DE69838538T2

DE69838538T2 - Verfahren zur erkennung von zielnukleinsäuren

Info

Publication number: DE69838538T2
Application number: DE69838538T
Authority: DE
Inventors: Isao Kawasaki-shi KARUBE; Shinya Tsuchiura-shi SAWATA; Ryohei Shinjuku-ku Nagata
Original assignee: Karube Isao Kawasaki; Dai Nippon Printing Co Ltd
Current assignee: Karube Isao Kawasaki; Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority date: 1997-05-08
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2018-05-09
Also published as: JP4185185B2; EP0915174B1; EP0915174A4; DE69838538D1; US6391546B1; JPH11332566A; WO1998050581A1; EP0915174A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleotidsequenz unter Verwendung einer Komplementärnukleotidsequenz.
Stand der Technik
Eine Anzahl von Verfahren zum nachweis einer Zieldeoxyribonukleinsäure (DNA) unter Verwendung einer DNA, die zur DNA-Sequenz komplementär ist („Komplmentär-DNA") ist bekannt. Bei einem typischen Beispiel handelt es sich um das Southern-Blot-Verfahren zum Identifizieren einer spezifizierten DNA. Plaque-Hybridisierung und Koloniehybridisierung, die beim DNA-Klonieren verwendet werden, sind ebenfalls eine bekannte Technik. Die Ziel-DNA muss zuerst in einen Einzelstrang aufgetrennt werden, da diese Verfahren auf der Tatsache basieren, dass eine Ziel-DNA spezifisch zu ihrer Komplementär-DNA hybridisiert.
Allerdings wird eine Einzelstrang-DNA außer beim Southern-Blot-Verfahren, in welchem sie an einer Membran immobilisiert wird, kugelförmig, und eine derartige kugelförmige DNA kann mit der Komplementär-DNA nicht hybridisieren. Weiterhin ist es nötig, eine Doppelstrang-DNA zu erwärmen, um sie zu einer Einzelstrang-DNA umzuwandeln. Allerdings beeinflussen derartige Behandlungen die Ziel-DNA nachteilig.
WO 92/08808 beschreibt ein verfahren zum nachweis einer Zielnukleotidsequenz, das die folgenden Schritte umfasst: Umwandeln einer Zielnukleotidsequenz in eine Teildoppelstrangnukleotidsequenz, die einen Doppelstrangteil und einen Einzelstrangteil aufweist; und Nachweis der Teildoppelstrangnukleotidsequenz unter Verwendung einer Nukleotidsequenz, die zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist, wobei die Nukleotidsequenz, die zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist, eine Nukleotidsequenz ist, die zu dem Einzelstrangteil der Teildoppelstrangnukleotidsequenz oder einem Abschnitt davon komplementär ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder fanden heraus, dass die Empfindlichkeit des Nachweises einer Zielnukleotidsequenz unter Verwendung einer Komplementärnukleotidsequenz durch Umwandeln der Zielnukleotidsequenz in eine Teildoppelstrangnukleotidsequenz deutlich verbessert wird. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesem Fund.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleotidsequenz unter Verwendung einer Komplementärnukleotidsequenz bereitzustellen, das eine ausgezeichnete Nachweisempfindlichkeit aufweist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz bereitzustellen, die für das Verfahren zum Nachweis der Zielnukleotidsequenz verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleotidsequenz umfasst die Schritte des Umwandelns einer Zielnukleotidsequenz in eine Teildop pelstrangnukleotidsequenz und des Nachweisens der Teildoppelstrangnukleotidsequenz unter Verwendung einer Nukleotidsequenz, die zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist („Komplementärnukleotidsequenz"), wobei der Schritt des Umwandelns der Zielnukleotidsequenz in die Teildoppelstrangnukleotidsequenz die folgenden Schritte einschließt:

(1) Durchführen einer asymmetrischen Polymerasekettenreaktion, in welcher eine Zielnukleotidsequenz als Template verwendet wird und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz identisch ist (Primer 1) und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz komplementär ist (Primer 2) als Primer verwendet werden;
(2) Durchführen einer asymmetrischen Polymerasekettenreaktion, in welcher die Zielnukleotidsequenz als Template verwendet wird und Primer 1 und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz mit Ausnahme von Primer 2 komplementär ist, (Primer 3) als Primer verwendet werden; und
(3) Erhalten einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz durch Erwärmen und Abkühlen eines Gemischs aus den Amplifikationsprodukten von Schritt (1) und Schritt (2).

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht schematisch ein Verfahren zur Herstellung einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz unter Verwendung einer asymmetrischen PCR.
2 zeigt ein Beispiel für einen Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor. 7: Patronenblock; 71: Messzelle; 72 und 73: Durchgang; 8: Lichtquelle; 80: einfallendes Licht; 9: Detektor; 90: reflektierendes Licht; 10: Messchip.
3 zeigt ein Beispiel für den Messchip für den Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor. 1: Transparentes Substrat; 2: Metallmembran; 3: organische Schicht; 4: Avidin; 5: biotinmarkierte Komplementärnukleotidsequenz; 6: Teildoppelstrangnukleotidsequenz.
4 zeigt eine DNA-Sequenz, die für Verotoxin Typ II von pathogenem Escherichia coli O-157 kodiert.
5 zeigt die Beziehung zwischen einem PCR-Zyklus und Resonanzsignalen, wenn eine Teildoppelstrangnukleotidsequenz verwendet wurde.
6 zeigt die Beziehung zwischen einem PCR-Zyklus und Resonanzsignalen, wenn keine Teildoppelstrangnukleotidsequenz verwendet wurde.
