜層を形成させた。次いで、50μl の５％アビジン溶液を同一チップ上の３箇所に滴下し、アビジン分子と有機薄膜層上の分子との間にアミド結合を形成させ、アビジン分子を固定化した。
【００３５】
次に、５’末端にビオチンを結合させた下記の３種類のＤＮＡを合成した（サワデー・テクノロジー社に合成を委託）。これらのＤＮＡは、毒素産生菌Vibrio parahaemolyticus（腸炎ビブリオ）の毒性の要因となるtdh1 、tdh2 、trh2 の３種類の遺伝子の一部と相補的な配列を持つ。
【００３６】
【００３７】
上記ＤＮＡを含む溶液（10μl ）をアビジン溶液を滴下した位置に30μl 滴下し、ＤＮＡをアビジン・ビオチン結合を介して測定チップ上に固定化した。
ＤＮＡを固定化した測定チップを表面プラズモン共鳴バイオセンサー（電気化学計器社製のＳＰＲ−２０型のセンサーヘッド、給排液液を改造したもの）に設置した（図９）。このバイオセンサーでは、測定チップを水平方向に自由に移動させることができるので、光学系を固定したままチップ上に存在する複数の試料の共鳴シグナルを測定することが可能である。
【００３８】
被検出物であるＤＮＡは、実施例１と同様に非対称ＰＣＲを利用し、部分二重鎖ＤＮＡ（二重鎖部分143bp, 単鎖部分101b）として増幅させた。増幅させた部分二重鎖ＤＮＡを含む溶液を、バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量10μl における共鳴シグナルを測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１に示すよう配列１〜３のいずれも３００ＲＵ（換算値）前後のシグナルを得ており、ＤＮＡの結合がない場合（陰性）のシグナルが１０〜２０ＲＵ（換算値）であることを考慮すると、固定した３種類のＤＮＡに部分二重鎖が結合したもの（陽性）と考えられる。
【００４１】
〔実施例５〕
実施例４と同様に青板ガラス上に金属層、有機薄膜層を形成させ、４枚の測定チップを作製した。次いで、50μl の５％アビジン溶液を４枚のチップ上の２箇所に滴下し（合計８箇所）、アビジン分子を固定化した。
次に、５’末端にビオチンを結合させた下記の８種類のＤＮＡを合成した（サワデー・テクノロジー社に合成を委託）。配列１〜３は、Vibrio parahaemolyticusのtdh1、tdh2、trh2遺伝子のそれぞれの一部と相補的な配列を持つＤＮＡであり、配列４はSalmonella enteritidis（サルモネラ）の18S rRNA、配列５はBorderella pertussis（百日咳菌）の百日咳毒素、配列６はVibrio chorera （コレラ）のコレラ毒素、配列７はEscherichia coli 0157 （病原性大腸菌O157）のベロ毒素１、配列８はEscherichia coli 0157 のベロ毒素２と相補的な配列を持つＤＮＡである。
【００４２】
【００４３】
上記ＤＮＡを含む溶液（10μl ）をアビジン溶液を滴下した位置に30μl 滴下し、ＤＮＡをアビジン・ビオチン結合を介して測定チップ上に固定化した。
ＤＮＡを固定化した測定チップを実施例４で使用した表面プラズモン共鳴バイオセンサーに設置した。被検出物であるＤＮＡは、実施例４と同様に非対称ＰＣＲを利用し、部分二重鎖ＤＮＡ（二重鎖部分143bp, 単鎖部分101b）として増幅させた。ＤＮＡは、大腸菌O157、腸炎ビブリオ、サルモネラのそれぞれから調製したＤＮＡと、大腸菌O157から調製したＤＮＡとサルモネラから調製したＤＮＡの混合物の４種類使用した。増幅させた部分二重鎖ＤＮＡを含む溶液を、バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量10μl における共鳴シグナルを測定した。結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】
表２に示すように、各種微生物に対して陽性の場合３００ＲＵ程度、陰性の場合３０ＲＵ以下のシグナルが得られた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明は、ＤＮＡの新規な検出方法を提供する。この方法は、ＤＮＡを部分二重鎖の状態で検出するので、加熱等の処理が不要であり、また、単鎖ＤＮＡのように球状化することもないので、検出感度においても優れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】非対称ＰＣＲを用いて本発明の部分二重鎖ＤＮＡを作製する方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの一実施例を示す図である。
【図３】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの一実施例を示す図である。
【図４】病原性大腸菌Ｏ−１５７の二型ベロ毒素をコードするＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図５】部分二重鎖ＤＮＡを用いた場合のＰＣＲサイクルと共鳴シグナルとの関係を示す図である。
【図６】部分二重鎖ＤＮＡを用いない場合のＰＣＲサイクルと共鳴シグナルとの関係を示す図である。
【図７】検出しようとするＤＮＡの構造と共鳴シグナルとの関係を示す図である。
【図８】増幅産物混合後の加熱の有無と共鳴シグナルとの関係を示す図である。