7 zeigt die Beziehung zwischen einer Struktur eines Amplifikationsprodukts und Resonanzsignalen.
8 zeigt die Beziehung zwischen der Gegenwart und Abwesenheit eines Erwärmungsverfahrens und Resonanzsignalen nach dem Beimischen des Amplifikationsprodukts.
9 zeigt eine typische Ausführungsform des im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren verwendeten Oberflächenplasmonresonanz-Biosensors. Die in 9 verwendeten Symbole sind dieselben wie in 2 definiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Begriff „Teildoppelstrangnukleotidsequenz" bedeutet wie hier verwendet eine Nukleotidsequenz, die einen Doppelstrangabschnitt und einen Einzelstrangabschnitt aufweist. Der Einzelstrangabschnitt dieser „Teildoppelstrangnukleotidsequenz" sollte eine ausreichende Länge aufweisen, um die Komplementärnukleotidsequenz zu hybridisieren. Demzufolge bedeutet der Begriff „Teildoppelstrangnukleotidsequenz" hier allgemein eine Nukleotidsequenz, die 6 oder mehr Basen des Einzelstrangabschnitts aufweist.
Der Begriff „Nukleotidsequenz" bedeutet wie hier verwendet DNA oder RNA.
Der Ausdruck „Umwandeln einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz" bedeutet nicht nur einen einfachen Vorgang zur Herstellung einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz aus einer Zielnukleotidsegeunz, sondern auch einen Amplifikationsvorgang der Zielnukleotidsequenz durch das Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Herstellung einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz.
Beispiele für die Zielnukleotidsequenz schließen DNA, kodierend für Verotoxin von pathogenem Escherichia coli, DNA, kodierend für gp120 (das Überzugsprotein für HIV), spezifische Nukleotidsequenzen (cDNA) von 16SrRNAs von verschiedenen Mikroorganismen und DNA, kodierend für das Antibiotikumbindungsprotein von Methisillin-resistentem Staphylococcus (MRSA) ein. Die Zielnukleotidsequenz kann Verunreinigungen enthalten. Zum Beispiel kann ein wärmebehandeltes Präparat von pathogenem E. coli ohne weitere Reinigung als Testprobe beim Nachweisen der für Verotoxin von pathogenem E. coli kodierenden DNA verwendet werden.
Ein Verfahren zum Umwandeln einer Zielnukleotidsequenz in eine Teildoppelstrangnukleotidsequenz, und zwar das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz schließt die folgenden Schritte ein:

(1) Durchführen einer asymmetrischen Polymerasekettenreaktion, in welcher die Zielnukleotidsequenz als Template verwendet wird und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz identisch ist (Primer 1) und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz komplementär ist (Primer 2) als Primer verwendet werden;
(2) Durchführen einer asymmetrischen Polymerasekettenreaktion, in welcher die Zielnukleotidsequenz als Template verwendet wird und Primer 1 und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz mit Ausnahme von Primer 2 komplementär ist, (Primer 3) als Primer verwendet werden; und
(3) Erhalten einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz durch Erwärmen und Abkühlen eines Gemischs aus den Amplifikationsprodukten von Schritt (1) und Schritt (2).

Das Verfahren zum Umwandeln einer Zielnukleotidsequenz in eine Teildoppelstrangnukleotidsequenz kannvor Schritt (1) die folgenden Schritte (A) und (B) einschließen:

(A) Synthetisieren eines Oligonukleotids (Primer 1) mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz identisch ist;
(B) Synthetisieren von zwei Oligonukleotiden (Primer 2 und Primer 3) mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz komplementär ist.

Ein Beispiel für die Positionen der Primer 1, 2 und 3 an der Zielnukleotidsequenz ist in 1 dargestellt. Primer 1 kann sich um einen Abstand a oder a + b näher am 5'-Ende (und zwar stromaufwärts) befinden als Primer 2 und 3. Wie in 1(A) dargestellt, entsprechen a und b einem Doppelstrangteil bzw. einem Einzelstrangteil der Teildoppelstrangnukleotidsequenz. Die Länge von a und b kann geeigneterweise gemäß der zum Nachweis zu verwendenden Komplementärnukleotidsequenz bestimmt werden. Da allerdings eine Länge von weniger als 84 Basen dahingehend Probleme verursachen kann, dass übermäßige Nebenprodukte während der PCR erzeugt werden, weist a vorzugsweise eine Länge von 100 bis 2000 Basen und b vorzugsweise eine Länge von 85 bis 1985 Basen auf.
In den Schritten (1) und (2) wird eine asymmetrische PCR unter Verwendung der Zielnukleotidsequenz als Template und der Primer 1 bis 3 als Primer durchgeführt. Bei der asymmetrischen PCR wird einer der beiden in der PCR verwendeten Primer gegenüber dem anderen Primer im Überschuss bereitgestellt (Gyllensten U. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7652–7655 (1988)).
Jeder Primer kann in der asymmetrischen PCR wie folgt verwendet werden. Zum Beispiel wird, wie in 1(B) dargestellt, Primer 1 gegenüber Primer 2 im Überschuss bereitgestellt, um ein langes amplifiziertes Fragment mit einer zur Zielnukleotidsequenz komplementären Sequenz zu erhalten. In 1 ist der durchgehende Pfeil der in einer überschüssigen Menge bereitgestellte Primer und der unterbrochene Pfeil der in einer geringeren Menge bereitgestellte Primer. Der im Überschuss bereitgestellte Primer macht vorzugsweise das 10- bis 100-Fache, stärker bevorzugt das 20-Fache des anderen Primers aus. Die Temperatur, die Zeit, der Zyklus und andere Variablen in der PCR können gemäß dem zu amplifizierenden Nukleotidfragment bestimmt werden.
Die PCR wird 2 mal unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt, um das wie in 1(B) dargestellte amplifizierte Fragment zu erhalten. In 1 zeigt die durchgehende Linie ein in einer großen Menge erhaltenes amplifiziertes Fragment und die unterbrochene Linie das in einer kleinen Menge erhaltene amplifizierte Fragment.
In Schritt (3) werden die in den Schritten (1) und (2) erhaltenen amplifizierten Produkte gemischt, erwärmt und abgekühlt, um eine Teildoppelstrangnukleotidsequenz zu erhalten. Das Erwärmen wird vorzugsweise für eine Dauer von 5 bis 10 Minuten bei 90 bis 95°C durchgeführt, und das Abkühlen wird vorzugsweise über eine Dauer von 20 bis 30 Minuten durchgeführt, um das Produkt auf 18 bis 30°C abzukühlen. Nach diesen Misch-, Erwärmungs- und Abkühlvorgängen werden, wie in 1(C) dargestellt, vier Fragmentarten, (i), (ii), (iii) und (iv) erhalten. Nur Nukleotidfragment (i) wird in großer Menge erhalten, und die anderen drei Nukleotidfragmente werden in kleinen Mengen erhalten. Der Einzelstrangteil der Teildoppelstrangnukleotidsequenz in (i) besteht aus einem Teil der Zielnukleotidsequenz.
Die teildoppelstrangnukleotidsequenz kann durch ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer zur Zielnukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz (Komplementärnukleotidsequenz) nachgewiesen werden. Die Komplementärnukleotidsequenz kann die Nukleotidsequenz sein, die zur gesamten oder einem Teil des Einzelstrangteils der Teildoppelstrangnukleotidsequenz komplementär ist. Der Nachweis kann unter Verwendung von nachweisbaren Markern wie Radioisotopen (z. B. ³²P), Enzymen, Enzymsubstraten oder Fluoreszenz durchgeführt werden, die von der Komplementärnukleotidsequenz getragen werden. Der Nachweis durch markierte Sonden kann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Der Nachweis kann auch unter Verwendung eines Oberflächenplasmonresonanz-Biosensors durchgeführt werden. Der Oberflä chenplasmonresonanz-Biosensor und Messchips, die zum Nachweis einer Zielnukleotidsequenz zu verwenden sind, werden wie folgt erklärt:
Ein Beispiel für einen in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor ist in 2 dargestellt. Dieser Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor weist einen Patronenblock 7, eine Lichtquelle 8 und einen Detektor 9 auf und wird verwendet, indem ein Messchip 10, an welchem eine Komplementärnukleotidsequenz immobilisiert ist, eingesetzt wird. Chip 10 ist an Patronenblock 7 bereitgestellt. Die Oberseite des Patronenblocks 7 weist einen Hohlraum auf, und eine Messzelle 71 besteht aus diesem Hohlraum und Messchip 10. Die Messzelle 71 steht über die Durchgänge 72 und 73 mit der Außenseite des Patronenblocks 7 in Verbindung. Die Probe fließt über den Durchgang 72 in die Messzelle 71 und wird nach der Messung über Durchgang 73 ausgetragen.
Monochromatisches Licht (ein einfallendes Licht 80) wird von einer Lichtquelle 8 zu dem transparenten Substrat des Messchips 10 abgestrahlt. Ein reflektiertes Licht 90, das von einem Metallmembranaufbau an der Rückseite des Messchips 10 reflektiert wird, erreicht Detektor 9, der die Intensität des reflektierten Lichts 90 nachweisen kann.
Der wie in 2 dargestellte Biosensor ergibt eine Intensitätskurve des reflektierten Lichts, die in Bezug auf einen vorgegebenen Einfallswinkel θ ein Tal bildet. Das Tal in der Intensitätskurve des reflektierten Lichts liegt aufgrund der Oberflächenplasmonresonanz vor. Wird Licht an der Grenzfläche zwischen dem transparenten Substrat und dem Äußeren des Messchips 10 vollständig reflektiert, wird eine Oberflächenwelle, bekannt als Welle mit herabgesetzter kritischer Frequenz (evanscent wave), an der Grenzfläche und auch eine Oberflächenwelle, bekannt als Oberflächenplasmon, an der Metallmembran gebildet. Eine Resonanz tritt auf, wenn die Wellenzahl dieser beiden Oberflächenwellen übereinstimmt, und ein Teil der Lichtenergie wird verbraucht, um das Oberflächenplasmon anzuregen, was zu einer Abnahme in der Intensität des reflektierten Lichts führt. Die Wellenzahl des Oberflächenplasmons wird durch den Brechungsindex des Medium unmittelbar an der Oberfläche der Metallmembran beeinflusst. Daher wird, wenn sich der Brechungsindex des Mediums aufgrund einer Wechselwirkung zwischen der nachzuweisenden Nukleotidsequenz und ihrer Komplementärnukleotidsequenz ändert, eine Oberflächenplasmonresonanz dazu veranlasst, den Einfallswinkel θ zu ändern. So kann eine Änderung der Konzentration der nachzuweisenden Nukleotidsequenz eine Verschiebung des Tals in der Intensitätskurve des reflektierten Lichts erkennen. Die Änderung des Einfallswinkels θ wird Resonanzsignal genannt, und eine Änderung von 10^–-Grad wird als 1 RU ausgedrückt.