【図９】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの一実施例を示す図である。
【符号の説明】
１…透明基板
２…金属膜
３…有機物質層
４…アビジン
５…ビオチン標識相補鎖ＤＮＡ
６…部分二重鎖ＤＮＡ
７…カートリッジブロック
71…測定セル
72，73…流路
８…光源
80…入射光
９…検出器
90…反射光
10…測定チップ
【発明の属する技術分野】
本発明は、部分二重鎖ＤＮＡを利用したＤＮＡの検出方法、並びにその部分二重鎖ＤＮＡ自体及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
あるＤＮＡをそのＤＮＡと相補的なＤＮＡ（以下、「相補鎖ＤＮＡ」という）を用いて検出する方法は、従来から数多く知られている。例えば、特定のＤＮＡを検出するサザンブロッテイング法はその代表的な例の一つである。また、ＤＮＡのクローニングの際に用いるプラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションもこのような検出方法の一種とみなすことができる。これらの方法は、いずれも検出しようとするＤＮＡがその相補鎖ＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることを利用するものなので、検出しようとするＤＮＡを予め単鎖状態にしておかなくてはならない。しかし、サザンブロッテイング法のように膜に固定している場合を除き、単鎖状態のＤＮＡは球状構造をとることが多く、そのような球状のＤＮＡはもはや相補鎖ＤＮＡとハイブリダイズすることはできない。また、二重鎖ＤＮＡを単鎖ＤＮＡにするためには、加熱などの処理が必要であるが、このような処理は一般に検出しようとするＤＮＡに好ましくない影響を与えることが多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このように相補鎖ＤＮＡを利用したＤＮＡ検出方法には未だに数多くの問題がある。本発明の目的は、このような問題を解決し、相補鎖ＤＮＡを利用した新たなＤＮＡ検出方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、検出しようとするＤＮＡを部分二重鎖ＤＮＡに変換した後に、相補鎖ＤＮＡを用いて検出することにより、検出感度が著しく向上することを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、検出しようとするＤＮＡをそのＤＮＡと相補的なＤＮＡを用いて検出する方法において、検出しようとするＤＮＡを、その一部分において二重鎖構造をとり、他の部分において単鎖構造をとる部分二重鎖ＤＮＡに変換した後に、相補的なＤＮＡを用いて検出することを特徴とするＤＮＡの検出方法である。
【０００５】
また、本発明は、下記の工程を含むことを特徴とする部分二重鎖ＤＮＡの作製方法である。
（１）作製しようとするＤＮＡの一部と同一な塩基配列を有する１種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（２）作製しようとするＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（３）作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの一方をプライマーとして非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う
【０００６】
（４）作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの他方をプライマーとして非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う
（５）工程（３）の増幅産物と工程（４）の増幅産物を混合した後、加熱、冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを得る
さらに、本発明は、一部分において二重鎖構造をとり、他の部分において単鎖構造をとる部分二重鎖ＤＮＡであって、単鎖構造をとる部分が６塩基以上である部分二重鎖ＤＮＡである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡの検出方法は、検出しようとするＤＮＡを部分二重鎖ＤＮＡに変換した後に、相補鎖ＤＮＡを用いて検出することを特徴とする。
ここで「部分二重鎖ＤＮＡ」とは、その一部分において二重鎖構造をとり、他の部分において単鎖構造をとるＤＮＡのことをいう。但し、この「部分二重鎖ＤＮＡ」を本発明の検出方法に利用するためには、単鎖部分は相補鎖ＤＮＡとハイブリダイズするのに十分な長さを持たなければならない。従って、通常、本発明において「部分二重鎖ＤＮＡ」といった場合、前記定義のＤＮＡのうち、単鎖部分の長さが６塩基以上であるものを意味する。また、「部分二重鎖ＤＮＡに変換する」とは、検出しようとするＤＮＡを単純に加工して部分二重鎖ＤＮＡにする場合だけでなく、検出しようとするＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させて部分二重鎖ＤＮＡにする場合をも含む意である。
【０００８】