Der Messchip 10 kann ein transparentes Substrat und eine für die Oberflächenplasmonresonanz nötige Metallmembran aufweisen, und eine Komplementärnukleotidsequenz kann an der Metallmembran des Chips immobilisiert werden. Im Handel erhältliche Messchips (z. B. ein Messchip für BIAcore 2000, Pharmacia Biosensor, Inc.) können verwendet werden. Der wie in 3 dargestellte Messchip ist bevorzugt. Eine Metallmembran 2 und eine organische Schicht 3 werden au ein transparentes Substrat geformt. Avidin 4 wird an der organischen Schicht immobilisiert, und eine mit Biotin markierte Komplementärnukleotidsequenz wird an dem Avidin 4 immobilisiert.
Das transparente Substrat 1 ist nicht besonders beschränkt und kann ein beliebiges Substrat sein, das in einem Messchip für einen Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor verwendet wird. Im Allgemeinen können Substrate verwendet werden, die aus einem für einen Laserstrahl transparenten Material, wie Glas, Poly(ethylenterephthalat) und Polycarbonaten hergestellt sind. Ein Material, das für polarisiertes Licht nicht anisotrop ist und leicht verarbeitet werden kann, ist erwünscht. Die Dicke des Substrats kann etwa 0,1 bis 20 mm betragen.
Die Metallmembran 2 ist nicht besonders beschränkt, mit der Maßgabe, dass sie eine Oberflächenplasmonresonanz herbeiführen kann. Beispiele für das für diese Metallmembran zu verwendende Metall schließen Gold, Silber, Kupfer, Aluminium und Platin ein. Sie können allein oder in Kombination verwendet werden. Weiterhin kann für ein besseres Haftvermögen am transparenten Substrat eine Hilfsschicht zwischen dem transparenten Substrat 1 und der aus Gold, Silber und dergleichen hergestellten Schicht eingelegt werden.
Die Dicke der Metallmembran 2 beträgt vorzugsweise 100 bis 2000 Angstrom, stärker bevorzugt 200 bis 600 Angstrom. Übersteigt die Dicke 3000 Angstrom kann das Oberflächenplasmonphenomen nicht ausreichend nachgewiesen werden. Weiterhin beträgt bei Verwendung einer aus Chrom hergestellten Hilfsschicht die Dicke der Schicht vorzugsweise 5 bis 50 Angstrom.
Die Metallmembran 2 kann durch ein herkömmliches Verfahren wie Sputtern, Vakuumverdampfung, Ionenplattieren, Elektroplattieren oder nicht-elektrolytisches Plattieren gebildet werden. Das Sputterverfahren ist bevorzugt.
Die organische Schicht 3 besteht aus einer Substanz, die sich sowohl an ein Metallatom als auch an ein Avidinmolekül binden kann. Die Dicke der organischen Schicht beträgt vorzugsweise 10 bis 200 Angstrom, besonders bevorzugt 10 bis 50 Angstrom. Weiterhin kann eine Nukleotidsequenz unter Verwendung einer kovalenten Bindung wie einer Esterbindung oder Amidbindung statt einer Avidin-Biotin-Bindung an der organischen Schicht 3 immobilisiert werden.
Die organische Schicht kann unter Verwendung eines Silankupplungsmittels oder einer Verbindung mit einer Mercaptogruppe und einer anderen organischen funk tionellen Gruppe („Thiolverbindung") oder unter Verwendung der LB(Langmuir-Blodgett)-Technik gebildet werden. Eine durch die LB-Technik gebildete Membran bindet sich an die metallmembran schwächer als eine unter Verwendung eines Silankupplungsmittels oder einer Thiolverbindung gebildete Membran. Allerdings ist die LB-Technik auf einen breiteren Bereich von Substanzen anwendbar und kann eine agglomerisierte Membran bilden. Daher kann die Anzahl an pro Flächeneinheit zu bindenden physiologisch wirksamen Substanzen erhöht werden.
Beispiele für Silankupplungsmittel, die zum Bilden der organischen Schicht verwendet werden können, schließen 3-Aminopropyltriethoxysilan, 3-Aminopropylthimethoxysilan, 3-Amidopropyldiethoxymethylsilan, 3-(2-Aminoethylaminopropyl)trimethoxysilan, 3-(2-Aminoethylaminopropyl)dimethoxymethylsilan, 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan und Dimethoxy-3-mercaptopropylmethylsilan ein. Beispiele für Thiolverbindungen schließen Mercaptoaminomethan, 2-Mercapto-1-aminoethan, 3-Mercapto-1-aminopropan, 4-Mercapto-1-aminobutan, 1,1,1-Triamino-2-mercaptoethan, Mercaptoessigsäure, 2-Mercaptopropionsäure, 3-Mercaptobuttersäure, 4-Mercaptovalerinsäure und 1,1,1-Triamino-3-mercaptopropan ein. Multifunktionelle Substanzen mit vielen Bindungsstellen mit Avidin, wie 1,1,1-triamino-2-mercaptoethan und 1,1,1-Triamino-3-mercaptopropan werden vorzugsweise verwendet. Beispiele für Substrate, die auf die LB-Technik anwendbar sind, schließen 21-Aminodocosansäure, Stearylamin und Polylysin ein.
Beispiele für Verfahren zum Bilden der organischen Schicht durch ein Silankupplungsmittel schließen die Aussetzung einer Metallmembran an einen gesättigten Dampf eines Silankupplungsmittels für eine bestimmte Zeitdauer (verfahren mit gesättigtem Dampf), das Eintauchen einer Metallmembran in eine ein Silankupplungsmittel enthaltende Lösung (Tauchverfahren), einen Rotationsbeschichter (Rotationsbeschichtungsverfahren) und eine Fototiefdruckpresse (Tiefdruckverfahren) ein. Das Verfahren mit gesättigtem Dampf, das Tauchverfahren, das Rotationsbeschichtungsverfahren oder das Tiefdruckverfahren kann zum Bilden der organischen Schicht 3 unter Verwendung einer Thiolverbindung verwendet werden.
Avidin 4 kann an der organischen Schicht 3 durch Inkontaktbringen einer festgesetzten Menge Avidin 4 mit der organischen Schicht 3 für eine festgesetzte Zeitdauer immobilisiert werden. Spezieller wird das transparente Substrat 1 mit der darauf haftenden organischen Schicht 3 auf dem Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor vom Fließzellentyp positioniert und eine festgesetzte Menge Avidin 4 für eine festgesetzte Zeitdauer gegossen.
Beispiele für Verfahren zum Immobilisieren einer mit Biotin markierten Komplementärnukleotidsequenz schließen das Tintenstrahlverfahren und das Makroverteilerverfahren ein. Das Tintenstrahlverfahren ist dahingehend vorteilhaft, dass es einen eine Komplementärnukleotidsequenz 5 enthaltenden Tropfen auf einen äußerst kleinen Bereich derart präzise ausstoßen kann, dass die zu immobilisierende Komplementärnukleotidsequenz 5 effizient genutzt werden kann. Die Immobilisierung kann durch Positionieren eines Messchips auf einem Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor vom Fließzellentyp und Gießen einer bestimmten menge einer Komplementärnukleotidsequenz 5 für eine festgesetzte Zeitdauer durchgeführt werden. Dieses Immobilisierungsverfahren ist dahingehend vorteilhaft, dass die Immobilisierung von Avidin 4 und der Komplementärnukleotidsequenz 5 aufeinander folgend durchgeführt werden kann. Ein Verfahren zum Markieren der Komplementärnukleotidsequenz mit Biotin erfolgt durch PCR unter Verwendung eines Primers mit Biotin.
Bei der Zielnukleotidsequenz kann es sich um eine oder mehrere handeln. Zwei oder mehr Arten von Zielnukleotidsequenzen können durch Immobilisieren von mehrfachen Anzahlen von Nukleotidsequenzen auf einem Chip oder durch Bereit stellen von mehrfachen Anzahlen von Chips auf dem Sensor nachgewiesen werden. Der Nachweis von zwei oder mehr Arten an Nukleotidsequenzen auf diese Weise stellt eine bessere Nachweisgenauigkeit der Nukleotidsequenzen bereit. Ob eine Probe von einem bestimmten Mikroorganismus abgeleitete DNA enthält, kann mit großer Genauigkeit, z. B. durch Immobilisieren von zwei oder mehr DNA-Sequenzen, die zur spezifischen DNA des Mikroorganismus komplementär sind, identifiziert werden. Die Genauigkeit kann auch durch Einschluss einer DNA-Sequenz, die sich in den DNA-Sequenzen die immobilisiert werden, an die Ziel-DNA nicht bindet (negative Sonde), verbessert werden. Weiterhin kann durch selektives Immobilisieren einer Nukleotidsequenz nicht nur die Gegenwart oder Abwesenheit von Verotoxin in der Probe, sondern auch der Toxintyp, Typ I oder Typ II, bestimmt werden.
Werden zwei oder mehr Zielnukleotidsequenzen immobilisiert, ist der zu verwendende Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor vorzugsweise von dem Typ, in welchem der Messchip in horizontaler Richtung frei bewegt werden kann. Ein derartiger Sensor ermöglicht die Messung von Signalen von mehrfachen Anzahlen an Proben an dem Chip, während das optische System festgehalten wird.
BEISPIEL
Beispiel 1
Eine 0,1%ige Avidinlösung wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 μl/Min. für eine Dauer von 10 Minuten in die Messzelle eines im Handel erhältlichen Oberflächenplasmonresonanz-Biosensors (BIAcore 2000, Pharmacia Biosensor) gegossen, um Avidin auf dem Messchip zu immobilisieren. Ein Oligonukleotid, das zur Sequenz von Base 401–421 der in 4 dargestellten DNA-Sequenz (SEQ ID NO. 1), kodierend für Verotoxin Typ 2, komplementär ist wurde synthetisiert, und Biotin wurde an sein 5'-Ende gebunden (dieses Oligonukleotid ist „Antisonde VT2-2B"). Eine Antisonde VT2-2B enthaltende Lösung, wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 μl/Min. für eine Dauer von 50 Minuten in die Messzelle des Biosensors gegossen, um das Oligonukleotid über Avidin auf dem Messchip zu immobilisieren.
Die folgenden Primer wurden auf der Basis der in 4 dargestellten DNA-Sequenz synthetisiert:
P-VT2C, Asp-VT2-2a und Asp-VT2-2b entsprechen den Basensequenzen 301–321, 381–401 bzw. 423–443 der in 4 dargestellten DNA-Sequenz.
Eine asymmetrische PCR wurde unter Verwendung einer aus pathogenem E. coli 0–157 extrahierten Genom-DNA als Template und P-VT2C und Asp-VT2-2b als Primer durchgeführt. P-VT2C und Asp-VT2-2b wurden in einem Verhältnis von 20:1 zugesetzt. Nach einer anfänglichen Denaturierung (94°C, 3 Minuten) wurde die PCR für eine Dauer von 10 bis 40 Denaturierungszyklen (94°C, 1 Minute), Ausheilen (59°C, 5 Minuten) und Verlängerung (72°C, 1 Minute) durchgeführt.