検出しようとするＤＮＡは、相補鎖ＤＮＡを調製できるものであればどのようなものでもよい。具体的には、病原性大腸菌のベロ毒素をコードするＤＮＡ、ＨＩＶの外殻タンパク質gp120 をコードするＤＮＡ、各種微生物の 16SｒＲＮＡの特異的塩基配列部分（ｃＤＮＡ）、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の抗生物質結合タンパク質をコードするＤＮＡなどの微生物由来のＤＮＡのほか、ヒトの遺伝病に関係するＤＮＡなども例示することができる。また、検出しようとするＤＮＡは、夾雑物を含んだ状態にあってもよく、例えば、ベロ毒素をコードするＤＮＡを検出する場合、病原性大腸菌の加熱処理物をそのまま検出試料とすることも可能である。
【０００９】
部分二重鎖ＤＮＡに変換する方法としては、下記の工程を含む方法を例示できるが、これに限定されるわけではない。
（１）検出しようとするＤＮＡの一部と同一な塩基配列を有する１種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（２）検出しようとするＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドを合成する
【００１０】
（３）検出しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの一方をプライマーとして非対称ＰＣＲを行う
（４）検出しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの他方をプライマーとして非対称ＰＣＲを行う
（５）工程（３）の増幅産物と工程（４）の増幅産物を混合した後、加熱、冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを得る
【００１１】
工程（１）及び工程（２）で合成するオリゴヌクレオチドと検出しようとするＤＮＡとの位置関係は図１に示す通りである。即ち、工程（１）のオリゴヌクレオチドは、工程（２）の２種類のオリゴヌクレオチドよりも、ａ又はａ＋ｂだけ5'末端側に位置する。このａ及びｂは、図１（Ａ）に示すように、そのまま得られる部分二重鎖ＤＮＡの二重鎖部分の長さ及び単鎖部分の長さとなる。ａ及びｂの長さは、検出に用いる相補的なＤＮＡに応じて任意に決めることができるが、84塩基以下の場合はＰＣＲによる副生成物が多いなどの問題点もあり、ａの長さは、100 〜2000塩基とするのが好ましく、ｂの長さは、85〜1985塩基とするのが好ましい。
【００１２】
工程（３）及び工程（４）では、工程（１）及び工程（２）で合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして非対称ＰＣＲを行う。非対称ＰＣＲとは、ＰＣＲの際に使用する２種類のプライマーのうち、一方を他方に対して過剰量添加して行うＰＣＲをいう（Gyllensten,U.B. らProc.Natl.Acad.Sci.USA,85,7652-7656(1988) ）。いずれのプライマーを過剰に添加するかは、図１（Ｂ）に示すように、長い増幅断片を得る場合は、工程（１）で作製したプライマーを過剰に添加し、短い増幅断片を得る場合は、工程（２）で作製したプライマーを過剰に添加する（図中の実線の矢印が過剰に添加するプライマーで破線の矢印が少量添加するプライマーである。）。プライマーの添加比は、過剰に添加するプライマーが、他方のプライマーの10〜100 倍とするのが好ましく、20倍とするのが更に好ましい。ＰＣＲにおける温度、時間、サイクル等は、増幅しようとするＤＮＡ断片に応じて決めればよく、特別な条件に限定されるものではない。以上のような条件で２種類のＰＣＲを行うと、図１（Ｂ）に示すような増幅断片が得られる（図中の実線が多量に得られた増幅断片、破線が少量得られた増幅断片である）。
【００１３】
工程（５）では、工程（３）及び工程（４）で得られた増幅産物を混合した後、加熱、冷却を行い、部分二重鎖ＤＮＡを得る。加熱処理は、90〜95℃で５〜10分行うのが好ましく、冷却処理は20〜30分かけて18〜30℃まで冷却するのが好ましい。この混合、加熱、冷却の一連の処理により、図１（Ｃ）に示すような（イ）、（ロ）、（ハ）、（ニ）の４種類のＤＮＡ断片が得られる。但し、得られるＤＮＡ断片の量は（イ）だけが多く、他の３種類のＤＮＡ断片はいずれも少量しか得られない。
【００１４】
相補的なＤＮＡを用いて検出する方法としては、標識した相補鎖ＤＮＡを用いる一般的なハイブリダイゼーション法を例示できるが、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いる方法が好ましい。
以下、本発明のＤＮＡ検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサー及びそれに用いる測定チップについて説明する。
本発明に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの一例を図２に示す。この表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、カートリッジブロック７と、光源８と、検出器９とを有し、カートリッジブロック７の上に相補鎖ＤＮＡを固定した測定チップ10を設置して使用する。カートリッジブロック７の上面には凹部が設けられており、この凹部と上記測定チップ10とで測定セル71が構成される。測定セル71は、流路72、73によりカートリッジブロック７の外部に連通しており、試料は流路72を通じて測定セル71中に流れ込み、測定に供された後流路73を通じて外部に排出される。
【００１５】