Eine asymmetrische PCR wurde auch unter Verwendung von P-VT2C und Asp-VT2-2a als Primer wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Asp-VT2-2b und P-VT2C wurden in einem Verhältnis von 20:1 zugesetzt.
Zwei Arten von wie vorstehend beschrieben erhaltenen PCR-Amplifikationsprodukten wurden in einem Gesamtvolumen von 100 μl gemischt. Das Gemisch wurde bei 95°C für eine Dauer von 10 Minuten erwärmt und dann für eine Dauer von 30 Minuten auf 25°C abgekühlt, um eine Teildoppelstrang-DNA herzustellen. Das diese Teildoppelstrang-DNA enthaltende Gemisch aus Amplifikationsprodukten wurde in die Messzelle des vorstehend erwähnten Biosensors gegossen, und Resonanzsignale wurden bei Fließvolumina von 10 μl, 20 μl, 30 μl und 40 μl gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Für eine Kontrolle wurde eine PCR (symmetrische PCR) unter Verwendung von P-VT2C und Asp-VT2-2b als Primer durchgeführt und das erhaltene Amplifikationsprodukt in die Messzelle gegossen, um Resonanzsignale zu messen. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. o: 10 Zyklen, •: 20 Zyklen, Δ: 25 Zyklen,
: 30 Zyklen und ⎕: 40 Zyklen.
Wie in den 5 und 6 dargestellt, konnten in beiden Fällen Hybridisierungssignale für eine Dauer von 30 und mehr Zyklen nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde die Nachweisempfindlichkeit um etwa das zweifache verbessert, indem die Produkte der asymmetrischen PCR zu einer Teildoppelstrang-DNA gemacht wurden.
Beispiel 2
Eine asymmetrische PCR wurde unter Verwendung einer aus pathogenem E. coli 0–157 extrahierten Genom-DNA als Template und P-VT2C und Asp-VT2-2b als Primer durchgeführt (das erhaltene Amplifikationsprodukt wird als „Amplifikationsprodukt A" bezeichnet). P-VT2C und Asp-VT2-2b wurden in einem Verhältnis von 20:1 zugesetzt. Nach einer anfänglichen Denaturierung (95°C, 3 Minuten) wurde die PCR für eine Dauer von 40 Denaturierungszyklen (94°C, 1 Minute), Ausheilen (61°C, 1 Minute) und Verlängerung (72°C, 1 Minute) durchgeführt.
Eine asymmetrische PCR wurde unter Verwendung einer aus pathogenem E. coli 0–157 extrahierten Genom-DNA als Template und P-VT2C und Asp-VT2-2a als Primer durchgeführt (das erhaltene Amplifikationsprodukt wird als „Amplifikationsprodukt B" bezeichnet). Asp-VT2-2a und P-VT2C wurden in einem Verhältnis von 20:1 zugesetzt. Die PCR wurde unter denselben Bedingungen wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Eine symmetrische PCR wurde unter Verwendung einer aus pathogenem E. coli 0–157 extrahierten Genom-DNA als Template und P-VT2C und Asp-VT2-2b als Primer durchgeführt (das erhaltene Amplifikationsprodukt wird als „Amplifikationsprodukt C" bezeichnet). Die PCR wurde unter denselben Bedingungen wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Eine symmetrische PCR wurde unter Verwendung einer aus pathogenem E. coli 0–157 extrahierten Genom-DNA als Template und P-VT2C und Asp-VT2-2a als Primer durchgeführt (das erhaltene Amplifikationsprodukt wird als „Amplifikationsprodukt D" bezeichnet). Die PCR wurde unter denselben Bedingungen wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die Amplifikationsprodukte A, B, C und D wurden in vier Kombinationen gemischt: (1) Amplifikationsprodukt C + Amplifikationsprodukt D, (2) Amplifikationsprodukt A + Amplifikationsprodukt B, (3) Amplifikationsprodukt A + Ampli fikationsprodukt D und (4) Amplifikationsprodukt B + Amplifikationsprodukt C. Diese gemischten Amplifikationsprodukte wurden bei 95°C für eine Dauer von 10 Minuten erwärmt und dann für eine Dauer von 30 Minuten auf 25°C abgekühlt. Diese vier Arten von gemischten Amplifikationsprodukten wurden in Messzellen des Biosensors gegossen, und Resonanzsignale wurden bei Fließvolumina von 10 μl, 20 μl, 30 μl und 40 μl gemessen. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. o: gemischtes Amplifikationsprodukt (1), •: gemischtes Amplifikationsprodukt (2), Δ: gemischtes Amplifikationsprodukt (3) und
: gemischtes Amplifikationsprodukt (4).
Wie in 7 dargestellt, war die Nachweisempfindlichkeit am besten, als zwei Amplifikationsprodukte der asymmetrischen PCR gemischt wurden (gemischtes Amplifikationsprodukt (2))
Beispiel 3
Ein gemischtes Amplifikationsprodukt aus Amplifikationsprodukt A und Amplifikationsprodukt B, hergestellt in Beispiel 2, wurde bei 95°C für eine Dauer von 10 Minuten erwärmt und dann für eine Dauer von 30 Minuten auf 25°C abgekühlt, um eine Teildoppelstrang-DNA herzustellen. Das diese Teildoppelstrang-DNA enthaltende gemischte Amplifikationsprodukt wurde in eine Messzelle des Biosensors gegossen, und Resonanzsignale wurden bei Fließvolumina von 10 μl, 20 μl, 30 μl und 40 μl gemessen. Amplifikationsprodukt A allein wurde erwärmt und abgekühlt, um eine Probe für Kontrolle 1 herzustellen, ein Gemisch aus Amplifikationsprodukt A und Amplifikationsprodukt B wurde erwärmt und abgekühlt, um eine Probe für Kontrolle 2 herzustellen, Amplifikationsprodukt A allein wurde erwärmt aber nicht abgekühlt, um eine Probe für Kontrolle 3 herzustellen. Resonanzsignale wurden für diese Kontrollproben in derselben Weise wie vorstehend beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. o: die die teildoppelstrang-DNA enthaltende Probe, •: Kontrolle 1, Δ: Kontrolle 2 und
: Kontrolle 3.