光源８からは、測定チップ10の透明基板に向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を検出することができる。
上記のような構造によって、ある入射角θに対して谷を形成する反射光強度曲線が得られる。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン共鳴によるものである。即ち、光が測定チップ10の透明基板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバネッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つの表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギーの一部が表面プラズモンを励起するために使用され、反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモンの波数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響を受けるため、検出しようとするＤＮＡと相補鎖ＤＮＡとの相互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、反射光強度曲線の谷のずれによって、検出しようとするＤＮＡの濃度の変化を検知することができる。入射角θの変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を１RUとして表す。
【００１６】
測定チップ10は、表面プラズモン共鳴に必要な透明基板及び金属膜を有し、相補鎖ＤＮＡを金属膜上に固定できるものであればどのようなものでもよく、市販の測定チップ（例えば、ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcore2000 用測定チップ ）を使用することもできるが、図３に示すような構造を有する測定チップを使用することが好ましい。この測定チップは、透明基板１上に金属膜２、有機物質層３が形成されおり、その上にアビジン４が固定されており、このアビジンにビオチン５で標識された相補鎖ＤＮＡ６が固定される。
【００１７】
透明基板１としては、通常表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるものであればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金属膜に使用することのできる金属の種類としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独で又は組み合わせて使用することができる。また、上記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１と金、銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００１８】
金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるのが好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。3000Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが好ましい。
金属膜２の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いるのが好ましい。
【００１９】
有機物質層３は、金属原子とアビジン分子の両者と結合することができる物質からなる層である。有機物質層３の厚さは、10〜200 Åであるのが好ましく、特に10〜50Åであるのが好ましい。また、アビジン−ビオチン結合を用いる以外にもエステル結合やアミド結合等の共有結合を利用してＤＮＡを有機物質層３に固定化することも可能である。
有機物質層は、シランカップリング剤、メルカプト基と他の有機官能基を有する化合物（以下、単に「チオール化合物」という）用いて形成させることができ、また、ＬＢ（ラングミュア・ブロジェット）法によっても形成させることができる。ＬＢ法によって成膜した場合、シランカップリング剤やチオール化合物によって成膜した場合に比べ、金属膜との結合能が弱いという短所があるが、広範な物質に適用でき、また、凝集膜を形成できるので単位面積当たりに結合させる生理活性物質の数を増加させることができるという長所もある。
【００２０】
有機物質層形成に使用できるシランカップリング剤としては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。また、チオール化合物としては、メルカプトアミノメタン、２−メルカプト−１−アミノエタン、３−メルカプト−１−アミノプロパン、４−メルカプト−１−アミノブタン、１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト酪酸、４−メルカプト吉草酸、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパンなどが挙げられ、これらの中でも多官能物質であり、アビジンとの結合部位が多い１，１，１−トリアミノ−２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパンなどを用いるのが好ましい。ＬＢ法に適用できる物質としては、２１−アミノドコサン酸、ステアリルアミン、ポリリジンなどを例示することができる。
【００２１】
シランカップリング剤を用いて有機物質層を形成する方法としては、シランカップリング剤の飽和蒸気中に金属膜を一定時間暴露する方法（飽和蒸気法）、シランカップリング剤を含む溶液中に金属膜を一定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータを用いる方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機を用いる方法（グラビア法）などを用いることができ、チオール化合物を用いて有機物質層３を形成する方法としては、飽和蒸気法、浸漬法、スピンコーティング法、グラビア法などを用いることができる。
【００２２】
有機物質層３にアビジン４を固定することは、所定量のアビジン４を有機物質層３に所定時間接触させることにより形成させることができる。具体的な方法としては、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに有機物質層３を形成させた透明基板１を設置して一定流量のアビジン４を所定時間（所定量）流す方法を例示できる。
【００２３】
アビジン４に、ビオチンで標識した相補鎖ＤＮＡ５に固定化する方法としては、インクジエット法、マクロディスペンサー法などを例示することができる。インクジェット法は、極めて狭い領域に精度よく相補鎖ＤＮＡ５を含む液滴を発射できるので、固定化する相補鎖ＤＮＡ５を有効利用できるという点で有利である。また、フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに測定チップを設置して一定流量の相補鎖ＤＮＡ５を所定時間（所定量）流すことによっても固定化できる。この固定化方法によれば、アビジン４及び相補鎖ＤＮＡ５の固定を一連の操作で行うことができるという点で有利である。相補鎖ＤＮＡをビオチンで標識する方法としては、ビオチンを結合させたプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を例示することができる。
【００２４】
検出するＤＮＡは１種類だけでなく、２種類以上であってもよい。２種類以上のＤＮＡを検出するには、一つのチップに複数のＤＮＡを固定するか、センサーに複数のチップを固定することにより行い得る。このように２種類以上のＤＮＡを検出することにより、検出の精度を向上させることができる。例えば、ある微生物の持つ特異的なＤＮＡと相補的なＤＮＡを二つ以上チップに固定することにより、その微生物に由来するＤＮＡが試料中に含まれているかどうかをより高い精度で判別することができる。また、固定化するＤＮＡの中に目的のＤＮＡとは結合しないＤＮＡ（陰性プローブ）を含ませておくことによっても精度を向上させることができる。さらに、固定化するＤＮＡの選択を適切に行えば、例えば、試料中にベロ毒素が含まれるかどうかということだけでなく、そのベロ毒素がＩ型なのかII型なのかというようなことまで判別できる。
【００２５】
２種類以上のＤＮＡを固定する場合、使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、測定チップを水平方向に自由に移動可能なタイプのものが好ましい。このようなセンサーを使用すれば、光学系を固定したままチップ上の複数の試料のシグナルを測定できる。
【００２６】
【実施例】
〔実施例１〕
市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcore2000 ）の測定セルに0.1 ％アビジン溶液を流速５μl/分で10分間流し込み、測定チップにアビジンを固定した。一方、図４に示す２型ベロ毒素をコードするＤＮＡの塩基配列の401 〜421 の塩基に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、その5'末端にビオチンを結合させた（以下、このオリゴヌクレオチドを「antiprobe VT2-2B」という）。antiprobe VT2-2Bを含む溶液を前記バイオセンサーの測定セルに流速１μl/分で50分間流し込み、測定チップ上にアビジンを介して固定した。
【００２７】
次に、図４に示す塩基配列に基づき、下記のプライマーを合成した。
【００２８】
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2bをプライマーとして非対称ＰＣＲを行った。P-VT2Cは、asp-VT2-2bの20倍量加えた。ＰＣＲは、初期変性（94℃３分）を行った後、変性（94℃１分）、アニーリング（59℃0.5 分）、伸長（72℃１分）のサイクルを10〜40に変化させて行った。
また、P-VT2Cとasp-VT2-2aをプライマーとして上記と同様に非対称ＰＣＲを行った。asp-VT2-2bは、P-VT2Cの20倍量加えた。
【００２９】
上記で得られる２種類のＰＣＲ増幅産物を混合し、全量100 μl とした。95℃で10分加熱した後、30分かけて25℃まで冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを作製した。この部分二重鎖ＤＮＡを含む混合増幅産物を、上記バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量が10μｌ、20μｌ、30μｌ、及び40μｌにおける共鳴シグナルを測定した。この結果を図５に示す。また、対照としてP-VT2Cとasp-VT2-2bをプライマーとしてＰＣＲ（対称ＰＣＲ）を行い、その増幅産物を測定セルに流し込み、共鳴シグナルを測定した。この結果を図６に示す。図中の○が10サイクル、●が20サイクル、△が25サイクル、▲が30サイクル、□が40サイクルを示す。