Wie in 8 dargestellt, wurde kein deutliches Signal für die Amplifikationsprodukt A allein umfassenden Proben nachgewiesen. Weiterhin waren bestimmte Signale immer für die Proben nachweisbar, die gemischte Amplifikationsprodukte umfassten. Allerdings war die Nachweisempfindlichkeit eindeutig schlecht, als keine Erwärmungs- und Abkühlvorgänge angewandt wurden.
Beispiel 4
Eine Chromschicht und dann eine Goldschicht wurden auf einer blauen Glasplatte mit 13 mm × 18 mm und einer Dicke von 0,3 mm (Matsunami Glass Kogyo) durch Sputtern abgeschieden, um einen Messchip für einen Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor herzustellen. Das Sputtern wurde bei 100 W für eine Dauer von 30 Sekunden, um eine Chromschicht mit 32,2 Angstrom herzustellen, und bei 100 W für eine Dauer von 150 Sekunden, um eine Goldschicht mit 474 Angstrom herzustellen, durchgeführt. Dieser Messchip wurde für eine Dauer von 24 Stunden in eine 1 mM Ethanollösung von 11-Mercaptoundecansäure getaucht, um eine dünne organische Membranschicht auf der Metallschicht zu bilden. Dann wurden 50 μl einer 5%igen Avidinlösung an 3 Punkten auf denselben Chip getropft, wobei Amidbindungen zwischen den Avidinmolekülen und den Molekülen der dünnen Membran gebildet wurden, wodurch die Avidinmoleküle immobilisiert wurden.
Die folgenden drei DNA-Arten mit am 5'-Ende gebundenen Biotin (synthetisiert von Sawaday Technology) wurden verwendet. Diese DNAs weisen Sequenzen auf, die zu einem Teil der drei Genarten, tdh1, tdh2 und trh2, bei welchen es sich um die toxischen Elemente eines toxinproduzierenden Bakteriums, Vibrio parahaemolyticus, handelt, komplementär sind.
30 μl einer die vorstehende DNA (10 μl) enthaltenden Lösung wurden auf die Punkte, auf welchen die Avidinlösung getropft war, getropft, um die DNA auf dem Messchip über eine Avidin-Biotin-Bindung zu immobilisieren.
Der Messchip, auf welchem die DNA immobilisiert war, wurde auf einen Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor (SPR-20-Typ mit einem modifizierten Sensorkopf und Fluidzulauf und -ablauf, Denki Kagaku Keiki) (9) gegeben. Da sich der Messchip dieses Biosensors horizontal frei bewegen kann, können Resonanzsignale der mehrfachen Anzahlen von auf dem Chip vorliegenden Proben gemessen werden, indem das optische System befestigt bleibt.
Die nachzuweisende DNA-Sequenz wurde als teildoppelt gebundene DNA (143 Bp für die Doppelstrang-DNA und 101 Bp für die Einzelstrang-DNA) unter Verwendung einer asymmetrischen PCR wie in Beispiel 1 beschrieben amplifiziert. Eine die amplifizierte Teildoppelstrang-DNA enthaltende Lösung wurde mit einem Fließvolumen von 10 μl in eine Messzelle des Biosensors gegossen, um Resonanzsignale zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

Sequenz A B C

Resonanzsignal (× 10^–4) 308 (RU) 298 (RU) 315 (RU)
Wie in Tabelle 1 dargestellt, zeigen die Sequenzen A, B und C sämtlich Signale in der Nähe von 300 RU (umgewandelte Werte). Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Signale 10–20 RU (umgewandelte Werte) betragen, wenn keine DNA gebunden ist (negativ), würde es dann scheinen, das die Teildoppelstrang-DNA an die drei Arten von immobilisierten DNAs gebunden war (positiv).
Beispiel 5
Eine Metallschicht und eine dünne organische Membranschicht wurden auf einer blauen Glasplatte abgeschieden, und vier Messchips wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. 50 μl einer 5%igen Avidinlösung wurden auf zwei Punkte von jedem der vier Chips (insgesamt 8 Punkte) getropft, um die Avidinmoleküle zu immobilisieren.
Die folgenden 8 DNAs, an welchen Biotin an deren 5'-Enden gebunden ist, wurden synthetisiert (synthetisiert von Sawday Technology). Die Sequenzen A, B und C sind DNAs, die Sequenzen aufweisen, die zu einem Teil des Gens tdh1, tdh2 bzw. trh2 von Vibrio parahaemolyticus komplementär sind. Die Sequenzen D, E, F, G und H sind DNAs, die Sequenzen aufweisen, die zu 18S-RNA von Salmonella enteriditis, einem Keuchhustentoxin von Borderlia pertussis, Toxin von Vibrio cholera, Verotoxin Typ I von Escherichia coli 0157 (pathogenes E. coli O157) bzw. Verotoxin Typ II von E. coli O-157 komplementär sind.