図５及び図６に示すように、いずれの場合も30サイクル以上でハイブリダイゼーションによるシグナルを検出することができた。また、非対称ＰＣＲ産物を部分二重鎖ＤＮＡにすることにより、検出感度が約２倍向上した。
【００３０】
〔実施例２〕
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2bをプライマーとして非対称ＰＣＲを行った（この増幅産物を「増幅産物Ａ」という）。P-VT2Cはasp-VT2-2bの20倍量加えた。ＰＣＲは、初期変性（95℃３分）を行った後、変性（94℃１分）、アニーリング（61℃１分）、伸長（72℃１分）を40サイクル繰り返した。
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2aをプライマーとして非対称ＰＣＲを行った（この増幅産物を「増幅産物Ｂ」という）。asp-VT2-2aはP-VT2Cの20倍量加えた。ＰＣＲの反応条件は、上記と同様にして行った。
【００３１】
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2bをプライマーとして対称ＰＣＲを行った（この増幅産物を「増幅産物Ｃ」という）。ＰＣＲの反応条件は、上記と同様にして行った。
病原性大腸菌Ｏ−１５７から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、P-VT2Cとasp-VT2-2aをプライマーとして対称ＰＣＲを行った（この増幅産物を「増幅産物Ｄ」という）。ＰＣＲの反応条件は、上記と同様にして行った。
【００３２】
増幅産物Ａ〜Ｄを、▲１▼増幅産物Ｃ＋増幅産物Ｄ、▲２▼増幅産物Ａ＋増幅産物Ｂ、▲３▼増幅産物Ａ＋増幅産物Ｄ、▲４▼増幅産物Ｂ＋増幅産物Ｃの４通りの組み合わせで混合し、その混合増幅産物を95℃で10分加熱した後、30分かけて25℃まで冷却した。この４種類の混合増幅産物を、上記バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量が10μｌ、20μｌ、30μｌ、及び40μｌにおける共鳴シグナルを測定した。この結果を図７に示す。図中の○が混合増幅産物▲１▼、●が混合増幅産物▲２▼、△が混合増幅産物▲３▼、▲が混合増幅産物▲４▼を示す。
図７に示すように、非対称ＰＣＲ増幅産物同士を混合した場合（混合増幅産物▲２▼）が最も検出感度が良好であった。
【００３３】
〔実施例３〕
実施例２で調製した増幅産物Ａと増幅産物Ｂとの混合増幅産物を95℃で10秒加熱した後、30分かけて25℃まで冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを作製した。この部分二重鎖ＤＮＡを含む混合増幅産物を、上記バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量が10μｌ、20μｌ、30μｌ、及び40μｌにおける共鳴シグナルを測定した。また、対照１として増幅産物Ａのみを加熱、冷却して調製したサンプル、対照２として増幅産物Ａと増幅産物Ｂとの混合増幅産物を加熱、冷却せずに調製したサンプル、対照３として増幅産物Ａのみを加熱、冷却せずに調製したサンプル、についても上記と同様に共鳴シグナルを測定した。この結果を図８に示す。図中の○が部分二重鎖ＤＮＡを含むサンプル、●が対照１のサンプル、△が対照２のサンプル、▲が対照３のサンプルを示す。
図８に示すように、増幅産物Ａのみからなるサンプルでは十分なシグナルを検出できなかった。また、混合増幅産物からなるサンプルではいずれも一定のシグナルを検出することはできたが、加熱、冷却処理を施さない場合は明らかに感度が劣った。
【００３４】
〔実施例４〕
13mm X 18mm 、厚さ0.3mm の青板ガラス（松浪硝子工業社製）上にスパッタリングによりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成し、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップを作製した。スパッタリングは、クロムについては100W、30秒間、金については100W、150 秒間行った。得られたクロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åであった。この測定チップを11- メルカプトウンデカン酸の１mMエタノ−ル溶液に24時間浸漬し、金属層上に有機薄膜層を形成させた。次いで、50μl の５％アビジン溶液を同一チップ上の３箇所に滴下し、アビジン分子と有機薄膜層上の分子との間にアミド結合を形成させ、アビジン分子を固定化した。
【００３５】
次に、５’末端にビオチンを結合させた下記の３種類のＤＮＡを合成した（サワデー・テクノロジー社に合成を委託）。これらのＤＮＡは、毒素産生菌Vibrio parahaemolyticus（腸炎ビブリオ）の毒性の要因となるtdh1 、tdh2 、trh2 の３種類の遺伝子の一部と相補的な配列を持つ。
【００３６】
上記ＤＮＡを含む溶液（10μl ）をアビジン溶液を滴下した位置に30μl 滴下し、ＤＮＡをアビジン・ビオチン結合を介して測定チップ上に固定化した。
ＤＮＡを固定化した測定チップを表面プラズモン共鳴バイオセンサー（電気化学計器社製のＳＰＲ−２０型のセンサーヘッド、給排液液を改造したもの）に設置した（図９）。このバイオセンサーでは、測定チップを水平方向に自由に移動させることができるので、光学系を固定したままチップ上に存在する複数の試料の共鳴シグナルを測定することが可能である。
【００３８】
被検出物であるＤＮＡは、実施例１と同様に非対称ＰＣＲを利用し、部分二重鎖ＤＮＡ（二重鎖部分143bp, 単鎖部分101b）として増幅させた。増幅させた部分二重鎖ＤＮＡを含む溶液を、バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量10μl における共鳴シグナルを測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
表１に示すよう配列１〜３のいずれも３００ＲＵ（換算値）前後のシグナルを得ており、ＤＮＡの結合がない場合（陰性）のシグナルが１０〜２０ＲＵ（換算値）であることを考慮すると、固定した３種類のＤＮＡに部分二重鎖が結合したもの（陽性）と考えられる。
【００４１】
〔実施例５〕
実施例４と同様に青板ガラス上に金属層、有機薄膜層を形成させ、４枚の測定チップを作製した。次いで、50μl の５％アビジン溶液を４枚のチップ上の２箇所に滴下し（合計８箇所）、アビジン分子を固定化した。
次に、５’末端にビオチンを結合させた下記の８種類のＤＮＡを合成した（サワデー・テクノロジー社に合成を委託）。配列１〜３は、Vibrio parahaemolyticusのtdh1、tdh2、trh2遺伝子のそれぞれの一部と相補的な配列を持つＤＮＡであり、配列４はSalmonella enteritidis（サルモネラ）の18S rRNA、配列５はBorderella pertussis（百日咳菌）の百日咳毒素、配列６はVibrio chorera （コレラ）のコレラ毒素、配列７はEscherichia coli 0157 （病原性大腸菌O157）のベロ毒素１、配列８はEscherichia coli 0157 のベロ毒素２と相補的な配列を持つＤＮＡである。
【００４２】
上記ＤＮＡを含む溶液（10μl ）をアビジン溶液を滴下した位置に30μl 滴下し、ＤＮＡをアビジン・ビオチン結合を介して測定チップ上に固定化した。
ＤＮＡを固定化した測定チップを実施例４で使用した表面プラズモン共鳴バイオセンサーに設置した。被検出物であるＤＮＡは、実施例４と同様に非対称ＰＣＲを利用し、部分二重鎖ＤＮＡ（二重鎖部分143bp, 単鎖部分101b）として増幅させた。ＤＮＡは、大腸菌O157、腸炎ビブリオ、サルモネラのそれぞれから調製したＤＮＡと、大腸菌O157から調製したＤＮＡとサルモネラから調製したＤＮＡの混合物の４種類使用した。増幅させた部分二重鎖ＤＮＡを含む溶液を、バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量10μl における共鳴シグナルを測定した。結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
表２に示すように、各種微生物に対して陽性の場合３００ＲＵ程度、陰性の場合３０ＲＵ以下のシグナルが得られた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明は、ＤＮＡの新規な検出方法を提供する。この方法は、ＤＮＡを部分二重鎖の状態で検出するので、加熱等の処理が不要であり、また、単鎖ＤＮＡのように球状化することもないので、検出感度においても優れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】非対称ＰＣＲを用いて本発明の部分二重鎖ＤＮＡを作製する方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの一実施例を示す図である。
【図３】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップの一実施例を示す図である。
【図４】病原性大腸菌Ｏ−１５７の二型ベロ毒素をコードするＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図５】部分二重鎖ＤＮＡを用いた場合のＰＣＲサイクルと共鳴シグナルとの関係を示す図である。
【図６】部分二重鎖ＤＮＡを用いない場合のＰＣＲサイクルと共鳴シグナルとの関係を示す図である。
【図７】検出しようとするＤＮＡの構造と共鳴シグナルとの関係を示す図である。
【図８】増幅産物混合後の加熱の有無と共鳴シグナルとの関係を示す図である。
【図９】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセンサーの一実施例を示す図である。
【符号の説明】
１…透明基板
２…金属膜
３…有機物質層
４…アビジン
５…ビオチン標識相補鎖ＤＮＡ
６…部分二重鎖ＤＮＡ
７…カートリッジブロック
71…測定セル
72，73…流路
８…光源
80…入射光
９…検出器
90…反射光
10…測定チップ
Claims (6)
- 検出しようとするＤＮＡをそのＤＮＡと相補的なＤＮＡを用いて検出する方法において、検出しようとするＤＮＡを、その一部分において二重鎖構造をとり、他の部分において単鎖構造をとる部分二重鎖ＤＮＡに変換した後に、相補的なＤＮＡを用いて検出することを特徴とするＤＮＡの検出方法であって、