30 μl einer die vorstehende DNA (10 μl) enthaltenden Lösung wurden auf die Punkte, auf welchen die Avidinlösung getropft war, getropft, um die DNA auf dem Messchip über Avidin-Biotin-Bindungen zu immobilisieren.

Der Messchip, auf welchem die DNA immobilisiert war, wurde auf den in Beispiel 4 verwendeten Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor gegeben. Die nachzuweisende DNA wurde als teilweise doppelt gebundene DNA (143 Bp für die Doppelstrang-DNA und 101 Bp für die Einzelstrang-DNA) unter Verwendung der asymmetrischen PCR wie in Beispiel 4 beschrieben amplifiziert. Vier DNAs wurden verwendet; DNAs, hergestellt von E. coli O-157, Vibrio parahaemolyticus und Salmonella und eine Kombination von DNAs von E. coli O-157 und Salmonella. Eine Lösung, enthaltend die amplifizierten Teildoppelstrang-DNA wurde mit einem Fließvolumen von 10 μl in eine Messzelle des Biosensors gegossen, um Resonanzsignale zu messen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

	E. coli O-157	V. parahaemolyticus	Salmonella	E. coli O-157 + Salmonella
Sequenz A	22	295	10	11
Sequenz B	18	331	12	28
Sequenz C	21	301	18	23
Sequenz D	15	22	321	299
Sequenz E	17	24	22	18
Sequenz F	24	19	33	19
Sequenz G	308	18	24	356
Sequenz H	311	25	26	334

Wie in Tabelle 2 dargestellt, wurden für die verschiedenen Mikroorganismen Signale in der Nähe von 300 RU für positive Proben und Signale von weniger als 30 RU für negative Proben erhalten.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleotidsequenz, das die folgenden Schritte umfasst: Umwandeln einer Zielnukleotidsequenz in eine Teildoppelstrangnukleotidsequenz, die einen Doppelstrangteil und einen Einzelstrangteil aufweist; und Nachweisen der Teildoppelstrangnukleotidsequenz unter Verwendung einer Nukleotidsequenz, die zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist, wobei der Schritt des Umwandelns der Zielnukleotidsequenz in die Teildoppelstrangnukleotidsequenz die folgenden Schritte einschließt: (1) Durchführen einer asymmetrischen Polymerasekettenreaktion, in welcher eine Zielnukleotidsequenz als Template verwendet wird und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz identisch ist (Primer 1) und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz komplementär ist (Primer 2) als Primer verwendet werden; (2) Durchführen einer asymmetrischen Polymerasekettenreaktion, in welcher die Zielnukleotidsequenz als Template verwendet wird und Primer 1 und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz mit Ausnahme von Primer 2 komplementär ist, (Primer 3) als Primer verwendet werden; und (3) Erhalten einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz durch Erwärmen und Abkühlen eines Gemischs aus den Amplifikationsprodukten von Schritt (1) und Schritt (2).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz, die zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist, eine Nukleotidsequenz ist, die zum Einzelstrangteil der Teildoppelstrangnukleotidsequenz oder einem Abschnitt davon komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Primer 2 und 3 jeweils aus einem Teil einer Nukleotidsequenz bestehen, der zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist und sich stromabwärts von der Position von Primer 1 auf der Zielnukleotidsequenz befindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Primer 2 und 3 jeweils aus einem Teil einer Nukleotidsequenz bestehen, der zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist und sich stromabwärts von der Position von Primer 1 auf der Zielnukleotidsequenz befindet, und wobei Primer 2 aus einem Teil einer Nukleotidsequenz besteht, der zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist und sich stromabwärts von der Position einer Nukleotidsequenz, die zur Primer 3 auf der Zielnukleotidsequenz komplementär ist, befindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Primer 1 gegenüber Primer 2 in Schritt (1) im Überschuss bereitgestellt wird, und Primer 3 gegenüber Primer 1 im Überschuss bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis von Primer 1 zu Primer 2 und das vorliegende Verhältnis von Primer 3 zu Primer 1 10 zu 100 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, das vor Schritt (1) ferner die folgenden Schritte umfasst: (A) Synthetisieren eines Oligonukleotids (Primer 1) mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz identisch ist; und (B) Synthetisieren von zwei Oligonukleotiden (Primer 2 und Primer 3) mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem teil der Zielnukleotidsequenz komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Doppelstrangteil 100 bis 2000 Basenpaare aufweist und der Einzelstrangteil 85 bis 1985 Basenpaare aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Teildoppelstrangnukleotidsequenz durch einen Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz, die zur Zielnukleotidsequenz komplementär ist, auf einem Messchip eines Oberflächenplasmonresonanz-Biosensors immobilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwei oder mehr Zielnukleotidsequenzen nachgewiesen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz DNA ist.
Verfahren zur Herstellung einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz, umfassend die folgenden Schritte: (1) Durchführen einer asymmetrischen Polymerasekettenreaktion, in welcher eine Zielnukleotidsequenz als Template verwendet wird und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, der zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz identisch ist (Primer 1) und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz komplementär ist (Primer 2) als Primer verwendet werden; (2) Durchführen einer asymmetrischen Polymerasekettenreaktion, in welcher die Zielnukleotidsequenz als Template verwendet wird und Primer 1 und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die zu einem Teil der Zielnukleotidsequenz mit Ausnahme von Primer 2 komplementär ist (Primer 3) als Primer verwendet werden; und (3) Erhalten einer Teildoppelstrangnukleotidsequenz durch Erwärmen und Abkühlen eines Gemischs aus den Amplifikationsprodukten von Schritt (1) und Schritt (2).