部分二重鎖ＤＮＡに変換する方法が、下記の工程を含む変換方法であること特徴とする前記ＤＮＡの検出方法。
（１）検出しようとするＤＮＡの一部と同一な塩基配列からなる１種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（２）検出しようとするＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（３）検出しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの一方をプライマーとして非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う
（４）検出しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの他方をプライマーとして非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う
（５）工程（３）の増幅産物と工程（４）の増幅産物を混合した後、加熱、冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを得る - 前記相補的なＤＮＡを表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップに固定し、該バイオセンサーによりＤＮＡを検出することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの検出方法。
- 二種類以上のＤＮＡを検出することを特徴とする請求項２記載のＤＮＡの検出方法。
- 下記の工程を含むことを特徴とする部分二重鎖ＤＮＡの作製方法。
（１）作製しようとするＤＮＡの一部と同一な塩基配列からなる１種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（２）作製しようとするＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドを合成する
（３）作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの一方をプライマーとして非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う
（４）作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドの他方をプライマーとして非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う
（５）工程（３）の増幅産物と工程（４）の増幅産物を混合した後、加熱、冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを得る（ただし、工程（３）の増幅産物と工程（４）の増幅産物をそれぞれ精製した後に、混合、加熱、冷却し、部分二重鎖ＤＮＡを得る場合を除く） - 作製される部分二重鎖ＤＮＡが、その単鎖構造をとる部分のＤＮＡと相補的なＤＮＡをフローセル型表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップに固定し、該バイオセンサーによりＤＮＡを検出する方法に用いるためのものである、請求項４記載の方法。
- 工程（２）が、作製しようとするＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなる、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドよりも a 又は a+b だけ 3 ’末端側に位置する２種類のオリゴヌクレオチドを合成する工程であり、
工程（３）が、作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌク レオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドのうち、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドよりも a+b だけ 3 ’末端側に位置するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドを過剰に添加して非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程であり、
工程（４）が、作製しようとするＤＮＡを鋳型とし、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドと工程（２）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドのうち、工程（１）で合成したオリゴヌクレオチドよりも a だけ 3 ’末端側に位置するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして、当該工程（２）で合成したオリゴヌクレオチドを過剰に添加して非対称ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程である、
請求項４又は５に記載の方法。
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